Elaboración de Inóculos de Microorganismos Lácticos Probióticos para Cerdos

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ELABORACIÓN DE INÓCULOS DE MICROORGANISMOS LÁCTICOS 
PROBIÓTICOS PARA APLICACIÓN A RACIONES DE ALIMENTO DE CERDOS 
EN PRIMERAS FASES DE CRECIMIENTO 
 
 
 
 
DIANA MARCELA AGUIRRE FERNANDEZ 
 
 
 
 
 
 UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
 
ELABORACIÓN DE INÓCULOS DE MICROORGANISMOS LÁCTICOS 
PROBIÓTICOS PARA APLICACIÓN A RACIONES DE ALIMENTO DE CERDOS 
EN PRIMERAS FASES DE CRECIMIENTO 
 
 
 
 
 
 
DIANA MARCELA AGUIRRE FERNANDEZ 
 
 
 
 
 
 UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
 
ELABORACIÓN DE INÓCULOS DE MICROORGANISMOS LÁCTICOS 
PROBIÓTICOS PARA APLICACIÓN A RACIONES DE ALIMENTO DE CERDOS 
EN PRIMERAS FASES DE CRECIMIENTO 
 
 
 
 DIANA MARCELA AGUIRRE FERNANDEZ 
 
 
Trabajo de grado como requisito parcial para optar para título de Biólogo 
 
 
 Director 
Germán Bolívar 
Biólogo, Ph. D. 
 
 
 UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009
ii 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2009 
 
 
 
 
AUTOR: DIANA MARCELA AGUIRRE (1985) 
 
 
 
TÍTULO: ELABORACIÓN DE INÓCULOS DE MICROORGANISMOS 
LÁCTICOS PROBIÓTICOS PARA APLICACIÓN A RACIONES DE ALIMENTO 
DE CERDOS EN PRIMERAS FASES DE CRECIMIENTO 
 
 
 
 
Materias o Tema: Microbiología, Bacterias lácticas, Probióticos, Raciones de alimento, 
cinéticas de fermentación. 
 
Nota de Aprobación 
iii 
 
 
 
 
 
El trabajo de grado titulado ―Elaboración de inóculos de microorganismos lácticos 
probióticos para aplicación a raciones de alimento de cerdos en primeras fases de 
crecimiento‖, presentado por el estudiante DIANA MARCELA AGUIRRE FERNÁNDEZ, 
para optar al título de Biólogo, fue revisado por el jurado y calificado como: 
 
 
 
APROBADO 
 
 
______________________________ 
Germán Bolívar 
Director 
 
______________________________ 
Jurado 
 
 
 
iv 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
A mi familia por el apoyo que me ofrecieron durante toda mi carrera y el desarrollo de mi 
trabajo de grado. 
 
 
 
A mi director de tesis, por brindarme su apoyo y amistad durante la realización de este 
proyecto. 
 
 
 
A la profesora Cristina Ramírez, por darme la oportunidad de trabajar en este proyecto, por 
sus comentarios, sugerencias y por la confianza depositada en mí. 
 
 
 
A mis compañeras de laboratorio por su apoyo incondicional y su compañía durante el 
trabajo de laboratorio. 
 
 
 
A la profesora Neyla Benítez, por su apoyo en mi trabajo de grado. 
 
 
 
A mis amigas Alejandra, Leidy, Fanny, Aura, Lina y Kathe por su amistad durante toda mi 
carrera. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
 
Tabla de contenido 
1. RESUMEN .................................................. ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. 
2. INTRODUCCION ............................................................................................................ 2 
3. MARCO TEORICO ......................................................................................................... 5 
3.1. Industria porcina……………………………………………………………………...5 
3.1.1. Enfermedades tracto gastrointestinales (TGI) en cerdos lactantes ................... 5 
3.1.2. Uso de antibióticos ........................................................................................... 6 
3.2. Uso de probióticos en la microbiología………………………………………………7 
3.2.1. Bacterias Ácido Lácticas .................................................................................. 8 
3.2.2. Genero Lactobacillus ........................................................................................ 9 
4. OBJETIVOS ................................................................................................................... 11 
4.1. General……………………………………………………………………………...11 
4.2. Específicos………………………………………………………………………….11 
5. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 12 
5.1. Selección de un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos lácticos12 
5.1.1 Preservación de cepas del estudio .................................................................... 12 
5.2. Optimización del crecimiento de los microorganismos lácticos, mediante cinéticas de 
fermentación………………………………………………………………………………..13 
5.2.1 Determinación de pH ..................................................................................... 14 
5.2.2 Determinación de ácidos orgánicos por HPLC ............................................. 14 
5.2.3 Conteo de microorganismos viables en placa UFC/mL ................................. 15 
5.2.4 Determinación de azúcar total ....................................................................... 15 
5.2.5 Evaluación de la producción de biomasa ..................................................... 16 
5.3. Elaboración de inóculos e inclusión de los probióticos en la ración………………..17 
5.3.1 Cinética de secado de la ración con bacterias lácticas probióticas ................. 18 
5.4. Identificación bioquímica…………………………………………………………...18 
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 20 
6.1 Selección de un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos lácticos.20 
6.2 Cinéticas de fermentación…………………………………………………………..22 
6.4.1 Determinación de pH .................................................................................. 22 
vi 
 
6.4.2 Determinación de ácidos orgánicos por HPLC ........................................... 23 
6.4.3. Conteo de microorganismos viables en placa UFC/mL ................................. 24 
6.4.4 Determinación de azúcar total .................................................................... 26 
6.4.5 Evaluación de la producción de biomasa ........................................................ 28 
6.6 Identificación bioquímica…………………………………………………………...30 
6.7 Elaboración de inóculos e inclusión de los probióticos en la ración………………..32 
6.9 Cinética de secado de la ración con bacterias lácticas probióticas………………….34 
7 CONCLUSIONES ........................................................................................................... 38 
8 LITERATURA CITADA ................................................................................................ 39 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
LISTA DE FIGURAS 
 Pág 
 
Figura 1. Tubos con caldo MRS para criopreservación. ..................................................... 13 
 
Figura 2. Coloración de Gram de bacterias lácticas. (a) Pro 1b y (b) Pro 2b. ................... 20 
 
Figura 3. Viabilidad de los cuatro medios de cultivo líquidos a 35°c durante 24 horas. .... 21 
 
Figura 4. Evolución del pH, por parte de las cepas Pro 1b y Pro 2b en el medio de cultivo 
seleccionado y en medio MRS. ............................................................................................ 23 
 
Figura 5. Viabilidad en UFC/mL y pH de las cepas Pro 1b y Pro 2b, en los medios MRS y 
M4. ........................................................................................................................................ 25 
 
Figura 6. Consumo de azúcares totales y viabilidad en UFC/mL, por parte de las dos cepas 
Pro1b y Pro2b, en los dos mediosutilizados. ....................................................................... 27 
 
Figura 7. Galería API 50 CH. (a. Cepa Pro1b y b. Cepa Pro2b). ........................................ 31 
 
Figura 8. Empaque al vacío de inóculos junto con la ración. ............................................. 32 
 
Figura 9. Viabilidad del inóculo junto con la ración pasadas 24 horas. .............................. 33 
 
Figura 10. Cinetica de secado para Lactobacillus plantarum 1, hasta obtener el 12% de 
humedad. .............................................................................................................................. 34 
 
Figura 11. Viabilidad de los microorganismos lácticos en la ración UFC/g y lectura de 
AW durante tres semanas. .................................................................................................... 35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
 
 
 
LISTA DE TABLAS 
 Pág 
 
 
TABLA 1. Formulaciones de los medios de cultivo para la producción de biomasa……..18 
 
TABLA 2. Perfil característico de la producción de ácidos orgánicos por Pro 1b y Pro 
2b…………………………………………………………………………………………..30 
 
TABLA 3. Datos cinéticos del crecimiento bacteriano de la cepa Pro 1b en dos medios de 
cultivo………………………………………………………………………………………35 
 
TABLA 4. Datos cinéticos del crecimiento bacteriano de la cepa Pro 2b en dos medios de 
cultivo………………………………………………………………………………………36 
 
TABLA 5. Identificación bioquímica de Pro1b y Pro2b por medio de la galería API 50 
CHL………………………………………………………………………………………...37 
 
 
 
1 
 
1. RESUMEN 
Los probióticos se están utilizando en estudios enfocados en la alimentación directa por 
medio de dietas en el campo de la producción porcina, por sus efectos benéficos en el tracto 
gastrointestinal. Por esta razón, éste trabajo tiene como propósito la estandarización e 
implementación de inóculos de bacterias lácticos aisladas del intestino de cerdo, en la 
elaboración de inóculos para incluirlos en raciones alimenticias de cerdos en destete, como 
potencial alternativa a antibióticos en caso de presentarse infecciones entéricas. Para esto 
se realizo la selección de un medio de cultivo adecuado, para la elaboración de los inóculos, 
además se efectuaron cinéticas de fermentación para obtener resultados de la evolución del 
pH, determinación de ácidos orgánicos, conteo de microorganismo viables en UFC/mL, 
determinación de azucares totales, evaluación de la producción de biomasa con el fin de 
estandarizar la producción de inoculo, también se llevo a cabo la identificación bioquímica 
de las cepas, la elaboración de la ración y cinéticas de secado para la conservación de las 
raciones; obteniéndose como resultado, que las dos cepas identificadas como Lactobacillus 
plantarum 1, presentaron un mejor comportamiento en el medio de cultivo M4, logrando un 
pH entre 3.8 y 3.9 y viabilidades superiores a 10
8
UFC/mL. La cepa Pro1b es 
homofermentativa por su producción de ácido láctico en un 80%, presentando una 
viabilidad superior de 10
13
UFC/mL y un tiempo de duplicación menor de 12 horas menor 
en el M4, en cambio que la cepa Pro2b presento una viabilidad de 10
11
UFC/mL y un 
tiempo de duplicación de 15 horas en el M4. Además en la realización de la cinética de 
secado se obtuvieron los mejores resultados por parte de la cepa Pro1b a 40°C, con una 
viabilidad final de 10
7
UFC/g. Concluyendo que Pro1b presento mejores resultados para su 
uso como potencial probiótico.
2 
 
2. INTRODUCCION 
 
Al estar recién nacidos los cerdos quedan expuestos a microorganismos del ambiente que 
les rodea, de igual manera entran en contacto con las heces maternas que contienen 
bacterias que colonizarán su tracto digestivo. Estas bacterias buscan un nicho adecuado, 
donde compiten e interactúan entre sí, para establecer finalmente una población 
relativamente estable y compleja que va a representar la microbiota intestinal normal del 
lechón (Boucourt et al. 2004 & Stamati 2006). 
Durante las primeras dos o tres semanas de vida del lechón, el patrón de producción de 
enzimas digestivas está adaptado para digerir la leche materna exclusivamente; en estas tres 
primeras semanas de vida las enzimas proteolíticas, específicamente pepsina, tripsina y 
quimiotripsina, son responsables de hidrolizar la fracción proteica del alimento, 
contribuyendo al buen funcionamiento y la estabilidad del aparato digestivo de los lechones 
lactantes (Mejía-Silva et al. 2007) 
Sin embargo, esta estabilidad puede ser alterada por cambios dietéticos o ambientales 
importantes en el tracto gastrointestinal (TGI), en donde se encuentran normalmente un 
gran número de especies de bacterias comensales y patógenas; además, al incrementar la 
cantidad de microorganismos patógenos se pueden producir problemas entéricos y hasta la 
muerte del lechón; siendo esto, una de las principales causas de pérdidas económicas en la 
industria porcina (Lázaro et al. 2005 & Boucourt et al. 2004 ), resultando de gran 
importancia un equilibrio correcto dentro de la microbiota del TGI, para que facilite la 
digestión y la máxima absorción de nutrientes, aumentando la resistencia a las 
enfermedades infecciosas de los cerdos, para poder someterlos a la alimentación sólida y 
son transportados a la producción de las explotaciones agrarias (Lázaro et al. 2005). 
3 
 
Al ser, la digestión de estos lechones de gran importancia en la industria, a través del 
tiempo se han utilizado terapéuticamente antibióticos en la alimentación de animales para 
mejorar la salud y el bienestar de ellos y para obtener mejores resultados en la industria 
porcina. Sin embargo, el uso de estos antibióticos ha llevado a un desequilibrio de los 
beneficios de la flora intestinal, efectos residuales en los alimentos y el desarrollo de cepas 
de patógenas resistentes para los seres humanos e incluso para los mismos lechones 
(Duncker 2006 & Pérez et al. 2007). 
Debido a la acción negativa de los antibióticos en el TGI, las bacterias lácticas con 
características probióticas se han introducido como una solución alternativa promisoria, 
siendo suministradas en cantidades adecuadas a través de inóculos, proporcionando el 
equilibrio de la microbiota intestinal (Brizuela 2003, Taras 2007 & Missotten 2007). Estos 
probióticos son descritos como ―microorganismos vivos que, cuando se administran en 
cantidades adecuadas, brindan un beneficio de salud en el hospedero‖. En general, el 
trabajo con probióticos en alimento para cerdos es estimular el crecimiento, el sistema 
inmunológico, suprimir los agentes patógenos a través de la competencia, exclusión y / o 
síntesis de compuestos inhibitorios, además reducen la incidencia de diarreas tanto en su 
morbilidad como en su mortalidad (Rinkinen et al. 2003, Scharek 2005 &De Angelis et al. 
2007). 
 
Es de gran importancia tener en cuenta que la respuesta de los probióticos en la dieta 
depende en parte de la cepa utilizada; pues, no todas las cepas tienen la misma capacidad de 
acción en la microbiota intestinal o la misma capacidad para unirse a las células 
intestinales, ya que en gran parte su éxito depende de la resistencia a condiciones 
especificas del tracto gastrointestinal, como la existencia de sales biliares y pH extremos 
4 
 
que hacen del TGI un ambiente hostil (Rodríguez et al. 2003); además tiene que poseer 
características tales como: ser habitante normal del intestino, tener un tiempo corto de 
reproducción, ser capaz de producir compuestos antimicrobianos, ser estable durante el 
proceso de producción, comercialización y distribución para que pueda acoplarse al 
intestino (Brizuela 2003), las bacterias más prominentes son los Lactobacillus, ya que 
constituyen parte mayoritariade la flora natural del TGI y son muy importantes en la 
producción de ácidos orgánicos, los que tienen un efecto benéfico (Boucourt et al. 2004); 
considerando lo anterior, el presente estudio tiene como propósito la selección de un medio 
de cultivo, para la elaboración de inóculos de dos cepas de microorganismos lácticos que 
han sido aislados del intestino de cerdos adultos y caracterizados como probióticos, para 
aplicarlos en la ración de alimento de cerdos en sus primeras fases de crecimiento, como 
potencial uso en el control de enfermedades entéricas facilitando el suministro en campo . 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
3. MARCO TEORICO 
 
3.1. Industria porcina 
El cerdo es una de las carnes de mayor consumo a nivel mundial, superando algunas veces 
a la carne de vacuno, aves y pescado. En las últimas décadas los productores de porcinos 
han mejorado notablemente la calidad de la carne invirtiendo en genética, alimentación, 
nutrición y manejo. Obteniendo como resultado, la carne de cerdo más magra, conteniendo 
menos colesterol y calorías, estimulando así su consumo, reflejando un aumento de la 
producción del cerdo. A pesar de estos adelantos, todavía se presentan dificultades a nivel 
sanitario y productivo en áreas críticas de los sistemas modernos de producción, así como 
en el procesamiento de productos cárnicos (Roppa 2006 y Mejía-Silva et al 2007). 
Una de las etapas de la vida del cerdo que más retos presenta a nivel sanitario es la de 
lactancia y destete, en la cual es común la presentación de patologías como es el caso de los 
brotes de diarrea ocasionadas por microorganismos entéricos tales como: E. coli, C. 
perfringens, S. typhimurium, etc., los cuales son responsables de producir deficientes 
ganancias de peso, pobre conversión alimenticia, trastornos en su sistema inmunológico y 
en casos severos la muerte del animal, que pueden llegar alrededor del 41% (Conde 2002 y 
APCS – AVESUI 2004). 
3.1.1. Enfermedades tracto gastrointestinales (TGI) en cerdos lactantes 
 
En el tracto gastrointestinal se encuentra normalmente un gran número de especies de 
bacterias comensales y patógenas; sin embargo, cuando se incrementa la cantidad de 
microorganismos patógenos se pueden producir alteraciones de la salud del lechón, la 
eficacia en la digestión animal depende de los microorganismos que viven en su tracto 
6 
 
digestivo de forma natural, en donde la interacción de la dieta y de esta microbiota en los 
mamíferos es extremadamente compleja. Un balance correcto dentro en la microbiota del 
(TGI), facilita una digestión eficiente y una máxima absorción de nutrientes e incrementa la 
resistencia a enfermedades infecciosas en cerdos, que se presentan por cambios en el estilo 
de vida y en la dieta, desequilibrio en estas interacciones y en la ecofisiología del TGI 
(Lázaro et al. 2005, De Angelis 2006 y Pérez 2007), además los métodos de manejo 
actuales en los animales de granja también están relacionados con los problemas del TGI, 
en donde es muy común que los cerdos durante el destete y en las edades tempranas en 
donde son sometidos a alimentación solida, ocasionando diarrea, pérdida de peso y en 
algunos casos la muerte. En donde Las principales formas de control de enfermedades 
entéricas se basan en el uso de antibióticos vía alimento. 
3.1.2. Uso de antibióticos 
 
En décadas pasadas para contrarrestar estas dificultades, las dietas se han suplementado con 
antibióticos los cuales han sido efectivos en la disminución de diarreas y para promover el 
crecimiento (Armstrong, 1986, Parker y Armstrong, 1987), este método común para 
prevenir enfermedades y aumentar la eficiencia alimentaria ha sido utilizado como 
promotor del crecimiento, pero se ha comprobado que estos tienen influencias negativas en 
la composición de la microbiota gastrointestinal, ya que los Lactobacillus son muy 
susceptibles a los antibióticos. Además, contribuyen a la antibiorresistencia bacteriana y a 
su presencia residual en las carnes, huevo, leche y otros productos de origen animal. Por 
esta razón se han introducido los probióticos como una solución alternativa promisoria que 
cobra cada día mayor interés (Pérez et al. 2007). 
7 
 
3.2. Uso de probióticos en la microbiología 
 
Desde la aparición de la microbiología, algunos investigadores como Metchnikoff (1907), 
Tissier (1984), Carre (1987) atribuyeron que las bacterias ácido lácticas presentaban efectos 
sobre la salud, como el cambio en el equilibrio microbiano intestinal. Metchnikoff (1907) 
planteó que la ingestión de yogur conteniendo lactobacilos, provocaba una reducción de las 
bacterias patógenas en el intestino y aumentaba la longevidad del hospedero; Tissier (1984) 
recomendó la administración de bifidobacterias a infantes que sufrían de diarrea, y postuló 
que estas bacterias reemplazan las bacterias patógenas que causan la enfermedad, además 
demostró que estas eran los microorganismos predominantes en la biota intestinal de 
infantes alimentados con leche materna. Por su parte Rettger y Cheplin (1921), Kopeloff 
(1926) y Rettger y cols (1935) demostraron en sus investigaciones que Lactobacillus 
acidophillus podía sobrevivir en el intestino humano mientras que el Lb. bulgaricus no 
poseía esa capacidad. El importante papel que juega la microbiota intestinal para la 
resistencia a enfermedades fue mostrado por Bohnhoff y cols (1954) Freter (1954, 1955 y 
1956) y Collins y Carter (1978) quienes demostraron que la administración oral de 
antibióticos a ratones, daba lugar a animales más susceptibles a infecciones con Salmonella 
typhimurium, Shigella flexneri y Vibrio cholerae; además los probióticos también se han 
utilizado en conejos y en lechones mejorando el equilibrio microbiano intestinal, sin 
generar resistencia a patógenos ni residuos indeseables y también se les atribuye una 
capacidad inmunoestimulante (Chiquieri 2006). 
Estas bacterias lácticas recibieron el nombre de probiótico, esta palabra se deriva del 
griego “pro bios” (a favor de la vida) y ha tenido varios significados a través de los años; 
primero por Lilley y Stillwell (1965) en donde las definieron como sustancias secretadas 
8 
 
por un microorganismo que estimulaba el crecimiento de otro; esta definición no persistió y 
fue subsecuentemente usada por Sperti (1971) para describir extractos de tejido que 
estimulaban el crecimiento microbiano. No fue, sino hasta 1974 que Parker los definió 
como: organismos y sustancias que contribuyen al balance microbiano intestinal. Fuller 
(1989) redefinió los probióticos como ―suplemento alimenticio microbiano vivo que afecta 
benéficamente al animal huésped mejorando su balance microbiano intestinal‖. En 1992, 
Havenaar y Huis in’t Velt consideraron los probióticos como aquellos que al ser 
suministrados en animales o humanos, producen efectos benéficos en la salud del 
hospedero por el incremento de las actividades de la microbiota nativa. Sin embargo, 
considerando las definiciones anteriores, Schezenmeier de Vrese (2001) propusieron la 
definición: ―Preparación de un producto que contiene microorganismos viables en 
suficiente número, los cuales alteran la microbiota en un compartimiento del huésped 
provocando efectos beneficiosos sobre la salud del mismo‖ (Oyetayo 2005, Figueroa et al. 
2006 & Ortiz et al. 2007). 
 
3.2.1. Bacterias Ácido Lácticas 
 
Las características más comunes de este grupo de bacterias son: gran positivas, inmóviles, 
no esporuladas, cocos y bacilos, catalasa negativas, presentan carencia de citocromos (lo 
que se refleja en la ausencia de metabolismo respiratorio generador de energía), no licuan 
gelatina y no producen sulfuro de hidrogeno (Betancourt & Quintero 2002). 
Estas bacterias también se encuentran distribuidas en diferentes morfologías como: cocos, 
que pueden presentar una forma esférica y otros, una forma más o menos alargada entre 
0.5y 2 µm llamados coco-bacilos, se presentan en pares tétradas o cadenas de numero 
9 
 
variado. Los géneros Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus y Enterococcus están 
dispuestos en pares o cadenas, los géneros Pediococcus y Tetragenococcus forman células 
dispuestas en tétradas. Los bastones regulares pueden tener un diámetro variable entre 0.5 
y 2 µm y una longitud hasta de más de 10 µm, presentándose solos en pares o en cadenas 
largas; a este grupo pertenecen los Lactobacillus y por último tenemos los bastones 
irregulares los cuales son característicos de las bacterias lácticas del genero 
Bifidobacterium y son típicos por sus aspectos extremadamente variables a otra (Betancourt 
& Quintero 2002). 
Además las bacterias ácido lácticas (BAL) desdoblan carbohidratos y producen ácido 
láctico y otros metabolitos descendiendo el pH hasta 4,7; se clasifican en homo o 
heterofermentativas. Las bacterias homofermentativas sintetizan sólo ácido láctico sin 
liberar CO2. Entre ellas está Lactobacillus plantarum, utilizado para fabricación de masas 
ácidas, leches ácidas, cárnicos madurados y vegetales fermentados (1, 3, 4). Las bacterias 
heterofermentativas generan, además de ácido láctico, una cantidad apreciable de etanol, 
acetato y CO2, como Lactobacillus brevis y Leuconostoc sp (León et al 2006). 
3.2.2. Genero Lactobacillus 
 
El grupo de las bacterias ácido lácticas comprende una gran variedad de géneros y especies, 
que se clasifican dentro de este grupo, las cuales producen como producto final de su 
metabolismo ácido láctico. Este grupo incluye a los Lactobacillus, los cuales tienen un 
metabolismo fermentativo estrictamente sacarolítico y de acuerdo a la producción de ácido 
se clasifican en homofermentativas estrictas que producen fundamentalmente ácido láctico 
como producto principal (entre 70-80%) de su metabolismo, mientras que las 
10 
 
heterofermentativa producen además ácido acético, CO2, y etanol con un 50% de 
producción de ácido láctico. Pueden producir diferentes isómeros ópticos 
del ácido láctico que incluyen la forma D, L, ó DL, es importante señalar que tanto el tipo 
de ácido láctico producido como la ruta metabólica empleada son características distintivas 
de las diferentes especies, aunque las condiciones medio ambientales pueden influir en el 
balance de los productos finales de la fermentación (Brizuela 2003), además estas bacterias 
toleran moderadas concentraciones de acidez (pH entre 3 y 4) por varias semanas, sin sufrir 
grandes alteraciones en su viabilidad y fisiología. Sin embargo, valores de pH por debajo de 
estos pueden provocar afectaciones en sus características e inclusive hasta su muerte 
(Brizuela 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
4. OBJETIVOS 
 
4.1. General 
 
Elaborar inóculos con microorganismos lácticos, aisladas del intestino de cerdo con 
características probióticas, para la preparación de raciones de alimento de cerdos 
destetados. 
 
4.2. Específicos 
 
- Seleccionar un medio de cultivo para el crecimiento de los microorganismos 
lácticos. 
- Realizar un estudio de optimización del crecimiento de los microorganismos 
seleccionados en el medio elegido, mediante estudio de cinéticas de fermentación. 
- Estandarizar la adición de inóculos en la ración de alimento, para obtener la 
viabilidad microbiana requerida para alimento probiótico. 
- Identificar bioquímicamente las dos cepas probióticas seleccionadas en el estudio 
preliminar. 
 
 
 
12 
 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
5.1. Selección de un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos lácticos. 
 
Se llevó a cabo, una selección del medio de cultivo, para las dos cepas escogidas 
preliminarmente. Se probando con los cuatro medios de cultivo hechos a partir de soya, 
suero de leche, azúcar y salvado de trigo, comparándolos contra el medio comercial MRS. 
Los medios de emplearon con el fin de desarrollar un medio de cultivo económico, viable a 
nivel industrial pero que permita condiciones de crecimiento similares o mejores a las del 
medio de cultivo comercial. La variable de respuesta fue la viabilidad de la cepa, evaluada 
a las 24 horas de fermentación. 
Tabla 1. Formulaciones de los medios de cultivo para la producción de biomasa. 
 
Medio Composición 
MRS(1) D-glucosa 20g/L; extracto de carne 8 g/L; extracto de levadura 4g/L. 
Medio 2 
(M2) 20g/l sacarosa; 14g/l leche de soya; 130g/l suero de leche; 30g/l salvado de trigo 
Medio 
3(M3) 15g/l sacarosa; 12g/l leche de soya; 120g/l suero de leche; 10g/l salvado de trigo 
Medio 4 
(M4) 10g/l sacarosa; 15g/l % leche de soya;150g/l suero de leche; 10g/l salvado de trigo 
 
5.1.1 Preservación de cepas del estudio 
 
Cada una de las cepas aisladas previamente en el proyecto preliminar, de diferentes 
trayectos intestinales, principalmente de colon y recto, y de materia fecal, provenientes de 
cerdos adultos sanos, fueron cultivadas en medio MRS con azul de anilina para ayudar al 
reconocimiento de los microorganismos lácticos según lo recomendado por Giraud (1992) 
13 
 
y Ramírez (2005), ya que las bacterias lácticas pueden diferenciarse por la asimilación del 
azul de anilina presente en el medio; el material fue sembrado por dilución de acuerdo a lo 
requerido, incubando a 30 ˚C en aerobiosis para selección de microorganismos facultativos; 
luego se verifico su pureza mediante coloración de Gram y se resembraron en tubos con 
caldo MRS, para ser criopreservarlas con 25% de glicerol a -20˚C (Figura 1). Una parte del 
material purificado fue preservado en tubos inclinados y en caldo para ser utilizado en este 
proyecto. 
 
Figura 1. Tubos con caldo MRS para criopreservación. 
5.2. Optimización del crecimiento de los microorganismos lácticos, mediante cinéticas 
de fermentación 
 
Con las cepas seleccionadas como las mejores probióticas y el mejor medio seleccionado, 
se efectuaron cinéticas de fermentación para verificar y optimizar las mejores condiciones 
para producción de biomasa y elaboración de los inóculos para aplicar en la ración. Las 
cinéticas se efectuaron en un fermentador de 2 litros a 30˚C, con velocidad de agitación de 
120 r.p.m.; en este caso no se hizo control de pH de los microorganismos seleccionados. 
Las mediciones o toma de muestras se efectuaron cada tres horas durante 24 horas, los 
parámetros que se consideraron en el proceso de fermentación fueron: evolución del pH, 
14 
 
conteo de células viables UFC/mL, consumo de azúcar total y producción de ácidos 
orgánicos por HPLC, en el medio de cultivo seleccionado y en MRS. 
5.2.1 Determinación de pH 
 
Las medidas de evolución del pH se realizaron con un pHmetro ORION, cada tres horas 
por 24h, los datos obtenidos de la evolución indicaron la producción de ácidos en el 
proceso. 
5.2.2 Determinación de ácidos orgánicos por HPLC 
 
Para evaluar la síntesis de metabolitos fue utilizada la cromatografía líquida de alta 
eficiencia HPLC. Esta técnica permitió determinar la concentración de ácidos orgánicos, 
azúcares simples y complejos por los mecanismos de separación de moléculas por acción 
combinada de intercambio iónico, separación molecular e interacciones hidrofóbicas 
usando columnas con resina (Aminex HPX 87H, 300mm). 
La producción de ácidos puede comprometer la inhibición del crecimiento bacteriano 
durante la evolución del proceso. Debido a esto se requiere, verificar su producción y 
correlacionar con el crecimiento microbiano. La evaluación de la síntesis de estos 
metabolitos se llevó a cabo siguiendo las mismas condiciones descritas anteriormente 
 
15 
 
 
 
 
 
5.2.3 Conteo de microorganismos viables en placa UFC/mL 
 
La técnica de conteo en placa propicia la información del número de células viables durante 
el proceso en términos de UFC/mL, permitiendo determinar la evolución de la producción 
de biomasa. No se efectuaron medidaspor peso seco ni por turbidimetría debido a las 
elevadas cantidades de sólidos en suspensión del medio de cultivo. Para los conteos se 
diluyó 1 mL de muestra en 9 mL de agua peptonada al 0,1% y efectuadas las diluciones 
decimales hasta 10
-12
, de cada dilución fueron transferidos 0.1mL a cajas de Petri con 
medio MRS-azul de anilina, para siembra en superficie. Las cajas fueron incubadas en 
estufa a 30 ˚C y observadas entre las 24 y 48 horas y consideradas las cajas de Petri con 
conteos de UFC/mL entre 30 y 300 colonias. El número de colonias fue multiplicado por el 
inverso de la dilución y por 10 para obtener las UFC/mL formadas (Lanara 1981). 
5.2.4 Determinación de azúcar total 
 
La cuantificación de azúcar permitió determinar el consumo de estos para el crecimiento de 
los microorganismos y ayuda a establecer la relación de consumo/crecimiento celular. Los 
azúcares fueron determinados por el método de Dubois (1956), conocido por el método de 
antrona. Se preparó previamente una curva patrón con diferentes concentraciones de la 
solución patrón glucosa; los valores obtenidos de la lectura de densidad óptica (D.O) a 525 
nm fueron graficados versus la concentración en mg/L. 
16 
 
La dosificación de los azúcares presentes en las muestras en estudio fue efectuada sobre 2,5 
mL de muestra previamente diluída en agua destilada y adicionados 5 mL de antrona 
preparada en ácido sulfúrico. Los valores obtenidos de las muestras se calcularon por la 
ecuación de la recta, obtenidos en la curva patrón y multiplicados por el factor de dilución. 
 
5.2.5 Evaluación de la producción de biomasa 
 
Los resultados obtenidos permitieron determinar las cepas que resultaron ser más 
adecuadas en términos tiempo-tasa de crecimiento durante el proceso de fermentación para 
establecer el tiempo de duración en la producción de biomasa. 
Los cálculos de fermentación para las cinéticas son los definidos por Crueger (1993) y 
Rodríguez et al., (2003). La velocidad específica de crecimiento definida por la ecuación 
tiempo de duplicación celular. 
 
Siendo la velocidad específica de crecimiento definida por la ecuación: 
 
v max = dln X
 dt
 
 
El tiempo de duplicación celular: 
td = ln2
 v
 
17 
 
La velocidad específica de formación de productos está basada en la producción de manitol 
en la fase exponencial de crecimiento dado que este es un producto asociado de la 
fermentación estará definido como: 
q p = P
 T
 
Los resultados obtenidos permitieron determinar las condiciones o tratamientos más 
adecuados en términos de tiempo - tasa de crecimiento, rendimiento durante el proceso de 
fermentación. 
5.3. Elaboración de inóculos e inclusión de los probióticos en la ración 
 
Los inóculos se elaboraron utilizando las cepas y el medio seleccionado que presentó 
mayor viabilidad a las condiciones definidas en la cinética, de acuerdo con Ramírez (2005). 
Para el proceso de elaboración de los inóculos, la fermentación se interrumpió al final de la 
fase logarítmica, la población microbiana producida durante la fermentación no puede ser 
menor de 10
8
 UFC/mL para poder conseguir posteriormente poblaciones mínimas de 10
7
 
UFC/g en la ración elaborada, la ración probiótica se elaboró a partir del inoculo 
adicionándola al concentrado para cerdos suministrado por CERVALLE en forma de 
pellet. Fueron pesados 30 gramos de pellet al cual se le incorporó el 20% del inoculo de la 
cepa seleccionada, donde se incubó a 40° C por 24 horas; finalmente se efectuó un conteo 
de viabilidad (UFC/g) para la ración con la cepa incorporada. 
 
 
 
18 
 
5.3.1 Cinética de secado de la ración con bacterias lácticas probióticas 
 
Para obtener raciones que reunieran las condiciones óptimas de secado, que presentasen 
las condiciones de humedad finales requeridas de 12% con una viabilidad no menor a 
10
8
UFC/g, siendo esto recomendado para un alimento probiótico. Fue necesario efectuar 
una curva o cinética de secado; para el ensayo se consideraron tres repeticiones. Se 
determinó la humedad de la muestra inicial y la pérdida de peso mediante el porcentaje de 
humedad en el tiempo, siguiendo el método recomendado por Pregnolatto-Pregnolatto 
(1985), la ración inoculada fue sometida a un proceso de secado en una estufa con 
circulación de aire vertical en bandejas perforadas, considerando las temperaturas de 
35°C y 40°C hasta alcanzar una humedad de 12%, siendo medida la humedad de las 
muestras cada tres horas. De este modo se obtuvo el resultado óptimo de secado en el 
tiempo. Posteriormente las raciones se empacaron en bolsas con 5 gr del alimento y se 
dejaron a temperatura ambiente siguiendo lo recomendado por Ocampo (2006) y 
Lertworasirikul (2008). 
La determinación de la vida útil de las raciones secas con inoculo incluído, se determinó 
siguiendo los métodos recomendados por Alexandre (1997); mediante la medición de la 
viabilidad de los microorganismos lácticos en la ración por UFC/g durante cuatro semanas 
y la lectura de la actividad de agua (AW). 
5.4. Identificación bioquímica 
 
 Esta prueba de identificación bioquímica se realizaró solo con las cepas seleccionadas que 
presentaron las mejores características como probióticas La identificación inicial se efectuó 
mediante la fermentación de carbohidratos con utilización de las galerías API 50 CHL para 
19 
 
identificación bioquímica de bacterias lácticas (Biomereux) De ROISSART y LUQUET 
(30). El API 50 CHL permitió el estudio de la fermentación de 49 azúcares. El 
microorganismo a ser estudiado fue colocado en suspensión en el medio y luego inoculado 
cada tubo de la galería API 50 CHL. Durante la incubación el catabolismo de glúcidos 
conduce a la formación de ácidos orgánicos que permiten el cambio del indicador del pH. 
Los resultados obtenidos permitieron determinar el perfil bioquímico de cada cepa, 
facilitando la identificación de la cepa. Las pruebas de fermentación de carbohidratos se 
realizaron en cultivos de 24 horas de crecimiento en caldo MRS. Las lecturas fueron hechas 
a las 24 y 48 horas después de la inoculación en las galerías API. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
 
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
6.1 Selección de un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos lácticos 
 
Las dos cepas de microorganismos lácticos (Figura 1), que se utilizaron, fueron aisladas 
previamente del estudio () intestino grueso de cerdo, denominadas Pro1b y Pro2b; con el 
propósito de ser utilizadas en la misma especie, siendo esto fundamental por la 
especificidad por el hospedero. 
 
 
 
Figura 2. Coloración de Gram de bacterias lácticas. (a) Pro 1b y (b) Pro 2b. 
 
Lo que constituye una alternativa que se centra en la limitación del crecimiento de 
patógenos en el intestino, fomentando el crecimiento de otras bacterias que compitan contra 
estas en la colonización de los nichos intestinales, es decir la ―exclusión competitiva‖ 
(Pluske & Pethick 2005), gracias a esto el animal fortalece su sistema inmunológico, 
facilitando así la colonización de las bacterias lácticas y su acción prebiótica. 
 
a. b. 
21 
 
De acuerdo a la metodología descrita en el ítem 5.1, se selecciono el medio de cultivo más 
eficiente para cada cepa, siendo la variable respuesta la viabilidad de los microorganismos en cada 
medio de cultivo evaluados; además para cada cepa se determinó también la viabilidad en el medio 
de cultivo patrón MRS. En el estudio de viabilidad en el tiempo en los cuatro inóculos, se 
presento una mayor viabilidad en el medio 4 (M4) por parte de las dos cepas (Figura 3). 
 
 
Figura 3. Viabilidad de los cuatro medios de cultivo líquidos a 35°c durante 24 horas. 
 
La cepa Pro1b y Pro2b, presentaron un comportamiento similar en el medio MRS, M3 y en 
el medio M4. Mientras que la viabilidad más alta se observo en el medio M4;este medio 
aunque contenga mayor cantidad de suero de leche, siendo este la fuente de carbono y de 
nitrógeno (Urribarrí et al. 2006), los otros componentes del medio están presentes en 
menores cantidades, resultando ser un medio más económico que el medio comercial 
(MRS) y más recomendable para el crecimiento de los microorganismos. Debido que los 
precios relativamente altos de los medios de cultivo comerciales para la producción de 
probióticos, da como resultado que el uso de estos productos no sea rentable en el sector 
porcino, una producción conjunta de grandes cantidades de biomasa en un medio de cultivo 
22 
 
más económico y adecuado podría ser una alternativa adecuada para resolver este problema 
(Pérez 2007, Mayra & Bigret 1993). 
6.2 Cinéticas de fermentación 
 
Las bacterias lácticas han sido utilizadas tradicionalmente como cultivos iniciadores para la 
fermentación de ciertos sustratos (Betancuor & Quintero 2002), en este caso las cinéticas 
que se le realizaron a las dos cepas en los medios de cultivo permitió comparar el 
comportamiento de los parámetros que se siguieron para control del crecimiento; como la 
evolución del pH, los tipos de ácidos orgánicos que se produjeron, el final de la fase 
logarítmica, el consumo de azucares totales y la producción de biomasa. 
6.4.1 Determinación de pH 
 
Se realizaron las medidas de pH durante la cinética de fermentación, encontrando que cada 
tres horas el pH disminuía, llegando a un pH final de 3,8 Pro1b y 3,9 Pro2b en el M4 
(Figura 3). Estos resultados se presentan, debido a que las bacterias lácticas son capaces de 
disminuir el pH del sustrato donde se encuentran por debajo del valor 4.0; esta acidificación 
del medio se presenta por la propiedad de las bacterias lácticas de producir ácido láctico, 
logrando de esta forma disminuir o evitar el crecimiento de casi todos los otros 
microorganismos competidores, exceptuando el de otras bacterias lácticas y el de las 
levaduras (Bergey 1992, Bolívar 2008 & Vásquez 2009), además, las bacterias lácticas se 
encuentran entre los microorganismos empleados para la producción de ácido láctico, en 
donde consume los nutrientes presentes en el suero de leche del medio de cultivo, 
principalmente la lactosa; siendo capaz de convertir el 85 % de la fuente de carbono 
23 
 
suministrada en ácido láctico (Urribarrí et al. 2006), lo que podría estar indicando que a 
medida que pasa el tiempo la producción de acido láctico incrementa, bajando el pH, 
evitando así la proliferación de patógenas . Se observó que la disminución de pH, no afectó 
la viabilidad de las bacterias lácticas del estudio y que fue muy similar al control. 
 
 
Figura 4. Evolución del pH, por parte de las cepas Pro 1b y Pro 2b en el medio de cultivo 
seleccionado y en medio MRS. 
 
 
6.4.2 Determinación de ácidos orgánicos por HPLC 
 
Con respecto a la prueba de HPLC (Tabla 4), se encontró que la cepa Pro 1b es 
homofermentativa por su producción de acido láctico en un 80%, de acuerdo a lo expresado 
por (Brizuela 2003) para considerar una cepa homofementativa, mientras que la cepa Pro 
2b produjo un 76% de acido láctico, identificándola como heterofermentativa; esta prueba 
24 
 
demuestra que las dos cepas presentaron diferencias, en la producción de ácidos orgánicos, 
encontrando que fuera de producir en mayor cantidad acido láctico, hay mayor producción 
de acido cítrico por parte de Pro 1b y acido acético por parte de Pro 2b. 
Tabla 2. Perfil característico de la producción de ácidos orgánicos por Pro 1b y Pro 2b 
 
 
 
 Ácido Cítrico Glucosa 
Acido 
Succínico 
Acido 
Láctico 
Acido 
Acético Etanol 
Pro 1b 2,82(g/l) 3,95(g/l) 0,72 (g/l) 
25,39 (g/l) 
80,94% 1,51(g/l) 0,93(g/l) 
Pro 2b 
1,89 (g/l) 
 
2,66( g/l) 
 
0,12( g/l) 
 
17,42 (g/l) 
76,0% 
3,48 (g/l) 
 
0,02 (g/l) 
 
 
Es de gran importancia seleccionar bacterias lácticas homofermentativas, como candidatos 
para el desarrollo de aditivos con potencialidades probióticas (Brizuela 2003), por esta 
razón la determinación de producción de acido láctico por HPLC, permite escoger cual de 
la dos cepas bacterianas es la mas apropiada en la inclusión de la ración, debido a su alta 
producción de acido láctico. Además las bacterias acido lácticas homofermentativas son 
muy utilizadas, porque este ácido es altamente palatable, además permite la eliminación de 
bacterias indeseables a nivel del tracto gastrointestinal (Brizuela 2003); aunque se encontró 
que solo una de las dos cepas era homofermentativa, se opto por realizar los estudios con 
las dos cepas, debido que son nativas del intestino de cerdo; además, aunque la producción 
de acido láctico de la cepa Pro 2b no sea tan elevada, al realizar la medición de pH, 
presentó un pH de 3.9 siendo este valor recomendado por Londoño-Uribe (2008), para la 
supervivencia en el tracto gastrointestinal y la inhibición de bacterias patógenas. 
6.4.3. Conteo de microorganismos viables en placa UFC/mL 
 
25 
 
Al realizar el conteo de microorganismos viables en UFC/mL, se pudo establecer una 
comparación entre el medio comercial MRS y el establecido por Ramírez (2005), para 
determinar en cuál de los dos hay una mayor producción de biomasa y como evoluciona el 
pH (Figura 4). 
 
 
 
 
 
Figura 5. Viabilidad en UFC/mL y pH de las cepas Pro 1b y Pro 2b, en los medios MRS y 
M4. 
 
Se encontró que tanto en medio comercial como en M4, las dos cepas estudiadas 
alcanzaron una viabilidad superior de 10
8
UFC/mL, valor reportado por Brizuela (2003), 
como valor ideal para el empleo de estos microorganismos en la obtención de 
preparaciones probióticas. Es de gran importancia que al realizar estudios para la selección 
de cepas de Lactobacillus como potenciales probióticos en animales, se observe si los 
26 
 
componentes de los medios de cultivo le aportan a los microorganismos lo necesario para 
presentar un crecimiento óptimo; esto fue lo que presentó en el medio M4 en donde da una 
viabilidad de 10
11
UFC/ml por parte de las dos cepas. Se observó un comportamiento 
uniforme del pH, en la cepa Pro1b se encontró que hasta las 9 horas el pH en el medio MRS 
es mayor que el del medio M4, pero al descender el pH del medio MRS se estabiliza con el 
del M4; observándose los mismos resultados para Pro2b, en donde hasta las 9 horas se 
presenta una diferencia en el pH de los dos medio. Indicando que en cuestión de obtener un 
pH bajo tanto las dos cepas, como los dos medios de cultivo pueden ser utilizados, como 
potenciales probióticos, pero para obtener una viabilidad alta se recomienda el uso del 
medio M4. 
 
6.4.4 Determinación de azúcar total 
 
Al realizar el estudio de azucares totales, se obtuvo el porcentaje de consumo de azúcar, por 
parte de las dos cepas en el M4 y en el MRS (Figura 5). 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
 
 
 
Figura 6. Consumo de azúcares totales y viabilidad en UFC/mL, por parte de las dos cepas 
Pro1b y Pro2b, en los dos medios utilizados. 
 
Se presentó un mayor consumo de azúcar por parte de la cepa Pro1b en los dos medios de 
cultivo, al finalizar la fase logarítmica. Para Callewaert y De Vuyst (1996), la principal 
causa de la finalización de la fase activa de crecimiento celular, es el agotamiento de la 
glucosa como fuente de energía; pudiendo indicar que la cepa Pro1b es una alta 
consumidora de glucosa, como fuente de alimento. De esta manera, se podría decir que el 
M4 es el medio que le proporciona una mayor cantidad de glucosa, obteniéndose un 
crecimiento apropiado para su uso como probiótico. Mientras que en el MRS la cepa 
consume menor cantidad de glucosa, posiblemente porque la formulación este medio solo 
28 
 
tiene una fuente de azúcar. Mientras que la cepa Pro2b, consumió una mayor cantidad de 
glucosa en el M4, que en el MRS; dando como resultado que el medio M4 es el adecuado 
para su crecimiento, pero Pro2bconsumió en menor cantidad la glucosa del medio que 
Pro1b, obteniendo como resultado una viabilidad menor que Pro1b al finalizar la fase 
logarítmica, indicando que la glucosa posiblemente puede actuar como limitante de 
crecimiento de la cepa Pro2b. Por lo tanto el M4 es recomendable para un crecimiento 
apropiado de los microorganismos lácticos aislados del intestino de cerdo. 
 
6.4.5 Evaluación de la producción de biomasa 
 
Para la selección de cepas lácticas como potenciales probióticos, se deben tener en cuenta 
parámetros como la velocidad de crecimiento, tiempo de duplicación y una viabilidad alta, 
para así favorecer la competencia de estos microorganismos frente a microorganismos 
patógenos a nivel del Tracto Gastrointestinal (Tuomola y Cols 2001), por esta razón, se 
realizo la evaluación de producción de biomasa a partir de las cinéticas de crecimiento. 
En el caso de Pro 1b (Tabla 5), se encontró diferencias entre los dos medios de cultivo en la 
velocidad específica de crecimiento siendo menor (0,61 h
-1
)
 
en el M4. Según Brizuela 
(2005), plantea que los valores de velocidad específica de crecimiento alcanzados deben de 
estar cercanos a 0.5 h-1 con tiempos de duplicación que se acercan a valores de una hora, lo 
que concuerda con lo encontrado en el crecimiento de Pro1b, en los dos medios de cultivo. 
Además Gilliland & Gorbach (1991), evaluaron las potencialidades probióticas de 
Lactobacillus acidophillus, encontrando que esta cepa utilizada para la preparación de 
productos probióticos eficaces deben poseer tiempos de duplicación de una hora o menores 
que esto. Por esta razón aunque el M4 presente una velocidad específica de crecimiento y 
29 
 
una viabilidad al final de la fase logarítmica de 10
9
UFC/mL, menor que el MRS, su fase 
logarítmica solo demora 12 horas y presenta un tiempo de duplicación más cercano a una 
hora que el MRS; indicando que para la elaboración del inoculo como potencial probiótico, 
en menor tiempo y costos se recomienda la utilización del M4 para la cepa. 
 
Tabla 3. Datos cinéticos del crecimiento bacteriano de la cepa Pro 1b en dos medios de 
cultivo. 
 
 
 
Cepa Pro 1b 
 
 
Medio 
M4 
 
 
MRS 
 
 
Fase lag 
 
0 
 
0 
Velocidad específica de crecimiento (μ 
h
-1 
) 0,61 0,73 
Fin fase log 12 15 
Tiempo de duplicación 68,16 73,46 
Incremento cel. Total 4,50E+08 9,48E+08 
Incremento cel. Fin fase log 9,45E+09 3,10E+10 
% azúcares consumidos totales 60 25,45 
% azúcares consumidos fin log 44,04 24,75 
r
2
= 0,98 0,91 
 
En cambio para Pro 2b (Tabla 6), se encontró un comportamiento muy similar en los dos 
medios de cultivo, tanto en la velocidad específica de crecimiento y en el tiempo de 
finalización de la fase logarítmica, siendo a las 15 horas para los dos medios. Pero al 
observar el tiempo de duplicación, se encuentra que es menor en el medio MRS, 
posiblemente porque su incremento celular al final de la fase logarítmica es de 10
9
UFC/mL, 
produciendo un menor número de células. En cambio en el M4, aunque el tiempo de 
duplicación sea mayor, presenta al final de la fase logarítmica una viabilidad de 
30 
 
10
11
UFC/mL, determinándose el mejor comportamiento para este medio y presentando las 
mejores viabilidades como inoculo iniciador. 
Tabla 4. Datos cinéticos del crecimiento bacteriano de la cepa Pro 2b en dos medios de 
cultivo. 
 
 
 
 Cepa Pro 2b 
Medio 
M4 MRS 
Fase lag 0 0 
Velocidad específica de crecimiento 
(μ h
-1 
) 0,5 0,5 
Fin fase log 15 15 
Tiempo de duplicación 88,47 83,16 
Incremento cel. Total 1,85E+07 2,93E+08 
Incremento cel. Fin fase log 1,27E+11 4,99E+09 
% azúcares consumidos totales 34,04 6,57 
% azúcares consumidos fin log 19,70 4,85 
r
2
= 0,880 0,980 
 
6.6 Identificación bioquímica 
 
Por medio de la galería API 50 CHL (Figura 6, Tabla 7), fueron identificadas 
bioquímicamente las cepas Pro 1b y Pro 2b como pertenecientes a Lactobacillus 
plantarum 1 aisladas del intestino grueso de cerdos adultos. Estos dos microorganismos 
presentaron un comportamiento bioquímico similar al fermentar el azúcar 2-cetogluconato 
y se diferenciaron en la fermentación del azúcar D-sorbitol por parte de Pro 2b; para 
diferenciar estas dos cepas se nombraron como Lb. plantarum 1 H
1 
(Pro1b) y Lb. 
plantarum 1 H
2 
(Pro2b). Al encontrarse estas diferencias metabólicas, no es suficiente para 
corroborar su género y especie, por esta razón se recomienda realizar en estudios 
posteriores una identificación molecular o procedimientos mas finos. 
31 
 
 
 
Figura 7. Galería API 50 CH. (a. Cepa Pro1b y b. Cepa Pro2b). 
 
 
Tabla 5. Identificación bioquímica de Pro1b y Pro2b por medio de la galería API 50 CHL. 
 
 
 
Lb.plantarum 1 
H1 
(Pro1b) 
Lb.plantarum 
1H2 
(Pro2b) 
Lb.plantarum 1 
H1 
(Pro1b) 
Lb.plantarum 
1H2 
(Pro2b) 
 
 48h 48h 48h 48h 
TESTIGO - - 
Metil-αD-
Mmanopiranosida + + 
Glicerol - - 
Metil-αD-
Glucopiranosida + - 
Eritritol - - N-AcetilGlucosamida + + 
D-ARAbinosa - - Amigdalina + + 
L-ARAbinosa + + ARButina + + 
D-RIBosa + + ESCulina + + 
D-XILosa - - SALicina + + 
L-Xilosa - - D-Celobiosa + + 
D-Adonitol - - D_Maltosa + + 
Metil-BD-
Xilopiranosida - - 
D-LACtosa origen 
bovino + + 
D-Galactosa + + D-MELibiosa + + 
D-GLUcosa + + D-SACarosa + + 
D-Fructosa + + D-TREhalosa + + 
D-Mamnosa + + INUlina - - 
L-SorBosa - - D-MeLeZitosa + + 
INOcitol - - L-RHAmnosa - + 
D-Manitol + + DULcitol - - 
D-SORbitol + - - - 
 a b 
32 
 
 
Estas cepas de L. plantarum 1 corresponden a lo reportado por la literatura como 
microorganismos GRAS, es decir, microorganismos generalmente reconocidos como 
seguros (Collins 1978), lo que nos indica que este género que se encuentran en la flora 
normal de los cerdos, es segura para utilizarse en probióticos y adicionar a las raciones de 
alimento de cerdos, igualmente Balcázar et al. (2008), reportaron que estos 
microorganismos también se utilizan en presentaciones comerciales con una mezcla de 
microorganismos probióticos. Lo que representa una ventaja para la elaboración posterior 
de inóculos, debido que estas cepas no representan peligro alguno para los animales, y son 
reconocidos como microorganismos probióticos. 
6.7 Elaboración de inóculos e inclusión de los probióticos en la ración. 
 
Se realizo el proceso de elaboración de los inóculos, interrumpiendo el tiempo de 
incubación de cada una de las cepas al finalizar la fase logarítmica, colocando el material a 
5°C, para ser utilizado en las próximas 12 horas; para así incorporar el probiótico a la 
ración y empacarlo al vacío (Figura 7). 
 
Figura 8. Empaque al vacío de inóculos junto con la ración. 
 
33 
 
Debido que los probióticos son más efectivos cuando son administrados directamente en 
los alimentos, de esta manera los probióticos pueden colonizar el tracto digestivo 
rápidamente, inhibiendo la acción de los microorganismos patógenos (Ramírez 2005, 
Vieira 2006 & Bolívar 2008). Al incubarse el inoculo junto con la ración durante 24 horas 
se obtuvieron los siguientes resultados (Figura 8). 
 
 
Figura 9. Viabilidad del inóculo junto con la ración pasadas 24 horas. 
 
Mostrando una viabilidad mayor por parte de la cepa Pro1b de 10
12
UFC/g, en cambio la 
cepa Pro2b presento una viabilidad de 10
9
UFC/g, teniendo como resultado que las dos 
cepas presentaron una viabilidad superior de 10
8
UFC/g, siendo estas adecuadas para ser 
adicionadas a la ración y utilizarlas como potencial probiótico en la alimentación de cerdos. 
Brizuela (2005), plantea que las bacterias que tienen su mejor crecimiento entre 36-44ºC, 
presentan una característica deseable en los microorganismos utilizados como probióticos, 
facilitando el proceso de producción del preparado tanto desde el punto de vista del 
proceso fermentativo como del de recuperación y formulación. TantoPro1b como Pro2b, 
34 
 
presentan esta característica creciendo a 40°C, favoreciéndolas para utilizarlas como 
probióticos. 
 
6.9 Cinética de secado de la ración con bacterias lácticas probióticas 
 
Se determino la curva de secado en el tiempo a 35°C y a 40 °C, para determinar el tiempo 
necesario para adquirir un 12% de humedad (Figura 9). 
 
Figura 10. Cinetica de secado para Lactobacillus plantarum 1, hasta obtener el 12% de 
humedad. 
 
Una vez determinado el tiempo necesario de secado para las temperaturas utilizadas, se 
determino la viabilidad en el tiempo en UFC/g y la AW (Figura 10). 
 
35 
 
 
 
 
Figura 11. Viabilidad de los microorganismos lácticos en la ración UFC/g y lectura de 
AW durante tres semanas. 
 
Al observar la viabilidad de las dos cepas, encontramos que luego de tres semanas la 
viabilidad que se obtuvo es la requerida para que el probiótico sea efectivo durante ese 
tiempo, aunque haya presentado una viabilidad de 10
7
 UFC/g. Al realizar la cinética a 
35°C, encontramos que tanto la cepa Pro1b la cepa Pro2b, presentan una viabilidad 
uniforme, alcanzando hasta 10
6
UFC/g en la cuarta semana. Mientras que al realizar la 
cinética a 40°C, de las dos cepas seleccionadas, Pro1b es la que logra obtener una 
36 
 
viabilidad mayor de 10
7
UFC/g hasta la cuarta semana. Lo que puede indicar que aunque las 
dos cepas presenten los valores de viabilidad requeridos, se recomienda utilizar a la cepa 
Pro1b en la cinética de secado a una temperatura de 40°C, siendo este un producto 
recomendable para utilizarse en la alimentación de los lechones durante las 4 semanas. Al 
observar los resultados de AW, se encontró, que se presento una AW menor en los ensayos 
realizados a 40°C. Aunque cada semana la actividad de agua va disminuyendo en las 
raciones a las dos temperaturas, ocasionando que la cantidad de agua disponible para el 
crecimiento bacteriano, se reduzca; las cepas bacterianas mantuvieron una viabilidad 
superior a 10
6
UFC/g. Indicando que aunque los microorganismos necesitan niveles de agua 
disponible para llevar a cabo sus reacciones químicas, al disminuir esta los 
microorganismos crecen solamente si se encuentra el valor de AW optimo para su 
crecimiento; en el caso del genero Lactobacillus, su desarrollo se puede realizar a valores 
de AW entre 0.94 y 0.95 (Astudillo 2004). Pero en este caso, estos microorganismos se 
encuentran en un substrato adecuado para el crecimiento, aunque la actividad de agua sea 
menor a 0.9, necesaria para su crecimiento, siendo probablemente esto, lo que ayudo al 
microorganismo a mantenerse en condiciones de resistencia, reduciendo su metabolismo. 
La cinética de secado podría considerarse como un método alternativo a la liofilización, 
debido que ésta es más costosa y lenta, que otros métodos tradicionales de secado; pero en 
el caso de la liofilización al no emplear calor da como resultado productos de mayor 
calidad, evitando en gran medida las pérdidas nutricionales (Zamora 2003). El calor 
excesivo puede desnaturalizar proteínas, romper emulsiones, destruir vitaminas y resecar 
los alimentos al eliminar la humedad; sin embargo la ración de alimento que se utiliza 
posee más o menos un 13% de humedad, lo que indica que al ser tan bajo el porcentaje de 
humedad del alimento, posiblemente no sufre tantas alteraciones en su composición, 
http://es.wikipedia.org/wiki/Nutriente
37 
 
además a la temperatura (40°C) que se obtuvo los mejores resultados de la cinética de 
secado, no ocurre una desnaturalización de la proteínas, debido que Ramírez (2005), 
plantea que para que ocurra una desnaturalización de proteínas se necesitan temperaturas 
superiores de 40°C; lo que puede indicar que a la temperatura que se realizo la cinética no 
afecta a la ración. 
Una de las ventajas que se presentan al obtener una AW muy baja, es que otros 
microorganismos como hongos o levaduras, no son capaces de crecer en substratos con una 
actividad de agua mucho menor, a la que ellos crecen. Por esta razón se recomienda la 
realización de la cinética de secado a 40°C, con los dos microorganismos en el M4, para la 
elaboración adecuada de productos probióticos para su manejo y almacenamiento a nivel 
industrial. 
Al observar los resultados en las diferentes pruebas, se encontró que la cepa Pro1b presento 
las mejores características probióticas en el M4, en cuanto su viabilidad, presentar una 
mayor cantidad de ácido láctico y una viabilidad requerida para conservar la ración 
realizando cinéticas de secado a 40ºC; resultando ser un inoculo de microorganismos 
lácticos adecuado para su uso en raciones de alimento de cerdos destetados, y su potencial 
uso en la industria. 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
7 CONCLUSIONES 
 
En el medio M4 las dos cepas aisladas presentaron una viabilidad en el tiempo superior de 
10
8
UFC/mL, siendo este el indicado para la realización de los inóculos para su potencial 
uso como probióticos. 
El pH final obtenido (3.8-3.9) en los medios de cultivo, por parte de las cepas, es el ideal 
como característica de bacteria láctica por la producción de ácido láctico, logrando de esta 
forma disminuir o evitar el crecimiento de patógenos. 
La cepa Pro1b resultó ser homofermentativa, siendo esto una característica de gran 
importancia, para ser candidata en el desarrollo de aditivos como potencial probiótico e 
inclusión en la ración alimenticia. 
La cepa Pro1b, al presentar una velocidad específica de crecimiento menor que la cepa 
Pro2b en el M4 y al finalizar su fase logarítmica en menor tiempo, presentando una 
viabilidad al final de 10
9
UFC/mL, presentaría una ventaja mayor en la elaboración del 
inoculo como potencial probiótico, en menor tiempo, que la cepa Pro2. 
Al realizar la cinética de secado a una temperatura de 40°C, la cepa Pro1b, presento la 
viabilidad requerida para que el probiótico sea efectivo durante tres semanas de 
conservación. 
La cinética de secado podría considerarse como un método alternativo a la liofilización, 
debido que este es más económico y rápido que otros métodos tradicionales de secado. 
Las cepas seleccionadas en el estudio preliminar fueron identificadas como Lactobacillus 
plantarum 1 
 
mostraron un gran perfil de bacterias lácticas con características probióticas, 
siendo una alternativa para uso potencial como inóculos. 
 
39 
 
8 LITERATURA CITADA 
 
1. AILEXANDRE, J.L. 1997. Conservación de Alimentos. Ed. Universidad 
Politécnica de Valencia, España. 508 pg. 
 
2. APCS – AVESUI. Respostas fisiológicas de suínos à dietas com misturas de ácidos 
orgânicos. Disponível. 2004 (Fecha de acceso 9 de enero de 2005) URL disponible 
en: http://www.apcs.com.br 
 
3. ASTUDILLO, M. 2004. Biología de los alimentos. Programa editorial de la 
universidad del valle. 155pp 
 
4. BALCÁZAR, JL., VENDRELL, D., BLAS, I., RUIZ-ZARZUELA, I., y JL, 
MUZQUIZ. 2008. Characterization of probiotic properties of lactic acid bacteria 
isolated from intestinal microbiota of fish. Articule in press Aquaculture. 10:188-
191 
 
 
5. BERGEY´S. 1992. Manual of Determinative Bacteriology.Tenth Edition. The 
Williams & Wilkings Co. Baltimore, U.S.A. 
 
6. BRIIZUELA, M.A. (2003). ―Selección de cepas de bacterias ácido lácticas para la 
obtención de un preparado con propiedades probióticas y su evaluación en cerdos‖. 
Tesis de Doctorado en Ciencias Veterinarias. Instituto Cubano de los Derivados de 
la Caña de Azúcar, ICIDCA. Ciudad de la Habana, Cuba. 2003. 
 
7. BOUCOURT, R., SAVÓN, L., DÍAZ, J., BRIZUELA, M. A., SERRANO, P., 
PRATS, A. y A. ELÍAS. 2004. Efecto de la actividad probiótica de Lactobacillus 
rhamnosus en indicadores fisiológicos de lechones. Revista Cubana de Ciencia 
Agrícola, Tomo 38, No. 4. 
 
8. CINTAS, L. M., CASAUS, P. y P.E. HERNÁNDEZ. 2000. Actividad 
antimicrobiana de las bacterias lácticas (I y II). En: Alimentación, Equiposy 
Tecnología. Vol. 19(7):109- 119. gateau 
 
http://www.apcs.com.br/
http://www.sciencedirect.com/science/journal/00448486
40 
 
9. CHIQUIERI, J.M., SOARES, R.T., Souza, J.C.D., HURTADO, V.L., NERY, R., 
FERREIRA, A. y B.G. VENTURA. 2006. Probiótico y prebiótico en la 
alimentación de cerdos en crecimiento y terminación. Archivos de zootecnia. 
55(211): 306 
 
10. CRUEGER, W., CRUEGER, A. 1993. Biotecnología: Manual de Microbiología 
Industrial. Ed. Acribia, 3 ed. Madrid. España. 
 
11. COLLINS, FM., y PB, CARTER. 1978. Grow of salmonelle in orally infected 
germfree mice. Infected and Immunity. 21: 41-47. 
 
12. DE ANGELIS, M., SIRAGUSA, S., BERLOCO, M., CAPUTO, L., SETTANNI, 
L., ALFONSI, G., AMERIO, M., GRANDIE, A., RAGNIF, A. y M. GOBBETTI. 
2006. Selection of potential probiotic lactobacilli from pig feces to be used as 
additives in pelleted feeding. Research in Microbiology 157: 792–801. 
 
13. DIBUT, B., ORTEGA, M., MARTINEZ, R., FEY, L y Y RIOS. 2005. Nuevos 
aislados de gluconacetobacter diazotrophicus en cultivos de importancia económica 
para cuba. Cultivos tropicales. 26: 5-10 
 
14. DUBOIS, M., HAMILTON, J. K., REBERS, P. A., SMITH, F. 1956. Colorimetric 
method for determination of sugar and related substances. Anal. Chem. 28: 350-
356. 
 
15. FIGUEROA, J.L., CHI, E.E., RAMIREZ, M. y E.I, DOMÍNGUEZ. 2006. 
Alimentos funcionales para cerdos al destete. Vet. Mex. 37: 1 
 
16. FULLER, R. 1989. Probiotic in man and animal. Journal of applied bacteriology. 
66: 365-378. 
 
17. GIRAUD, E.1992. Contribution a l'etude physiologique et ezimologique d'une 
nouvelle souche de Lactobacillus plantarum amylolytique isolee du mandioc 
fermente. Thése Université demProvence aix-Marseille. 139p. 
41 
 
 
18. LANARA. 1981. Métodos Analíticos Oficiais para Controle de Produtos de Origem 
Animal e seus Ingredientes. Métodos microbiológicos. Ministerio de agricultura, 
Secretaria Nacional de Defesa Agropecuaria, Laboratorio Nacional de Referëncia 
Animal. Brasilia D. F., 
 
19. LÁZARO C., CARCELÉN, F., TORRES, M. Y M, ARA. 2005. Efecto de 
probióticos en el alimento de marranas sobre los parámetros productivos de 
lechones. Rev inv vet perú 16 (2): 97-102. 
 
20. LERTWORASIRIKUL, S. 2008. Drying kinetics of semi-finished cassava crackers: 
A comparative study. Swiss Society of Food Science and Technology. 41: 1360–
1371. 
 
21. LONDOÑO-URIBE, M., SEPÚLVEDA, U., MONZÓN, A., E, PARRA. 2008. 
Bebida fermentada de suero de queso fresco inoculada con Lactobacillus casei. 
Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín. 61:4409-4421. 
 
22. MEJÍA, J.A., CHACÓN, Z., GUERRERO, B., ROJAS, J., y G, LÓPEZ. 2007. 
Obtención de cepas de Lactobacillus. Caracterización in vitro como potenciales pro 
bioticas FCV-LUZ. Revista científica. 7: 178-185 
 
23. MEJÍA-SILVA, W., RUBIO-GUILLÉN, J., CALATAYUD-MÁRQUEZ, D., 
RODRÍGUEZ-CALDERA, A., y A, QUINTERO-MORENO. 2007. Evaluación de 
dos probióticos sobre parámetros productivos en lechones lactantes. ZOOTECNIA 
TROPICAL. 25(4): 301-306. 
 
24. MISSOTTEN, J.A.M., MICHIELS, J., GORIS, J., HERMAN, L., 
HEYNDRICKX, M., DE SMET, S., y N.A. DIERICK. 2007. Screening of two 
probiotic products for use in fermented liquid feed. Livestock Science. 108: 232–
235 
42 
 
 
25. OCAMPO, A. Modelo cinético del secado de la pulpa de mango. 2006. Revista 
EIA. 5: 119-128 
 
26. ORTIZ, A.R. y REUTO, J.I. 2007. Evaluación de la capacidad prebiótica in vitro de 
una cepa nativa de Saccharomyces cerevisiae. Pontificia universidad javeriana. 
Facultad ciencias. Trabajo de grado para optar titulo de microbióloga industrial y 
microbióloga agrícola y veterinaria. Bogotá D. C. 108p. 
 
27. OYETAYO, V.O. y F.L, OYETAYO. 2005. Potential of probiotics as 
biotherapeutic agents targeting the innate immune system. African Journal of 
Biotechnology Vol. 4 (2): 123-127 
 
28. PÉREZ-GUERRA, N., FAJARDO BERNARDEZ, P., MENDEZ, J., 
CACHALDORA, P., y L. PASTRANA-CASTRO. 2007. Production of four 
potentially probiotic lactic acid bacteria and their evaluation as feed additives for 
weaned piglets. Animal Feed Science and Technology. 134: 89–107. 
 
29. PREGNOLATTO, W., y N PREGNOLATTO.1985. Normas analíticas do instituto 
Adolfo Lutz. Vol 1. Métodos quimicos e fisicos para análise de alimentos. Sao 
Paulo, SP Brasil. 533 pp. 
 
30. PLUSKE, J. y PETHICK D. 2005. El impacto de la nutrición sobre desórdenes y 
enfermedades de tipo entérico en porcino. Hampson Division of Veterinary and 
Biomedical Sciences.Murdoch University, Murdoch WA 6150, Australia. 
 
31. RAMÍREZ T. C. 2005. Uso de bactérias lácticas probióticas na alimentação de 
camarões Litopenaeus vannamei como inibidoras de microrganismos patogênicos e 
estimulantes do sistema imune. Tese de doutorado da Universidade Federal do 
Paraná, Curitiba Brasil, 152 p. 2005. 
 
32. RINKINEN, M., JALAVA, K., y E, WESTERMARCK. 2003. Interaction between 
probiotic lactic acid bacteria and canine enteric pathogens: a risk factor for intestinal 
Enterococcus faecium colonization. Seppo Salminen, Arthur C. Ouwehand. 
Veterinary Microbiology 92: 111–119. 
43 
 
 
33. RODRÍGUEZ, L., BUENO, G., RODRÍGUEZ, D.E., DELGADO, G., 
SERRANO, P. y M.A. BRIZUELA. 2003. True and apparent yields and 
maintenance coefficient and their significance on fermentation kinetics in: New 
Horizons Biotechnology, 163-172. 
 
32. ROPPA, L. 2006. Producción global de carne porcina: enfrentando los desafíos en 
un mundo en transición. Vº Congreso de Producción Porcina del Mercosur, 
Córdoba, argentina. (Fecha de Acceso 14 de Septiembre de 2008) URL disponible 
en: www.agrocadenas.gov.co/inteligencia/documentos/em_carne_cerdo.pdf 
 
34. SCHAREK, L., GUTH, J., REITERB, K., WEYRAUCH, K.D., TARAS, D.P., 
SCHIERACK, P., SCHMIDTA, M.F.G., WIELER, L.H., y K. TEDIN. 2005. 
Influence of a probiotic Enterococcus faecium strain on development of the immune 
system of sows and piglets. Veterinary Immunology and Immunopathology. 105: 
151–161. 
 
35. STAMATI, S., ALEXOPOULOS, C., SIOCHU, A., SAOULIDIS, K., y S.C., 
KYRIAKIS. 2006. Probiosis in sows by administration of bacillus toyoi spores 
during late pregnancy and lactation: effect on their health status/performance and on 
litter characteristics. International Journal of Probiotics and Prebiotics.1(1): 33-40. 
 
36. SWANTJE, C.D., LORENTZ, A,. SCHROEDER, B., BREVES, G., Y C, 
STEPHAN.2006. Effect of orally administered probiotic E. coli strain Nissle 1917 
on intestinal mucosal immune cells of healthy young pigs. Veterinary Immunology 
and Immunopathology . 111: 239–250 
 
37. TARAS, D., VAHJEN, W., y O, SIMON. 2007. Probiotics in pigs — modulation 
of their intestinal distribution and of their impact on health and performance. 
Livestock Science. 108: 229–23 
 
http://www.agrocadenas.gov.co/inteligencia/documentos/em_carne_cerdo.pdf
44 
 
38. URRIBARRÍ, L., VIELMA, A., PAÉZ, G., FERRER, J., MÁRMOL, Z y E, 
RAMONES. 2006. Producción de acido láctico a partir de suero de leche, utilizando 
Lactobacillus helveticus en cultivo continuo. Veterinaria. (Consulta julio 12 de 2009 
file://C:\SciELO\serial\rc\v14n4\body\art_03.htm). 
 
39. VÁSQUEZ, SM., SUÁREZ, V., y S, ZAPATA.2009. Utilización de sustancias 
antimicrobianas producidas por bacterias acido lácticas en la conservación de la 
carne. Rev Chil Nutr. 36:1-8 
 
40. ZAMORA R. L. 2003. Aislamiento, identificación y conservación de cultivos de 
bacterias Lácticas antagonistas de microbiota contaminante de sangre de matadero. 
Tesis de doctorado de la universidad de Girona, España, 259 p. 
 
 
../AppData/Local/Microsoft/Windows/Temporary%20Internet%20Files/SciELO/serial/rc/v14n4/body/art_03.htm