Leveduras na produção de chicha de milho

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AISLAMIENTO, IDENTIFICACION MOLECULAR Y CARACTERIZACION 
PARCIAL DE LAS LEVADURAS ASOCIADAS A LA PRODUCCION DE LA 
CHICHA DE MAÍZ 
 
 
 
 
LUZ ADRIANA MAMBUSCAY MENA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
AISLAMIENTO, IDENTIFICACION MOLECULAR Y CARACTERIZACION 
PARCIAL DE LAS LEVADURAS ASOCIADAS A LA PRODUCCION DE LA 
CHICHA DE MAÍZ 
 
 
 
 
 
 
LUZ ADRIANA MAMBUSCAY MENA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
AISLAMIENTO, IDENTIFICACION MOLECULAR Y CARACTERIZACION 
PARCIAL DE LAS LEVADURAS ASOCIADAS A LA PRODUCCION DE LA 
CHICHA DE MAÍZ 
 
LUZ ADRIANA MAMBUSCAY MENA 
 
 
Trabajo de grado presentado como requisito parcial 
para optar al titulo de Biólogo 
 
 
 
Director 
ESTEBAN OSORIO CADAVID 
Biólogo, Ph. D. 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
ii 
 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADEMICO DE BIOLOGIA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
 
 
 
 
LUZ ADRIANA MAMBUSCAY MENA, 1986 
 
 
 
 
 
 
AISLAMIENTO, IDENTIFICACION MOLECULAR Y CARACTERIZACION 
PARCIAL DE LAS LEVADURAS ASOCIADAS A LA PRODUCCION DE LA 
CHICHA DE MAÍZ 
 
 
 
 
 
Temas: Chicha de maíz, levaduras, identificación molecular, secuenciación, 
caracterización. 
 
 
iii 
 
NOTA DE APROBACIÓN 
 
El trabajo de grado titulado “Aislamiento, identificación molecular y caracterización 
parcial de las levaduras asociadas a la producción de la chicha de maíz”, presentado 
por la estudiante LUZ ADRIANA MAMBUSCAY, para optar por el título de Biólogo, 
fue revisado por el jurado y calificado como: 
 
 
 
Esteban Osorio Cadavid, Ph. D. 
Director 
 
 
 
 
 
Jurado 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Quiero agradecer en prime lugar a mi madre Patricia por ser la persona a quien le debo 
este logro, a mis hermanos William y Ferney, a mi tía Ayde y a todos mis familiares que 
contribuyeron de alguna forma en todo este proceso. A mi novio William Andrés por su 
amor y total apoyo durante toda la carrera. Igualmente a mis mejores amigos, Yherson, 
Martha, Mauricio, Sandra y marcela, por su gran compañerismo y amistad 
incondicional. 
 
A Esteban Osorio Cadavid por ser mi tutor y un gran amigo. A la Universidad del Valle, 
a la Vicerrectora de investigaciones por la financiación, a todos los integrantes de la 
sección de Genética que contribuyeron en la realización de este proyecto, 
principalmente Ronny y el profesor Nelson toro por el préstamo de equipos. También 
quiero agradecer al consejo superior de investigaciones científicas (CSIC) de la 
Universidad de Valencia, España, por permitir el uso de la base de datos Yeast-id.com 
en convenio con la Universidad del Valle. 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
 
TABLA DE CONTENIDO 
 
 Página 
1. RESUMEN………………………………………………………………. 1 
2. INTRODUCCIÓN………………………………………………………... 3 
3. ANTECEDENTE………………………………………………………… 5 
 3.1 Levaduras……………………………………………………………. 5 
 3.1.1 Importancia industrial de las levaduras……………………. 6 
 3.2 Bebidas fermentadas…………………………………………………. 6 
 3.3 Chicha de maíz………………………………………………………. 8 
 3.4 Métodos para identificación de levadura…………………………..... 9 
 3.4.1 Identificación morfológica y bioquímica…………………..... 9 
 3.4.2 Identificación mediante técnicas moleculares……………….. 10 
 3.4.2.1 Métodos basados en el análisis de regiones 
ribosomales…………………………………………. 
11 
 3.4.2.1.1 Secuenciación de las regiones 
ribosomales……………………............... 
12 
 3.4.2.1.2 Análisis de restricción de las regiones 
ribosomales……………………............... 
12 
 3.5 Importancia biotecnológica de las levaduras………………………… 13 
 3.6 Estudios de levaduras asociadas bebidas fermentadas en Colombia… 14 
4. OBJETIVOS………………………………………………………………. 15 
 4.1 General……………………………………………………………… 15 
 4.2 Específicos………………………………………………………….. 15 
5. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………….. 16 
 5.1 Preparación de la chicha…………………………………………….. 16 
 5.2 Aislamiento de las levaduras………………………………………… 16 
vi 
 
 5.3 Caracterización morfológica y fisiológica…………………………… 16 
 5.4 Extracción de ADN genómico…………………………………......... 17 
 5.5 PCR-RFLP´s de la región 5.8S-ITS………………………………… 17 
 5.6 Secuenciación del domino D1/D2 del gen ribosomal 26S…............. 18 
 5.7 Análisis estadístico…………………………………………………. 19 
6. RESULTADOS………………………………………………………….. 21 
 6.1 Aislamiento…………………………………………………………. 21 
 6.2 Caracterización morfológica y fisiológica…………………………… 21 
 6.3 Extracción de ADN genómico………………………………………. 33 
 6.4 PCR- RFLP´s de la región 5,8S-ITS.………………………………. 33 
 6.5 Secuenciación del domino D1/D2 del gen ribosomal 26S….............. 38 
 6.6 Levaduras encontradas en la chicha………………………………… 39 
7. DISCUSIÓN………………………………………………………………. 44 
 7.1 Aislamiento y caracterización 
parcial………………………………... 
44 
 7.2 Caracterización molecular e identificación………………………….. 46 
 7.3 Levaduras encontradas en la chicha de maíz………………………… 49 
8. CONCLUSIONES………………………………………………………. 55 
9. LITERATURA CITADA………………………………………………… 56 
10. ANEXOS………………………………………………………………….. 61 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
LISTA DE FIGURAS 
 Página 
FIGURA 1: Representación esquemática del cluster de genes 
ribosomales………………………………………………………. 
 
12 
FIGURA 2: Representación gráfica de la abundancia de aislados en cada 
fase de la fermentación………....................................................... 
 
21 
FIGURA 3: Foto del aislado MF-2 que muestra tinción de espora positiva….. 29 
FIGURA 4: Verificación de extracción de ADN en gel de agarosa al 
1%................................................................................................... 
 
33 
FIGURA 5: Verificación de producto de PCR (4µl/pozo) en gel de agarosa al 
1.5%................................................................................................ 
 
34 
FIGURA 6: Verificación de los fragmentos obtenidos a partir de la digestión 
del amplificado (7µ/pozo) en gel de agarosa al 
1.5%............................................................................................... 
 
35 
FIGURA 7: Relación de riqueza y abundancia de especies de levaduras 
presentes en la producción de la chicha de maíz………………… 
 
40 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
LISTA DE TABLAS 
 Página 
TABLA 1: Usos industriales de la levadura y de sus productos…………… 6 
TABLA 2: Agrupamientos por morfotipos de los aislados………………… 22 
TABLA 3: Resultados de las pruebas de tinción de espora y filamento de 
todos los aislados………………………………………………. 
 
27 
TABLA 4: Resultados de las pruebas de crecimiento y fermentación de 
azucares……………................................................................... 
 
29 
TABLA 5: Resultados de las pruebas de halo-tolerancia y etanol-
tolerancia……………………………………………………….. 
 
31 
TABLA 6: Agrupaciones formadas de acuerdo al Tamaño de las bandas de 
los amplificados y de los fragmentos de restricción de todos los 
aislados, calculados usando el software UvigelStartMw v11 ©, 
tomando como referencia el marcador de peso molecular 
Generuler 50pb. …………………………………..……………. 
 
 
 
35 
TABLA7: Porcentaje de asignación correcta para cada uno de los grupos 
propuestos …………………………………….………………... 
 
38 
TABLA 8: Alineamiento de secuencias obtenidas con el algoritmo 
BLAST………………………………………… ………………. 
 
38 
TABLA 9: Frecuencia de especies encontradas de acuerdo a la fase de 
fermentación muestreada……………………………………….. 
 
39TABLA 10: Especies de levaduras encontradas en el proceso de la 
fermentación de la chicha de maíz. Por especie se muestra la 
morfología de las colonias y de las 
células……………………..……………………………………. 
 
 
41 
 
 
 
 
ix 
 
LISTA ANEXOS 
 Página 
ANEXO A: Medios de cultivo empleados……………………………………. 61 
ANEXO B: Protocolo para extracción de ADN genómico de levadura……… 64 
 
 1 
 
1. RESUMEN 
En Colombia el conocimiento de la comunidad levaduriforme ha sido limitado, ya que 
los estudios se han enfocado principalmente en especies de interés clínico. Las 
fermentaciones espontáneas a partir de diversos sustratos representan hábitats de gran 
importancia para el estudio de la dinámica de las poblaciones de levaduras nativas. Por 
tal razón, en el presente estudio se aislaron e identificaron las levaduras asociadas a la 
chicha de maíz, una bebida fermentada de preparación artesanal, típica en Colombia. 
 
Se realizó el aislamiento de las levaduras más representativas de la chicha durante las 
tres fases de la fermentación: inicial, tumultuosa y final; en medio YPDA. Inicialmente, 
se hizo una caracterización parcial de los aislados, que incluyó descripciones 
macroscópicas y microscópicas, pruebas fisiológicas, capacidad de producir filamentos 
y esporas. Sin embargo, debido a que estas técnicas no son suficientes para identificar 
los aislados hasta el nivel taxonómico de género o de especie, se complementó el 
estudio de cada aislado empleando técnicas moleculares basadas en el análisis de 
restricción del gen rRNA 5.8S y los espaciadores transcritos internos (ITS 1 e ITS 2). 
Cuando el empleo de esta técnica no permitió obtener resultados definitivos, se empleó 
la técnica de secuenciación del dominio D1/D2 del gen 26S rRNA, para los aislados con 
identificación dudosa. 
 
Por medio de la aplicación de estas metodologías se pudieron identificar las especies 
más representativas de la chicha de maíz en cada una de las fases de la fermentación: 
inicial, Candida tropicalis, Pichia kluyveri y Pichia guilliermondii, tumultuosa, 
 2 
 
Candida tropicalis, Pichia guilliermondii, Hanseniapora guilliermondii, Pichia 
fermentans, Saccharomyces cerevisiae, Candida maltosa y Rhodotorula glutinis y final, 
Candida tropicalis, Hanseniapora guilliermondii, Pichia fermentans, Saccharomyces 
cerevisiae y Torulaspora delbruecki. Así pues, la fase que presento mayor diversidad 
fue la fase tumultuosa y la especie que predomino en el proceso fermentativo de la 
chicha de maíz fue Candida tropicalis. 
 
La caracterización preliminar de unos pocos aislados obtenidos, basada en pruebas de 
etanol-tolerancia y halo-tolerancia, permitió identificar que, entre los aislados obtenidos 
existe una posibilidad de lograr encontrar en el Valle del Cauca levaduras nativas con 
posible utilización biotecnológica, en el sector productivo e industrial, lo cual es de 
importancia en una región como el Valle del Cauca, donde la fermentación del guarapo 
de la caña de azúcar es obtenida por cepas de levaduras importadas de la india, con la 
finalidad de lograr el alcohol como combustible 
 
 
 
 
 
 
 
 3 
 
2. INTRODUCCION 
Numerosos estudios de la macrobiota colombiana han demostrado que este es un país 
altamente biodiverso, sin embargo, la biodiversidad de la microbiota ha sido hasta el 
momento poco estudiada. Por ejemplo, se desconoce casi por completo las levaduras 
asociadas a suelos, aguas, alimentos y a procesos fermentativos, siendo quizás las mejor 
estudiadas las asociadas a patologías humanas (Chen et al. 2000; Chang et al. 2001; 
Ciardo et al. 2006; de Llanos et al. 2006). 
 
Con la finalidad de contribuir en el estudio de la diversidad de la comunidad 
levaduriforme en Colombia, se estudiaron las levaduras asociadas al proceso 
fermentativo de la chicha, ya que en este proceso las levaduras cumplen un papel 
protagónico, y por ser ésta, una bebida ampliamente utilizada en todo el continente 
americano, durante mucho tiempo, aún mucho antes de su descubrimiento. Para este 
estudio, se escogió como modelo la chicha de maíz, porque ésta es una de las bebidas 
fermentadas más tradicionales en Colombia y Sur América (Bejarano 1950). A pesar de 
que el proceso de elaboración de la chicha es ampliamente conocido, se desconocen casi 
en su totalidad las levaduras encargadas y asociadas al proceso fermentativo para la 
producción de la bebida. 
 
Debido a que la chicha es una bebida tradicional producto de la fermentación natural 
ocasionada por las levaduras presentes en el maíz, resulta de gran interés el estudio de 
las levaduras relacionadas a este proceso de fermentación, ya que se logra conocer algo 
más de la comunidad levaduriforme nativa del país. 
 4 
 
También es importante resaltar que los pocos estudios realizados con levaduras en 
Colombia no han aplicado las técnicas moleculares disponibles en la actualidad, las 
cuales permiten tanto un análisis preciso de la diversidad de especies de levaduras 
presentes, como la variabilidad intraespecifica (Querol et al. 1994). 
 
Tradicionalmente, la identificación y caracterización de especies y cepas de levaduras se 
ha realizado utilizando pruebas morfológicas y bioquímicas (Barnett et al. 1990). Sin 
embargo, este proceso implica de aproximadamente 90 pruebas que requieren de tiempo, 
es laborioso, depende completamente del medio de cultivo y la aplicación de este tipo de 
pruebas no permite diferenciar a nivel de cepas. Además, alguna de estas características, 
por ejemplo la capacidad o incapacidad de fermentación de algunos azúcares, 
simplemente son debidas a la mutación de un único gen y pueden influir en el resultado 
de las condiciones de cultivo (Guillamón et al. 1996; Arias et al. 2002). Por el contrario, 
las técnicas de biología molecular se presentan como una alternativa a los métodos 
tradicionales para caracterizar e identificar levaduras (Querol & Ramón 1996). 
 
La caracterización de levaduras hasta el nivel de especie es de relevancia desde el punto 
de vista industrial, debido a que muchos grupos forman parte de la microflora natural de 
alimentos y bebidas fermentadas y/o participan en el proceso de obtención de éstos. De 
ahí la necesidad de poseer métodos de identificación rápidos, precisos y fáciles, que 
puedan ser aplicados al control de la calidad en la industria, con el fin de asegurar que la 
cepa de partida, la que conduce el proceso y la que rinde el producto final, sea la misma 
(Velázquez et al. 2001). 
 5 
 
3. ANTECEDENTES 
3.1 Levaduras 
Las levaduras son microorganismos eucarióticos, que están clasificados en el reino de 
los Hongos, pertenecientes en su mayoría al grupo de los Ascomicetos, con alrededor de 
1.500 especies descritas. Las levaduras son generalmente unicelulares, aunque en 
algunas especies se pueden observar formas multicelulares que se generan mediante la 
formación de cadenas de células conectadas, conocidas como pseudohifas. El tamaño de 
las levaduras puede variar dependiendo de la especie, por lo general miden entre 3-4µ 
de diámetro, aunque algunas pueden llegar a medir más de 40µ (Kurtzman & Fell 
1998). 
 
Por otro lado las levaduras se caracterizan por presentar formas muy variadas, Las hay 
elípticas (con forma de huevo) como las especies del género Saccharomyces; esféricas, 
alargadas como Candida stellata y apiculadas (con forma de limón) como las del genero 
Hanseniaspora (Peynaud 1989, citado por Mesas & Alegre 1999). Su morfología es uno 
de los caracteres utilizados en su clasificación, como también lo son entre otros, su 
forma de reproducción y sus características bioquímicas (Barnett et al. 1990, Navarre 
1994, De Rosa 1997, citado por Mesas y Alegre 1999). Su reproducción puede ser 
vegetativa (asexual), generalmente por gemación o por fisión binaria, aunque cuando las 
condiciones son adversas la mayor parte de laslevaduras pueden reproducirse 
sexualmente generando ascosporas (Mesas & Alegre 1999). 
 
 
 
 6 
 
3.1.1 Importancia industrial de las levaduras 
Las levaduras son los microorganismos más importantes y ampliamente utilizados en la 
industria. Se cultivan por sus propias células, por sus componentes celulares y por los 
productos finales que se producen durante la fermentación alcohólica (Tabla 1). La 
producción de células de levadura y la producción de alcohol mediante levaduras, son 
dos procesos que se diferencian desde el punto de vista industrial en el hecho de que el 
primero requiere la presencia de oxigeno para la producción máxima de material 
celular, mientras que la fermentación es anaerobia (Madigan et al. 2004). 
 
Tabla 1. Usos industriales de la levadura y de sus productos 
Producción de células de levaduras 
• Levadura para la fabricación de pan 
• Levaduras desecada como suplemento alimenticio 
• Levadura desecada como pienso animal 
 
Productos de la levadura 
• Extracto de levadura para medio de cultivo 
• Vitamina D, vitamina B 
• Enzimas para la industria alimentaria, (sucrasa, galactosidasa) 
• Productos para investigación bioquímica: ATP, NAD+, RNA 
Productos de fermentación de levaduras 
• Etanol para alcohol industrial y como aditivo para la gasolina (glicerol) 
Alcohol para bebidas 
• Vino 
• Cerveza 
Bebidas destiladas 
• Güisqui, brandy, vodka, ron 
 
 
3.2 Bebidas fermentadas 
La fermentación alcohólica es un proceso bioquímico llevado a cabo principalmente por 
las levaduras. Este proceso se origina en sustancias ricas en carbohidratos, como la 
glucosa, de la cual las levaduras obtienen la energía necesaria para sobrevivir disociando 
sus moléculas en ausencia de oxigeno y produciendo como consecuencia el alcohol. A 
 7 
 
través de este tipo de fermentación se obtienen bebidas como la cerveza, el vino, la cidra, 
la chicha, entre otras (Madigan et al. 2004). 
 
Para que la fermentación alcohólica tenga lugar, el mosto debe estar en un medio de 
poco oxígeno. En condiciones de aerobiosis las levaduras se multiplican 
abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consigue 1 g de 
levadura por cada 4 g de azúcares consumidos. En anaerobiosis las levaduras realizan la 
fermentación alcohólica, es decir degradan los azúcares de forma incompleta generando 
etanol, CO2
Es reconocido, que en todo proceso fermentativo, existe una dinámica y sucesión de la 
comunidad microbiana, reguladas fundamentalmente por el contenido de alcohol etílico 
presente en el mosto a ser fermentado. De esta manera, el proceso de fermentación 
presenta 3 fases: inicial, intermedia y final. En la fase inicial, existe una comunidad 
microbiana muy diversa, conformada por bacterias y levaduras que se caracterizan por 
producir gran cantidad de compuestos secundarios enriquecedores del sabor y aroma de 
la bebida. A medida que el proceso fermentativo avanza a las fases intermedia y final, 
aparecen levaduras que se caracterizan principalmente por producir gran cantidad de 
etanol como la especie Saccharomyces cerevisiae (Mesas & Alegre 1999). De esta 
manera, al incrementarse el contenido de alcohol, éste se vuelve tóxico y mata a la gran 
mayoría de los microorganismos presentes, favoreciendo únicamente a aquellos que 
presentan una verdadera resistencia a altas concentraciones de alcohol, superiores a un 8 
o 12% (Esteve-Zarzoso et al. 2001). 
 y energía. En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan sólo 1 
g de levadura por cada 100 g de azúcares consumidos (Mesas & Alegre 1999). 
 
 8 
 
Las bebidas fermentadas se pueden obtener tanto de manera espontanea, como por 
medio de la inoculación de cepas de levaduras especiales o seleccionadas. La 
fermentación espontanea, es dirigida por las levaduras presentes en el sustrato a 
fermentar o en los equipos en los cuales se llevará a cabo la fermentación. En la 
fermentación a partir de inóculos de levaduras, son las levaduras presentes en el 
inóculo, las directas responsables de la obtención del producto final (Suarez et. al 
2007). 
 
3.3 Chicha de maíz 
El conocimiento de las técnicas de fermentación tradicionales se ha transmitido de 
generación, en generación a lo largo de los años. En Colombia, permanece 
principalmente el conocimiento de la elaboración de la chicha de maíz (Wacher-Rodarte 
1995), de la cual su origen data desde la época prehispánica donde para los indígenas 
era de gran importancia y reconocimiento cultural, ya que se reconocía como un 
producto de origen divino, ceremonial y colectivo. Sin embargo, con el inicio de la 
colonización esta tradición se fue perdiendo debido a la influencia de los españoles, los 
cuales consideraban el consumo de la chicha como causa de la miseria de la población, 
de las malas costumbres y un obstáculo para el inicio de la cultura capitalista. De esta 
manera se llego a la prohibición del consumo de la chicha y se introdujo a cambio el 
consumo de nuevas bebidas comerciales como la cerveza (Bejarano 1950). 
 
La chicha es una bebida alcohólica, efervescente, amarillenta y clara, su contenido 
alcohólico varía entre 2 a 12 por ciento y su proceso de fermentación esta basado en 
una fuente de amilasa para convertir el almidón en azúcares fermentables. 
 9 
 
Tradicionalmente en varios países latinoamericanos, entre los que se encuentran 
México, Perú y Colombia la chicha se prepara principalmente con granos de maíz, 
debido a su abundancia y economía (Steinkraus 1995). 
 
3.4 Métodos para identificación de levaduras 
Los estudios destinados a identificar las diferentes especies de levaduras se han basado 
en características morfológicas, como la forma de las células y de las colonias, 
fisiológicas, como la fermentación de azucares y la caracterización con métodos 
moleculares. 
 
3.4.1 Identificación morfológica y bioquímica 
Las características morfológicas usadas para la identificación de levaduras, son la 
forma de la célula y de la colonia. Las formas de la células vegetativas pueden ser: 
globosa, subglobosa, elipsoide, ovoide, cilíndrica, reniforme, baciliforme, elongada, 
fusiforme, apiculada, lunada o triangular. Mientras que para la forma de la colonia se 
tienen en cuenta diferentes aspectos como: 
• Textura: que puede ser mucoide, fluida, mantequillosa, membranosa o harinosa. 
• Color: la mayoría son de color crema y algunas producen colonias de color 
amarillo, naranja o rojo. 
• Superficie: lisa, rugosa, subdividida, brillante u opaca. 
• Margen: puede ser liso, entero, ondulado o lobulado (Boekhout et.al 2004). 
 10 
 
 
Por otro lado, entre las diversas características bioquímicas utilizadas en la clasificación 
de las levaduras se encuentran: 
• El tipo de azúcares que pueden fermentar y/o crecer, entre los cuales se 
encuentran: glucosa, galactosa, xilosa, lactosa, rafinosa, entre otras. 
• El rendimiento en alcohol, hay algunas levaduras que para producir 1 grado de 
alcohol consumen de 17 a 18 g de azúcar, otras en cambio con 
menor rendimiento metabolizan de 21 a 22 g. 
• Su poder alcohológeno, o grado máximo de alcohol que pueden alcanzar, 
algunas detienen su actividad al 5% mientras que otras llegan al 17 o 18%. 
• Productos secundarios de la fermentación. 
• Resistencia al anhídrido sulfuroso. 
• Capacidad para asimilar diferentes sustancias nitrogenadas (Quesada & Cenis 
1995, Suárez 1997 citado por Mesas & Alegre 1999). 
 
3.4.2 Identificación mediante técnicas moleculares 
La identificación de levaduras por características fenotípicas, tales como pruebas de 
crecimiento y morfología celular, han sido significativamente remplazadas por métodos 
basados en el ADN. Diversos estudios moleculares, han mostrado que los resultados de 
las pruebas de fermentación y asimilación, al igual que las diferencias morfológicas 
como forma de la ascospora y presenciao ausencia de hifa o pseudónima, pueden diferir 
entre cepas de la misma especie (kurtzman 2006). 
 11 
 
Entre los métodos de identificación molecular más usados se encuentran: patrones 
aloenzimáticos, hibridación ADN-ADN, cariotipaje electroforético, análisis 
microsatélite, PCR en tiempo real, polimorfismos de ADN amplificados aleatoriamente 
(RAPD´s), RFLP´s (polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción) de ADN 
mitocondrial y/o cromosomal (Esteve-Zarzoso 1999), secuenciación del dominio D1/D2 
del gen ribosomal 265s (Kurtzman & Robnett 1998) y PCR-DGGE (Muyzer et al. 1993, 
citado por Martorell 2006). 
 
3.4.2.1 Métodos basados en el análisis de regiones ribosomales 
Los genes ribosomales (5.8S, 18S y 26S) están agrupados en unidades transcripcionales 
en tándem que se repiten entre 100 y 200 veces en el genoma (Figura 1). En cada 
unidad transcripcional existen otras dos regiones, los espaciadores transcritos internos 
(ITS) y los externos (ETS), estas son regiones que se transcriben pero no se procesan. A 
su vez, las unidades codificadoras son separadas por los espaciadores intergenicos, 
también llamados NTS. Los genes ribosomales 5.8S, 18S y 26 S, al igual que los ITS y 
NTS, constituyen poderosas herramientas para establecer relaciones filogenéticas e 
identificación de especies (Kurtzman & Robnett 1998), debido a sus regiones 
conservadas, así como su evolución concertada, es decir, que la similitud entre las 
unidades transcripcionales repetidas es mayor dentro de una especie que entre las 
unidades pertenecientes a especies diferentes, debido a mecanismos como cruces 
desiguales o conversión genética (Li 1997, citado por Martorell 2006). Por esto, 
diferentes métodos para la identificación de levaduras han sido desarrollados usando la 
información contenida en estas regiones (Martorell 2006). 
 
 12 
 
 
 
Figura 1. Representación esquemática del cluster de genes ribosomales. 
 
3.4.2.1.1 Secuenciación de las regiones ribosomales 
Uno de estos métodos esta basado en la determinación y comparación de las secuencias 
de nucleótidos en esta región, las dos regiones más usadas corresponden a los dominios 
D1 y D2 localizados en el gen 26S (Kurtzman & Robnett 1998) y el gen 18S (James et 
al. 1997, citado por Martorell 2006). La disponibilidad de estas secuencias en las bases 
de datos, especialmente en el caso de la región D1/D2 del gen 26S, hace que esta 
técnica sea muy útil para asignar una levadura desconocida hasta el nivel de especie, 
cuando el porcentaje de homología de las secuencias sea similar o superior a 99% 
(Kurtzman & Robnett 1998). 
 
3.4.2.1.2 Análisis de restricción de las regiones ribosomales 
Con una aplicación industrial en mente, otros métodos de identificación fueron 
desarrollados paralelamente, basándose en amplificación por PCR de estas regiones de 
ADN ribosomal y posterior restricción de los fragmentos amplificados. La diferencia de 
tamaño de los productos amplificados, corresponde a diferentes especies, sin embargo 
cuando los fragmentos amplificados son de igual tamaño, no siempre corresponden a la 
misma especie y es necesario recurrir a la digestión de estos fragmentos para hacer 
posible una identificación definitiva. Esta técnica se caracteriza por su fácil ejecución y 
reproductibilidad. Dlauchy et al. (1999) usaron esta metodología para la amplificación 
 13 
 
del gen ribosomal 18S y la región intergénica ITS1 de 128 especies de levaduras 
asociadas principalmente con alimentos, vino, cerveza y otra bebidas usando los primers 
ns1 ((5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′) e its2 (5′-GCT GCG TTC TTC ATC 
GAT GC-3′) y digiriendo con las enzimas AluI, HaeIII, MspI y RsaI. Luego esta 
metodología fue aplicada por Redzepovic et al. (2002), con otra región ribosomal que es 
muy usada para diferenciar hasta el nivel de especie, esta incluye el gen 5.8S y las 
regiones intergénicas adyacentes ITS1 y ITS2, la amplificación se realizó usando los 
primers its1 (5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′) e its4 (5′-TCC TCC GCT TAT 
TGA TAT GC-3′) descritos por White et al. (1990). Guillamón et al. (1998) uso esta 
técnica para la identificación de levaduras en vino, posteriormente su uso fue extendido 
a un total de 191 levaduras relacionadas con alimentos y bebidas (Martorell 2006). 
 
3.5 Importancia biotecnológica de las levaduras 
Desde tiempos inmemorables los alimentos y bebidas fermentadas han representado en 
la práctica ejemplos de la asociación entre levaduras y biotecnología. Para la mayoría de 
personas las levaduras están ejemplificadas por la especie Saccharomyces cerevisiae y 
por la producción de bebidas alcohólicas, pero esto es solo un fragmento de la gran 
diversidad biológica y potencial biotecnológico de las levaduras en el mundo. En las 
ultimas décadas estudios de la diversidad metabólica de las llamadas levaduras no 
convencionales, han revelado prometedoras propiedades biotecnológicas (Rosa & Péter 
2006). 
 
La biotecnología en las levaduras abarca una numerosa variedad de procesos que 
involucran las células de las levaduras y sus metabolitos, los cuales incluyen, bebidas y 
alimentos fermentados, productos químicos y farmacéuticos, así como importantes 
 14 
 
interacciones agrícolas y ambientales. Mientras, muchos productos y moléculas son 
producidos comercialmente, otros aun están confinados al laboratorio, los que en un 
futuro serán productos rentables (Rosa & Péter 2006). 
 
Entre las aplicaciones biotecnológicas en las que participan las levaduras están: 
producción de bioetanol, producción de células de levaduras para suplementos 
alimenticios, producción de moléculas importantes industrialmente (enzimas, lípidos, 
carotenoides, vitaminas, ácidos orgánicos, polisacáridos extracelulares), levaduras como 
probioticos y agentes bioterapéuticos, como agentes de bioremediación, mejoramiento 
de levaduras por mutación, fusión de protoplastos y tecnología del ADN recombinante, 
entre otras cosas (Rosa & Péter 2006). 
 
 
3.6 Estudios de levaduras asociadas bebidas fermentadas en Colombia 
Osorio-Cadavid et al. (2008) identificaron y caracterizaron las levaduras más 
representativas asociadas la bebida fermentada champús. En este estudio se emplearon 
técnicas microbiológicas tradicionales y el análisis RFLP de la región 5.8s ITS para la 
identificación de los aislados. Las especies encontradas en esta bebida fueron: 
Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis, Pichia fermentans, Pichia kluyveri 
var. kluyveri, Zygosaccharomyces fermentati, Torulospora delbruekii, Galactomyces 
geotrichum y Hanseniaspora sp; de las cuales G. geotrichum (estrictamente oxidativa), 
P. fermentans, S. cerevisiae, T. delbruekii y I. orientalis (especies fermentativas) fueron 
las especies con mayor número de aislados. Estas especies también han sido reportadas 
en otros estudios relacionados con fermentaciones basadas en cereales o alimentos con 
 15 
 
alto contenido de almidón, De hecho se ha reportado a S. cerevisiae como la levadura 
más común en bebidas y alimentos fermentados de origen indígena. 
 
4. OBJETVOS 
 
4.1 Objetivo general 
Aislar, identificar y caracterizar las levaduras asociadas a la producción de la chicha de 
maíz. 
 
4.2 Objetivos específicos 
• Aislar las levaduras asociadas a la producción de la chicha de maíz a lo largo 
de las distintas fases del proceso fermentativo (prefermentación, 
fermentación tumultuosa y final de la fermentación) 
• Identificar las levaduras presentes en la chicha de maíz. 
• Aplicar técnicas bioquímicas, fisiológicas y moleculares que permitan la 
identificación y caracterización de la comunidad levaduriforme asociada a la 
producción de la chicha de maíz. 
 
 
 
 
 
 
 
 16 
 
5. MATERIALES Y METODOS 
5.1 Preparación de la chicha de maíz 
Se tomaron 100g de maíz, los cuales se cocinaron por aproximadamente 60 minutos o 
hasta que el maíz ablandara.Luego se licuó en 500mL de agua, posteriormente, se le 
adicionó 50g de panela y 2 clavos de olor y esta preparación se cocinó durante 15 
minutos. Finalmente, la mezcla se dejó enfriar y se puso a fermentar a temperatura 
ambiente en un recipiente cerrado durante 15 días. 
 
 
5.2 Aislamiento de levaduras 
Se realizaron cuatro preparaciones de chicha, para cada preparación diferente se 
hicieron muestreos en cada una de las fases del proceso fermentativo: inicial, 
tumultuosa y final de la fermentación. 
 
En cada muestreo, se realizaron recuentos mediante diluciones seriadas (10-1-10-5
Durante los primeros tres días de la incubación se observó el color y la textura de las 
colonias obtenidas, en paralelo se examinaron microscópicamente la forma de las 
células, tipo de gemación, posteriormente se hicieron pruebas complementarias para 
analizar la capacidad de esporulación y la formación de micelio. A cada cepa de 
) y 
aislamiento mediante siembra en medio de cultivo YPDA (1% extracto de levadura, 2% 
peptona micológica, 2% de glucosa, 2% agar) suplementado con 25mg/L de penicilina y 
cloramfenicol. Las placas se incubaron a 30°C por dos o tres días y se aislaron las 
colonias más representativas. 
 
5.3 Caracterización morfológica y fisiológica 
 17 
 
levadura obtenida se le realizaron pruebas bioquímicas, tales como fermentación de 
azúcares (glucosa, sacarosa, galactosa), crecimiento en compuestos de carbono 
(sacarosa, galactosa, xilosa, almidón), asimilación de almidón; y pruebas fisiológicas 
como halotolerancia (10 y 16% de NaCl) y etanoltolerancia (10 y 15% de etanol), de 
acuerdo a la metodología descrita por Boekhout et al. (2004) (ver Anexo A). 
 
5.4 Extracción de ADN genómico 
La extracción de ADN de los aislados se realizó mediante modificación del protocolo 
propuesto por Querol et al. (1992) (ver anexo B). La cuantificación del ADN extraído se 
obtuvo por espectrofotometría a partir de las absorbancias a 260nm y su pureza se 
determinó con base a la relación A260/A280nm. 
 
5.5 PCR- RFLP´s de la región 5,8S-ITS 
Para la amplificación de la región que comprende el gen ribosomal 5.8S y sus dos 
espaciadores transcritos internos (ITS1 e ITS2), se utilizaron los primers ITS1 (5´-
CCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) 
(White et al. 1990; Suárez et al. 2007). 
 
Para la amplificación, se tomaron 7uL (aproximadamente 1ng/μL) de ADN extraído y 
se resuspendió en 28μL de mezcla de PCR: 0.5μM ITS1, 0.5μM ITS4, 10μM dNTPs, 
1X NH4+, 1.5mM MgCl2, y 1U de Taq Polimerasa. La región del gen de rRNA se 
amplificó en un termociclador (M.J. Research, USA), bajo las siguientes condiciones: 
 18 
 
desnaturalización inicial a 94ºC por 5minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 
1min, apareamiento a 55ºC por 1min, y extensión a 72ºC por 2min, con una extensión 
final de 10min a 72ºC. (Osorio-cadavid et al. En imprenta), Además se siguieron 
atentamente las recomendaciones de la empresa distribuidora de la enzima Taq 
Polimerasa, (Fermentans, USA) La calidad de la amplificación fue evaluada en geles de 
agarosa al 1.5% y visualizadas con Bromuro de Etidio a 240nm. 
 
La digestión de la región amplificada se realizó con las enzimas CfoI, HaeIII y HinfI 
(Esteve-Zarzoso et. al 1999). Para la reacción con cada enzima se utilizaron 9µl de 
amplificado, 1 U de enzima y 1X del buffer de la enzima. Los fragmentos de ADN 
generados por cada enzima fueron visualizados en gel de agarosa al 1.5% teñido con 
bromuro de etidio. Los tamaños, tanto de los amplificados como de los fragmentos de 
restricción, se calcularon usando el software UvigelStartMw v11 ©, tomando como 
referencia el marcador de peso molecular Generuler 50pb. 
 
5.6 Secuenciación del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26S 
Cuando los resultados eran confusos y poco concluyentes utilizando el sistema ITS, se 
amplificó el dominio D1/D2 de la Subunidad grande del gen ribosomal (rRNA) 26S. 
También, se analizó una muestra de cada grupo principal conformado. Los primers 
fueron: NL1 (5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´) y NL4 (5´-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3´). Las reacciones de amplificación (PCR) fueron 
realizadas en un termociclador (Multigene- Labnet, USA) bajo las siguientes 
condiciones: desnaturalización inicial a 94ºC por 5minutos, 30 ciclos de 
 19 
 
desnaturalización a 94ºC por 1min, apareamiento a 55ºC por 30seg, y extensión a 72ºC 
por 1min, con una extensión final de 10min a 72ºC. (Kurtzman & Robnett, 1998). Para 
la amplificación, se tomaron 7uL (aproximadamente 1ng/μL) de ADN Genómico 
extraído y se resuspendió en 28μL de mezcla de PCR: 0.5μM ITS1, 0.5μM ITS4, 10μM 
dNTPs, 1X NH4+, 1.5mM MgCl2, y 1U de Taq Polimerasa. La calidad de la 
amplificación fue evaluada en geles de agarosa al 1.5% y visualizadas con Bromuro de 
Etidio a 240nm. 
 
Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados por la empresa MACROGEN 
(USA) bajo las condiciones estandarizadas por ellos. Posteriormente, las secuencias 
(Forward y Reverse) enviadas vía Internet por la empresa MACROGEN (USA) fueron 
ensambladas mediante el programa Chromas Pro v. 1.42 ® y comparadas con las 
secuencias reportadas en el GenBank usando el algoritmo “Basic Local Alignment 
Search Tool (BLAST)”. Posteriormente, se realizó un alineamiento de las secuencias y 
se realizó un árbol filogenético de Máxima Parsimonia empleando el software MEGA 
4.1 ®. 
 
5.7 Análisis estadístico 
Los aislados fueron agrupados por similitud en los patrones de restricción y 
características bioquímicas y fisiológicas, y fueron verificados mediante Análisis 
Discriminante con el Software STATISTICA 7.0 ®. La prueba de significancia de 
Wilkin´s Lambda con p<0.05 indica que las clasificaciones se realizaron con gran nivel 
de confianza y, variables de predicción con p<0.05 pueden ser discriminatorios en el 
momento de la clasificación. Para calcular las especies dominantes presentes en la 
 20 
 
chicha, se realizó un análisis de porcentaje de frecuencias, el cual indica, en la dilución 
más alta, la probabilidad de encontrar una especie de levadura en cualquier muestreo 
realizado. Para determinar la concentración óptima de enzima beta-glucoronidasa en la 
extracción de ADN genómico de levadura se realizó un Análisis de Varianza (ANOVA) 
Factorial donde la variable respuesta es la concentración de ADN en ng/μl. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 21 
 
6. RESULTADOS 
6.1 Aislamiento 
Los aislados fueron obtenidos mediante la metodología explicada en la sección 5.2. El 
número inicial de colonias aisladas fue de 84, de las cuales 17 pertenecieron a la fase 
inicial del proceso fermentativo (MI), 54 a la tumultuosa (MT) y 13 a la final (MF) 
(figura 1). 
 
 
Figura 2. Representación gráfica de la abundancia de aislados en cada fase de la 
fermentación. 
 
 
En la figura 2, se puede observar claramente que la fase que presento mayor número de 
aislados fue la fase tumultuosa, seguida de la fase inicial y por ultimo, pero no muy 
lejos de la inicial la fase final. 
 
6.2 Caracterización morfológica y fisiológica 
De cada morfotipo encontrado en las tres fases de la fermentación, se realizó una 
descripción morfológica de las colonias y de las células (Tabla 1). 
 22 
 
 
Tabla 2. Agrupamientos por morfotipos de los aislados. Por agrupación se muestra 
representación macroscópica y microscópica del morfotipo. 
Agrupación Aislado Figura Descripción 
 
1 
 
 
 
 
 
MI-
1,2,3,5,8,9,11,13 
MT-
1,2,16,23,25,27,30 
MF-4,6 
 
 
 
Textura colonia = 
Mantequillosa 
Apariencia colonia = 
Lisa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Entero 
Elevación = Umbonada 
Forma= Circular 
 
Forma de la célula = 
Ovalada 
Reproducción asexual 
= gemación monopolar 
Filamentos = no 
encontrado 
 
2 
 
Textura colonia = 
Membranosa 
Apariencia colonia = 
Venosa 
Color colonia = Crema 
Margen colonia = 
Rizado 
Elevación = ElevadaForma= Circular 
 
 MI-4,7,10,12 
MT-13,18,26,29,31 
MF-1,3,5 
 
Forma de la célula = 
Ovalada y cilíndrica 
Reproducción asexual 
= gemación multilateral 
Filamentos = si 
 
3 
 
 
 
 
 
 
 
MI-6 
MT-
6,7,10,11,19,24,36,4
 
Textura colonia = 
Mantequillosa 
Apariencia colonia = 
Lisa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Entero 
Elevación = Convexa 
Forma= Circular 
 
 
 23 
 
0,41,49 
 
Forma de la célula = 
Ovalada y redonda 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = no 
encontrados 
 
4 
 
 
 
 
 
 
 
 
MI-14,15,16,17 
 
Textura colonia = 
Membranosa 
Apariencia colonia = 
Harinosa 
Color colonia = Crema 
Margen colonia = 
Rizado 
Elevación = Elevada 
Forma= Circular 
 
 
Forma de la célula = 
Ovalada 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = no 
encontrados 
5 
 
 
 
 
 
 
MT-3,4,5,8,9, 
12,20, 
21,22,28. 
 
 
 
Textura colonia = 
Mantequillosa 
Apariencia colonia = 
Lisa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Entero 
Elevación = Umbonada 
Forma= Circular 
 
 
Forma de la célula = 
Redondas y ovaladas. 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = No 
encontrados 
 
 
6 
 
 
 
 
MT-14,15 
 
 
Textura colonia = 
Mantequillosa 
Apariencia colonia = 
Lisa 
Color colonia = 
Rosada 
Margen colonia = 
Entero 
Elevación = Convexa 
Forma= Circular 
 
 24 
 
 
Forma de la célula = 
Redonda 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = No 
encontrados 
 
7 
 
 
 
 
 
MT-32 
 
Textura colonia = 
Mantequillosa 
Apariencia colonia = 
Lisa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Entero 
Elevación = Elevada 
Forma= Circular 
 
 
Forma de la célula = 
Redondas 
Reproducción asexual 
= Gemación bipolar 
Filamentos = No 
encontrados 
 
8 
 
 
 
 
 
 
 
MT-34,37,54,55 
 
Textura colonia = 
membranosa 
Apariencia colonia = 
Verrugosa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Ondulado 
Elevación = elevada 
Forma= Circular 
 
 
Forma de la célula = 
Ovaladas y cilíndricas 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = No 
encontrados 
 
9 
 
 
 
 
 
 
 
MT-38,47,48,50,53 
MF-7 
 
 
Textura colonia = 
Mantequillosa 
Apariencia colonia = 
Lisa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Entera 
Elevación = Convexa 
Forma= Circular 
 
 25 
 
 
Forma de la célula = 
Apiculada 
Reproducción asexual 
= Gemación bipolar 
Filamentos = No 
encontrados 
 
10 
 
 
 
 
MF-2 
 
Textura colonia = 
Membranosa 
Apariencia colonia = 
Surcada 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Entero 
Elevación = En relieve 
Forma= Circular 
 
 
 
Forma de la célula = 
Redonda 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = no 
encontrados 
 
11 
 
 
 
MT-33,42,43,44,45 
 
 
 
 
 
 
Textura colonia = 
Membranosa 
Apariencia colonia = 
Harinosa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Ondulado 
Elevación = Convexa 
Forma= Circular 
 
Forma de la célula = 
Ovaladas y cilíndricas 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = No 
encontrados 
 
 26 
 
 
 
12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 MT-35 
 
 
Textura colonia = 
Membranosa 
Apariencia colonia = 
Harinosa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Ondulado 
Elevación = Elevada 
Forma= Circular 
 
Forma de la célula = 
Ovaladas y cilíndricas 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = No 
encontrados 
13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MT-39,46,51,52 
 
 
Textura colonia = 
Membranosa 
Apariencia colonia = 
Harinosa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Ondulado 
Elevación = Elevada 
Forma= Circular 
 
Forma de la célula = 
Ovaladas y cilíndricas 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = No 
encontrados 
13 
 
 
 
MF-9,8 
 
 
Textura colonia = 
Membranosa 
Apariencia colonia = 
Harinosa 
Color colonia = Blanca 
Margen colonia = 
Entero 
Elevación = Elevada 
Forma= Circular 
 
Forma de la célula = 
Ovaladas y cilíndricas 
Reproducción asexual 
= Gemación monopolar 
Filamentos = No 
encontrados 
 
 
 
 27 
 
En la tabla 2 se puede observar, la gran diversidad que se encuentra tanto en las 
colonias, como en las células de las levaduras aisladas durante las diferentes fases del 
proceso de fermentación. Las colonias presentan variedad en su textura, apariencia, 
elevación y margen, el color predominante es el color blanco, seguido del color crema y 
por ultimo el rosado que esta presente solo en los aislados MT-14 y 15, la forma de 
todas las colonias es circular. Entre las características observadas en las células están: la 
forma, que varía entre redonda, ovalada, cilíndrica y apiculada, la reproducción asexual 
que en todas es por gemación, puede ser monopolar, bipolar y multilateral y la presencia 
de filamentos que solo se encuentra en un morfotipo. 
 
Para una mejor caracterización de los aislados presentes en las tres fases de la 
fermentación, se realizaron algunas pruebas como tinción de espora, presencia de 
filamento (Tabla 3) y fermentación y crecimiento en diferentes azucares (Tabla 4) (ver 
sección 5.3). 
 
Tabla 3. Resultados de las pruebas de tinción de espora y filamento de todos los 
aislados. 
Aislados Espora Filamento 
MI-1 - + 
MI-2 - + 
MI-3 - + 
MI-4 - + 
MI-5 - + 
MI-6 - - 
MI-7 - + 
MI-8 - + 
MI-9 - + 
MI10 - + 
MI-11 - + 
MI-12 - + 
MI-13 - + 
MI-14 - + 
MI-15 - + 
MI-16 - + 
 28 
 
MI-17 - - 
MT-1 - + 
MT-2 - + 
MT-3 - - 
MT-4 - + 
MT-5 - - 
MT-6 - + 
MT-7 - + 
MT-8 - + 
MT-9 - + 
MT-10 - + 
MT-11 - + 
MT-12 - + 
MT-13 - + 
MT-14 - - 
MT-15 - 
MT-16 - + 
MT-17 - + 
MT-18 - + 
MT-19 - + 
MT-20 - + 
MT-21 + - 
MT-22 - + 
MT-23 - + 
MT-24 - + 
MT-25 - + 
MT-26 - + 
MT-27 - + 
MT-28 - + 
MT-29 - + 
MT-30 - + 
MT-31 - + 
MT-32 - + 
MT-33 - - 
MT-34 - - 
MT-35 - - 
MT-36 - + 
MT-37 - + 
MT-38 - - 
MT-39 - - 
MT-40 - + 
MT-41 - + 
MT-42 - - 
MT-43 - - 
MT-44 - - 
MT-46 - - 
MT-47 - - 
MT-48 - - 
MT-49 - - 
MT-50 - - 
MT-51 - - 
MT-52 - - 
MT-53 - - 
MT-54 - - 
MT-55 - - 
MF-1 - + 
MF-2 + - 
MF-3 - + 
MF-4 - + 
MF-5 - + 
 29 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Foto del aislado MF-2 que muestra tinción de espora positiva. 
 
 
En la prueba de tinción de espora solo los aislados MT-21 y MF-2 (figura 3) resultaron 
positivos. Por otro lado en la prueba de filamento se presentaron resultados variados, 50 
aislados dieron positivos y 34 negativos (Tabla 3). 
 
Tabla 4. Resultados de las pruebas de crecimiento y fermentación de azucares. 
Aislado 
 Crecimiento Fermentación 
Glc Sac Mal Xil Gal Glc Gal 
MI-1 + + + + 
MI-2 + + + + 
MI-3 + + + + 
MI-4 + + + + 
MI-5 + + + + 
MI-6 + + 
MI-7 + + + + 
MI-8 + + + + 
MI-9 + + + + 
MI-10 + + + + 
MI-11 + + + + 
MI-12 + + + + 
MI-13 + + + + 
MI-14 + - - 
MI-15 + - - 
MI-16 + - - 
MF-6 - + 
MF-7 - - 
MF-8 - - 
MF-9 - - 
MF-10 - - 
MF-11 - - 
MF-12 - - 
MF-13 - - 
 30 
 
MI-17 + - - 
MT-1 + + 
MT-2 + + 
MT-3 + + + 
MT-4 
MT-5 + + + 
MT-6 + + 
MT-7 + + 
MT-8 + + 
MT-9 + + + 
MT-10 + + 
MT-11 + + 
MT-12 + + 
MT-13 + + + 
MT-14 + - 
MT-16 + + 
MT-17 + + + 
MT-18 + + + 
MT-19 + + 
MT-20 + + + 
MT-21 + + + 
MT-22 + + + 
MT-23 + + 
MT-24 + + 
MT-25 + + + 
MT-26 + + + 
MT-27 + + + 
MT-28 + + + 
MT-29 + + 
MT-30 + + 
MT-31 + + + 
MT-32 + 
MT-33 - + 
MT-34 - + 
MT-35 - + 
MT-36 + + 
MT-37 - + 
MT-38 - + - 
MT-39 - + 
MT-40 + + 
MT-41 + + 
MT-42 - + 
MT-43 - + 
MT-44 - + 
MT-46 - + 
MT-47 - + - 
MT-48 - + - 
MT-49 + + 
MT-50 - + - 
MT-51 + + 
MT-52 + + 
MT-53 - + - 
MT-54 + + 
MT-55 + + 
MF-1 + + + 
MF-2 + + + 
MF-3 + + + 
MF-4 + + + 
MF-5 + + + 
MF-6 + + + 
 31 
 
MF-7 - + 
MF-8 - + 
MF-9 - + 
MF-10 - + 
MF-11- + 
MF-12 - + 
MF-13 + + + 
 
Para caracterizar y poder tratar de identificar las levaduras, se realizaron pruebas de 
fermentación y crecimiento en algunos azucares como glucosa, galactosa, sacarosa, 
xilosa y maltosa (Tabla 4). Estas pruebas fueron llevadas a cabo, teniendo en cuenta los 
grupos formados después de aplicar las técnicas moleculares (Tabla 5), es decir, fueron 
realizadas de acuerdo a las necesidades de cada grupo, para lograr asignarlos a posibles 
géneros o especies. 
 
 Tabla 5. Resultados de las pruebas de halo-tolerancia y etanol-tolerancia. 
Aislado Crecimiento Etanol 10% Etanol 15% NaCl 10% NaCl 16% 
MI-1 + + + - 
MI-2 + + + - 
MI-3 + + + - 
MI-4 + + + - 
MI-5 + + + - 
MI-6 + + + - 
MI-7 + + + - 
MI-8 + + + - 
MI-9 + + + - 
MI-10 + + + - 
MI-11 + + + - 
MI-12 + + + - 
MI-13 + + + - 
MI-14 + + + - 
MI-15 + + + - 
MI-16 + + + - 
MI-17 + + + - 
MT-1 + + + - 
MT-2 + + + - 
MT-3 + + + - 
MT-4 + + + - 
MT-5 + + + - 
MT-6 + + + - 
MT-7 + + + - 
MT-8 + + + - 
MT-9 + + + - 
MT-10 + + + - 
MT-11 + + + - 
MT-12 + + + - 
 32 
 
MT-13 - - - - 
MT-14 - - - - 
MT-16 + + + - 
MT-17 + + + - 
MT-18 + + + - 
MT-19 + + + - 
MT-20 + + + - 
MT-21 + + - - 
MT-22 + + - - 
MT-23 + + - - 
MT-24 + + - - 
MT-25 + + + - 
MT-26 + + - - 
MT-27 + + - - 
MT-28 + + - - 
MT-29 + + - - 
MT-30 + + - - 
MT-31 + + - - 
MT-32 + + - - 
MT-33 + + - - 
MT-34 + + - - 
MT-35 + + - - 
MT-36 + + - - 
MT-37 + + - - 
MT-38 + + - - 
MT-39 + + - - 
MT-40 + + - - 
MT-41 + + - - 
MT-42 + + - - 
MT-43 + + - - 
MT-44 + + - - 
MT-46 + + - - 
MT-47 + + - - 
MT-48 + + - - 
MT-49 + + - - 
MT-50 + + + - 
MT-51 + + - - 
MT-52 + + - - 
MT-53 + + - - 
MT-54 + + - - 
MT-55 + + - - 
MF-1 + + + - 
MF-2 + + - - 
MF-3 + + + - 
MF-4 + + + - 
MF-5 + + + - 
MF-6 + + + - 
MF-7 + + - - 
MF-8 + + - - 
MF-9 + + - - 
MF-10 + + - - 
MF-11 + + - - 
MF-12 + + - - 
MF-13 + + + - 
 
 
 33 
 
6.3 Extracción de ADN genómico 
El ADN genómico de cada aislado se obtuvo a partir de la modificación del protocolo 
propuesto por Querol et al. (1992) (Osorio-Cadavid et al., sometido a publicación) 
(sección 5.4). La figura 4 muestra la evaluación de diferentes concentraciones de 
enzima beta-glucoronidasa en dos especies de levaduras (Saccharomyces cerevisiae y 
Pichia kluyveri). 
 
 
Figura 4. Verificación de extracción de ADN en gel de agarosa al 1%. Los carriles 1 a 
9 corresponden a preparaciones de Pichia kluyveri (1-3 200 U, 4-6 100 U, 7-9 50 U). 
Los carriles 10 a 18 corresponden a Saccharomyces cerevisiae (10-12 200 U, 13-15 100 
U, 16-18 50 U). 
 
 
6.4 PCR- RFLP´s de la región 5,8S-ITS 
Para la amplificación de la región que comprende el gen ribosomal 5.8S y sus dos 
espaciadores transcritos internos (ITS1 e ITS2) se uso el método explicado en la sección 
5.5. La verificación de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa al 1.5% y 
teñidos con brumuro de etidio (Figura 5). 
 
 34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Verificación de producto de PCR (4µl/pozo) en gel de agarosa 1.5%. En el 
carril 6 se encuentra el marcador de peso molecular, Generuler 50pb (Fermentas, USA). 
 
En el gel mostrado en la figura 5, los carriles 1-5 corresponden a los aislados MT-27, 
MT-26, MT-25, MT-24, MT-23, respectivamente y en los carriles 7-11 los aislados, 
MT-22, MT-21, MT-20, MT-19, MT-18 respectivamente. El tamaño de las bandas de 
estos islados varía entre 400 y 900pb. 
 
Para la digestión de los amplificados fueron utilizadas las enzimas CfoI, HaeIII y HinfI 
(sección 5.5) y la verificación de los patrones de restricción se realizaron en geles de 
agarosa al 1.5%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados en un transiluminador de 
luz ultravioleta a 260 y a 320 nm. 
. 
 
 35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Verificación de los fragmentos obtenidos a partir de la digestión del 
amplificado en gel de agarosa 1.5%. En los carriles 1, 5 y 8 digestión con CfoI, en los 
carriles 2, 6 y 9 digestión con HaeIII y en los carriles 3, 7 y 10 digestión con la enzima 
Hinf I. En el carril 4 se encuentra el marcador de peso molecular, Generuler 50pb 
(Fermentas, USA). 
 
En la figura 6, se observan los fragmentos obtenidos a partir de la digestión del 
amplificado del ADN de los asilados MT-48 (carriles 1-3), MT-47 (carriles 5-7) y MT-
46 (carriles 8-10). Además, en el gel se observan 2 patrones iguales (MT-48 y MT-47) 
que probablemente corresponden a la misma especie y uno diferente (MT-46). 
 
 
Tabla 6. Agrupaciones formadas de acuerdo al Tamaño de las bandas de los 
amplificados y de los fragmentos de restricción de todos los aislados, calculados usando 
el software UvigelStartMw v11 ©, tomando como referencia el marcador de peso 
molecular Generuler 50pb. 
Aislado 
 
Amplificado Cfo I Hae III Hinf I 
MI-14 443 212-119 400 261-228 
MI-15 443 182 349 217-193 
MI-16 404 191 369 258-229 
MI-17 456 209-186 355 232-198 
MI-6 608 300-266 409 329-300 
MT-1 556 298+272 386 295+279 
 36 
 
MT-2 587 331+291 426 355+323 
MT-6 555 328+280 427 350+325 
MT-7 558 349+305 432 356+336 
MT-8 585 329+292 398 329+305 
MT-10 600 217+182 341 264 
MT-11 600 287+234 398 335 
MT-12 604 325+267 386 279 
MT-16 585 282+246 360 295+268 
MT-19 621 307+262 400 333+297 
MT-23 608 285+243 379 315+297 
MT-24 596 312+276 389 315+288 
MT-30 590 327+274 406 324+303 
MT-36 580 326+287 414 332+310 
MT-40 591 343+310 419 338+305 
MT-41 595 315+269 400 305+279 
MT-49 546 340+276 428 300+280 
MT-3 754 403+366 339+250+200 383 
MT-5 755 400+350 310+232+187 371 
MT-21 865 376+346 297 336 
MF-2 810 372+345 311+240+192 354 
MI-1 524 303 476 314 
MI-5 530 246 429 261 
MI-4 536 249-225 408 247 
MI-2 536 289-252 425 265 
MI-7 526 279-245 457 292 
MI-10 529 300-285 454 291 
MI-12 472 257-234 427 279 
MI-13 535 303-265 455 279 
MT-9 540 305+270 453 276 
MT-13 529 277+253 438 271 
MT-17 490 268+233 433 268 
MT-18 543 295+268 433 259 
MT-20 543 303+259 459 274 
MT-22 543 270+233 413 245 
MT-27 473 289+248 449 262 
MT-31 519 255+219 422 268 
MT-25 579 326+281 413 292 
MT-26 571 309+265 394 294 
MT-28 595 362+327 454 354 
MT-29 505 340+313 454 354 
MF-1 514 303+272 454 270 
MF-3 493 219+193 366 216 
MF-4 487 253+228 419 259 
MF-5 507 286+256 423 234 
MF-6 458 261+232 434 261 
MT-37 412 171 334 254+196 
MT-39 425 173+113 370 289+237 
MT-54 422 167+118 320 236+184 
MT-55 431 187+112 342 275+218 
MT-44 425 170+110 333 265+193 
MT-33 447 161+105 343 275+217 
MT-34 442 182+118 355 269+219 
 37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Después de obtener los geles de verificación de los amplificados y de los fragmentos de 
restricción de los aislados de cada una de las tres fases, las bandas obtenidas fueron 
analizadas usando el software UvigelStartMw v11 ©. Con los tamaños de las bandas se 
realizaron agrupaciones teniendo en cuenta el peso de los amplificados y de los 
fragmentos de restricción, además de las características morfológicas. De acuerdo a esto 
se obtuvieron 9 grupos (Tabla 6). Estos datos posteriormente fueron ingresados a la 
base de datos Yeast-id, para encontrar posibles asignaciones de género o especie de los 
grupos. 
 
 
 
MT-35 429 166+104 328 232+186 
MT-51 422 166+100 331 250+189 
MT-52 431 126+83 294 221+171 
MT-42 444 95+41 267 229+165 
MT-43 425 139+89 311 267+191 
MT-46 384 163+105 335 269+214 
MF-8 409 159+103 312 221+164 
MF-9 428 131+48 331 259+210 
MF-10 437 187+111 349 263+214 
MF-11 437 174105 324 233+188 
MT-38 715 321 770 339 
MT-47 659 333+116 769 364+214+171 
MT-48 700 326+116 734 322+179+146 
MT-50 723 353+116 790 355+198+164 
MT-53 759 294 741 345 
MF-7 692 320 785 366 
MF-12 739 271 710 334 
MT-32 559 344+273 577 326+300 
MT-14 609 332-253 423-246 376-253 
MT-15 609 332-253 423-246 376-253 
MF-13 765 343+236+163 834 450+410 
 38 
 
Tabla 7. Porcentaje de asignación correcta para cada uno de los grupos propuestos 
GRUPO %Correcto G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 
G1 100 29 0 0 0 0 0 0 
G2 100 0 18 0 0 0 0 0 
G3 100 0 0 4 0 0 0 0 
G4 100 0 0 0 4 00 0 
G5 100 0 0 0 0 16 0 0 
G6 100 0 0 0 0 0 7 0 
G7 100 0 0 0 0 0 0 2 
 
Para probar el nivel de confianza de los grupos propuestos se realizó un análisis 
discriminante en cual se obtuvo un lambda de Wilkins < 0.00001 y un p < 0.05, lo que 
soporta estadísticamente los grupos propuestos. En la tabla 7 se presenta el porcentaje 
de asignación correcta de los aislados a cada grupo. De esta manera, el 100% de 
asignación correcta indica que todos los aislados en cada grupo han sido asignados 
correctamente (Tabla 7). 
 
6.5 Secuenciación del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26S 
Se secuenció la región del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26S (ver sección 5.6) para 
un aislado representativo de cada agrupación y para todos los aislados no identificados 
hasta el nivel de género o especie (18 en total). En la tabla 8 se muestra la comparación 
de las secuencias con la base de datos GenBank. 
 
Tabla 8. Alineamiento de secuencias obtenidas con el algoritmo BLAST. Las 
accesiones mostradas son las que representaron el alineamiento más preciso disponible 
en la red. 
Aislado Número accesión porcentaje especie 
MF-3 FJ665624.1 96% Candida tropicalis 
MF-6 FJ665624.1 99% Candida tropicalis 
MI-1 FJ595932.1 100% Candida tropicalis 
MI-5 FJ665624.1 99% Candida tropicalis 
MI-7 FJ665624.1 97% Candida tropicalis 
 39 
 
MI-11 FJ595932.1 99% Candida tropicalis 
MI-14 EU285497.1 98% Pichia kluyveri 
MI-15 EU285497.1 99% Pichia kluyveri 
MT-5 EU327093.1 99% Saccharomyces 
cerevisiae 
MT-11 FJ432597.1 99% Pichia 
guilliermondii 
MT-18 FJ665624.1 99% Candida tropicalis 
MT-21 FJ770557.1 99% Saccharomyces 
cerevisiae 
MT-26 FJ516747.1 98% Candida tropicalis 
MT-29 FJ665624.1 99% Candida tropicalis 
MT-33 EU019222.1 99% Pichia fermentans 
MT-36 FJ432597.1 97% Pichia 
guilliermondii 
MF-13 FJ468458.1 99% Torulaspora 
delbruecki 
MF-4 FJ665624.1 94% Candida tropicalis 
 
En la tabla 8 se puede observar que los porcentajes de alineamiento fueron altos para la 
mayoría de los aislados a excepción de el aislado MF-4 que presenta un porcentaje de 
tan solo 94% para Candida tropicalis. 
 
6.6 Levaduras encontradas en la chicha 
Después de aplicar los diversos métodos para la identificación de las levaduras, las 
especies obtenidas por fase se muestran en la tabla 8. 
 
Tabla 9. Frecuencia de especies encontradas de acuerdo a la fase de fermentación 
muestreada. 
Fase Número de aislados Especie o género 
Inicial 
12 Candida tropicalis 
4 Pichia kluyveri 
1 Pichia guilliermondii 
Tumultuosa 
5 Hanseniaspora guilliermondi 
13 Pichia fermentans 
3 Saccharomyces cerevisiae 
17 Pichia guilliermondii 
 40 
 
 
 
 
 
Figura 7. Relación de riqueza y abundancia de especies de levaduras presentes en la 
producción de la chicha de maíz. 
 
 
La tabla 9 y la figura 7 muestran que en la fase inicial se encontraron 3 especies, en la 
fase tumultuosa 7 y en la fase final 5 especies, de esta manera la fase que presento 
1 Candida maltose 
12 Candida tropicalis 
2 Rhodotorula glutinis 
Final 
2 Hanseniaspora guilliermondii 
4 Pichia fermentans 
1 Saccharomyces cerevisiae 
1 
5 
Torulaspora delbruecki 
Candida tropicalis 
Subtotal 
identificados 
83 
 
Subtotal no 
identificados 
0 
Total 83 
 41 
 
mayor diversidad fue la tumultuosa, seguida de la fase final y por ultimo la fase inicial. 
Además el total de especies de levaduras encontradas en todo el proceso de 
fermentación fue de 9. 
 
Tabla 10. Especies de levaduras encontradas en el proceso de la fermentación de la 
chicha de maíz. Por especie se muestra la morfología de las colonias y de las células. 
Especie Imagen Aislados 
 
 
 
 
 
Candida 
tropicalis 
 
 
 
 
MI-1,2,3,4,5,7,8, 
9,10,11,12,13 
 
MT-9,13,17,18, 
20,22,25,26,27,28,2
9,31 
 
MF-1,3,4,5,6 
 
 
 
Pichia kluyveri 
 
 
 
 
MI-14,15,16,17 
 
 
Pichia 
guilliermondii 
 
 
 
MI-6 
 
MT-
1,2,6,7,8,10,11, 
12,16,19,23,24,30,3
6,40,41,49 
 
 
Hanseniapora 
guilliermondii 
 
MT-38,47,48,50,53 
 
MF-7,12 
 42 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pichia 
fermentans 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MT-
33,34,35,37,39,42, 
43,44,46,51,52,54, 
55 
 
 
MF-8,9,10,11 
 
 
 
 
 
Saccharomyces 
cerevisiae 
 
 
 
 
 
MT-5,3,21 
 
MF-2 
 43 
 
 
 
Candida 
maltosa 
 
 
 
MT-32 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rhodotorula 
glutinis 
 
 
 
 
 
 
MT-14,15 
 
 
En la tabla 10, se pueden observar las especien encontradas en el proceso de 
fermentación de la chicha de maíz. Además se muestran las imágenes de las colonias y 
de las células de cada unas de las especies. Lo que más se destaca es que en la especie 
Candida tropicalis se presentaron dos morfologías diferentes tanto en la colonia como 
en las células, en la especie Pichia fermentans se obtuvieron 4 morfologías diferentes en 
las colonias sin embargo la forma de las células es igual y en la especie Saccharomyces 
cerevisiae se observaron 2 colonias con morfologías diferentes. 
 
 
 
 
 
 44 
 
7. DISCUSIÓN 
7.1 Aislamiento y caracterización parcial 
El aislamiento de las levaduras se realizó a partir de diluciones seriadas a lo largo de las 
fases de la fermentación, con su posterior siembra en el medio YPDA, esta es una 
metodología comúnmente empleada en los trabajos con levaduras (Esteve-Zarzoso et al. 
2001, Guillamón et al. 1996, Clemente-Jiménez et al. 2004). El YPDA es un medio de 
cultivo para el crecimiento y viabilidad a mediano plazo de levaduras ascomicetosas, lo 
que dificulta el aislamiento y mantenimiento de levaduras basidiomicetosas (Boekhout 
et al. 2004), lo que trae como consecuencia, que las levaduras aisladas en este estudio, 
no reflejan el total de la población de levaduras que posiblemente intervienen en el 
proceso fermentativo de la chicha de maíz. 
 
La caracterización de los aislados encontrados se baso en: la morfología de las colonias 
y de las células, tipo de reproducción asexual, pruebas fisiológicas de esporulación, 
filamentación y pruebas de crecimiento y fermentación de compuestos de carbono. La 
morfología de las células permite en ocasiones poder inferir a que posible género 
pertenece un aislado, ya que algunas formas son típicas, como la forma apiculada de las 
células de Hanseniaspora, o la forma de botella de las especies del género Malasezzia, 
de la misma forma la morfología y pigmentación de las colonias pueden servir de guía, 
como en el caso del genero Rhodotorula en el que la colonias se caracterizan por tener 
un color entre rosado y salmón, además de ser redonda y con superficie elevada. Sin 
embargo, en algunos casos estas características no fueron de gran ayuda, ya que se 
presentaron colonias con formas diferentes a las que típicamente se reportan, lo que 
dificulto al momento de caracterizar las agrupaciones formadas después del análisis 
 45 
 
molecular, ya que no coincidían las formas de las colonias de algunos aislados con los 
que formaban grupo, lo que hacia dudar sobre su pertenencia de estos grupos, como en 
el caso de Candida tropicalis que presento 2 morfologías diferentes o Pichia 
fermentans que mostro 4 tipos de morfologías. 
 
La capacidad de formar filamentos y la capacidad de producir esporas son 
características importantes a la hora del agrupamiento e identificación de levaduras, ya 
que pueden delimitar los géneros para las posteriores comparaciones taxonómicas 
(Kurtzman y Fell 1998). En los resultados obtenidos con la prueba de tinción de 
esporas, solo los aislados MT-21 Y MF-2 fueron positivos, estos pertenecen a la especie 
Saccharomyces cereviciae, sin embrago los aislados MT-3 y 5 que también son de esta 
especie no lo fueron, lo que muy probablemente se debió a errores en la realización de 
la prueba. 
 
Las pruebas fisiológicas no fueron usadas como metodología de identificación final, 
sino que se emplearon como complemento a la caracterización molecular y 
comparación en bases de datos. Es decir, que en muchos casospara varios aislados sólo 
se realizaron pruebas que permitieron la diferenciación entre parejas de especies, las 
más usadas fueron el crecimiento y capacidad de fermentación de diferentes fuentes de 
carbono. La mayor dificultad con las pruebas fisiológicas fue la ambigüedad a la hora 
de las lecturas de los resultados, por ejemplo para las pruebas de crecimiento en fuentes 
de carbono se utilizó la escala de Wickerham, con el fin de describir la turbidez del 
medio de acuerdo a un rango y así obtener el resultado, en algunos aislados la turbidez 
fue tal que el resultado fue contundente observable después de dos o tres días de 
 46 
 
incubación. Sin embargo, para otros aislados se presentaron dificultades a la hora de ser 
catalogados, debido a que el crecimiento en la fuente de carbono presente era muy débil, 
o porque la fermentación de este compuesto solo se lograba alcanzar de forma visible 
solamente después de dos o tres semanas de incubación. 
 
 De la misma manera, se presentaron problemas en los test de fermentación con la 
interpretación del contenido de gas en los tubos durham, para los fermentadores débiles, 
retrasados o negativos, y en ocasiones se registraron pérdidas de gas en algunos tubos al 
cabo de algunos días, lo que concluía en resultados erróneos. Además de esto, estas 
pruebas demandan una gran cantidad de tiempo, pues para realizarlas es necesario 
preparar inóculos nuevos y disponer de 21 días para la lectura final de algunos aislados. 
 
Lo anterior confirma la poca utilidad de las pruebas morfológicas, fisiológicas y 
bioquímicas como únicas pruebas de diagnóstico, para asignar un determinado aislado a 
un género o a una especie. Sin embargo, esto no significa que estas pruebas no sean de 
importancia, ya que muchos aislados que con las pruebas moleculares no pueden ser 
identificados, con la ayuda de unas pocas pruebas fisiológicas o bioquímicas, o aún 
morfológicas, son fácilmente diferenciados e identificados. 
 
7.2 Caracterización molecular e identificación 
La caracterización molecular de los aislados se realizó mediante el análisis PCR-RFLP 
del gen ribosomal 5.8S y sus dos espaciadores transcritos internos (ITS1 e ITS2). Esta 
técnica descrita por Esteve-Zarzoso et al. (1999), es actualmente la más usada para la 
 47 
 
identificación molecular de levaduras, por ser un método rápido y fácil. Esta 
metodología ha sido usada para la identificación de levaduras de diversas bebidas 
fermentadas tales como, la bebida tradicional colombiana“champús” (Osorio-Cadavid et 
al. 2008), el “hamei” un vino de arroz tradicional de la India (Jeyaram et al. 2008), la 
cidra (Morrisey et al. 2004), entre otras. También, Zott et al. (2008) se basaron en esta 
técnica para observar la dinámica y diversidad de las levaduras no-Saccharomyces 
durante las etapas tempranas en la elaboración del vino. 
 
Por medio del análisis molecular se pudieron realizar agrupaciones, de acuerdo al 
tamaño de los amplificados y de los patrones de restricción, y su nivel de confianza fue 
probado a través de un análisis discriminante. Uno de los principales limitantes para el 
establecimiento de las agrupaciones, fueron las diferencias de tamaño de las bandas 
entre patrones similares, debido posiblemente a las diferencias de corrida provocadas 
por cambios de voltaje. Además, la diferencia del número de bandas, provocada por 
digestiones parciales, tinciones de poco contraste que no permiten diferenciar la banda, 
o la ausencia por bajo peso molecular; ambos inconvenientes también fueron un 
obstáculo importante al momento de ingresar los tamaños de los patrones a la base de 
datos Yeast-id, ya que muchas veces las diferencias entre los tamaños y el número de 
bandas eran muy grandes lo que llevaba a que la base de datos arrojara asignaciones 
erróneas o con porcentajes de similitud muy bajos. No obstante, estas dificultades al 
momento de obtener y buscar interpretar los resultados en algunos casos, ésta técnica es 
importante para el diagnóstico inicial de las levaduras. 
 
 48 
 
Para poder identificar los grupos de aislados que no se lograron asignar a una especie, 
con el análisis molecular, la caracterización fisiológica y morfológica, se procedió a la 
amplificación del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26S para su posterior 
secuenciación. 
 
 La secuenciación de regiones específicas del genoma de las levaduras es un método 
rápido para el reconocimiento de especies y su resolución no se limita a taxa 
estrechamente relacionados. Peterson & Kurtzman (1991) determinaron que el dominio 
2 de la subunidad grande del ADN ribosomal, es suficientemente variable para definir 
especies. Kurtzman & Robnett (1998) ampliaron el anterior trabajo a ambos dominios 1 
y 2 (D1/D2) de la subunidad grande de ADN ribosomal para todas las especies de 
levaduras Ascomicetosas conocidas y Fell et al. (2000) publicaron las secuencias D1/D2 
de todas las levaduras Basidiomicetosas, completando así la base de datos de todas las 
levaduras conocidas hasta esa época. 
 
En este estudio, los resultados obtenidos por la secuenciación de los dominios D1/D2 
del gen ribosomal 26S, fueron comparados mediante BLAST siguiendo la metodología 
ya descrita. De esta manera se pudieron determinar las especies a las que pertenecían 
estos aislados. Los porcentajes de identidad máxima arrojados fueron en su mayoría 
superiores al 97%, a diferencia de los aislados MF-3 y 4 que fueron del 96 y 94% 
respectivamente. Debido a que diferenciaciones nucleotídicas superiores al 1% son 
suficientes para proponer especies nuevas; se podría sugerir que para los aislados 
anteriores es necesario realizar la secuenciación de más regiones de ADN (ribosomales 
y mitocondriales para proponerlos como posibles nuevas especies. 
 49 
 
 
Después de aplicar todos los métodos mencionados para la identificación, las especies 
encontradas en la chicha de maíz fueron: Candida tropicalis, Pichia kluyveri, Pichia 
guilliermondii, Hanseniapora guilliermondii, Pichia fermentans, Saccharomyces 
cerevisiae, Candida maltosa, Rhodotorula glutinis y Torulaspora delbruecki. 
 
7.3 Levaduras encontradas en la chicha de maíz 
En total fueron encontradas 9 especies diferentes de levaduras a lo largo de las tres fases 
de la fermentación de la chicha. En la fase inicial se encontraron 3 especies: Candida 
tropicalis, Pichia kluyveri y Pichia guilliermondii, en la fase tumultuosa 7 especies: 
Candida tropicalis, Pichia guilliermondii, Hanseniapora guilliermondii, Pichia 
fermentans, Saccharomyces cerevisiae, Candida maltosa y Rhodotorula glutinis y en la 
fase final 5 especies Candida tropicalis, Hanseniapora guilliermondii, Pichia 
fermentans, Saccharomyces cerevisiae y Torulaspora delbruecki. 
 
La fase que presentó mayor diversidad en especies de levaduras fue la tumultuosa, 
seguida de la fase final y por último la fase inicial. Este resultado, contradice la 
hipótesis muy bien conocida de que, en el proceso de la fermentación alcohólica en la 
fase inicial, existe mayor diversidad y a medida que el proceso fermentativo avanza a 
las fases intermedia y final, permanecen o aparecen como más representativas 
únicamente las levaduras que producen o toleran concentraciones de alcohol más altas. 
Este resultado no esperado, se debió posiblemente a que durante el proceso de 
elaboración de este tipo de chicha, el maíz que podría pensarse es la fuente de la gran 
 50 
 
mayoría de las levaduras, debe cocinarse por mucho tiempo hasta lograr que se ablande, 
lo cual lleva a pensar que, en el momento en que se toma la muestra de la fase inicial las 
levaduras presentes en el maíz, probablemente se encuentren en estado de latencia, o sus 
poblaciones hayan caído drásticamente (en unidades formadoras de colonias) o que 
algunas hayan sido destruidas y solo hayan sobrevivido aquellas con capacidad de 
formación de esporas y que porsu poca abundancia, no hayan sido encontradas en las 
diluciones realizadas. 
 
La especie Candida tropicalis fue la única que estuvo presente en las tres fases de la 
fermentación, con la mayor representación de aislados, en total 29 de 83 aislados 
pertenecieron a esta especie. En la fase inicial fue la especie con mayor número de 
aislados presentando el 70%, en la fase tumultuosa fue la tercera con una representación 
de 23% y en la fase final también fue la que presento mayor número de aislados con un 
38%. De esta manera Candida tropicalis predominó en el proceso de fermentación de 
la chicha de maíz. Esta especie también ha sido reportada en otras bebidas fermentadas: 
Sefa-Dedeh et al. (1999) encontraron a Candida tropicalis en “pito”, que es una bebida 
fermentada tradicional en Ghana (África), que se realiza a base de cereales como el 
maíz y el sorgo, en esta bebida fue la segunda especie con mayor cantidad de aislados 
después de Saccharomyces cerevisiae. Gassem (2002), también la reportó en la bebida 
tradicional fermentada “sobia” de Arabia Saudita, que se realiza a base de harina de 
trigo y malta, como la segunda especie con mayor cantidad de aislados igualmente 
después de Saccharomyces cerevisiae. Gadaga et al. (2000) reportaron Candida 
tropicalis en la leche tradicional fermentada de Zimbabue “amasi”, con poca frecuencia 
a diferencia de las bebidas anteriores a base de cereales. 
 51 
 
 
La especie Pichia guilliermondii fue encontrada en las fases inicial y tumultuosa. En la 
fase inicial presento la menor cantidad de aislados con una representación del 6% y en 
la fase tumultuosa fue la especie con mayor cantidad de aislados, con un 32%. Esta 
especie ha sido reportada en diferentes bebidas fermentadas. Morrissey et al. (2004), 
encontró esta especie durante la fermentación de la cidra, una bebida tradicional de 
Irlanda fabricada a base de manzana. Jeyaram et al. (2008), aisló esta especie de 
“hamei”, un vino de arroz tradicional de la India. Zott et al. (2008), identificaron a 
Pichia guilliermondii evaluando la dinámica y diversidad de levaduras no-
Saccharomyces durante las etapas tempranas de la elaboración del vino. 
 
Algunas investigaciones relacionadas con la contaminación de vinos, han reportado a 
Pichia guilliermondii como responsable de la pérdida de varias características 
organolépticas importantes en vinos almacenados (Dias et al. 2003). Martorell et al. 
(2006), evaluaron la capacidad de producción de 4 –etilfenol en 32 cepas de P. 
guilliermondii relacionadas con vinerías, encontrando niveles de producción diferentes 
entre cepas. Se pudieron distinguir dos grupos de cepas de acuerdo al nivel de 
producción de 4-etilfenol, uno de los grupos mostró un rango de producción de 0.1 – 1 
mg/l mientras que el otro grupo presentó una producción más alta de 51 – 68.9 mg/l. 
Además también encontraron una relación entre los patrones de restricción de ADN 
mitocondrial y la producción de 4-etilfenol por parte de las cepas. 
 
 52 
 
El 4-etilfenol es un compuesto volátil con una fuerte influencia sobre el sabor del vino, 
y es una de las principales moléculas en los vinos rojos. En particular, altas cantidades 
de este compuesto en vinos rojos genera una condición conocida como hedor fenólico 
(Chatonnet et al. 1992, Rodrigues et al. 2001). Así pues, la presencia de esta molécula 
es de gran importancia no sólo en vinos sino también en otras bebidas fermentadas, 
siempre y cuando no llegue a concentraciones elevadas, por tal razón es de gran 
importancia la presencia de especies como Pichia guilliermondii y Dekkera anomala 
durante las etapas iníciales de la fermentación y que posteriormente se de el reemplazo 
de las mismas por especies de alto poder fermentativo como Saccharomyces cerevisiae. 
 
Pichia kluyveri ha sido utilizada como una especie co-fermentativa en procesos de 
producción de bebidas fermentadas, uno de estos involucró la producción de tioles 
volátiles que añaden aroma y sabor al “Sauvignon Blanc” de Nueva Zelanda. La 
presencia de esta especie durante el proceso fermentativo mejoró las concentraciones de 
3-mercaptohexil acetato añadiendo valores a las características organolépticas de la 
bebida (Anfang et al. 2009). Osorio-Cadavid et al. (2008) también mostraron la 
importancia de esta especie en la producción de compuestos volátiles, detectando la 
producción de butil caprilato en la bebida tradicional colombiana “champús”, además 
fue el primer reporte en bebidas fermentadas a base de cereales. A diferencia de los dos 
reportes anteriores, Ferreira et al. (2008) resaltan la importancia de Pichia kluyveri por 
su alta actividad pectinolítica a lo largo de la fermentación de la pulpa y el mucilago de 
café. 
 
 53 
 
Saccharomyces cerevisiae es la especie de mayor interés en la producción de bebidas 
fermentadas, ya que produce y tolera altas concentraciones de etanol y sintetiza 
compuestos volátiles que le dan buen sabor y aroma a las bebidas. Esta especie ha sido 
encontrada en bebidas alcohólicas obtenidas a partir de diferentes sustratos como frutas 
y cereales, siendo la mayoría de las veces la de mayor abundancia. Omemu et al. (2007) 
aislaron cepas de Saccharomyces cerevisiae de “ogy” que es una bebida que se produce 
de la fermentación del maíz, sorgo o millo en los países del oeste de África. Jeyaram et 
al. (2008) identificaron esta especie en la bebida “hamei”, que es un vino de arroz 
tradicional de la India. En la bebida tradicional del África “pito” fue la especie con 
mayor representación de aislados (Sefa-Dedeh et al. 1999). Clemente-Jimenez et al. 
(2004), reportaron Saccharomyces cerevisiae durante la fermentación espontanea del 
mosto de seis variedades de uva. En la cidra fue la levadura predominante en las etapas 
finales de la fermentación (Morrisey et al. 2004). Osorio-Cadavid et al. (2008), la 
encontraron en la bebida tradicional “champús” bebida refrescante típica de Cali, Valle 
del Cauca-Colombia. 
 
La especie Pichia fermentans fue la segunda especie con mayor representación de 
aislados en las fases tumultuosa (25%) y final (31%). Esta especie, también ha sido 
encontrada en otros tipos de bebidas fermentadas, como en el tradicional “champús” 
que fue reportada como una de las levaduras fermentativas mas dominantes (Osorio-
Cadavid et al. 2008). Celemente-Jiménez et al. (2004) identificaron esta especie 
durante la fermentación espontanea de 6 variedades de mosto de uvas, como una alta 
productora de etil caprilato y 2-fenil etanol que son compuestos que proporcionan 
agradable aroma a la bebida. Pichia fermentans también fue aislada por Botes et al. 
 54 
 
(2007), en “boza” que es una bebida de bajo contenido de alcohol que se produce por la 
fomentación de avena, millo, maíz o arroz. 
 
Moreira et al. (2008), resalta la importancia de la interacción de las levaduras no-
Saccharomyces en las etapas tempranas de la elaboración de bebidas fermentadas, 
destacando el papel de la especie Hanseniaspora guilliermondii en la calidad final de 
vinos fabricados a partir de inóculos iniciadores. Esta especie presentó resistencias a 
concentraciones de etanol del 7.2%, y tuvo una producción significativa de glicerol, 
además participó en la síntesis de alcoholes de cadena larga y presentó los mayores 
niveles de 2-feniletilacetato, ambos compuestos de gran importancia para el aroma del 
vino y responsables del olor intenso del banano y la manzana. Esta especie también se 
ha encontrado haciendo parte de la flora no-Saccharomyces en vinos de jerez (Esteve-
Zarzoso et al. 2001). 
 
Candida maltosa, Rhodotorula glutinis y Torulaspora delbruecki, fueron las especies 
que se encontraron con menor frecuencia en la chicha de maíz. Candida maltosa se 
encontró solo en la fase tumultuosa con 1 de 53 aislados, esta especie también fue 
aislada por Morais et al. (1997) en la fermentación