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,
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA,
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA,
DE MEXICO
Efecto de la inactivación de las isoenzimas de piruvato
cinasa sobre el metabolismo central y la capacidad de
síntesis de compuestos aromáticos en cepas de
Escherichia coli que carecen del sistema de
fosfotransferasa.
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
P.R E S E N T A
Q. ADRIANA CORTAZAR MARTÍNEZ
Cuernavaca, Mor. Septiembre, 2005
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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EL PRESENTE TRABAJO SE
REALIZÓ BAJO LA
DIRECCIÓN DEL DR.
GUILLERMO GOSSET
LAGARDA EN EL
DEPARTAMENTO DE
INGENIERÍA CELULAR Y
BIOCATÁLISIS DEL
INSTITUTO DE
BIOTECNOLOGÍA DE LA
UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTÓNOMA DE MÉXICO
Autorizo a la~ié'n ())n¡ I¡1 de 8itlliotiCIs d& I~
UNA'" • ditulldir in fOrlllllo 'ti :lré oleo t illprt to ti
contenido · de mi tru Bjo racepctonal .
NOMBRE: ( Q~ c:__ . ~ a
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FECHA~ 2-J~~¿.~ --FIFn.iA. ~;>:-----
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MIEMBROS DEL JURADO
Presidente:
Secretario:
Vocal:
Suplente:
Suplente:
•
Dr. Edmundo Calva Mercado
Dr. Guillermo Gosset Lagarda
Dr. Miguel Ángel Cevallos Gaos
Dra. Elda Guadalupe Espín Ocampo
Dr. Mario Soberón Chávez
Orlando. Te quiero mucho. De tu dedicación, tu esfuerzo y tu amor hacia los demás he
aprendido mucho.
DEDICATORIA:
Papá, Mamá, Orlando... ustedes son mi motivo para seguir adelante.
Papá. Te quiero y te admiro. Me has inspirado a seguir adelante.
Mamá. Eres mi ejemplo por ser una gran mujer. Tu amor y la enseñanza que me has dado
me han permitido lograr todo esto.
li
il,
", Familia Cortazar, Familia Martínez. Su confianza y su cariño han sido un gran aliento para
mí. A las "Señoras", a mi consentida, a mi abuelito, en fin.. . a cada uno de ustedes, por
haber dejado algo hermoso en mi vida.
A mis amigas Kris, Arge, Magaly, Quilla, Gretel, Rosita. En todo este tiempo, su amistad
incondicional me ha ayudado a seguir adelante. Ustedes forman una parte importante de
mi vida.
Álvaro, Inés, lidia, Marina, Naty, Paty. Este tiempo en el IBt no hubiera sido lo mismo sin
ustedes. De cada uno de ustedes pude aprender mucho. Los admiro por su dedicación y
su trabajo. Los quiero mucho.
AGRADECIMIENTOS:
Agradezco de todo corazón a cada persona que de alguna manera ha estado conmigo. A
mi familia, mis amigos, mis maestros. GRACIAS¡¡¡
A Dios, por ser quien guía mi camino.
Al Dr. Gosset por darme la confianza de pertenecer a su grupo de trabajo. Por su
paciencia, guianza y experiencia. Usted es un ejemplo no solo como investigador, sino
como persona. Gracias.
Al Dr. Alfredo Martínez. Su interés, su dedicación y sus consejos hicieron que me
superara. Gracias por su apoyo.
A los miembros de mi comité tutoral: Dr. Joel Osuna, Dr. Tonatiuh Ramírez. Gracias por
sus críticas y sugerencias que permitieron llevar a cabo este proyecto.
A los miembros del jurado, por su tiempo, su dedicación y sus comentarios acerca de esta
tesis.
José Luis Báez. Gracias por tu enseñanza y el interés que siempre demostraste en este
proyecto.
Mechita, Silvia y Geo... No solamente agradezco su trabajo y su ayuda sin el cual no
hubiera sido posible terminar esta tesis, sino también el ejemplo acerca del
profesionalismo y excelencia en el trabajo.
A mis compañeros y amigos del Laboratorio Bolívar-Gosset. Adelfo, Ramón, Lidia, Noemí,
Montse, Silvia, Tere, Juan Carlos, Paty, Eugenio, Gerardo, Marina, Joyce, Susana, José,
Andrea, Inés, Naty, Álvaro, Karla. Muchas gracias por sus aportaciones, sus consejos, su
ayuda y por hacer mi estancia en el laboratorio mucho mas fácil y agradable.
A mis compañeros de generación, por los momentos de estudio y de diversión.
Índice
1. ÍNDICE GENERAL
1. ÍNDICE GENERAL
11. ÍNDICE DE FIGURAS iv
111. ÍNDICE DE TABLAS vii
1. RESUMEN 1
2. INTRODUCCIÓN 2
3. ANTECEDENTES 5
3.1. Metabolismo central 5
3.2. El nodo de PEP 7
3.2.1. Sistema de transporte de fosfotransferasa (PTS) 8
3.2.1.1. Distribución de flujos de carbono en la cepa PB12 9
3.2.2. Isoenzimas piruvato cinasas 10
3.2.3. Producción de compuestos de interés industrial utilizando cepas
con modificaciones en el metabolismo central. 12
3.3. Aminoácidos aromáticos y sus derivados. 14
3.3.1. Biosíntesis de los aminoácidos aromáticos 16
3.3.2. Vía del siquimato 18
3.3.2.1.3-Desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato Sintasa 19
3.3.2.2. Estrategias que se han seguido en E. coli para la producción de
aminoácidos aromáticos 21
3.3.2.2.1. Incremento en la disponibilidad de eritrosa-4-fosfato
(E4P) 21
3.3.2.2.1.1. Sobreexpresión de las enzimas trancetolasa (TKT) y
transaldolasa (TAL) 21
3.3.2.2.1.2. Inactivación de la enzima fosfoglucosa isomerasa
~Gij n
3.3.2.2.2. Incremento en la disponibilidad de PEP 22
3.3.2.2.2.1. Inactivación de la enzima PEP carboxilasa
(PPC) 23
3.3.2.2.2.2. Inactivación de las isoenzimas piruvato cinasas
(PYKA, PYKF)
3.3.2.2.2.3. Sobreexpresión del gen pps
3.3.2.2.2.4. Inactivación del sistema PTS
3.3.2.2.2.5. Utilización de azúcares no PTS
23
23
23
24
3.3.2.2.3. Eliminación de la inhibición
Índice
por
retroalimentación
3.3.2.2.4. Evolución dirigida de proteínas.
3.3.3. Síntesis de fenilalanina
24
25
25
3.3.3.1. Corismato Mutasa/prefenato dehidratasa (CM-PDT) 26
3.3.3.2. Rendimiento máximo teórico de fenilalanina 27
3.3.3.3. Ejemplos en la producción de fenilalanina 27
3.3.3.4. Ejemplos de producción de aminoácidos aromáticos y sus
derivados 28
3.3.3.4.1. Triptofano e Índigo 28
3.3.3.4.2. Siquimato (SHIK) 29
3.3.3.4.3. 3-dehidrosiquimato (DHS) y derivados 29
4. JUSTIFICACIÓN 30
5. HIPOTESIS 31
6. OBJETIVOS 32
6.1. Objetivo general 32
6.2. Objetivo particular 32
7. MATERIALES Y METODOS 33
7.1. Plásmidos 33
7.2. Cepas 33
7.3. Construcción de las cepas de E. coli modificadas por ingeniería genética
e ingeniería de proteínas. 33
7.4. Medios de cultivo 34
7.5. Condiciones de cultivo 35
7.6. Métodos analíticos 35
7.6.1. Evaluación de los metabolitos excretados mediante HPLC 36
7.6.1.1. Determinación de Glucosa 36
7.6.1.2. Determinación de aminoácidos aromáticos 36
7.6.1.3. Determinación de Ácidos Orgánicos e intermediarios de la vía
de aromáticos.
7.6.1.3.1. Método Aromáticos Aminex
7.6.1.3.2. Método Acqua
8. RESULTADOS y DISCUSION
8.1. Sistema de células en reposo (Resting ceIls)
36
37
37
38
38
11
Índice
8.2. Evaluación de la máxima capacidad de síntesis de fenilalanina en la cepa
PB28 utilizando células en reposo. 39
8.2.1. Consumo de Glucosa 40
8.2.2. Acumulación de intermediarios 45
8.2.3. Producción de fenilalanina 46
8.2.4. Distribución de flujos metabólicos en el nodo de PEP 47
8.3. Evaluación de los metabolitos excretados mediante HPLC 51
8.4. Efecto de la alimentación de piruvato sobre el metabolismo central en la
cepa PB28 52
8.4.1. Consumo de Glucosa 52
8.4.2. Acumulación de intermediarios 53
8.4.3. Producción de L-fenilalanina 55
8.4.4. Distribución de flujos metabólicos en el nodo de PEP 56
8.5. Efecto de la presencia de los plásmidos en las cepas PB28, }M101 Y
PB12. 59
8.5.1. Consumo de glucosa en las cepas }M101, PB12 YPB28. 59
8.5.2. Consumo de glucosa en la cepa PB28 transformada con diferentes
plásmidos. 60
8.5.3. Replicación de plásmido durante un sistema de células en
reposo 62
9. CONCLUSIONES 64
10. PERSPECTIVAS 66
11. REFERENCIAS 67
12. ANEXOS 72
12.1. Anexo1. Nomenclatura 72
12.2. Anexo 2. Reacciones en las que participa el piruvato 75
111
------------- - - - -
Índice de figuras
II. ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Descripción Página
Compuestos que pueden obtenerse a partir del metabolismo central
y la vía de síntesis de compuestos aromáticos de E. eolio 3
Metabolismo central de E. eolio 6
Flujos metabólicos a nivel del nodo de fosfoenolpiruvato en E. eolio 7
Componentes del Sistema de Transportes Fosfotransferasa (PIS). 8
Comparación de la distribución de los flujos de carbono en el
metabolismo central, determinados por resonancia magnética
nuclear para las cepas ]Ml0l y PB12. 10
Compuestos que pueden generarse a partir del PEPo 12
Cantidad de DAHP acumulado en Mol DAHP/ g DCW utilizando
diferentes diferentes modificaciones en el met abolismo central. 13
Compuestos de importancia industrial derivados de la vía de
síntesis de aminoácidos aromá ticos. 15
Aminoácidos aromáticos. 16
Biosíntesis de aminoácidos aromáticos. 17
Vía del siquimato. 18
Regulación de la DAHP sintasa. 20
Biosíntesis de L-Fen 26
Densidad óptica a 600 nm de los cultivos de células en reposo. 39
Comparación entre el qci-. qPhe y YL-Fen/Glc para las cepas
16
PB28tktGevl y PB28tktGev2. 40
Gráfica representativa del consumo de glucosa en la cepa
PB28tktGev2. 41
17 Comparación entre la qcie de las cepas ]Ml0l, PB12 Y PB28
transformadas con los plásmidos pTrcppheAev2, p]LBaroGfbr y
18
19
20
pCLtkt
Cinética de producción de SHIK y DHS
Perfil de producción de L-Fenilalanina para la cepa PB28tktGev2.
Comparación entre la qL-Fen de las cepas ]Ml0l, PB12 Y PB28
transformadas con los plásmidos pTrcppheAev2, p]LBaroGfbr y
pCLtkt
41
45
46
47
IV
Índice de figuras
Figura
21
Descripción
Comparación entre el YLFen/Glc de las cepas JM101, PB12 Y PB28
transformadas con los plásmidos pTrcppheAev2, pJLBaroG fbr y
pCLtkt
Página
47
22 Distribución parcial de flujos de carbono a nivel del nodo de PEP
en la cepa PB28tktGev2, JM101tktGev2 y PB12tktGev2. 48
23 Comportamiento del TCA en anaerobiosis. La rama oxidativa se
muestra a la derecha y la rama reductiva a la izquierda. 50
~ ~~~~ ~
25 Gráfica representativa del perfil de consumo de glucosa y de
piruvato. 52
26 Consumo de glucosa y de piruvato para la cepa PB28tktGev2 en un
sistema de células en reposo suplementado con glucosa y piruvato 53
27 Gráfica representativa de la cinética de producción de a) DHS b)
SHIK y e) ácido acético en los cultivos de células en reposo
suplementados con glucosa y suplementados con glucosa y 54
piruvato.
28 qSHIK y qOHS en los cultivos de células en reposo suplementados con
glucosa y suplementados con glucosa y piruvato. 55
29 Gráfica representativa de la cinética de producción de L-Fen en los
cultivos de células en reposo suplementados con glucosa y
suplementados con glucosa y piruvato. 55
30 qL-Fen en los cultivos de células en reposo suplementados con
glucosa y suplementados con glucosa y piruvato. 56
31 YL-Fen/Glc en los experimentos con células en reposo suplementados
con glucosa y suplementados con glucosa y piruvato. 56
32 Distribución parcial de flujos de carbono alrededor del nodo de
33
34
35
PEP
Vías metabólicas en las cuales se puede prod ucir ATP.
Consumo de glucosa para las cepas JM101, PB12Y PB28.
Consumo de glucosa para la ' cepa PB28 transformada con
diferentes plásmidos.
57
58
59
61
v
Índice de figuras
Figura Descripción
36 . A) Cuantificación relativa mediante densitometría de la cantidad
de los plásmidos pTrc99A y pACYCl84 presente en un sistema de
células en reposo. B) Gráfica representativa de la cantidad relativa
de plásmido y la biomasa en un sistema de células en reposo.
Página
63
vi
Tabla
1
2
3
4
5
6
Índice de tablas
III. ÍNDICE DE TABLAS
Descripción Página
Actividades enzimáticas de las enzimas PykA y PykF Y crecimiento
de cepas de e. coli con diferentes fondos genéticos. 11
Reacciones de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en E. coli y 19
su regulación.
Cepas y plasmidos que se utilizarán en este proyecto de
investigación. 34
Estimación aproximada de la cantidad de ATP producida 45
Cepas originadas a partir de PB28 utilizando diversas
combinaciones de plásmidos 60
Consumo de glucosa para las diferentes versiones de PB28. 61
Vll
Resumen
1.RE5UMEN
La biosíntesis de los aminoácidos aromáticos, L-Tirosina, L-Triptofano y L-
Fenilalanina, en Escherichia coli es de gran interés por las aplicaciones de estos
compuestos en la industria. Algunas de las estrategias para mejorar la capacidad de
síntesis de aromáticos se basan en aumentar la disponibilidad de los precursores
(fosfoenolpiruvato y eritrosa-4-fosfato). El sistema de fosfotransferasa (PTS) y las
piruvato cinasas son las dos principales vías que consumen fosfoenolpiruvato por lo
que la inactivación de estas vías pudiera ocasionar un aumento en la producción de
aromáticos. En el trabajo de Báez Víveros (2004) se transformó una cepa que carece del
sistema PTS pero que puede transportar glucosa eficientemente (PB12, PTS-Glc+), con
plásmidos (pCLtkt, pJLBaroGJbr y pTrcpheAev2) que le permiten dirigir un mayor flujo
hacia aromáticos. Con esta cepa se pueden obtener rendimientos cercanos al 60% del
máximo teórico. En este trabajo se evaluó una cepa derivada de PB12, que tiene
inactivas las piruvato cinasas (PB28, PTS-Glc+, pykA-F-), y se transformó con los mismos
plásmidos que a PB12 (PB28jpCLtkt, pJLBaroGJbr y pTrcpheAev2, PB28tktGev2). Se
utilizaron cultivos de células en reposo suplementados con glucosa. La inactivación de
las piruvato cinasas podría ocasionar un aumento en la disponibilidad de
fosfoenolpiruvato que pudiera utilizarse en la producción de L-Fenilalanina. Sin
embargo, lo que se observó fue que en la cepa PB28tktGev2 hay un aumento en el
consumo de glucosa y un menor flujo de carbono hacia aromáticos con respecto a la
cepa PB12tktGev2. La cepa PB28 no tiene las dos principales vías de síntesis de
piruvato, por lo que se propone que se encuentra limitada en su capacidad de síntesis
de ATP. Esto ocasiona un aumento significativo en el flujo glucolítico, ya que la cepa
PB28 obtiene energía principalmente a través de la glucólisis. Además la falta de ATP y
precursores derivados del piruvato hacen que esta cepa dirija un menor flujo de
carbono hacia la síntesis de aromáticos. En un medio suplementado con glucosa y
piruvato, el consumo de glucosa para la cepa PB28tktGev2 disminuyó mientras que el
flujo hacia aromáticos aumentó al doble. Esto se debe a que la célula cuenta con los
precursores y el ATP que pueden sintetizarse a partir de piruvato. El consumo de
glucosa de la cepa PB28 sin transformar fue similar al de las cepas JMIOl y PB12, en un
sistema de células en reposo en M9 suplementado con glucosa. Cuando la cepa PB28 se
transforma con algún plásmido, el consumo de glucosa se incrementa debido a la carga
metabólica, ya que el plásmido se sigue replicando aún cuando se tenga un sistema de
células en reposo.
Introducción
2. INTRODUCCIÓN
Actualmente, un número importante de grupos de investigación en el mundo
dedican su esfuerzo al estudio de diversos aspectos de la fisiología microbiana, con el
propósito de aplicar el conocimiento generado al desarrollo de cepas de producción
capaces de sintetizar compuestos que previamente solo se podían obtener mediante
síntesis química. Estas nuevas cepas microbianas pueden constituir la base de nuevas
tecnologías biológicas para la producción sustentable de compuestos de interés
industrial. Sin embargo, muchas de estas cepas aún no alcanzan niveles de producción
cercanos al máximo teórico y no pueden competir económicamente con los procesos
tradicionales.
La ingeniería metabólica (1M) tiene como objetivo la modificación de las vías
metabólicas, de manera que se altere el perfil de productos que acumula un organismo.
Es un campo interdisciplinario que usa principios y técnicasde varias ciencias como la
genética, la bioquímica, la biología celular y molecular, la ingeniería bioquímica, etc. El
objetivo es redirigir los flujos metabólicos para incrementar la producción de
metabolitos que el organismo produce; lograr que el organismo sintetice nuevos
metabolitos; ampliar el rango de los sustratos que utiliza; mejorar las propiedades
celulares para facilitar algunos bioprocesos; etc. Hasta hace poco, esto se hacía de
modo empírico, por ensayo y error (rondas sucesivas de mutagénesis y rastreo o
selección de mutantes). El desarrollo de tecnologías de DNA recombinante ha
permitido el diseño y el desarrollo de microorganismos sobreproductores de
metabolitos de interés industrial. Esto se lleva a cabo realizando modificaciones
específicas en las vías metabólicas.
Hay muchos ejemplos reportados en la literatura sobre la aplicación de la 1M
para incrementar los rendimientos y productividades de diferentes procesos. Muchos
compuestos de interés industrial se derivan del metabolismo central de E. coli, como
son los aminoácidos aromáticos, productos de fermentación, ácidos orgánicos, etc.
Además con la introducción de genes heterólogos se pueden crear nuevas rutas de
síntesis para otros compuestos. (Figura 1).
2
Introducción
PTS PIR
.a····· as
-. :CATECOL ••-.
e•••••••••_
Ácido cís, cis
mucónico
....i...
•• ACIOO ••
~ AolpICO:
e. • •.......
. .. . .
-,~INOIGO:.......
Via d~ las pentosas
••
GLUCOSA - -.. Glucólisis
PEP 1
"••••• PEPyE4P. .f...·TeA -.~ PYR ,/
.... ....: I OA¡HP..... ...~....
•• - Lactato - ••
~.. :::~~~) °IQ......... -..... .... +
: Pirogalol:'-- Ácido gálico .-- O¡S. .
e•••••••
SHIK
I ••••••••........s. ~ ..a e.
: ••B.e.n:~~=i~:.~+---Pam~~~~nzoicollll /COrism~-. ~.~UINONAS••:¡ ~ .
........
~·~SPARTA,;É·. lIII L-Fen Tir Trp -. Indol............ *
.a.······.e.
a MI=I ANINA ~.. ~ -.~~..- ~-~ ~ ~ .~
Figura 1. Compuestos que pueden obtenerse a partir del metabolismo central y la vía de síntesis de
compuestos aromáticos de E. eolio El metabolismo central de E. coli comp rende una gran
variedad de reacciones. A par tir del metabolismo central se generan intermediarios, como el
fosfoenolpiruvato y el piru vato. Estos intermediarios pueden ut ilizarse como precursores de
compuestos de interés industrial, generánd olos a partir del metabolismo, con nuevas vías
metabólicas mediante la introducción de genes heterólogos o bien mediante sintesis enzimática o
química.
E. coli puede utilizarse para la producción de productos de ferm entación como
lactato, etanol, ácido acético, succinato, etc. de manera natural y en condiciones
anaeróbicas. Además, se han realizado manipulaciones genéticas con el fin de
aumentar la producción del compuesto de interés y disminuir la producción de
algunos subproductos. También se han manipulado las vías metabólicas para poder
producir mayoritariamente un producto que an teriormente solamente se sintetizaba
bajo condiciones específicas. Un ejemplo de esto es la producción de su ccinato en
condiciones aeróbicas (Lin el. al., 2005).
Los intermediarios y productos finales de la biosíntesis de aminoácidos
aromáticos tienen un gran interés, por sus propiedades y aplicaciones en la industr ia
farmacéutica, la cosmética y la alimenticia. Se han realizado considerables esfuerzos
enfocados a la construcción de microorganismos recombinantes sobreproductores de
3
Introducción
aminoácidos aromáticos. Estos metabolitos, así como los intermediarios de esta vía,
pueden utilizarse como precursores para sintetizar otros compuestos por métodos
químicos o producirlos utilizando una nueva ruta biosíntetica con la introducción de
genes heterólogos.
La fenilalanina puede ser química o enzimáticamente convertida al edulcorante
dietético aspartamo, el cual se usa ampliamente en el mercado mundial. Mediante la
aplicación de la 1M se ha modificado genéticamente el metabolismo central de E. coii,
empleando estrategias para mejorar la producción de fenilalanina a partir de glucosa.
La base de algunas de estas estrategias es aumentar la disponibilidad de los
precursores mediante la sobreexpresión de las enzimas que los producen o mediante la
eliminación de las vías que compiten por esos mismos.
La melanina es un compuesto de interés debido a su potencial para ser utilizada
en la industria química y farmacéutica. E. colí puede sintetizar melanina mediante la
introducción de los genes melA de Rhizobium etli, que codifican para una tiros inasa
(Lagunas, 2004).
Otro ejemplo de la aplicación de la 1M es la producción de índigo. Este
compuesto es un colorante que se usa para teñir la mezclilla. Se puede obtener a partir
de fuentes vegetales o mediante síntesis química. Se ha podido introducir genes con el
fin de producir índigo en cepas de E. coli sobreproductoras de algunos intermediarios
de su metabolismo central.
El metabolismo central se considera como una red, donde las enzimas y sus
reacciones se encuentran interrelacionadas, por lo que una alteración en una de ellas
puede ocasionar cambios en todo el metabolismo. Este trabajo se enfoca al estudio de
los efectos sobre el metabolismo central que causa la inactivación de las piruvato
cinasas en cepas de E. coli que carecen del sistema de fosfotransferasa (PTS).
4
Antecedentes
3. ANTECEDENTES
3.1. Metabolismo central
Entre las especies bacterianas comúnmente utilizadas en procesos biotecnológicos,
E. coli es el que mejor se conoce, ya que su metabolismo se ha estudiado y caracterizado
extensivamente.
En la figura 2 se muestra parte del metabolismo central de E. coli, el cual
comprende numerosas reacciones. El metabolismo central forma una red que está
constituida principalmente por el sistema de fosfotransferasa (PTS), las vías glucolíticas
(Vía de Embden-Meyerhof-Pamas, EMP), la vía de las pentosas fosfato (PP) y el ciclo de
los ácidos tricarboxílicos (TCA). El sistema PTS consta de varias proteínas que funcionan
corno una cadena de transportadores del grupo fosfato de alta energía del
fosfoenolpiruvato (PEP) hasta el azúcar a transportar en cuestión. En E. coli el sistema
PTS permite el transporte de glucosa, de manosa, de fructosa y de los polioles sorbitol
y manitol. La vía de EMP genera energía en forma de ATP, poder reductor (NADH) y
piruvato corno producto final. Este último puede irse hacia el TCA para generar más ATP,
más poder reductor y precursores corno el a.-cetoglutarato, succinilCoA y oxaloacetato.
En la vía de las pentosas fosfato se genera poder reductor en forma de NADPH y
precursores (Eritrosa 4-fosfato, E4P) necesarios para la biosíntesis.
5
Antecedentes
F6P
S7P
R5P
PTS
Glucosa
---------~ NADP NADPH
,-----~ \ 1f
GiP- - - - -- - - - - - --::---= -:_- --- -----.. 6-fosfogluconato
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I,
I
I
I I
l ~ -----
I
I
I
I,
I
~ -
OAHP sintasa
DAHP
1
DHQ
1
DHS
NAOPH -i
NAOP' ~
L-T ir
L-Fen
~ EPSP
1
CHA
r,
PPA L-Trp
// \ Corismato
.. mutasal
PPI ~~~~~:l~sa1 pheA
SHIK
ATP-i
AOP~
S3P
Succinil-CoA
- - - - -~ Inactiva durante
anaerobiosis
GlioxilatoMalato -<'11..------,
Fumarato
\
Succinato
Figura 2. Metabolismo central de E eolio
6
Antecedentes
En E. colí el flujo glucolítico lo controlan dos enzimas de la vía EMP: la
fosfofructodnasa y piruvato cinasa. Parte de este control depende de la demanda de ATP
(Koebmann et. al., 2002)
3.2. El nodo de Fosfoenolpiruvato (PEP)
El PEP es un intermediario clave dentro de varios procesos celulares y participa
en la síntesis de varios compuestos por lo que representa un nodo importante en el
metabolismo central. El flujo de carbono que llega a PEP puede dirigirse hacia la
síntesis de aminoácidos aromáticos a través de la enzima DAHP sintasa, aunque
normalmente solo un pequeño porcentaje del PEP producido se utiliza en la biosíntesis
de aromáticos. La enzima PEP carboxilasa (PPC) convierte el PEP a oxaloacetato en una
de las reacciones anapleróticas que sirven para suplir el TeA. La mayor parte del PEP
producido se dirige haciala formación de piruvato (PIR), principalmente a través del
sistema PTS yen menor proporción por las isoenzimas piruvato cinasas 'PYK).
En el trabajo de Holms (1996) se calcularon los flujos metabólicos en E. coli
(Figura 3) y se determinó que el principal consumidor del PEP es el sistema PTS. En
estudios recientes (Flores et. al., 2002) se ha demostrado que además del sistema PTS,
las isoenzimas piruvato cinasas consumen una cantidad importante del PEPo
Glucosa
PTS
Lipopolisacárido
Acido UDP-N-
acetilmurám ico
I
Y
Glucosa-e-P
Compuestos
aromáticos
Piruvato
víaPK
Figura 3. Flujos metabólicos a nivel del nodo de fosfoenolpiruvato (PEP) en E. eolio
7
Antecedentes
La disponibilidad del PEP es un factor limitante en la producción de ciertos
compuestos por lo que se han realizado numerosas estrategias para poder aumentar la
disponibilidad del PEP y poder dirigir el flujo hacia la producción de estos
compuestos. Una de estas estrategias es utilizar sistemas de transporte alternativos al
PIS (Yi et. al., 2003), usar azúcares no-PIS como la xilosa (Frost y Draths, 1995) o
utilizar cepas que carezcan del sistema PIS (Flores et. al., 1996, Gosset et. al., 1996).
Otra estrategia que se ha seguido es la inactivación de las enzimas que consumen PEP
como las dos isoenzimas piruvato cinasas (Gosset et. al., 1996) o la PEP carboxilasa
(Patnaiak y Liao, et. al. 1994). El piruvato (PIR) puede convertirse a P-SP mediante la
enzima PEP sin tasa (PPS), por lo que la sobreexpresión de esta enzima se ha estudiado
con el fin de aumentar la disponibilidad de PEP (Miller et. al., 1987)
3.2.1. Sistema de Transporte Fosfotransferasa (PTS)
En E. coli, el transporte de algunos azúcares como la glucosa, depende de un
sistema constituido por varias proteínas denominado sistema de fosfotransferasa (PIS)
(Postma et. al. 1987). Es un sistema complejo que consta de proteínas que funcionan
como una cadena de transportadores del grupo fosfato de alta energía del PEP hasta el
azúcar a transportar (Figura 4)
PEPX
PIR
El XP-HPr X IIAGlc P IIBG1c
P-EI HPr P-IIAGlc~
Citoplasma
Figura 4. Componentes del Sistema de Transportes Fosfotransferasa (PTS).
Periplasma
Las dos primeras proteínas son comunes a los diversos sustratos a transportar,
se localizan en el citoplasma y se conocen como Enzima 1 (El) Y HPr (esta última es
una pequeña proteína termoestable, rica en histidina). El otro componente, llamado
Enzima JI (EJI) es específico para cada azúcar. La enzima JI específica para glucosa
8
Antecedentes
consta de tres subunidades. El dominio soluble se denomina IIAGIc (codificado por el
gen crr) y dos dominios unidos a la membrana (IICBGIc" codificados por el gen ptsG).
En la glucólisis, por cada molécula de glucosa que se internaliza en la célula, se
generan dos moléculas de PEPo Una de esas moléculas de PEP se consume por el
sistema PTS en el transporte de la siguiente molécula de glucosa que entra.
El control fino y complejo que el sistema ejerce sobre el consumo de mezclas de
azúcares y su dependencia de PEP para transportar azúcares, constituyen una
desventaja para algunos procesos ya que representa un factor limitante en la
producción de compuestos que se deriven parcial o totalmente del PEP, entre ellos los
llamados aromáticos.
Considerando esta situación, en trabajos previos (Flores et. al. 1996), nuestro
grupo decidió emplear la ingeniería metabólica para desarrollar cepas de E. coli que
carecieran del sistema PTS, pero que tuvieran la capacidad de transportar glucosa
eficientemente. Con este propósito se generó la cepa PBll por deleción del sistema PTS
(L'1PTS) a partir una cepa de E. coli (JM101). Esta cepa tiene una capacidad mu y limitada
para crecer utilizando glucosa como fuente de carbono (fenotipo PTS-GIc-). A partir de
esta mutante y por medio de cultivos en quimiostato con glucosa como única fuente de
carbono, se aislaron cepas que son capaces de crecer en glucosa (PTS-Glc+) . Estas
mutantes se denominaron PB12 y PB13 Y utilizan el sistema GalP para transportar
glucosa y la enzima glucocinasa para fosforilarla (Flores, et al 1996; Flores et al. 2002).
3.2.1.1. Distribución de flujos de carbono en la cepa PB12
Como parte de la caracterización a nivel metabólico de estas cepas, se ha
empleado la técnica de resonancia magnética nuclear (RMN) para caracterizar la
distribución de flujos de carbono relativos (referidos como porcentajes molares de
consumo de glucosa). En la figura 5 se muestran los flujos de carbono relativos de la
cepa progenitora JM101 y de la cepa PB12, en cultivos en medio mínimo.
9
----------------------~-- --
Antecedentes
G!C
(f/l6) lOO
Zwf NMlPHG1P -22.'3 .ti¡ 6RG
Psi 7&.ti -x: ttMlPU
FIP~R5/)GG_nndd
Tkt lIrl, T.1
G PE4P
<!lI" I 17$ I U JI A JI
" ~ ./ ."'"'"
~
P1P ~kPyltA.F
PT 100 40.1 7.7 Me>:
PYR"- - - -- l'llllll'tl
I __~/ ¡fl3.2NllDH l· ...
Ferm ACoA p~ • eo, ~ _1
61.2 _ .• • I.~U 2 lO
CIT~OAA~!1.ÁL
• • • • 38.2
JM101
G~C
(5.5) 1'00 ZwI NADl'H
G1P ¿'6PG
Psi 93.1 5.3 /C. HADI'H
F~PY:R5/)áánn~d
1 TI<I Tld, TBI
G~P . E4PGap 1?}- I 2.0. MA
P P"--:l
~ P-/4A)' I
r.", 128.6 I M~zPYR- - r - - - 1 ";)~ffi
/
• ca,_ 11'u '''llD'' I
Ferm ACoA Ppe : • ca,-1
4e _ •. • 1_~2 I I '3.7
CIT~ÚM~MÁL
, 1 '32.::1
PB12
Figura 5. Comparación de la distribución de los flujos de carbono en el metabolismo central,
determinados por resonancia magnética nuclear para las cepas JMI01 y PB12. Los flujos de
carbono relativos se encuentran referidos como porcentajes molares de consumo de glucosa.
Comparado con lo observado en la cepa JM101, existe una disminución
importante en la PB12 del flujo de carbono hacia el brazo oxidativo de la vía de las
pentosas. En la cepa JM101, el sistema PTS es el mayor consumidor de PEP (100%). En
la cepa PB12 son las piruvato cinasas las que consumen la mayor cantidad de PEP
(128.6%), por lo que su inactivación pudiera dar lugar a un incremento en la
disponibilidad de este precursor que podría ser canalizado hacia la producción de
aminoácidos aromáticos. El flujo de carbono metabolizado por la enzima Pck es
prácticamente cero en la cepa PB12, contrario a lo observado en la cepa JM101 (7.7%),
mientras que el flujo de carbono de la enzima málica hacia piruvato es de un 4% en la
PB12 Y 0% en la JM101 (Flores, et al 2002).
3.2.2. Isoenzimas Piruvato Cinasas
El piruvato es un intermediario clave en las reacciones catabólicas y
biosintéticas. Cuando E. coli crece en glucosa como única fuente de carbono, sintetiza
piruvato a través del sistema PTS. Otro mecanismo para sintetizar piruvato es
mediante las piruvato cínasas. E. coli posee dos isoenzimas piruvato cinasas (PYK,
codificadas por los genes pykA y pykF) que catalizan la conversión de PEP y ADP a
piruvato y ATP. Esta reacción es el último paso de la vía glucolítica y es irreversible
en condiciones fisiológicas. Junto con la fosfofructocinasa, estas enzimas juegan un rol
importante en la regulación del flujo glucolítico.
10
Antecedentes
En una cepa silvestre, la actividad de la enzima PYKF es 15 veces más alta que
la isoenzima PYKA. Cuando una de ellas se inactiva, la actividad enzimática de la otra
isoenzima se incrementa ligeramente (Tabla 1). La ausencia de una de las isoenzimas
causa una ligera disminución en su crecimiento. Sin embargo la doble mutante tiene
una disminución de su crecimiento del 28% con respecto a la cepa silvestre (Tabla 1).
La doble mutante también presenta una mayor actividad en la vía de las PP. Por
ensayos radiorespirométricos y medición de actividades enzimáticas, se concluyó que
la glucosa se metaboliza principalmente a través de la vía de las PP (Ponce et. al. 1995;
Ponce et. al. 1998).
En un fondo PTS- Clc" la inactivación de los genes pykA y pykF tiene
consecuencias más drásticas. En el trabajo de Ponce y colaboradores (1995) se
construyeron mutantes a partir de la cepa PB12 (PTS- Clc -) que tuvieran inactivados
una o ambas de las isoenzimas piruvato cinasas. En la tabla '1 se muestran losdatos de
crecimiento y actividades específicas para la cepa silvestre y las mutantes estudiadas.
En cuanto a crecimiento, la mutante en pykA no muestra un cambio significativo con
respecto a la cepa PB12, la mutante en pykF muestra un aumento en su tiempo de
duplicación del 33% y la mutante pykA-F- es incapaz de crecer en glucosa como única
fuente de carbono. La cepa PB12 tiene una disminución en la actividad enzimática de
PYKA. La actividad de PYKF en la mutante PTS- Clc ' PYkA- permanece igual, mientras
que la actividad de PYKA en la mutante PTS- Clc' pykF- se incrementa en un 13%
(Ponce et. al., 1995).
Tabla 1. Actividades enzimáticas de las enzimas PykA y PykF Y crecimiento de cepas de E. coli con
diferentes fondos genéticos.
Cepa lo Acl. Especifica (IUjmg proleína
(Descripción) (min) PykA PykF
JMI01 (cepa silvestre) 58.8 0.42 0.026
PB22 OMI01, inactivada en pykA) 69.3 0.50 ND
PB24 OMI01, inactivada en pykF) 69.4 ND 0.029
PB25 OMlOl, inactivada en pykA y pykF) 82.2 ND ND
PB12 (mutante derivada de JMIOl, PT5- Glc+) 106.4 0.25 0.037
PB26 (PB12, inaclivada en pykA) 98.5 0.25 ND
PB27 (PBI2, inactivada en pykF) 141.0 ND 0.042
PB28 (PBI2, inactivada en pykAy pykF) ND ND
11
Antecedentes
Con esto se puede ver que tanto en una cepa silvestre como en una cepa con el
fenotipo PTS- Clct la inactivación de una de las isoenzimas piruvato cinasas no causa
un efecto tan marcado como el causado por una doble inactivación. En las mutantes
sencillas la actividad de una de las isoenzimas compensa la que se inactivó. Sin
embargo la doble inactivación de las isoenzimas piruvato cinasas causa un efecto más
notorio. Este efecto es mayor en una cepa PTS' Clct pykA- pykF- ya que pierde las dos
principales vías de síntesis de piruvato y por lo tanto es incapaz de crecer en glucosa
como única fuente de carbono.
3.2.3. Producción de compuestos de interés industrial utilizando cepas con
modificaciones en el metabolismo central.
El PEP participa en algunas vías metabólicas como precursor de varios
compuestos. (Figura 6). Es por eso que al aumentar la disponibilidad del PEP se puede
dirigir un mayor flujo de carbono hacia alguna de estas rutas y obtener mayores
rendimientos.
GLUCOSA
1 - - - - - - - - - - - - @_ . uca"
I I e
I
I PTS
I
I
I
I
~Fenilalanina ""
Tirosina
Triptofano
DAHP ..
DAHP
Sintasa
eroc,
aroF.
aroH
•
- - --,
I
I
o
I
I
I
I
I
T
Ac. Láctico
Piruvato' , , formato
liasa " ,
f)fl '4 .
Ac. Fórmico
"'Intermediarios del TeA
(fumarato, malato , succinato , etc.)
Figura 6. Compuestos que pueden generarse a partir del PEPo
Se han utilizado mutantes en ptsG para evaluar la producción de compuestos
derivados del PEP como el succinato. Una cepa pfl-ldh: (que tiene inactivadas la enzima
piruvato formato liasa y la enzima lactato deshigrogenasa) con una mutaci ón en el
sistema de fosfotransferasa (ptsG) tuvo un rendimiento mayor de succinato en E. coli
12
- - - ---- --- - - - - - - - - - ---- - -- _. -
Antecedentes
(Chaterjee et. al., 2001). A partir de la cepa NZNll (Pfl-ldh-) se generó una mutante que
recupera su capacidad de crecer fermentativamente en glucosa. La mutación que se
generó se localiza en el gen ptsG , el cual codifica para una proteína del sistema PT5
llamada EIICBGIc que es específica para glucosa. Esta cepa cambia la distribución de
sus productos de fermentación, obteniendo aproximadamente un mol de succinato por
mol de glucosa.
Como parte de la caracterización fisiológica de las cepas con el fenotipo PT5-
GIc+, se demostró que poseen el potencial para la síntesis de compuestos aromáticos
con un alto rendimiento a partir de glucosa (Gosset, et al. 1996; Flores, et al. 1996; Báez
et al., 2001;Báez-Viveros et. al., 2004).
El trabajo de Gosset y colaboradores (1996) comparó la producci ón de los
aromáticos en un medio rico, utilizando diferentes modificaciones sobre el
metabolismo central como el sistema PT5 y las isoenzimas piruvato cinasas. En la
figura 7 se muestra la comparación entre las diferentes estrategias utilizadas.
Las barras representan rnMol DAHP/g DCW
Figura 7. Cantidad de DAHP acumulado en rnMol DAHP/g DCW utilizando diferentes modificaciones
en el metabolismo central.
13
Antecedentes
En este trabajo se evaluaron diferentes estrategias para incrementar el flujo
hacia aminoácidos aromáticos, midiendo la cantidad de DAHP que las cepas excretan.
En una cepa silvestre la inactivación de los genes pykA y pykF incrementaron el flujo de
carbono hacia aromáticos 3.4 veces. La sobreexpresión del gen pps generó un
incremento similar. Una cepa PIS- Glc" incrementa el flujo hacia aromáticos 1.6 veces
más que la cepa silvestre. La inactivación de los genes pykA y pykF incrementó 5.8
veces el flujo hacia aromáticos. En esta cepa, la sobreexpresión del gen tktA incrementó
el flujo hacia aromáticos 19.9 veces .
3.3. Aminoácidos Aromáticos y sus derivados.
Los aminoácidos aromáticos L-fenilalanina (L-Fen), L-tirosina (L-Tir), L-
triptofano (L-Trp) y sus derivados son compuestos de importancia económica por su
uso en la industria alimenticia como aditivos, saborizantes y aromatizantes. También
se utilizan como precursores en la síntesis de fármacos y en la producción de
cosméticos. (Bongaerts et. al., 2001) .
El triptofano tiene un uso importante en la industria alimenticia principalmente
como aditivo. La fenilalanina se utiliza principalmente como precursor del edulcorante
artificial (aspartame), aunque también se utiliza como aditivo en alimentos y
saborizante. La tirosina se produce en una pequeña escala y tiene un uso importante
en la producción de L- DOPA que es una droga que se utiliza en el tratamiento de la
enfermedad de Parkinson. La tirosina también se utiliza como tratamiento para la
enfermedad de Basedow y como suplemento alimenticio (Bongaerts et. al., 2001).
Los aminoácidos aromáticos pueden sintetizarse a través métodos químicos,
usando compuestos derivados del petróleo como materia prima . Entre algunos de los
inconvenientes de la síntesis química esta la generación de contaminación y que la
síntesis química genera mezclas racémicas de las formas L y D, por lo que es necesario
un proceso de purificación. Estos productos de interés comercial también pueden
sintetizarse utilizando microorganismos.
Existen numerosos microorganismos que tienen el potencial de sobreproducir
aminoácidos aromáticos. Algunos de estos microorganismos son Corinebaeterium
glutamieum y Eseheriehia eolio . En la vía de síntesis de los aminoácidos aromáticos (o vía
del siquimato) también se generan intermediarios que también son de interés
industrial (Figura 8).
14
----------------------~ --- -- -
Antecedentes
Glic6lisis Penlosas
.. k~:bsi;a O¡O ~aPCA -:¡Ze/:alelCO~a~
neumoniae neumoniae neumoniae Acinobacter
OHS calcoaceticus
~
I
i tktA
... E coli
Pirogalol
Ácido
aroE °rp 02~;IiCO
Ecoli ~ /
...
PEP E4P
1 1
Hidroquinona
L..----S-ín-te-s...Ji s~ Ácido
QUím¡ca/ Ouinico
,.-------,
Benzoquinona
SíntesisQuímica
SHIK
~
Ácido Cis,
cis muc6nico
Ácido
Adípico
S3P
~
E coli PPI
~
pheA
Ácido
Benzóico
EPSP
~~
/C¡O
~ PPA ----. PPI
Indol éJ
IL·T",I~ I ;~:"d_",' L·T;, -1 L-DOPA1
... putlda
melA
Ilndigo I R. melilioti t
/
IAspartameI
Figura 8. Compuestos de importancia industrial derivados de la vía de síntesis de aminoácidos
aromáticos.
Aparte de los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptofano)
algunos de los compuestos de interés industrial que se han sintetizado utilizando
microorganismos modificados son intermediarios de la vía de síntesis de aminoácidos
aromáticos, como el 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato (DAHP) (Patnaiak y
Liao, 1994; Gosset el . al. 1992; Baez el. al. 2001), 3-dehidroquinato (DHQ) (Draths el al.,
15
Antecedentes
1992; Ran et. al., 2001), 3-deshidrosiquimato (DHS) (U, et. al., 1999; Yi et. al., 1991) y
siquimato (SHIK) (Chandran, et. al., 2003). Además, utilizando a estos intermediarios
como precursores se ha podido sintetizar otroscompuestos como melanina (Della-
Cioppa, et. al.,1990), índigo (Murdock et. al., 1993; Berry et. al., 1992), catecol (Draths y
Frost, 1991), vainillina (Kí, el. al., 1998), ácido adípico, L-Dopa, aspartamo (Murata et.
al. 1993), ácido paraminobenzóico (Kaplan et. al., 1983; Goncharoff et. al.,1984; Green
et.al.,1992), etc.
3.3.1 Biosíntesis de Aminoácidos Aromáticos
Las plantas y los microorganismos poseen la maquinaria necesaria para
convertir los carbohidratos simples, como la glucosa, en aminoácidos como glutamato,
lisina, glutamina, arginina, y aminoácidos aromáticos. Los aminoácidos aromáticos se
muestran en la figura 9. Cada uno de estos aminoácidos contiene nueve átomos de
carbono, si se toma en cuenta el anillo aromático. Dos moléculas de fosfoenolpiruvato y
una molécula de eritrosa 4-fosfato aportan estos átomos de carbono, perdiendo un
átomo de carbono en forma de COz.
L-Fen
NlI •, )
-ooc__~
9
1»1
L-Tyr
L-Trp
Figura 9. Aminoácidos aromáticos.
La vía de síntesis de compuestos aromáticos es una fuente de metabolitos
esenciales, así como de un gran número de los llamados metabolitos secundarios en
bacterias y plantas.
En la figura 10 se muestra un esquema de la biosíntesis de aminoácidos
aromáticos y su regulación en E. eolio La biosíntesis de aminoácidos aromáticos
comprende una vía común denominada vía del siquimato y tres vías específicas para
16
Antecedentes
cada aminoácido. Como se puede observar, esta ruta biosintética está altamente
regulada de forma alostérica y transcripcional.
Triptofano
sintasa
trpB
Triptofano
sintasa
trpA
IND
L-Ser ~I
GA3P~
L-Trp
I
I
I
I
I
J
ANTA
PRPP:{ ANTA PRPP
transferasa
PPi trpD
PRAA
1 FosforibosilAntranilato
CDRP Isomerasal
Indol
1 glicerolfosfatoCO sintetasatrpC
13GP
1
tyrB,
aspC
ilvE
ANTA sintasa
trpE
L-Glu
PIR
L-GI
Corismato
Mutasal
Prefenato
Dehidratasa
pheA
Corismato
Mutasal
! Prefenato
i Dehidrogenasa PPA
! tyrA ~J~:¡----------. H20T) H20
:i f cO2
:i HPP PPI L-Glu
I ¡L-GIU~ Amino- ~
: : tyrB, transferasas
:¡aKG aspC uKG
:¡ L-Tir L-Fen
:1 ¡ : : ::
L :_-: ~~~~~~~~=-~-_~ j¡ J
PEP E4P
DAHP sintasa~
aroG, aroK, aroH
.. .. .. Pi
r-- ---------- - -----~ I I
¡ --------------~~~~~.\.~~~~---------------- ---------------- - --- - ------- -- --
DHQ
DHQ dehidratasa l
aroD ~H20
SHIK D]: NADPH
r _.. dehidrogEenasa NADP
. aro1_._ ._ ._._ ._ ._ .- SHIK
SHIK quinasa 11111 1 ~TP
aroK'lroL y
, , S3P
EPSP sintasa I FjEP
aroA y
EPSP
CHO sintasa l
aroC ~'\lPi
CHo------'
11
Control alostérico y transcripcional
Control transcripcional
Control alostérico
Figura 10. Biosíntesis de aminoácidos aromáticos. Las abreviaciones usadas son: ANTA, antranilato;
aKG, a-cetoglutarato; CDRP, 1-(o-carboxifenilamino)-1-deoxiribulosa-5-fosfato; CHO, corisma to;
DAHP, 3-deoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato; DHQ, 3-dehidroquinato; DHS, 3-
dehidrosiquimato; EPSP, 5enolpiruvatosiquimato 3-fosfato; E4P, eritrosa 4-fosfato; GA3P,
gliceraldehido 3-fosfato; HPP, 4-hidroxifenilpiruvato; I3GP, indol 3-glicerol-fosfato; IND, indol;
L-Gln, L-glutamina; L-Glu, L-Glutamato; L-Fen, L- fenilalanina; L-Ser, L-serina. L-Trp, L-
triptofano; L-Tir, L-tirosina; PEP, fosfoenolpiruvato; PPA, prefenato; PPI, fenilpiruvato; PRAA,
fosforibosil antranilato; PRPP, 5-fosforibosil-a -pirofosfato; PIR, piruvato; SHIK, siquimato; S3P,
siquimato 3-fosfato.
17
Antecedentes
3.3.2. Vía del siquimato
La biosíntesis de los aminoácidos aromáticos comprende una vía común (Vía
del siquimato) que comienza con la condensación de E4P y PEP para formar DAHP, y
. tras siete reacciones enzimáticas llega a la formación de corismato (Figura 11). A partir
de éste se generan las vías de síntesis de fenilalanina, tirosina y triptofano, así como la
de otros compuestos aromáticos como la ubiquinona, menaquinona, ácido fólico,
vitaminas aromáticas, etc.
i
tI!
SHIK
e
DHS &ll
DHQDAHP
,~~~. 'i:~~,
I! ~ E4P PEP 1I
~'
(\
111 - 011
ll-.tr-úll
1 2
HO-J:-H
I
=0
I
ceo.
CHO
Figura 11. Vía del Siquimato.
18
Antecedentes
Esta vía se encuentra altamente regulada de manera transcripcional y alostérica.
La regulación transcripcional de la biosínte sis de aminoácidos aromáticos, así como su
transporte se encuentra mediada por tyrR (Wallace et. al., 1969; Camakaris et. al., 1973)
y trpR (Cohen et. al., 1959). Además de la regulación en el nivel de expresión, existe una
inhibición alostérica en el primer paso de la vía común, llevado a cabo por la enzima
DAHP sintasa, así como en las enzimas corismato mutasaj prefenato dehidrogenasa,
corismato mutasajprefenato dehidrogenasa y la antranilato sintasa. E.1 la tabla 2 se
muestran las reacciones así como la regulación de la vía común de aminoácidos
aromáticos y de la vía de síntesis de fenilalanina.
Tabla 2. Reacciones de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en E. coli y su regulación.
Número de Enzima Gene Regulación Producto
reacción sintetizado
(Figura 11)
3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato aroF, tyrR/trpR, DAHP
1 (DAHP) sintasa aroG, L-Tir, L-Fen,
aroH L-Trp
2 3-deshidroquinato (DHQ) sintasa aroB DHQ
3 3-dehidroquinato (DHS) dehidratasa araD DHS
4 3-dehidrosiquimato (DHS) deshidrogenasa aroE SHlK SHlK
5 Siquimato cinasa l/III arol; tyrR, trpR S3P
aroK
-
6 5-enolpiruvatosiquimato-3-fosfato (EPSP) sintasa aroA EPSP
7 Corismato (CHO) sintasa aroC CHO
Corismato mutasaf prefenato deh idratasa pheA tyrR,L-Fen PPAyPPY
Amino transferasas tyrB, Fen
aspC,
ilvE
3.3.2.1. 3-Desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato Sintasa
El primer paso enzimático de la vía de aminoácidos aromáticos consiste en la
condensación de E4P y PEP para formar DAHP y fosfato . Esta reacción la lleva a cabo
la enzima DAHP sintasa. E. coli posee tres isoenzimas DAHP sintasas codificadas por
los genes aroF, aroG y aroH. Estas enzimas se controlan a nivel transcripcional y
alostérico por cada uno de los aminoácidos aromáticos: tirosina (aroF) , fenilalanina
19
aroF
aroG
Antecedentes
(aroG) y triptofano (aroH) (Pittard, et. al., 1996). En la figura ]~ se muestra la
regulación de la DAHP sintasa.
n-
o~ 0-0" /'__0,
PEP 11
o
aroH ..·················································· :
~ :I o- 'p/
(\
H---<:-OH
I
HI-oH
HO---<:-H
I
c=o
I
coo-
DAHP.... .
L-Fen
... . I •. llH)
-ooc--!/
OH
- . +
--- < ; - . -- ~'--("'''
&),
o-L
L-Trp
LT
' ··· ··L:::::::::::::::::::.~:; : ~~~~~~;~~;~:~iCO y
Figura 12. Regulación de la DAHP sintasa. E. coli posee tres isoenzimas DAHP sintasas (araF, aroG y
aroH). Estas enzimas están controladas a nivel transcripcional y alostérico por producto final
(tirosín a, fenila lanina y triptofano) .
En una cepa silvestre de E. coli la enzima cod ificada por el gen aroG contribu ye
un 80% a la actividad total de la enzima DAHP sintasa (Tribe et. al., 1976).
20
Antecedentes
3.3.2.2. Estrategias que se han seguido en E. coli para la producción de aminoácidos
aromáticos.
La biosíntesis de los aminoácidos aromáticos puede modificarse para producir
una gran cantidad de estructuras aromáticas, que pueden utilizarse en la síntesis de
compuestos industriales y medicinales, a partir de fuentes de carbono baratas y que no
son tóxicas. Sin embargo, todos estos cambios pueden afectar el rendimiento, la
velocidad de conversión producto/sustrato o la pureza del compuesto que se busca
sintetizar.
Para obtener cepas productoras de compuestos aromáticos, un alto porcentaje
de la glucosa consumida debe ser dirigida hacia la síntesis de DAHP. Finalmente el
flujo de carbono debe dirigirse hacia la síntesis particular de cada uno de los
aminoácidos aromáticos.
La sobreexpresión de la DAHP sintasa es solo uno de los elementos necesarios
para incrementar el flujo de carbono hacia la vía común de aminoácidos aromáticos.
Un factor crítico es el control alostérico que existe sobre algunas enzimas de la vía de
aromáticos, por lo que el uso de de DAHP sintasas insensibles a inhibición alostérica
es una de las principales estrategias qu e se ha seguido para la síntesis microbiológicade forma comercial de algunos productos corno la L-Fen y L-Trp.
La disponibilidad de los precursores (E4P y PEP) también es un factor
importante que limita la actividad de la DAHP sintasa in vivo .
3.3.2.2.1. Incremento en la disponibilidad de eritrosa-4-fosfato (E4P)
La E4P es uno de los precursores de loas aminoácidos aromáticos, la
disponibilidad de éste es un aspecto que se ha tratado de incrementar para obtener
mejores rendimientos de aminoácidos aromáticos o de algún intermediario de la vía de
síntesis.
3.3.2.2.1.1. Sobreexpresión de las enzimas trancetolasa (TKT) y transaldolasa (TAL)
La E4P es uno de los precursores de los aminoácidos aromáticos. Este
compuesto se produce en la parte no oxidativa de la vía de las pentosas fosfato. Las
enzimas transcetolasa y transaldolasa catalizan las reacciones que llevan de fructosa-6-
21
Antecedentes
fosfato a gliceraldehído-3- fosfato y E4P. El incremento en la disponibilidad de E4P se
ha estudiado cuando los niveles de expresión de la transcetolasa o la transaldolasa son
mayores.
Se ha demostrado que la sobreexpresión de la transcetolasa incrementa el flujo
de carbono hacia la vía de aromáticos (Draths et. al, 1992). El impacto de la
transaldolasa sobre el flujo hacia aromáticos se ha analizado y se ha demostrado que
incrementa el flujo hacia aromáticos significativamente (Lu ei. al., 1997) .
3.3.2.2.1.1. Inactivación de la enzima fosfoglucosa isomerasa (PGI)
La deleción del gen pgi altera el metabolismo de glucosa de tal manera que la
conversión de glucosa a triptofano aumenta en una cepa modificada genéticamente
para la producción de aromáticos (Mascareñas, 1991). El aumento del flujo hacia la vía
de las pentosas genera un incremento en la disponibilidad de precursores necesarios
para la biosíntesis de aromáticos:
3.3.2.2.2. Incremento en la disponibilidad de fosfoenolpiruvato (PEP)
El PEP es un intermediario que se encuentra involucrado en numerosos
procesos celulares (Valle et. al., 1996). El sistema PTS es el principal consumidor de
PEPo Otras enzimas que utilizan PEP son las enzimas fosfoenolpiruvato carboxilasa
(PPC), las piruvato cinasas (PYKA y PYKF) Y la DAHP sintasa. Además de la
glucólisis, hay otras vías que generan PEPo Las enzimas que participan en la formación
de PEP son la PEP sintasa (PPS) y la PEP carboxiquinasa (PCK). Esta última actúa en
condiciones gluconeogénicas. Dado que el PEP es precursor de los aminoácidos
aromáticos, el aumento en la disponibilidad de PEP podría ocasionar un aumento en
la síntesis de aminoácidos aromáticos. Algunas estrategias que se han seguido para
aumentar la disponibilidad de PEP es inactivar las reacciones que lo consumen (PPC,
PYKA, PYKF, PTS) o aumentar la formación de PEP, sobreexpresando las enzimas que
lo producen (PPS).
22
Antecedentes
3.3.2.2.2.1 Inactivación de la enzima PEP carboxilasa (PPC)
La enzima PPC cataliza la conversión de PEP a oxaloacetato. La inactivación de
esta enzima aumentó la producción de fenilalanina en una cepa de E. coli aunque
también se incrementó la producción de acetato y piruvato. Además de eso, la cepa
ppc- genera menos biomasa y requiere de la adición de otro sustrato para crecer (Miller
et.al., 1987). En una cepa productora de DAHP, la inactivación del gen ppc no aumentó
la producción de DAHP (Patnaiak y Liao et.al., 1994).
3.3.2.2.2.2. Inactivación de las isoenzimas piruvato cinasas (PYKA, PYKF)
Las isoenzimas piruvato cinasas catalizan la reacción que convierte el PEP en
piruvato. La inactivación de estas enzimas se evaluó en base a la capacidad de
producción de DAHP en medio LB (Gosset et. al., 1996). La inactivación de pykA o de
pykFno aumentó significativamente el flujo hacia aromáticos. La inactivación de ambas
isoenzimas en combinación con otras estrategias (uso de una cepa PTS-GIc+ y la
sobreexpresión de tktA) incrementó 19.9 veces el flujo de carbono hacia la biosíntesis de
aromáticos.
3.3.2.2.2.3. Sobreexpresión del gen pps
Una de las estrategias que se ha seguido para aumentar la disponibilidad de
PEP es sobreexpresar el gen pps. Este gen codifica para la enzima PEP sintasa que
cataliza la conversión de piruvato a PEPo En condiciones normales, E. coli no lleva a
cabo esa reacción debido al costo energético que tiene. La sobreexpresión del gen pps
tuvo un efecto positivo sobre la producción de DAHP en un cepa en donde también se
sobreexpresaba tktA y un gen que codifica para una DAHP sintasa insensible a
retroinhibición (Patnaiak et. al.,1994).
3.3.2.2.2.4. Inactivación del sistema PTS
Una cepa que no utilice el sistema PTS para transportar glucosa tendría, en
teoría, dos moles de PEP disponibles por cada mol de glucosa que entre. Esta cepa
23
Antecedentes
tendría el potencial de dirigir un mayor flujo de carbono hacia la biosíntesis de
aminoácidos aromáticos.
En varios trabajos se ha evaluado el aumento en la disponibilidad de PEP
cuando se utilizan cepas con alguna modificación en el sistema PIS, ya sea una
deleción de algún gen, la inactivación total del sistema PIS y la sustitución del sistema
PIS por otro mecanismo de transporte de glucosa (Báez et. al., 2001; Chen et. al., 1997;
Chandran et. al., 2003; Gosset et. al., 1996; Yi et. al., 2003).
La cepa PB12 (mutante generada a partir de una cepa PIS-) puede dirigir un
flujo mayor de carbono hacia la biosíntesis de aminoácidos aromáticos (Gosset et. al.,
1996; Flores et. al., 1996). Recientemente se inició un proyecto para desarrollar cepas
PIS-Glc+de E. coli con la capacidad de sintetizar fenilalanina con un alto rendimiento a
partir de glucosa (Baez-Viveros et. al., 2004) utilizando también técnicas de evolución
dirigida de proteínas.
3.3.2.2.2.5. Utilización de azúcares no PTS
El sistema PIS es uno de los principales consumidores de PEP y por lo tanto es
una desventaja para la producción de aminoácidos aromáticos. Además el piruvato
producido por el PIS no puede convertirse en PEP debido a que la enzima que lleva a
cabo esta reaccion (PPS) no se induce en presencia de glucosa. Utilizando azúcares no-
PIS como la xilosa se puede aumentar el flujo hacia aromáticos (Frost, et.al., 1995;
Patnaiak, 1995). La producción de DAHP utilizando xilosa como sustrato alcanza el
rendimiento máximo teórico (0.71 mol/mol) en cepas de E. coli que sobreexpresan la
DAHP sintasa.
3.3.2.2.3. Eliminación de la inhibición por retroalimentación
En cepas productoras de aromáticos, la actividad de la DAHP sintasa se reduce
considerablemente como resultado de control por retroalimentación de los productos
finales. La regulación a nivel transcripcional se puede eliminar colocando los genes
regulados bajo promotores que no se regulen por TrpR/TIR o por deleción de los
reguladores (LaDuca et. al; 1999; Berry, 1996). La inhibición alostérica se puede
eliminar utilizando mutantes resistentes a inhibición. Algunas de estas DAHP sintasas
24
Antecedentes
mutantes han sido caracterizadas y utilizadas para la producción de aminoácidos
aromáticos.
También se han seleccionado mutantes de la enzima CM-PDT que son
resistentes a inhibición por L-Fen. La modificación de Trp226 y Trp338 dan como
resultado mutantes resistentes a inhibición por L-Fen (Gething el. al., 1976), así como
las sustituciones en la Serina 330 o la eliminación de los residuos de aminoácidos
localizados después de este residuo (Tonouchi el. al., 1997). Las mutaciones en los
codones 304 al 310 del gen phe/: exhiben una completa resistencia a inhibición por
retroalimentación, incluso en presencia de altas concentraciones de L-Fen (Nelms el. al.,
1992). Algunas de estas versiones del gen pheAJbT (resistentes a inhibición por
retroalimentación) se han utilizado para evaluar la producción de aminoácidos
aromáticos.
3.3.2.2.4. Evolución dirigida de proteínas.
Se generó una versión mutante de la enzima corismato mutasa-prefenato
deshidratasa (CM-PDT) que carece del dominio de inhibición alostérica. El gene pheA
truncado se le nombró phe/v>. Para mejorarlos parámetros catalíticos de la enzima que
codifica el gene pheAlbr se decidió emplear una estrategia de ingeniería de proteínas,
llamada evolución dirigida, para seleccionar variantes de la proteina PheAw. De esta
manera se obtuvieron las mutantes evolucionadas PheAev' y PheA ev2.
Se han logrado rendimientos para la producción de fenilalanina a partir de
glucosa, cercanos al 60% del máximo teórico al utilizar la cepa PB12 que expresa el
gene que codifica para las enzimas PheAevl ó PheAev2.
3.3.3. Síntesis de fenilalanina
La fenilalanina se produce industrialmente. Mediante métodos químicos o
enzimáticos, la fenilalanina puede convertirse en aspartame (Pietsch ,1976, Ager, 1998)
o en 2-feniletanol (Etschmann el. al. 2002). Estos dos compuestos se utilizan en la
industria alimenticia. El aspartame es un edulcorante artificial de bajas calorías y el 2-
feniletanol es un compuesto saborizante y aromatizante que se utiliza en la industria
alimenticia y cosmética (Clark, 1990; Fabre el. al., 1998)
25
Antecedentes
La vía particular para la biosíntesis de L-Fen, L-Tir y L-Trp están sujetas a
control transcripcional y alostérico. En E. colí la biosíntesis de L-Fen (Figura 13)
comienza con la conversión de corismato (CHO) a prefenato (PPA) y de prefenato a
fenilpiruvato (PPY). Estas dos reacciones las cataliza la enzima corismato mutasa-
prefenato dehidratasa (PheA). Esta enzima está retroinhibida alostericamente por L-
Fen.
~-{
tH C~~
Corismato
tll
Prefenato Fenilpiruvato Fenilalanina
Figura 13. Biosíntesis de L-Fen.
La producción biotecnológica de fenilalanina emplea cepas modificadas de E.
coli. En particular, el tipo de alteración que se introduce es la resistencia a inhibición
alostérica de las enzimas que regulan el flujo de carbono hacia la vía de síntesis del
aminoácido. Estas tecnologías distan aún mucho de ser eficientes ya que el
rendimiento promedio en la síntesis del aminoácido a partir de glucosa se aproxima al
30% del nivel máximo teórico . Una mejora significativa a las tecnologías actuales ser ía
incrementar el rendimiento de fenilalanina a partir de glucosa.
3.3.3.1. Corismato Mutasa-prefenato dehidratasa (CM-PDT)
La conversión de CHO a PPA Y de PPA a PPI se cataliza por la enzima
corismato mutasa-prefenato dehidatasa (pheA). Esta enzima se regula mediante
mecanismos de represión y retroinhibición alostérica por L-Fen. Esta enzima
bifuncional contiene dos dominios catalíticos, uno con actividad de corismato mutasa
(residuos 1-109) y el otro con actividad de prefenato dehidratasa (residuos 101-205).
Además posee un dominio R responsable de la inhibición por retroalimentación por
fenilalanina. La eliminación de este dominio inactiva el efecto de inhibición por L-Fen,
aunque disminuye la afinidad por corismato (Pohnert el. al. 1999; Zhang el. al., 1998).
26
Antecedentes
3.3.3.2. Rendimiento máximo teórico de fenilalanina
La estequiometría para la síntesis de fenilalanina se puede derivar de la vía
común de aminoácidos aromáticos y de tres pasos finales que llevan a la formación de
L-Fen (reacción 1)
2PEP +E4P +NADPH +ATP +Glu -t L-Fen +C02 +a-cetoglutarato +NADP +ADP +4Pi
La formación de glutamato se lleva a cabo como se muestra en la reacción 2:
a-cetoglutarato + NH3+ NADPH -t Glu + NADP
Combinando las reacciones 1 y 2, tenemos que:
2PEP + E4P + 2NADPH + ATP + NH3-t L-Fen + C02+ 2NADP + ADP + 4Pi
El rendimiento máximo teórico de L-Fen (m axYL_Fen/ GIc) a partir de glucosa se ha
calculado en base a la estequiometría de la biosíntesis de L-Fen, bajo diversas
situaciones metabólicas (Fórberg, 1998; Patnaiak, 1994). Para cepas silvestres el maxYI_
Fen/GIc es 0.275 g/ g. Para una cepa modificada genéticamente, donde el PIR sea
reciclado a PEP o que carezca del sistema PTS, el maxYL-Fen/GIc puede incrementarse
teóricamente a 0.55 g/ g.
3.3.3.3. Ejemplos de producción de fenilalanina (L-Fen)
Existen varios trabajos donde se evalúa la producción de fenilalanina (L-Fen)
utilizando microorganismos modificados [Fórberg el. al. 1988, Chen el. al. 1997:
Weikert et. al., 1998; Tatarko y Romeo, 2002; Báez-Viveros el. al. 2004).
La inactivación de la enzima PPC en cepas de E. coli, que sobreexpresan una
DAHP sintasa (aroF) y una enzima corismato mutasa prefenato dehidratasa (CM-PDT)
insensible a regulación, dio como resultado un rendimiento del 5% correspondiente al
máximo teórico (Miller el. al., 1987) .
27
- - - - - - - - - - - - -
Antecedentes
Fórberg y colaboradores reportaron en 1988, la producción de fenilalanina en
una cepa que portaba los genes aroF y pheAfbr (CM-PDT insensible a retvoinhibici ón por
fenilalanina) en un sistema de células en reposo, obteniendo rendimientos del 50% del
máximo teórico.
La inactivación del sistema PTS también se ha evaluado como una estrategia
para aumentar la producción de fenilalanina. Cheng y colaboradores en 1997,
utilizaron una cepa que utilizaba un sistema de transporte diferente al PTS (simporte
de protones). Contrario a lo que se esperaba, esta cepa produce menos fenilalanina que
una cepa silvestre. Sin embargo, existen otros trabajos donde la inactivación del
sistema PTS, han dado como resultado un aumento en el flujo de aromáticos (Flores et.
al. 1996; Gosset et. al. 1996). En una cepa de E. colí con el fenotipo PTS-Glc+,
sobreexpresando los genes tktA, aroGJbr y pheAfbr se obtuvieron rendimientos de
fenilalanina hasta del 60% del máximo teórico (Báez-viveros et. al., 2004)
3.3.3.4. Ejemplos de la producción de compuestos aromáticos en Eseheriehia eolio
3.3.3.4.1. Triptofano e Índigo.
La vía de síntesis de aminoácidos aromáticos se ha tratado de optimizar no solo
para la producción de éstos, sino para la producción de otros compuestos aromáticos
de interés industrial. Un ejemplo de esto es la producción de índigo en E. colí
utilizando cepas modificadas en la vía de aromáticos y mediante la introducción de
genes heterólogos.
Las cepas recombinantes de E. colí usadas para la producción de índigo están
modificadas en la vía del triptofano. Una de las estrategias para obtener cepas
sobreproductoras de triptofano es introducir los genes que codifican para una DAHP
sintasa y una antranilato sintasa insensibles a inhibición (aroGJbr y trpEJbr) en una cepa
que contiene numerosas mutaciones (definidas e indefinidas) que le permiten
incrementar la producción de triptofano (Berry, 1996).
En una cepa sobreproductora de triptofano como la qUe se describió
anteriormente la inactivación de los gener trpR y tnaA2 da como resultado una cepa
con altos niveles de producción de indol que es el precursor del colorante. La
introducción de los genes de Pseudomonas putida, que codifican para una naftaleno
28
- - - - - - - - - - - - - - - --- - ----
Antecedentes
dioxigenasa (NDO) le permiten a esta cepa producir indol a partir de glucosa ( Berry et.
al. 2002).
3.3.3.4.2. Siquimato (SHIK)
El SHIK es un precursor en la síntesis varios compuestos como el catecol, el
ácido gálico y el pirogalol. También se utiliza corno materia prima para la fabricaci6n
de TamifIú, un agente antiinfluenza. El SHIK es uno de los intermediarios de la síntesis
de aminoácidos aromáticos.
Una estrategia que se ha seguido para la producci6n de SHIK en E. coli es la
sobreexpresi6n de los genes que codificaran para una DAHP sintasa insensible a
retroinhibici6n (aroffbT) y para la trancetolasa (tktA). Además para incrementar la
disponibilidad de PEP se ha evaluado la sobreexpresi6n de la enzima PEP sintasa (PPS)
y el uso de diferentes sistemas de transporte de glucosa (Chandran et. al., 2002; Yi, et.
al.,2002;Yi et. al., 2003).
3.3.3.4.3. 3-dehidrosiquimato (DHS) y derivados
El DHS es un intermediario aromático que se utiliza corno precursor en la
síntesis del catecol, el ácido adípico y la vainillina.
En el trabajo de Niu y colaboradores (2002) se construyeron ..:epas de E. coli
sobreproductoras de DHS para evaluar la síntesis de ácido cis, cis muc6nico a partir de
glucosa. Tambiénse evalu6 la hidrogenaci6n de este compuesto para formar ácido
adípico. El ácido cis, cis muc6nico se sintetiza a pa rtir de DHS mediante la
introducci6n de dos genes heter61ogos.
La vainillina es un saborizante aromático utilizado en la industria alimenticia,
farmacéutica y cosmética. Se ha podido sintetizar vanillina a pa rtir del DHS que
acumula una cepa de E. coli sobreproductora de DHS. (Priefert, et. al., 2001)
29
Tustificación
4. JUSTIFICACIÓN
• Las tecnologías de producción de L-fenilalanina aún pueden mejorarse
ya que el rendimiento promedio en la síntesis a partir de glucosa se
aproxima al 30% del nivel máximo teórico. Una mejora significativa a las
tecnologías actuales sería incrementar el rendimiento de fenilalanina a
partir de glucosa. Es por eso que en este trabajo se pretende evaluar el
rendimiento y la productividad de L-Fenilalanina a partir de glucosa en
cepas carentes del sistema PT5 y que además tienen inactivadas las
isoenzimas piruvato cinasas. Estas modificaciones ocasionarían una
mayor disponibilidad de PEP que pudiera canalizarse hacia la
biosíntesis de L-Fenilalanina.
30
Hipótesis
5. HIPÓTESIS
• Si en una cepa PTS-Glc+, que expresa los genes phe/vv» ó pheAev2 , aroGfbr y tktA,
existe una conversión significativa de fosfoenol piruvato en piruvato por las
isoenzimas de piruvato cinasa, la inactivación de estas enzimas causará un
incremento en la productividad y el rendimiento de L-fenilalanina a partir de
glucosa.
31
Objetivos
6. OBJETIVOS
6.1. OBJETIVO GENERAL
• Estudiar el efecto de la inactivación de las isoenzimas de piruvato cinasa
sobre el metabolismo central y la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en
cepas PTS-Clc' de E. eolio
6.2. OBJETIVOS PARTICULARES
• Evaluar la máxima capacidad de síntesis de fenilalanina en la cepa PB28
(PTS-GIc+, pykA-F-) en términos de rendimiento y productividad de L-
Fen utilizando experimentos de células en reposo en medio mínimo M9
suplementado con glucosa (10g/L).
• Comparar la capacidad de producción de L-fenilalanina de la cepa PB28
con las cepas JMI01 (PTS+) y PB12 (PTS-GIc+) transformadas con los
plásm idos pJLBaroGfbr, pCLtkt y pTrcpheAev2. En base a estos resultados,
determinar los pasos limitantes en la producción de L-Fen para la cepa
PB28
• Evaluar el efecto de la alimentación de piruvato sobre el consumo de
glucosa y la producción de aromáticas en la cepa PB28tktGev2.
• Determinar el efecto de la presencia de plásmidos sobre la velocidad
específica de consumo de glucosa en la cepa PB28.
32
Materiales y Métodos
7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1. Plásmidos
Todos los plásmidos que se utilizaron en este estudio se describen en la Tabla
3. El plásmido pCLtkt (Draths et. al., 1992) contiene el gen tktA que codifica para la
trancetolasa A. El plásmido p]LBaroGJbr (Báez-Viveros et. al., 2004) porta el gen aroGJbr
bajo el control del promotor lacUV5 y codifica para una DAHP sin tasa insensible a
retroinhibición (fbr) por L-Fen. Los plásmidos pTrcpheArol y pTrcpheAro2 (Báez-Viveros
et. al., 2004) contienen dos genes mutados que se generaron a partir del gen pheAJOr. Los
genes phe/v» y pheAro2 codifican cada uno para una enzima corismato mutasa
prefenato dehidratasa resistente a retroinhibición por fenilalanina. Estas enzimas se
obtuvieron mediante evolución dirigida de la proteína PheAfbr (insensible a
retroinhibición por fenilalanina) (Osuna et. al., datos por publicar) .
Los pl ásmidos se purificaron mediante el método de lisis alcalina y se
cuantificaron por densitometría utilizando un analizador de imagen Eagle Eye Il
5tratagene.
7.2. Cepas
Todas las cepas utilizadas en este trabajo se encuentran descritas en la Tabla 3.
Escherichia coli ]M101 (PT5+) y sus derivadas PB12 (PT5- Glc+) y PB28 (PT5-Glc+PykA-
Pykf-) fueron hospederos para la construcción de las cepas sobreproductoras de L-Fen
fue . ]M101 es la cepa progenitora de la mutante PBll, en la cual el operón PT5 se
escindió. En la cepa PB11 su capacidad de transporte y consumo de glucosa disminuyó
drásticamente. Utilizando un cultivo continuo se selecciónó la cepa mutante PB12 a
partir de la cepa PBll por su habilidad de crecer más rápido utilizando glucosa como
fuente de carbono (Flores, et. al. 1996). La cepa PB28 tiene el fenotipo PT5-Glc+ y tiene
inactivadas las dos isoenzimas piruvato cinasas (Ponce, et. al.1995).
7.3. Construcción de las cepas de E. coli modificadas por ingeniería genética e
ingeniería de proteínas.
La cepa PB28 se transformó con los plásmidos p]LBaroGfbr, pCLtkt y se
seleccionó con antibióticos. Posteriormente estas cepas se transformaron con el
33
Materiales y Métodos
plásmido pTrcppheAevl o pTrcppheAev2. La cepa PB28 también se transformó con
diferentes combinaciones de plásmidos sin genes clonados. Se generaron un total de 8
combinaciones posibles, éstas se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Cepas y plásmidos que se utilizarán en este proyecto de investigación.
Cepa/pl ásmido Características
JMlOl suaE, thi, Ll(lac-praAB), F'
PB12 Similar a JMlOl, ptsHI', crr y GIc+
PB28 Similar a PB12, pykA::cat pykf:gen!
PB28/ pCL1920 PB28 transformada con el plásmido pCL vacío.
pB28/pTrc99A PB28 transformada con el plásmido pTrc99A vacío.
PB28/pTrc99A,pACYC184 PB28 transformada con los pl ásmidos pTrc99A ypACYC184
vacíos
PB28Gev2
PB28tkt
PB28tktG
PB28tktGevl
PB28tktGev2
pCLtkt
pJLBaroGfbr
pTrcp/¡eArol pTrcppheAev2
pCL1920
pACYCl84
pTrc99A
7.4. Medios de cultivo
PB28/ pJLBaroGfbr y pTrcppheAev2
PB28/pCLtkt
PB28/ PJLBaroG fbr y pCLtkt
PB28/pJLBaroGfbr, pCLtkt y pTrcppheAevl
PB28/pJLBaroGfbr, pCLtkt y pTrcppheAev2
tktA (resistente a estreptomicina o espectinomicina)
araGfbr bajo el control del promotor lacUV5, genes lucl«y teto
Origen de replicación de pACYC184
pheArol o p/¡eAev2
Resistente a inhibición por fenilalanin a
Replicón derivado de pSClOl, tamaño de 4.6 kbp, bajo
n{umero de copias (5 aproximadamente), resistente a
estreptomicina o espectinomicina.
Replicón derivado de pISA , tamaño de 4.2 kbp, bajo
número de copias ' (10 aproximadamente), resistente a
tetraciclina
Replicon de la familia de ColEl, tamaño de 4.2 kbp, alto
número de copias (30 aproximadamente), resistente a
ampicilina
La composición química del medio M9 fue 211 mM Na2HP04, 42.8 mM NaCl,
110 mM KH2P04, 74.7 mM NH4Cl, 1 mM MgS04, 50 !J,M CaCh y 0.3 !J,M vitamina Bl,
100 !J,M IPTG Y 1 ml/L de solución de elementos traza conteniendo 0.1 giL CaCh .
2H20, 0.02 giL de CuCh ·5H20, 0.1 giL de CoCh ·6H20, 0.2 giL de FeS04 ' 7H20, 0.1
34
Materiales y Métodos
g/L de MnS04 · 5H20 , 0.1 giL de ZnS04 . 7H20 y 0.01 giL de Na2Mo04 . 2H20. Se
adicionó glucosa a una concentración de 10 g/L. Para los cultivos de células en reposo
suplementados con glucosa y piruvato se adicionaron ambos compuestos a una
concentración de 10 giL.
7.5. Condiciones de cultivo
Cepas. Las cepas se almacenaron en crioviales a -70 "C en medio Luria-Bertani
con glicerol al 50%.
Preinóculos. Se tomó una azada a partir de los crioviales. Se inoculó en un tubo
con LB y los antibióticos adecuados para el mantenimiento de los plásmidos. Se
crecieron a 37°C y 250 rp m.
Inóculos. Al día siguiente, los preinóculos se subcultivaron en matraces
bafleados conteniendo 50 mI de medio M9 suplementado con glucosa (10 giL) Y
extracto de levadura (5g/L). Se adicionó IPTG a una concentración de 100 ¡.tM.
Sistema de células en reposo. Estas células provienen de un preinóculo creciendo
en fase exponencial y tienen un estado fisiológicamente activo. Cuando las células en
el inóculo alcanzaron una densidad óptica de 2 (600 nm) se cosecharon por
centrifugación (a 7000 rpm y 4 "C), se lavaron con medio M9 y se usaron como inóculo
para las células en reposo. Se resuspenden estas células en matraces bafleados
conteniendo 50 mI de medio mínimo M9, el crecimiento se detuvo con cloranfenicol a
una concentración de 100 ¡.tg/L. No se adicionaron otros antibióticos.
7.6. Métodos Analíticos
La densidad óptica (absorbanciaa 600 nm) se determinó en un
espectrofotómetro (Beckman DU-70). El peso seco de las células se calculó
multiplicando la absorbancia por un factor de 0.45 giL, que se determinó previamente.
En los cultivos de células en reposo, se tomaron muestras de 1.5 mI periódicamente
durante 10 horas. Las muestras se centrifugaron, el sobrenadante se colectó para
analizar los principales productos generados en estos cultivos.
35
Materiales y Métodos
7.6.1. Evaluación de los metabolitos excretados mediante HPLC
Los metabolitos en los sobrenadantes filtrados se determinaron utilizando un
equipo de HPLC (cromatografía líquida de alta presión) con detectores de índice de
refracción y de arreglo de diodos. Además se utilizó con un sistema de HPLC
conectado a un detector de masas (ESIMCHPLC) modelo Agilent 1100. Con este
equipo para realizar espectrometría de masas se puede confirmar la identidad química
de algunos de los metabolitos producidos por las cepas recombinantes.
7.6.1.1. Determinación de glucosa
Para la determinación de glucosa se empleó una columna Aminex HPX-87H,
utilizando como fase móvil H2S04 5mM, a un flujo de 0.5 ml/rnín y a una temperatura
de 50° C. La glucosa se detectó por índice de refracción.
7.6.1.2. Determinación de Aminoácidos Aromáticos
Para la determinación de fenilalanina, triptofano, tirosina y fenilpiruvato, se
utilizó con un sistema de HPLC conectado a un detector de masas (ESIMCHPLC)
modelo Agilent 1100 con una columna Supelco Discovery C18. La fase móvil fue 0.2 %
TFA en 40% de metanol, a un flujo de 0.5 ml /rnín. La detección se hizo por arreglo de
diodos, a 220nm para la fenilalanina y 280nm para los demás analitos.
Con este sistema se cuantificó fenilalanina. Se detectó tiros ina y triptofano, pero
no se pudo cuantificar debido a que las cantidades que produce PB2~tktG2 son muy
pequeñas. También se intentó medir fenilpiruvato pero este no pudo detectarse bajo
estas condiciones.
7.6.1.3. Determinación de Ácidos Orgánicos e intermediarios de la vía de aromáticos.
Se utilizó un equipo de HPLC con un detector de arreglo de diodos a 235 nm
para DHS y 210 para los demás metabolitos. Se utilizaron dos métodos para analizar
los sobrenadantes de los experimentos de células en reposo para detectar algún
intermediario del TCA (oxaloacetato, malato, fumarato y succinato), productos de
36
Materiales y Métodos
fermentación (acético, láctico, fórmico) e intermediarios de la vía de aromáticos (DHS,
SHIK) .
7.6.1.3.1. Método Ácidos Aminex
Este método utiliza una columna tipo Aminex HPX-87H, utilizando como fase
móvil H2S04 5mM, a un flujo de 0.5 ml /rnin y a una temperatura de 50° C. Los
compuestos que se analizaron con este método fueron DHS, SHIK, acético, láctico,
fórmico, glicerol, piruvato, PEP, malato, fumarato, oxaloacetato y siquimato.
En este método el succinato coeluye con el siquimato y aparece un solo pico en
14 minutos con un máximo de absorbancia de 213
Se cambiaron las condiciones de corrida (fase movil y temperatura). Se utilizó
una fase móvil H2S04 5mM, 20 mM, 20 mM (1% acetonitrilo), un flujo de 0.5 mljmin y
temperaturas de 50° C y ambiente. En ninguna de estas condiciones se pudo obtener
picos separados para el siquimato y el succinato.
7.6.1.3.1.2. Método Acqua
Se montó un método de cuantificación de ácidos orgánicos basado en un técnica
de HPLC de fase reversa (Tormo M., el . al., 2004). Se utilizó una columna marca
phenomenex de tipo aqua C18 de 150x4.6 mm. Como fase móvil se utilizó 1% de
acetonitrilo en buffer de fosfatos 20 mM ajustado a un pH de 2.2 con ácido fosfórico y
un flujo de 0.5 ml / mino Con este método se analizaron estándares de los siguientes
compuestos: DHS, SHIK, acético, láctico, fórmico, glicerol, piruvato, PEP, malato,
fumarato, oxaloacetato y siquimato.
En estas condiciones se pudieron separar el siquimato y el succinato en una
curva estándar, además de que se obtuvieron picos diferenciabIes para otros
metabolitos (oxaloacetato, fórmico, láctico, fumarato, DHS).
37
Resultados y Discusión
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1. Sistema de células en reposo (resting cells)
Las herramientas de la ingeniería genética se han desarrollado de tal manera que
en la actualidad se pueden optimizar procesos biocatalíticos para la producción de
compuestos de interés químico y farmacéutico (Nielsen, 1998). Para algunos bioprocesos
como bioremediación, producción de metabolitos o biocatálisis pueden utilizarse células
en crecimiento o células en reposo (resting cells).
El sistema de células en reposo es útil para varios procesos metabólicos
intracelulares, que se activan cuando las células pasan de un estado de crecimiento
exponencial a un estado de fase estacionaria. Este sistema también puede utilizarse
cuando se requiere un estado de células en reposo para mantener la viabilidad, ya que se
controlan factores ambientales que pueden ser desfavorables para la célula como la
escacez de nutrientes o una cantidad excesiva de biomasa. Además, utilizando un sistema
de células en reposo no hay flujo de carbono hacia la producción de biomasa. Como
consecuencia, un sistema de células en reposo constituye un estado fisiológico seguro para
el mantenimiento de las células. Estas células provienen de un cultivo creciendo en fase
exponencial y por lo tanto están en un estado fisiológico activo (Báez-Viveros el. al., 2004;
Lloyd el. al., 1996).
Por estas razones se decidió emplear este tipo de cultivos en este trabajo. En estas
condiciones de no crecimiento la producción de biomasa se reduce completamente. Las
células que se utilizaron se encuentran en un estado metabólico activo por las condiciones
de cultivo que se utilizaron. Provienen de células creciendo en fase exponencial en un
medio mínimo M9 enriquecido con extracto de levadura (ver materiales y métodos). Con
estas células se inocularon matraces bafleados de 250 ml conteniendo 50 ml de medio M9
suplementado con glucosa (10g/L) e IPTG (100 ~M) para inducir la expresión de los genes
contenidos en los plásmidos. Además se añadió c1oranfenicol (100 ~g/ml), que es un
bacteriostático, para detener el crecimiento celular. La competencia por los precursores
que se utilizan para la formación de biomasa se elimina, aumentando la capacidad de
biosíntesis de L-Fen.
38
Resultados y Discusión
8.2 Evaluación de la máxima capacidad de síntesis de fenilalanina en la cepa PB28
utilizando células en reposo.
La cepa PB28 se transformó con los plásmidos pTrcppheAevl ó pTrcppheAev2,
pJLBaroGfbr y pCLtkt, de esta manera se obtuvieron las cepas PB28tktGevl y PB28tktGev2
(Tabla 3). Posteriormente se hicieron experimentos con células en reposo.
La concentración celular inicial en los cultivos de células en rep:')so se ajustó a una
densidad de 2.2 que corresponde a 1 g de bíomasa/L (Figura 14). Los matraces se
incubaron a 37 "C y 250 rpm, tomando muestras cada hora durante 10 horas. La biomasa
se mantuvo constante durante todo el cultivo. La biomasa se removió por centrifugación y
los sobrenadantes se colectaron por decantación y se filtraron para su posterior análisis
por HPLC.
5
-o- PB28/pJLBaroG'br,pCLtkt y pTrcpheAev1
E 4 -- PB28/pJ LBaroG'br, pCLtkt y pTrcpheAev2
c:
03o
ti- 2 k~~==t=~~===!p1~i=:i:==:::O
o
0+---.---.--.--.---.-.----.------,--,-.
o 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo. h
Figura 14. Densidad óptica a 600 nrn de los cultivos de células en reposo.
En el trabajo de Báez-Viveros (2004) no se observaron diferencias significativas
entre las cepas JM10l y PB12 transformadas con los pl ásmidos pTrcppheAevl o
pTrcppheAev2 sin embargo se evaluaron los dos pl ásmidos dado que la cepa PB28 es una
cepa con modificaciones adicionales en su metabolismo y pudiera presentar alguna
diferencia más notable al expresar los genes phe/v» Ó phe/vr« .
Se observó que la velocidad de consumo de glucosa se mantuvo relativamente
constante durante las 10 horas que duró el experimento. La producción de L-Fen, DHS y
SHIK se incrementó linealmente (Figuras