Detecção de Batrachochytrium dendrobatidis em Valle del Cauca

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DETECCIÓN DE Batrachochytrium dendrobatidis (CHYTRIDIALES: 
CHYTRIDIOMICETES) EN NUEVE LOCALIDADES DE VALLE DEL CAUCA 
MEDIANTE EL USO DE PCR 
 
 
 
 
 
 
CINDY MOJICA GUERRERO 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2010 
 
DETECCIÓN DE Batrachochytrium dendrobatidis (CHYTRIDIALES: 
CHYTRIDIOMICETES) EN NUEVE LOCALIDADES DE VALLE DEL CAUCA 
MEDIANTE EL USO DE PCR 
 
 
CINDY MOJICA GUERRERO 
 
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de 
Bióloga 
 
Director 
FERNANDO CASTRO HERRERA 
Biólogo, Ph.D 
 
Codirector 
WILMAR BOLIVAR GARCIA 
Biólogo, B.Sc. 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2010 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
 
 
 
 
 
CINDY MOJICA GUERRERO, 1987 
 
 
 
 
DETECCIÓN DE Batrachochytrium dendrobatidis (CHYTRIDIALES: 
CHYTRIDIOMICETES) EN NUEVE LOCALIDADES DE VALLE DEL CAUCA 
MEDIANTE EL USO DE PCR 
 
 
 
 
 
TEMAS: Chytridiomicosis, Anfibios.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para mi madre, por su esfuerzo y su apoyo incondicional hoy y siempre… 
 
 
vi 
 
SINCEROS AGRADECIMEINTOS 
 
A mis padres y familia por su apoyo y fe en que puedo lograr lo que me 
proponga. 
A Fernando Castro, por introducirme en el interesante mundo de la 
herpetología, también por su guía y confianza en mis habilidades. 
A Wilmar Bolívar, por su esfuerzo, apoyo e incondicional ayuda en el desarrollo 
de esta investigación. 
Al grupo hongo, Ángela Cortés, Javier Mendez, John Jairo Ospina y Carlos 
Burbano, por su compañía, nuevas experiencias y ayuda en la colecta de 
datos. 
A Adolfo Amézquita y al GECOH por abrirme las puertas de su laboratorio 
permitiéndome desarrollar de forma agradable mi trabajo y obtener nuevos 
conocimientos. 
A Victoria Flechas y Edgar Medina por el entrenamiento en detección del hongo 
mediante PCR y sus invaluables consejos para la obtención de resultados. 
A Astrid y el Laboratorio de Genética de Poblaciones en la Universidad de los 
Andes que amablemente me brindaron un espacio para realizar mi trabajo de 
grado. 
Al personal de Biología Molecular Ltda, por su eficacia a la hora de entregar 
reactivos y sus consejos para el óptimo desarrollo de mis pruebas en el 
laboratorio. 
A la CVC por la oportunidad de hacer parte de este proyecto y por la 
financiación. 
A Sergio Castro por su compañía y apoyo en los momentos difíciles. 
A Carlos Ávila por sus ánimos, seguimiento y ayuda en la parte tecnológica de 
este proyecto. 
A Mauricio Rengifo por su apoyo y ayuda en los datos de campo. 
A Isabel Nichols por su amistad y constante empuje para continuar. 
Y a todas las personas que de una u otra forma colaboraron e hicieron parte en 
el desarrollo de este proyecto, que creyeron en mi y me animaron a llegar hasta 
el final de todo. A todas esas personas, mil y mil gracias, de verdad no habría 
sido posible sin su invaluable ayuda. 
 
vii 
 
TABLA DE CONTENIDO 
1. RESUMEN ..................................................................................................... 1 
2. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 2 
3. MARCO TEORICO ........................................................................................ 5 
3.1 Técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................................ 5 
3.1.1 Implementación de PCR para la detección de Batrachochytrium 
dendrobatidis ........................................................................................... 7 
3.2 Generalidades de Batrachochytrium dendrobatidis .................................. 9 
3.2.1 Ciclo de Vida ................................................................................. 10 
3.3 La Chytridiomicosis .................................................................................11 
3.3.1 Signos de la enfermedad ...............................................................11 
3.3.2 Diagnosis ...................................................................................... 13 
3.4 Impacto de la enfermedad en las comunidades de anfibios................... 14 
4. OBJETIVOS ................................................................................................. 17 
4.1 Objetivo General .................................................................................... 17 
4.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 17 
5. ÁREAS DE ESTUDIO .................................................................................. 18 
5.1 Localidad Anchicayá .............................................................................. 18 
5.2 Localidad Bitaco – Chicoral .................................................................... 18 
5.3 Localidad Centro de Educación Ambiental La Sirena ............................ 18 
5.4 Localidad Cerro El Ingles ....................................................................... 18 
5.5 Localidad Piangüita ................................................................................ 19 
5.6 Localidad San Antonio ........................................................................... 19 
5.7 Localidad San Cipriano .......................................................................... 19 
5.8 Localidad Alto Queremal ........................................................................ 19 
viii 
 
5.9 Localidad Reserva Natural Bosque de Yotoco ....................................... 20 
6. METODOLOGÍA .......................................................................................... 21 
6.1 Fase de Campo ...................................................................................... 21 
6.1.1 Toma de Muestras ............................................................................... 21 
6.2 Fase de Laboratorio ............................................................................... 22 
6.2.1 Extracción de ADN ........................................................................ 22 
6.2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)............................................... 24 
6.2.3 Gel de Agarosa ............................................................................. 25 
7. RESULTADOS ............................................................................................. 27 
7.1 Individuos Analizados ............................................................................. 27 
7.2 Presencia de Batrachochytrium dendrobatidis ....................................... 36 
8. DISCUSIÓN ................................................................................................. 38 
9. CONCLUSIONES ........................................................................................ 45 
10. LITERATURA CITADA ............................................................................... 46 
ANEXO. GELES DE AGAROSA CON RESULTADOS DE PCR ..................... 50 
 
ix 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1. Esquema General de una PCR 6 
Figura 2. Primers para detectar Batrachochytrium dendrobatidis 
probados en diferentes cepas 
7 
Figura 3. Ensayo que comprueba la cantidad mínima requerida del 
hongo para su detección 
8 
Figura 4. Ciclo de vida Batrachochytrium dendrobatidis 11 
Figura 5. Mapa de distribución global para Batrachochytrium 
dendrobatidis 
15 
Figura 6. Mapa con las localidades muestreadas 20 
Figura 7. Toma de muestras mediante frotis con hisopo 22 
Figura 8. Abundancia de individuos por especie en Anchicayá 30 
Figura 9. Abundancia de individuos por especie en Cerro El Inglés 31 
Figura 10. Abundancia de individuos por especie en Chicoral 32 
Figura 11. Abundancia de individuos por especie en La Sirena 32 
Figura12. Abundancia de individuos por especie en San Cipriano 33 
Figura 13. Abundancia de individuos por especie en Yotoco 34 
Figura 14. Abundancia de individuos por especie en Piangüita 34 
Figura 15. Abundancia de individuos por especie en San Antonio 35 
Figura 16. Abundancia de individuos por especie en San Pedro 36 
 
 
x 
 
LISTA DE TABLAS 
Tabla 1. Proporciones para elaboración de Master Mix 24 
Tabla 2. Programa de amplificación usado en la PCR 25 
Tabla 3. Número de individuos analizados por especie en cada localidad 27 
Tabla 4. Especies infectadas con chytridiomicosis 36 
Tabla 5. Prevalencia del hongo en la localidad de Yotoco 37 
Tabla 6. Prevalencia del hongo en la localidad de San Pedro 37 
1 
 
1. RESUMEN 
La disminución en las poblaciones de anfibios a nivel mundial ha generado una 
alarma en la comunidad científica que ha llevado a indagar las posibles causas 
de las desapariciones de algunas especies. Un factor en común para los 
diferentes países afectados ha sido la detección del hongo patógeno 
Batrachochytrium dendrobatidis, en muestras de tejido en animales de zonas 
donde han ocurrido las muertes y reducciones masivas de las especies, lo que 
confirma su impacto directo en esta problemática. 
En nueve localidades de Valle del Cauca, se evaluó la presencia de 
Batrachochytrium dendrobatidis tomando muestras de piel de anfibios haciendo 
frotis para analizar mediante el uso de la PCR. Se analizaron 629 individuos 
pertenecientes a 49 especies de 11 familias. Todos colectados en muestreos 
realizados entre 2008 y 2009. Se encontraron cinco individuos positivos de tres 
especies en dos de las localidades visitadas. 
Esta investigación ofrece un reporte de chytridiomicosis en el Valle del Cauca, 
brindando una posible explicación a la presencia constante de este patógeno 
en ciertas zonas estudiadas, lo que contribuye a la disminución local de varias 
especies. 
 
2 
 
2. INTRODUCCIÓN 
En los últimos años, la pérdida de diversidad de anfibios se ha incrementado de 
forma generalizada alrededor del mundo (Lips 1998, Lips et al. 2004, 
Carey1993, Beard y O’Neill 2005, Burrowes et al. 2004, Bustamente et al. 
2005).Aunque en algunos estudios se ha postulado que esto puede deberse a 
fluctuaciones normales de las poblaciones de anfibios (Pounds et al. 2006), en 
otros estudios no se da por sentado esta teoría. 
 
La aparición de enfermedades y la pérdida de la biodiversidad se encuentran 
entre los problemas ambientales más apremiantes que enfrentan la ciencia y la 
sociedad. Son generalizadas y graves las pérdidas de las poblaciones de 
anfibios que representan la clave de estas situaciones (Lips et al. 2005). 
Desde los años noventa el declive en las poblaciones de anfibios ha tenido una 
especial atención debido a situaciones como el incremento de reportes que 
informan la extinción o la disminución marcada de especies, el hecho que estas 
situaciones se presenten de manera similar en sitios apartados y que estos 
problemas ocurran en áreas protegidas. Esto último resulta alarmante debido a 
que la función de estas áreas es la protección de las especies, pero por lo visto 
ha fallado en cuanto a los anfibios (Collins & Storfer 2003). 
 
Las actuales tendencias sobre la baja mundial en las poblaciones de anfibios 
son una gran preocupación para la conservación de los mismos y puede tener 
graves consecuencias para la calidad del medio ambiente (Daszak et al. 1999). 
Colombia es el segundo país con mayor diversidad de anfibios en el mundo, 
contiene alrededor de 785 especies descritas (Velásquez 2006). En años más 
3 
 
recientes, los herpetólogos y conservacionistas han confirmado la rápida 
disminución de 50 especies aproximadamente, señalando a los anfibios como 
el grupo de animales más vulnerable a la extinción en este país (Rueda-
Almonacid et al. 2004). 
 
Entre las muchas causas posibles para el descenso en los anfibios se 
encuentra la destrucción del hábitat, sobre-explotación, el cambio climático, el 
aumento de la radiación ultravioleta, las especies introducidas, la 
contaminación del medio ambiente y las especies infecciosas (Berger et al. 
1998, Daszak et al. 1999, La Marca et al. 2005). 
 
En la actualidad, el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis aislado 
por primera vez por Longcore en 1998, a partir de individuos hallados muertos 
en países como Panamá, Australia y Costa Rica es considerado una de las 
principales causas de la desaparición de anfibios (Longcore et al. 1999). La 
enfermedad causada por este hongo se denomina chytridiomicosis y fue 
propuesta como la causa de muerte en las poblaciones de ranas en bosques 
lluviosos en Australia y Panamá, también se ha asociado con el declive de las 
poblaciones de ranas en América, Australia, Nueva Zelanda y Europa (Berger 
et al. 1998; Daszak et al. 1999). 
 
Según estudios realizados por Ron (2005), se ha podido hacer una predicción 
del comportamiento y dirección del patógeno para detectar posibles sitios en 
los que se podría encontrar o establecer, dentro de los cuales está Colombia. 
En investigaciones realizadas anteriormente (Velásquez 2006 y Velásquez et 
4 
 
al. 2008) se corrobora la presencia y la asociación del hongo en la disminución 
de especies en las localidades Alto Queremal y Cerro el Inglés resaltando que 
tanto especies asociadas al agua y otras que no lo son, fueron diagnosticadas 
positivas para chytridiomicosis, por análisis histológicos en la piel. 
 
Como parte fundamental en la detección del hongo en las comunidades de 
anfibios, se ha propuesto la revisión de sitios donde se ha colectado con 
frecuencia, ya que esto permite saber que poblaciones persisten actualmente y 
cuales han desaparecido o simplemente disminuido, lo cual podría relacionarse 
con la presencia del hongo, también hacer revisiones en sitios donde el 
patógeno ya ha sido encontrado para analizar el estado de conservación tanto 
de las especies, como del sitio en sí, pues se debe tener en cuenta que 
muchos factores influyen en la disminución de la diversidad, uno de ellos es el 
cambio climático. 
 
El presente informe recoge información sobre la presencia del hongo en 
diferentes localidades de Valle del Cauca, en sitios donde ya ha sido 
encontrado para corroborar su presencia y hacer seguimiento, como otras en 
que no ha sido detectado para realizar un registro de su propagación. También 
en esta investigación se implementa una técnica novedosa y no dañina para los 
anfibios con el fin de encontrar este patógeno sin dañar a los organismos, la 
PCR (Polymerase Chain Reaction) un método efectivo con alta confiabilidad. 
 
5 
 
3. MARCO TEORICO 
3.1 Técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) 
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica útil para amplificar un 
fragmento de ADN, su objetivo es obtener un gran número de copias a partir de 
un fragmento original de ADN particular. Este método es muy usado para 
identificar con alta probabilidad bacterias causantes de una enfermedad gracias 
a la amplificación de un simple fragmento (Coleman & Tsongalis 2006). 
 
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas 
para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas 
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre 
sí, tras cada fase de replicación, luego vuelven a unirse a polimerasas para que 
vuelvan a duplicarlas. Actualmente el proceso es automatizado mediante el 
termociclador, el cual permite calentar y enfriar los tubos de reacción para 
controlar la temperatura necesaria a lo largo de todo el proceso (Coleman & 
Tsongalis 2006). 
6 
 
 
Figura 1. Esquema general de una PCR (Tomado de: Coleman & Tsongalis 
2006). 
 
Por lo general, esta técnica es indispensable en laboratorios de investigación 
debido a su variedad de aplicaciones como la clonación de ADN para 
secuenciar,trabajos de filogenia, diagnóstico de enfermedades genéticas y la 
diagnosis de enfermedades infecciosas (Butler 2005). 
http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:PCR_es.svg
7 
 
 
3.1.1 Implementación de PCR para la detección de Batrachochytrium 
dendrobatidis 
La PCR es una técnica sensible basada en una prueba que detecta a 
Batrachochytrium dendrobatidis (Longcore et al.1999) con mínima reacción 
hacia otros hongos. Esta prueba emplea un par de primers que amplifica 
específicamente una porción del rDNA del hongo. Otra ventaja de esta técnica 
es poder procesar muchas muestras el mismo día con poca cantidad de tejido 
(Annis et al. 2004). 
 
Los primers o cebadores desarrollados para implementar esta técnica fueron 
probados en 52 cultivos del hongo provenientes de varios lugares del mundo 
como Norte América y África, por lo que eran diferentes cepas, también se 
compararon con otros hongos relacionados a los anfibios que no pertenecieran 
al grupo de los chytridios (Annis et al. 2004). 
 
 
Figura 2. Primers para detectar Batrachochytrium dendrobatidis probados en 
diferentes cepas (Tomado de: Annis et al.2004). 
8 
 
 
Inicialmente la especificidad de los primers fue probada amplificando ADN de 
otros chytridios y diferentes cepas de B. dendrobatidis. También fue probada su 
limitación, haciendo corridas con diferentes números de zoosporas. Para todas 
las pruebas se comprobó la efectividad de los primers, pues estos pertenecen a 
regiones conservadas de esta especie de hongo en particular, regiones que no 
se encontraban en otras especies de chytridios. Acerca de la cantidad mínima 
que la prueba detecta fue de 10 pg, es decir cerca de 10 zoosporas, haciendo 
que la banda sea más marcada cuando la muestra tenga mayor cantidad de 
zoosporas. La banda que indica la presencia del hongo aparece cerca de las 
300 pb (Annis et al. 2004). 
 
 
Figura 3. Ensayo que comprueba la cantidad mínima requerida del hongo para 
su detección (Tomdo de: Annis et al. 2004). 
 
La sensibilidad de esta prueba reduce la posibilidad de hallar un falso positivo, 
debido a que puede detectar infecciones leves y los frotis pueden ser de todo el 
9 
 
cuerpo del animal permitiendo un análisis más completo (Annis et al. 2004). 
 
3.2 Generalidades de Batrachochytrium dendrobatidis 
Batrachochytrium dendrobatidis pertenece al Phylum Chytridiomicota, es un 
patógeno en anfibios causante de la enfermedad denominada chytridiomicosis 
(Berger et al. 1998). Este hongo es dulce acuícola y ataca a la piel de los 
anfibios, la cual es imprescindible para su homeóstasis hídrica y gaseosa 
además de su defensa inmunológica (Bosch et al. 2001). 
 
La examinación de las capas epidérmicas de ranas muertas o moribundas 
colectadas de la población afectada en Australia y Panamá revelaron la 
presencia de un hongo chytridiomicota (Berger et al.1999) postulado como la 
causa más próxima de estos declives (Berger & Speare 1998; Berger et al. 
1999). 
 
Debido a la pandemia producida por este hongo desde la década de los 80, se 
ha discutido el papel del hombre en la propagación de este patógeno. En la 
actualidad, se asume que Xenopues laevis fue el vector propagador del hongo 
a nivel global, por ser una rana empleada para realizar pruebas de embarazo, 
técnica que empezó a difundirse en los años 30 y hasta hace poco más de 
veinte años la enfermedad empezó a causar graves problemas (Nichols et al. 
1998). Respecto a esto, hay dos hipótesis en una se cree que el hongo es 
originario de África proveniente de poblaciones silvestres de Xenopus laevis en 
donde era una infección estable dentro de este biotopo antes de su 
propagación en los años 30, pero por otro lado, hay una hipótesis que plantea 
10 
 
al hongo como un elemento que siempre ha estado en contacto con las 
poblaciones de anfibios, solo que ahora por el impacto humano, los organismos 
se encuentran inmunodeprimidos lo que hace que su micosis sea más agresiva 
(Pounds et al. 2006). 
 
3.2.1 Ciclo de Vida 
Este inicia cuando las zoosporas (esporas móviles mediante flagelos) del 
hongo entran en contacto con la epidermis de los anfibios a través del agua o 
de otro individuo infectado, estas se fijan a la epidermis y penetran el estrato 
córneo del hospedero. En unos cuantos días se desarrollan unas estructuras 
con paredes refractivas llamadas zoosporangios, encargadas de producir y 
liberar nuevas zoosporas mediante tubos de expulsión inoperculados que se 
proyectan hasta la superficie de la piel, perforando la epidermis del hospedero 
(Berger et al. 1999). El periodo de incubación de la enfermedad es entre 9 y 76 
días, dependiendo qué tan severa sea la infección y qué tan sensible sea el 
organismo a la micosis. 
 
 
11 
 
Figura 4. Ciclo de vida Batrachochytrium dendrobatidis 
(www.alamerica.info/lou/images/stories/Chytrid) 
 
3.3 La Chytridiomicosis 
3.3.1 Signos de la enfermedad 
En anfibios adultos, el hongo coloniza las células queratinizadas de la piel y 
usualmente es encontrado en parches aislados del lado ventral en el animal. 
Con infecciones más severas se encuentra en la ingle, entre los muslos y 
dedos (Longcore et al. 1999). Debido a que el hongo parece usar el medio 
acuático de manera regular para pasar de manera eficaz de un huésped a otro, 
animales ligados a cuerpos de agua como los centrolenidos pueden tener la 
infección en ambos lados, tanto la superficie ventral como la dorsal (Parker et 
al. 2002). 
12 
 
En el caso de los renacuajos la infección está limitada a las células 
queratinizadas de la región oral, la cual puede producir erosión, deformidad e 
incluso pérdida de partes bucales, lo que también es empleado para la 
diagnosis (Berger et al. 1998). 
 
En cuanto a síntomas notorios de la enfermedad, los anfibios adultos exhiben 
pocos signos incluso cuando están seriamente afectados o cercanos a la 
muerte (Parker et al. 2002). 
 
La patogénesis de la chytridiomicosis ha sido difícilmente determinada debido a 
que las infecciones cutáneas producidas por hongos son raramente fatales sin 
considerar la predisposición de otros factores. Además, Batrachochytrium 
dendrobatidis pertenece a un phylum que no era conocido previamente como 
patógeno en vertebrados (Longcore et al.1999), está confinado a la capa 
superficial de la epidermis con mínima reacción del hospedero a la infección 
(Berger et al. 2002) y no es consistente con los cambios patológicos en 
órganos internos de enfermedades en anfibios detectables con microscopio 
(Berger & Speare 1998). 
 
Esta enfermedad cuando se torna letal para un individuo hace que muera 
prácticamente por asfixia, el hongo libera sustancias tóxicas que son 
absorbidas a través de la piel y eliminadas en sus últimos estadíos por 
intercambio gaseoso, lo que provoca hiperplasia de los estratos córneos y 
granulosos de la epidermis de la victima (Berger & Speare 1998). 
Aunque la apariencia externa de algunos animales puede no denotar la 
13 
 
infección, el comportamiento de estos puede dar pistas claras como la 
inapetencia o falta de coordinación. Pueden aparecer manchas en la parte 
superior del cuerpo, un color rojizo en la zona ventral, inguinal y dedos, 
inflamación en las patas traseras (Parker et al. 2002). Pueden observarse 
individuos desnutridos con movimientos letárgicos y falta de reacción ante los 
instintos básicos (Parker et al. 2002). 
 
3.3.2 Diagnosis 
Usualmente la diagnosis de la chytridiomicosis es por análisis histológico, 
análisis histoquímico o ambos y esto presenta dificultad cuando los individuos 
están infectados por poca cantidad del hongo (Annis et al. 2004). 
 
Cuando son severamente infectados, la piel de algunas especies se desprende 
y puede ser usada para la diagnosis. Sin embargo, la detección con esta piel, 
puede ser problemática, porque animales con menores infecciones a menudo 
no sueltan piel infectada que sea útilpara realizar el diagnóstico correcto (Annis 
et al. 2004). 
 
Recientemente, reportes de diagnosis de chytridiomicosis afirman que no 
depende solo de muestras de piel de animales muertos. Por otro lado, un 
método rentable para tratar animales incluye aquellos con infecciones 
tempranas, pero requiere el entendimiento de la ecología del hongo y el rol que 
desempeña este en el declive de una población de anfibios. La técnica puede 
ser especifica, sensible y rentable, los anticuerpos policlonales han sido usados 
en el desarrollo de pruebas inmunohistoquímicas (Berger et al. 2002; Van Ells 
14 
 
et al. 2003). Esta prueba es una mejora en la histopatología; sin embargo, los 
anticuerpos han reportado cierta reacción con otros chytridios y al menos a un 
género de hongo ascomiceto, (Microsporum) (Annis et al. 2004). 
 
La chytridiomicosis puede ser diagnosticada con un protocolo de histología 
donde la piel de los especímenes es preservada en formalina o etanol. La 
examinación de cortes de piel es un método rápido, pero requiere gran 
experiencia identificando organismos. La identificación mediante cultivos 
requiere especímenes frescos y es muy difícil. Por ello, la mayoría de diagnosis 
se han hecho usando histología. Pero esta técnica requiere habilidades en el 
microscopio y conocimiento de la morfología tanto del chytridio como de la piel 
normal del anfibio para poder diferenciar el hongo de otras estructuras de la 
piel (Berger et al. 2002). 
 
3.4 Impacto de la enfermedad en las comunidades de anfibios 
Enfermedades infecciosas pueden causar el declive en poblaciones y 
extinciones potenciales si múltiples variables crean favorables condiciones para 
brotes severos (Daszak et al. 2000). 
 
Numerosos especies de anfibios en el mundo han declinado notablemente 
desde los años 70 (Barinage 1990).Individuos colectados muertos fueron 
examinados encontrándose el hongo en ellos (Morell 1999). Esta enfermedad 
se ha convertido en un fenómeno mundial (Speare & Berger 2000; Bosch et al. 
2001) y ha sido implicada en la disminución de especies de anfibios en Norte y 
Centro América, Australia y Europa (Berger et al. 1998; Daszak et al. 1999). 
15 
 
 
Figura 5. Mapa de distribución global para Batrachochytrium dendrobatidis. 
(Tomado de: www.spatialepidemiology.net) 
 
A pesar de una resistencia inicial para aceptar la enfermedad como causa 
directa de la disminución, Batrachochytrium dendrobatidis ahora es reconocido 
por su capacidad para propagarse rápidamente en las poblaciones (Lips et al. 
2005), infectar numerosas especies (Daszak et al. 2000), causar elevadas 
tasas de mortalidad (Lips et al. 2005) y persistir incluso cuando hay baja 
densidad de hospederos (Woodhams & Alford 2005). Estas características de 
la enfermedad hacen que la recuperación a la enfermedad sea difícil y 
proporciona una fuerte evidencia para considerar que es una enfermedad que 
induce a extinciones, sin embargo el mecanismo por el cual mata a los anfibios 
es aún poco comprendido. La hipótesis más aceptada dice que el hongo, 
invade la piel de los anfibios y altera su equilibrio hídrico, lo que puede 
desencadenar asfixia en el organismo lo que lleva a su muerte en los casos 
16 
 
más graves, esto en adultos, mientras que las larvas, que presentan infección 
sólo en la zona bucal mueren más tarde, cuando la queratina se extiende por 
todo su cuerpo al complementar la metamorfosis (Berger et al. 1998). Una vez 
que el hongo ha aparecido en una zona, puede permanecer en el medio como 
saprófito hasta que un nuevo hospedero vuelva aparecer. Mientras esto ocurre, 
el hongo se extiende fácilmente a través de medios acuáticos y húmedos. Una 
vez que mata poblaciones locales y desaparecen temporalmente los 
hospederos, permanece en el agua como saprófito (Retallick et al. 2004). 
 
El hongo suele despertar de su inactividad en el medio acuático entre los 17 y 
25 grados centígrados, lo que puede causar la muerte del 100% de los 
ejemplares afectados, siendo del 50% las bajas entre los 27 y los 30ºC, a partir 
de esta temperatura el hongo tiende a desaparecer. Lamentablemente, el 
cambio climático modifica las temperaturas en ciertas zonas que solían estar 
protegidas por temperaturas en las que el hongo no era tolerante permitiendo 
su propagación más rápida (Pounds et al. 2006). 
 
17 
 
4. OBJETIVOS 
4.1 Objetivo General 
La búsqueda y el análisis de la presencia del hongo Batrachochytrium 
dendrobatidis en anfibios en ocho localidades del Valle del Cauca. 
 
4.2 Objetivos Específicos 
 Diagnosticar la presencia de B. dendrobatidis en áreas de intensos 
muestreos tradicionales en el Valle del Cauca. 
 Determinar la prevalencia del hongo en las muestras analizadas por 
especie y localidad. 
 Establecer un protocolo óptimo para la detección de chytridiomycosis 
mediante el uso de PCR (Polymerase Chain Reaction) en poblaciones de 
anfibios locales. 
 
18 
 
5. ÁREAS DE ESTUDIO 
5.1 Localidad Anchicayá 
Se encuentra en el sur occidente de Valle del Cauca (N03º 36` 55.3" W 76º 55` 
06.2") en el municipio de Dagua a 655 msnm con temperaturas entre 26 y 
28°C. El lugar se compone por una selva húmeda con árboles hasta de 40 m 
de altura. 
 
5.2 Localidad Bitaco – Chicoral 
Se localiza en el municipio de la Cumbre, al noroccidente de Santiago de Cali 
(N 03°34´09.5” W 76°35´44.4”) sobre el flanco medio de la Cordillera 
Occidental. La zona se compone de un bosque muy húmedo premontano, cuya 
altura va desde los 1700 hasta los 2200 msnm, con temperaturas entre 14 y 
18° C. 
 
5.3 Localidad Centro de Educación Ambiental La Sirena 
Se ubica en el municipio de Palmira (N 03°31´31.9” W 76°06´27.5”) a 2550 
msnm, a lo largo de un sendero de 840 metros donde se aprecian especies 
nativas, que viven a 16°C. 
 
5.4 Localidad Cerro El Ingles 
Se localiza ubicado en el municipio El Cairo (N 04°44´29.9” W 76°17´45.6”) 
entre 2150 y 2600 msnm, su temperatura oscila entre los 14 y 18°C. Este lugar 
se encuentra en el límite político entre el departamento del Valle del Cauca y el 
Chocó. Forma parte del complejo boscoso de la Serranía de los Paraguas 
siendo un Bosque Pluvial Premontano. 
19 
 
5.5 Localidad Piangüita 
Se encuentra a 20 minutos en lancha desde el muelle de Buenaventura (N 
03°50,634´ W 76°11,951´), siendo parte de este municipio. En la zona se ubica 
una selva lluviosa y playas, su temperatura oscila entre los 25 y 35°C, su altitud 
es de 7 msnm. 
 
5.6 Localidad San Antonio 
Es un bosque cuya principal altura es el cerro de la Horqueta a 2200 msnm. 
Sus áreas boscosas se sitúan en el sector conocido como km 18 (N 
03°28´57.9” W 76°37´24.4”). Pertenece a los municipios de Cali (corregimientos 
El Saladito, Felidia, La Elvira) y Dagua (corregimiento San Bernardo). 
 
5.7 Localidad San Cipriano 
Esta área pertenece a la Reserva Forestal de San Cipriano y Escalerete (N 
03°49´54.5” W 76°53´18.7”). La reserva protege las cuencas del los ríos San 
Cipriano y Escalerete afluentes del río Dagua; recibe entre 7000-8000 mm de 
precipitación anual y pertenece al Chocó Biogeográfico. La Reserva cuenta con 
unas 8600 ha de bosque pluvial, con elevaciones entre 100-800 msnm. 
 
5.8 Localidad Alto Queremal 
El área de muestreo hace parte de la Hacienda San Pedro, se encuentra 
ubicada en el corregimiento de Queremal, municipio de Dagua (N 03°29´01,5” 
W 76°42´07.3”). Su altura está entre 1700 y 2200 msnm, el área se clasifica 
como un bosque húmedo premontano. 
 
20 
 
5.9 Localidad Reserva Natural Bosque de Yotoco 
Se encuentra ubicada en la Cordillera Occidental del Valle del Cauca (N 
03°52´37.2” W 76°26´11.3”), hace parte del municipio de Yotoco, con una 
altura entre los 1200 y 1600 msnm, su clima es templado pues la temperatura 
oscila entre los 15 y 22°C. La zona se compone de pequeños y aislados 
parches de bosque, uno de los últimos remanentes de bosque subtropicalhúmedo en el departamento. 
 
 
Figura 6. Mapa con las localidades muestreadas. 
21 
 
6. METODOLOGÍA 
6.1 Fase de Campo 
Se llevó a cabo al menos una salida a cada sitio. Las salidas duraron tres días 
durante los cuales se realizaban muestreos diurnos y nocturnos trazando para 
cada localidad tres transectos de 300 m de largo por 5 m de ancho (1500 m2) 
previamente marcados, los transectos eran de diferentes hábitats como 
quebrada, bosque ripario, siguiendo la metodología de Transectos de 
Inspección por Encuentro Visual (IEV) (Lips et al. 2001). 
 
Para los muestreos se utilizan medidas de bioseguridad, entre las cuales se 
destacan lavar muy bien las botas antes de cada recorrido con hipoclorito para 
evitar la contaminación entre localidades de posibles esporas transportadas en 
la suela. 
 
6.1.1 Toma de Muestras 
Cada individuo se capturó usando una bolsa plástica para evitar el contacto con 
el organismo. La bolsa se marcó con la hora, fecha, lugar o datos convenientes 
para identificar la muestra, posteriormente. Cada individuo se transportó en una 
bolsa con agua para garantizar su bienestar. Para el frotis se usaron guantes 
de nitrilo para manipular el anfibio, con un hisopo plástico previamente 
esterilizado se frotó repetidamente la piel en lugares como espalda, vientre, 
muslos, lados y dedos, concentrándose especialmente en la ingle, este frotis se 
hace repetidamente. El hisopo con el raspado se guardó en un vial con etanol 
al 70%, debidamente marcado con el número de la muestra y con la misma 
cantidad de etanol para todos los viales a fin de evitar la dilución del hongo en 
22 
 
caso de que esté presente en alguna muestra. Posteriormente las muestras se 
refrigeraron lo más posible, en campo se usó termo-neveras con hielo seco. 
Una vez llevadas a la ciudad, se guardaron en neveras a -26°C. 
 
 
Figura 7. Toma de muestras mediante frotis con hisopo. (Tomado de 
http://wildlife.state.co.us/NR/rdonlyres/710BBC95-2DCF-4CF9-8443-
D4561DBC3B69/0/PCRsampling2004.pdf) 
 
6.2 Fase de Laboratorio 
Esta fase se realizó en las instalaciones de Genética Poblacional de la 
Universidad de los Andes, basado en un protocolo elaborado por Annis et al. 
2004. 
 
6.2.1 Extracción de ADN 
Antes de empezar todos los materiales fueron puestos en una cámara de flujo 
laminar (LABCONCO Purifier Class II Biosafety Cabinet Delta Series) con UV 
unos minutos. Para la extracción se tomó el tubo con la muestra y se realizó 
vortex por 30 segundos cambiando de posición el tubo. Con la ayuda de unas 
pinzas se presionó el hisopo contra las paredes del tubo y se retiró para 
23 
 
transferir 300 ul de la muestra a un vial nuevo de 0.6 mL. Los hisopos se 
guardaron en caso de necesitar una confirmación. Las pinzas fueron 
esterilizadas entre muestra y muestra para evitar la contaminación. Luego se 
centrifugó (Centrifuga Thermo Electron Corporation IEC CL31R Multispeed 
Centrifuge) cada tubo a 12000 rpm durante 5 minutos hasta que se formaba un 
pellet en el fondo. Algunas veces el pellet era muy pequeño y no se podía ver, 
sin embargo puede ser una muestra positiva. Al terminar la centrifugación se 
descartó el sobrenadante. El etanol se vertió en un beaker y para eliminar 
residuos en los tubos se ponían boca abajo sobre una toalla absorbente. Luego 
se pusieron las muestras en un Speedvac (RC 1010 Jovan AM LTDA) por 90 
minutos para terminar de evaporar el etanol. Finalizado este proceso, se 
agregó a cada tubo 5 ul de H2Odd (agua libre de nucleasas) y se realizó vortex 
para resuspender el pellet. Luego se transfería los 5 ul un nuevo vial de 0.2 mL. 
Para identificar los resultados en el gel de agarosa se crearon una muestra 
positiva y otra negativa. Para el positivo se agregaron 5 ul de H2Odd y 5 ul de 
la dilución de un cultivo de hongo en un vial de 0.2 mL. Para el negativo se 
agregaron 10 ul de H2Odd en un vial de 0.2 mL. Luego se adicionaron a las 
muestras incluyendo el control positivo y negativo 12 ul de GeneReleaser. Las 
alícuotas de GeneReleaser se mezclaron usando vortex, esto se hizo antes de 
agregar a la muestra. Cuando se adicionaron a la muestra hay que asegurarse 
que el GeneReleaser caiga al fondo del vial. El GeneReleaser se almacena a 
4ºC, nunca en el congelador. Las muestras se llevaron al termociclador (MJ 
Research PTC-200 Thermal Cycler) y se usó el protocolo general de 
GeneReleaser: 
a) 65ºC x 30 segundos 
24 
 
b) 8ºC x 30 segundos 
c) 65ºC x 90 segundos 
d) 97ºC x 180 segundos 
e) 8ºC x 60 segundos 
f) 65ºC x 180 segundos 
g) 97ºC x 60 segundos 
h) 65ºC x 60 segundos 
i) mantener a 80ºC 
 
Terminado el proceso se centrifugaron las muestras a 12000 rpm durante 3 
minutos. Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo marcado correctamente. 
Se realizó con cuidado para evitar tomar la fase blanca que causaría una 
inhibición en la PCR. La extracción se almacenó a -20ºC. 
 
6.2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction) 
Para la PCR se realizó el cálculo del Master Mix según las proporciones de la 
siguiente tabla. 
 
Tabla 1. Proporciones para la elaboración de Master Mix. 
COMPONENTE VOLUMEN (ul) 
GoTaq Green Master Mix 6 
Primer Bd1a 0.5 
Primer Bd2a 0.5 
H2Odd 3 
AND 2 
TOTAL 12 
 
Se preparó el mix agregando de último la Taq. Los reactivos fueron puestos en 
hielo mientras se realizaba la preparación. Se marcaron los tubos incluyendo el 
25 
 
positivo (hongo) y el negativo (agua). 
 
En tubos de 0.2 mL se agregan 10 ul del mix y 2 ul de cada muestra. Luego se 
hizo vortex. Después de realizar vortex a todas las muestras se centrifugaron 
los tubos unos segundos. Luego se llevaron las muestras al termociclador y se 
usó el procedimiento de la Tabla 2. 
 
Tabla 2. Programa de amplificación usado en la PCR. 
PASO Temperatura ºC Tiempo Número de 
Ciclos 
1. Denaturación inicial 95 2 minutos 1 
2. Denaturación 95 45 
segundos 
 
3. Anillaje 55 45 
segundos 
35* 
4. Extensión 72 1 minuto 
*Los pasos 2 a 4 se repiten 35 ciclos 
5. Extensión final 72 10 minutos 1 
Temperatura final de 
mantenimiento 
4 indefinido 1 
 
6.2.3 Gel de Agarosa 
Las muestras se corrieron en gel de agarosa. Para ello se preparó el molde 
para el gel, se acomodaron las bandas y las peinillas con el mayor número de 
pozos para sembrar el mayor número de muestras en una sola corrida. Se 
preparó el gel al 1% (0.8 g de agarosa con 80 mL de TBE a 0.5X) en un beaker 
y se calentó en un microondas durante un minuto. Luego se agregó 1 ul de 
Bromuro de Etidio, se mezcló y se vertió sobre el molde. Despues de enfriarse 
y cuando se garantiza que el gel es consistente se retiró las peinillas y las 
bandas. Se puso en la cámara de electroforesis y se agregó TBE a 0.5X hasta 
la marca de indicación. Se sembró en cada pozo 3 ul siguiendo este orden, el 
primero con marcador de peso, luego positivo, negativo y las muestras. Se hizo 
26 
 
la corrida con la fuente de energía a 100 voltios, 110mA y 45 minutos. Se 
observó el gel en un transiluminador de luz ultravioleta. 
 
27 
 
7. RESULTADOS 
7.1 Individuos Analizados 
Se analizaron un total de 629 individuos pertenecientes a 49 especies de 22 
géneros de 11 familias, se puede observar la presencia de algunas especies en 
común para varias localidades como Pristimantis palmeri, también se puede 
decir que mientras las especies en común tienen una marcada abundancia hay 
otras especies que presentan escacez (Ver Tabla 3). 
 
Tabla 3. Número de individuos analizados por especie en cada localidad. 
LOCALIDAD ANCHICAYÁ 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
Bufonidae Rhaebo haematiticus 2 
Rhinella marina 2 
Centrolenidae Centrolene prosoblepon 1 
Centrolene sp. 12 
Craugastoridae Craugastor fitzingeri 1 
Craugastor raniformis 25 
Eleutherodactylidae Diasporus gularis 1 
Hylidae Smilisca phaeota 6 
 
Strabomantidae 
Pristimantis achatinus 2 
Pristimantis hybotragus 1 
Pristimantis sp.1 
LOCALIDAD CERRO EL INGLÉS 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
Bufonidae Rhinella paraguas 9 
Centrolenidae Centrolene buckleyi 2 
Plethodontidae Bolitoglossa walkeri 4 
Bolitoglossa vallecula 1 
 
 
 
 
Strabomantidae 
 
Pristimantis brevifrons 5 
Pristimantis erythropleura 5 
Pristimantis kelephus 2 
Pristimantis myops 4 
Pristimantis palmeri 6 
Pristimantis phalarus 1 
Pristimantis quantus 3 
Pristimantis restrepoi 5 
Pristimantis sp. 14 
 
 
 
28 
 
Continuación de la 
Tabla 3. 
 
LOCALIDAD CHICORAL 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
Centrolenidae Cochranella savagei 5 
Nymphargus ignotus 10 
 
 
 
Strabomantidae 
Pristimantis brevifrons 5 
Pristimantis erythropleura 21 
Pristimantis juanchoi 2 
Pristimantis orpacobates 1 
Pristimantis palmeri 30 
Pristimantis platychilus 1 
Pristimantis sp. 1 
LOCALIDAD LA SIRENA 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
Bufonidae Osornophryne sp. 5 
Hylidae Hyloscirtus larinopygion 7 
Plethodontidae Bolitoglossa adspersa 11 
Bolitoglossa sp. 10 
 
 
 
 
Strabomantidae 
Pristimantis alalocophus 6 
Pristimantis boulengeri 5 
Pristimantis brevifrons 4 
Pristimantis buckleyi 8 
Pristimantis phalarus 1 
Pristimantis piceus 19 
Pristimantis sp. 63 
Pristimantis thectopternus 4 
LOCALIDAD SAN CIPRIANO 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
Bufonidae Rhaebo haematiticus 2 
 
 
 
Centrolenidae 
Centrolene calllistommum 
 
5 
Centrolene ilex 4 
Cochranella pulverata 3 
Cochranella spinosa 8 
 
Craugastoridae 
Craugastor fitzingeri 3 
Craugastor longirostris 1 
Craugastor raniformis 10 
Dendrobatidae Allobates talamancae 1 
Silverstoneia nubicola 3 
Eleutherodactylidae Diasporus gularis 3 
 
 
Hylidae 
 
Hyloscirtus palmeri 1 
Hypsiboas boans 1 
Hypsiboas crepitans 1 
Hypsiboas rosenbergi 2 
29 
 
Continuación de la 
Tabla 3. 
 
 
Smilisca phaeota 3 
Leptodactylidae Leptodactylus 
ventrimaculatus 
1 
Plethodontidae Bolitoglossa biseriata 2 
Ranidae Lithobates vaillanti 11 
Strabomantidae Pristimantis achatinus 1 
Pristimantis latidiscus 5 
LOCALIDAD YOTOCO 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
Centrolenidae Cochranella savagei 3 
Dendrobatidae Ranitomeya bombetes 18 
 
Strabomantidae 
Pristimantis orpacobates 2 
Pristimantis palmeri 25 
Strabomantis ruizi 1 
LOCALIDAD PIANGUITA 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE 
INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
Bufonidae Rhinella margaritifera 2 
Rhinella marina 1 
Centrolenidae Centrolene ilex 2 
Craugastoridae Craugastor fitzingeri 10 
Craugastor raniformis 1 
Dendrobatidae Phyllobates aurataenia 1 
Colostethus sp. 1 
Eleutherodactylidae Diaporus gularis 10 
Hylidae Hypsiboas picturatus 2 
Smilisca phaeota 1 
 
 
Strabomantidae 
Pristimantis achatinus 1 
Pristimantis latidiscus 1 
Pristimantis sp. 5 
Pristimantis tinker 3 
Strabomantis anomalus 1 
LOCALIDAD SAN ANTONIO 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE 
INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
Plethodontidae Bolitoglossa walkeri 6 
 
 
 
Strabomantidae 
Hypodactylus mantipus 17 
Pristimantis brevifrons 2 
Pristimantis calcaratus 8 
Pristimantis erythropleura 7 
Pristimantis palmeri 36 
Pristimantis sp. 5 
 
 
 
30 
 
Continuación de la Tabla 3. 
 
LOCALIDAD SAN PEDRO 
FAMILIA ESPECIE NÚMERO DE 
INDIVIDUOS 
ANALIZADOS 
 
 
Strabomantidae 
Pristimantisplatychilus 1 
Hypodactylus mantipus 1 
Pristimantis brevifrons 3 
Pristimantis erythropleura 6 
Pristimantis juanchoi 2 
Pristimantis palmeri 39 
 
 
La localidad de Anchicayá fue visitada desde el 13 al 15 de marzo de 2009, se 
pudo observar una presencia marcada de Craugastor raniformis hallada en los 
pastizales y caminos de la zona de muestreo. En las quebradas ubicadas en el 
interior de los bosques se encontraron algunos centrolenidos siendo el segundo 
en abundancia, de otras especies hubo poca presencia en las jornadas 
muestreadas. (Figura 8). 
 
 
Figura 8. Abundancia de individuos por especie en Anchicayá 
 
2 2 1
12
1
25
1
6
2 1 1
0
5
10
15
20
25
30
31 
 
En el Cerro El Inglés visitado entre el 26 y 28 de noviembre de 2009 se 
encontró una buena diversidad de especies con abundancia limitada, siendo 
marcada la presencia del género Pristimantis y de la especie Rhinella 
paraguas, estos resultados se pueden comparar con los obtenidos en el trabajo 
de Velásquez 2006 y se observa que aunque se encontraron las mismas 
especies a excepción de Centrolene grandisonae que para nuestra visita no fue 
encontrada, la abundancia de especies ha mostrado cambios notorios, como 
una disminución en los individuos Pristimantis brevifrons y Pristimantis 
erythropleura (Figura 9). 
 
 
Figura 9. Abundancia de Individuos por especie en Cerro El Inglés 
 
En Chicoral se observó una mayor presencia de individuos del género 
Pristimantis siendo Pristimantis palmeri y Pristimantis erythropleura las 
especies más comúnmente encontradas. También se tuvo la oportunidad de 
observar una limitada agrupación de centrolenidos en pequeñas quebradas 
internas en un bosque cercano al rio. (Figura 10). 
9
2
4
1
5 5
2
4
6
1
3
5
14
0
2
4
6
8
10
12
14
16
32 
 
 
Figura 10. Abundancia de Individuos por especie en Chicoral 
 
En las visitas realizadas a la Sirena entre el 6 y 8 de febrero y 29, 30, 31 de 
mayo de 2009 se constató la presencia marcada de diferentes especies del 
género Pristimantis halladas en los bordes de bosque. Por otro lado, se 
encontraron varios individuos del género Bolitoglossa en un camino de piedras 
cercano al sitio de muestreo (Figura 11). 
 
 
Figura 11. Abundancia de Individuos por especie en La Sirena 
5
10
5
21
2 1
30
1 1
0
5
10
15
20
25
30
35
5 7
11 10
6 5 4
8
1
19
63
4
0
10
20
30
40
50
60
70
33 
 
En los muestreos realizados en San Cipriano durante el 9, 10 y 11 de mayo de 
2009 se pudo colectar la mayor cantidad de especies en comparación con otros 
muestreos lo que indica una gran diversidad de especies en la zona. Las 
especies más abundantes según el muestreo realizados son Lithobates 
vaillanti, Craugastor raniformis y Cochranella spinosa (Figura 12). 
 
 
Figura 12. Abundancia de Individuos por especie en San Cipriano 
 
En el muestreo realizado el 6, 7 y 8 de febrero de 2009 en la Reserva de 
Yotoco, se observó una baja diversidad de especies con una alta abundancia 
en Pristimantis palmeri y Ranitomeya bombetes siendo la primera una especie 
común en varias zonas del Valle y la segunda una especie con una comunidad 
estable ubicada en la cima de la Reserva (Figura 13). 
 
2
5
4
3
8
3
1
10
1
3 3
1 1 1
2
3
1
2
11
1
5
0
2
4
6
8
10
12
R
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s
34 
 
 
Figura 13. Abundancia de Individuos por especie en Yotoco 
 
En Piangüita se hizo el muestreo los días 2, 3 y 4 de marzo de 2009, aunque 
se halló una gran diversidad de especies solo se tuvo una marcada abundancia 
en dos de ellas Craugastor fitzingeri y Diasporus gularis (Figura 14). 
 
 
Figura 14. Abundancia de Individuos por especie en Piangüita 
 
El muestreo en la localidad de San Antonio se realizó el 4, 5 y 6 de abril de 
3
18
2
25
1
0
5
10
15
20
25
30
Cochranellasavagei
Ranitomeya 
bombetes
Pristimantis 
orpacobates
Pristimantis 
palmeri
Strabomantis 
ruizi
2
1
2
10
1 1 1
10
2
1 1 1
5
3
1
0
2
4
6
8
10
12
35 
 
2009, se observó una limitada diversidad en el lugar aunque las especies 
capturadas muestran una presencia marcada por el número de individuos 
encontrados en especial Pristimantis palmeri y Hypodactylus mantipus (Figura 
15). 
 
 
Figura 15. Abundancia de Individuos por especie en San Antonio 
 
La localidad de San Pedro fue visitada los días 20, 21 y 22 de febrero de 2009, 
se pudo observar una baja diversidad y baja abundancia en especies a 
excepción de Pristimantis palmeri la cual presentó una marcada presencia en la 
zona (Figura 16). 
6
17
2
8 7
36
5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
36 
 
 
Figura 16. Abundancia de Individuos por especie en San Pedro 
 
7.2 Presencia de Batrachochytrium dendrobatidis 
Mediante el uso de PCR convencional fue posible la determinación de 
chytridiomicosis en 5 individuos pertenecientes a 3 especies en dos de las 
localidades muestreadas correspondientes a Yotoco y San Pedro. 
 
Las especies positivas para el hongo fueron Pristimantis erythropleura, 
Pristimantis brevifrons y Pristimantis palmeri en la localidad San Pedro y 
Pristimantis palmeri en Yotoco. 
 
Tabla 4. Especies infectadas con chytridiomicosis. 
Especie Hábitat Elevación Captura Hora Sustrato Peso SVL Localidad 
Pristimantis 
erythropleura 
Borde - 
Quebrada 
1750 20-02-09 19:46 Hojas 1.29 26.4 San Pedro 
Pristimantis 
brevifrons 
Bosque 1750 20-02-09 19:52 Hojas 0.29 17.7 San Pedro 
Pristimantis 
palmeri 
Bosque 1750 20-02-09 20:20 Hojas 0.45 17.9 San Pedro 
Pristimantis 
palmeri 
Bosque 1750 20-02-09 20:50 Hojas 1.48 26.7 San Pedro 
Pristimantis 
palmeri 
Bosque 1551 6-02-09 20:32 Hojas 0.45 17.6 Yotoco 
 
1 1 3
6
2
39
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
37 
 
En la localidad de Yotoco el porcentaje de infección fue del 2% (1/49), 
encontrado en un individuo de la especie Pristimantis palmeri siendo la especie 
más abundante en la localidad. 
 
Tabla 5.Prevalencia del hongo en la localidad de Yotoco. 
LOCALIDAD YOTOCO 
ESPECIE PREVALENCIA* PORCENTAJE 
Cochranella savagei 0/3 0 
Ranitomeya bombetes 0/18 0 
Pristimantis 
orpacobates 
0/2 0 
Pristimantis palmeri 1/25 4 
Strabomantis ruizi 0/1 0 
*Número de individuos con infección/Número de individuos examinados 
 
En la localidad de San Pedro el porcentaje de infección es del 7.6% (4/52), 
teniendo la mayor prevalencia Pristimantis brevifrons con33% seguido por 
Pristimantis erythropleura con 16%. 
 
Tabla 6. Prevalencia del hongo en la localidad de San Pedro. 
LOCALIDAD SAN PEDRO 
ESPECIE PREVALENCIA PORCENTAJE 
Pristimantis crysops 0/1 0.0 
Hypodactylus 
mantipus 
0/1 0.0 
Pristimantis brevifrons 1/3 33.3 
Pristimantis 
erythropleura 
1/6 16.6 
Pristimantis juanchoi 0/2 0.0 
Pristimantis palmeri 2/39 5.1 
 
 
38 
 
8. DISCUSIÓN 
Con los datos obtenidos en esta investigación, se hace evidente la presencia 
del hongo en las localidades Alto Queremal y Yotoco, además que permite 
corroborar los resultados obtenidos en la investigación de Velásquez et al. 
(2008). 
 
Las localidades en donde el hongo no fue detectado, se presenta mayor 
diversidad de especies, mientras que en las localidades como San Pedro, 
Yotoco y Cerro El Inglés en las cuales el patógeno ha estado presente desde 
años atrás (Velásquez et al. 2008) han mostrado una disminución marcada de 
especies, la cual se ha intensificado conforme pasa el tiempo. 
 
En la localidad Cerro El Inglés, a pesar de ser una reserva con cierto tipo de 
protección, se han presentado desapariciones de especies en los últimos 
quince años (Velásquez 2006). En esta zona la deforestación, contaminantes 
en el agua y la pérdida del hábitat son factores que no están implicados en la 
disminución de biodiversidad. Especies como Atelopus chocoensis, Centrolene 
robledoi, Nimphargus griffithsi, Gastroteca antomia entre otras han dejado de 
ser vistas en la zona desde antes del 2005 (Velásquez 2006), aunque en esta 
investigación el hongo no fue detectado en esta zona, lo había sido con 
anterioridad por lo que se puede decir que ha influenciado en la desaparición 
de algunas especies susceptibles a la enfermedad. 
 
La localidad San Pedro es una zona retirada con poco impacto antrópico, 
consiste en pedazos pequeños de bosque de galería separados por una gran 
39 
 
extensión de potreros usados en algunos sitios para pastoreo de ganado. Sin 
embargo, se han presentado varias extinciones locales y una gran disminución 
en la diversidad de especies. En la zona de muestreo, se encontró la presencia 
marcada de Pristimantis palmeri y unos cuantos de Pristimantis erythropleura, 
mientras que la abundancia de otras especies se ha reducido e incluso no se 
detectaron algunas de las 28 especies registradas para la zona (Velásquez et 
al. 2008). Entre las desapariciones están Hyloscirtus alytolilax, Hyloxalus 
abditaurantius y Hyloxalus fascianigrus positivas para el hongo siendo 
muestras de los años 90, al igual que Pristimantis palmeri y Pristimantis 
erythropleura (Velásquez et al. 2008). En este trabajo se encontraron individuos 
positivos de las especies Pristimantis palmeri, Pristimantis erythropleura y 
Pristimantis brevifrons de las cuales las dos primeras son conocidos por ser 
organismos resistentes al hongo, por lo que se puede suponer que su 
resistencia les ha permitido mantenerse y establecerse en la zona además de 
ser vectores para la propagación del patógeno mientras otras especies han 
desaparecido (Johnson & Speare 2005). 
 
En la Reserva Forestal de Yotoco también se halló la presencia del hongo para 
un espécimen de Pristimantis palmeri en comparación con la especie hallada 
por (Velásquez et al. 2008) Strabomantis ruizi. Tomando como antecedente la 
tolerancia de Pristimantis palmeri se puede inferir que el patógeno se está 
asentando en el área teniendo un vector tolerante a la enfermedad con una 
comunidad bastante estable. 
La prevalencia de Batrachochytrium dendrobatidis en las dos localidades 
detectada ha sido baja, 2% para Yotoco y 7% para San Pedro. A nivel 
40 
 
intraespecifico, se puede observar una alta prevalencia en Pristimantis 
brevifrons (33%), eso se debe a un tamaño poblacional bajo, lo cual puede 
llevar a que se vea afectado en mayor medida por enfermedades (Green et al. 
2001). Pristimantis erythropleura tiene una prevalencia media (16%), también 
con el número bajo de individuos. Pero Pristimantis palmeri cuyo tamaño 
poblacional fue alto en ambas localidades tiene una baja prevalencia, lo que 
confirma que hay especies que no se afectan por el patógeno y que tienen 
cierto tipo de resistencia, lo que hace de esta especie un hospedero de 
reserva, lo que permite la persistencia del hongo en una zona despues del 
declive de especies más sensibles (Johnson& Speare 2005). 
 
En varios lugares del planeta, la chytridiomicosis está causando eventos de 
desaparición masiva de anfibios (Berger et al. 1998; Bosch et al. 2001; Lips 
1999) y si es verdad que las disminuciones que están ocurriendo en las 
localidades muestreadas de Valle del Cauca son producidas por el patógeno, 
es correcto pensar en esta enfermedad como evento importante que amenaza 
la biodiversidad actual. Dada esta situación alarmante, para la comunidad 
científica es importante hacer investigaciones sobre disminución de especies y 
tener en cuenta que los organismos viven en ambientes influenciados por 
muchos factores como la contaminación, especies introducidas, deforestación, 
depredación y los cambios climáticos los cuales pueden ayudar en la aparición 
de enfermedades infecciosas como la chytridiomicosis (Pounds et al. 2006). 
También se deben considerar otros posibles vectores de infección como aves, 
peces o invertebrados y humanos incluyendo investigadores como agentes 
dispersantesdel hongo (Johnson & Speare 2005). 
41 
 
 
Las situaciones que genera el cambio climático como largos periodos de 
sequía, causa que los organismos se concentren en los sitios disponibles con 
humedad, aumentando el riesgo de contagio por contacto con infectados 
(Burrowes et al. 2004) aunque no todas las especies presentan dependencia a 
fuentes de agua, suelen usarla temporalmente lo cual contribuye al contagio o 
por las esporas que se concentran en los pocos sitios húmedos, las cuales 
pueden sobrevivir mucho tiempo, soportando sustratos secos hasta que llegue 
el hospedero apropiado para parasitar (Johnson & Speare 2003; Johnson & 
Speare 2005). Por otro lado, los reportes de infección con el hongo, se dan 
principalmente en especies de hábitat acuáticos lo que hace de la enfermedad 
una amenaza marcada para este tipo de especímenes (Rueda-Almonacid et al. 
2004). 
 
Según Blaustein & Dobson (2006) cambios climáticos muy marcados producen 
un factor estresante en los organismos lo que causa que en estos se 
disminuyan sus defensas y se aumente la probabilidad de contraer 
enfermedades. La inmunidad que posean los organismos influye en el daño 
que pueda causar una infección como la chytridiomicosis a su hospedero, esta 
puede variar entre especies lo que hace a algunas más susceptibles a contraer 
esta enfermedad que a otras e incluso puede variar entre individuos de la 
misma especie (Daszak et al. 2003). 
 
Entre las especies conocidas por tener algún tipo de resistencia al patógeno 
están Pristimantis palmeri, Pristimantis erythropleura y Pristimantis brevifrons 
42 
 
las cuales fueron positivas para el hongo en este trabajo. Además de su 
resistencia al hongo, también poseen algún grado de tolerancia a factores de 
perturbación, lo que permite que colonicen nuevos sitios y se establezcan 
exitosamente desplazando a otras especies nativas que no posean esta 
ventaja en su sistema inmune (Lynch & Ruiz-Carranza 1996). 
 
Además, Pristimantis palmeri y Pristimantis erythropleura son especies que han 
sido encontradas en las localidades con presencia del hongo (Cerro El Inglés, 
Yotoco y San Pedro) y en otras con riesgo de infección debido a la intromisión 
humana (San Antonio y Chicoral) mientras que en zonas que son alejadas o 
con algún tipo de protección no han sido registradas (Anchicayá, San Cipriano, 
La Sirena y Piangüita) lo que corrobora la suposición que estas especies 
contribuyen a la propagación del hongo, ayudando su asentamiento en la zona 
de infección. Estas especies se prestan inconscientemente como hospederos 
de reserva mientras las poblaciones de anfibios sensibles declinan con pocas 
probabilidades de recuperación, pues mientras se restablecen, estos 
especímenes ya se han establecido con una presencia marcada en la zona 
llevando consigo el patógeno. Esto puede ser una posible explicación para lo 
ocurrido en la localidad de San Pedro, este argumento se fundamenta en la 
hipótesis planteada por Daszak et al. (2003) en que la disminución de especies 
ocasionada por Batrachochytrium dendrobatidis sucede por una predisposición 
en un grupo de especies donde las poblaciones no se afectan 
significativamente. Esto se observa cuando ocurre un brote del hongo: estas 
especies permanecen estables mientras que la abundancia de otras más 
susceptibles tiende a disminuir, como es el caso de Pristimantis palmeri y 
43 
 
Pristimantis erythropleura. 
 
La participación de los hospederos de reserva, transporte de vectores, y 
esparcimiento de estados de vida libre puede desacoplar la dependencia de un 
patógeno en la supervivencia en una sola especie de hospedero (Johnson & 
Speare 2005). 
 
También es importante tener en cuenta, que todos los individuos positivos no 
indican nuevos brotes en la localidad donde ha sido encontrado, en algunos 
casos pueden presentarse “casos aislados” como el ocurrido en San Antonio 
con un individuo de Pristimantis w-nigrum (Velásquez et al. 2008), debido a no 
haber encontrado otro caso en el sector. Por situaciones como esta, es 
importante implementar programas de monitoreo continuo en las localidades de 
estudio, ya que las desapariciones de especies ocurren inevitablemente en 
diferentes zonas y lamentablemente no se sabe que fue lo que causó la 
extinción debido a los vacios en la información tanto del lugar como de los 
especímenes, esto dificulta la evaluación de la frecuencia de eventos 
anormales (Lips et al. 2001). De manera adicional sería apropiado realizar otras 
investigaciones que identifiquen más factores que puedan alterar la diversidad 
de anfibios, un ejemplo de esto sería los datos del clima, factores como este 
influyen de manera directa sobre los individuos (Pounds et al. 2006). 
Por otro lado, debido al impacto producido por la chytridiomicosis a nivel global, 
es importante implementar las propuestas de bioseguridad que deberían ser 
tomadas en cuenta por todas las personas que transiten por áreas rurales, así 
no pertenezcan a la comunidad científica. Estas consisten en desinfectar el 
44 
 
equipo al ingresar y salir de campo con hipoclorito o antimicótico como las 
botas que serían los principales medios de transporte de las esporas. Medidas 
sencillas como estas, pueden contribuir a evitar la dispersión de este patógeno, 
que está causando grandes calamidades en la comunidad herpetológica por su 
naturaleza y rapidez de dispersión (Johnson & Speare 2005). 
 
45 
 
9. CONCLUSIONES 
 El presente estudio reporta la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis 
en las localidades Alto Queremal y Yotoco de Valle del Cauca. 
 Las localidades que han presentado disminuciones marcadas y extinciones 
son aquellas donde el hongo ha sido detectado en los últimos 15 años. 
 Pristimantis palmeri y Pristimantis erythropleura poseen resistencia a la 
chytridiomicosis lo que las hace hospederos de reserva favoreciendo la 
propagación y fijación del hongo en las localidades. 
 Es imprescindible realizar monitoreos continuos en las localidades para 
evaluar el estado de las poblaciones e implementar protocolos de limpieza 
en las comunidades rurales y científicas para impedir la contaminación de 
las zonas de manera involuntaria. 
 
46 
 
10. LITERATURA CITADA 
ANNIS, S. L., F.P. DASTOOR, H. ZIEL, P. DASZAK & J. E. LONGCORE. 2004. 
A DNA-Basedassay identifies Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. 
Journal of WildlifeDiseases, 40 (3)420-428. 
 
BARINAGE, M. (1990). Where have all the froggies gone?Science 247:133-
1034. 
 
BEARD, K.H. & E.M. O’NEILL. 2005. Infection of an invasive frog 
Eleutherodactylus coqui by the chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis 
in Hawaii. Biological Conservation 126 : 591–595 
 
BERGER, L., SPEARE, R., DASZAK, P., GREEN, D., CUNNINGHAM, A., 
GOGGIN, C., SLOCOMBE, R., RAGAN, M., HYATT, A., MCDONALD, K., 
HINESI, H., LIPS, K., MARANTELLI, G & H. PARKES. 1998. Chytridiomycosis 
causes amphibian mortality associated with population declines in the rain 
forest of Australia and Central America. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 
9031–9036 
 
BERGER, L. & R. SPEARE. 1998. Chytridiomycosis: A new disease of wild and 
captiveamphibians. ANZCARRT Newsletter 11/4: 1-3 
 
BERGER, L., R. SPEARE & A. HYATT. 1999. Chytrid fungi and amphibian 
declines: overview,implications and future directions. Declines and 
Disappearances of Australian Frogs. Ed. A.Campbell. Environment Australia: 
Canberra: 23-33 
 
BERGER, L., A.D. HYATT, V. OLSEN, S.G. HENGSTBERGER, D. BOYLE, G. 
MARANTELLI, K.HUMPHREYS, J.E. LONGCORE. 2002. Production of 
polyclonal antibodies to Batrachochytriumdendrobatidis and their use in an 
immunoperoxidase test for chytridiomycosis in amphibians.Diseases of Aquatic 
Organisms; 48(3):213-220 
 
BLAUSTEIN, A & A, DOBSON. 2006. A message from the frogs. Nature Vol 439 
 
BOSCH, J., I. MARTINEZ-SOLANO, M. GARCIA-PARIS. 2001. Evidence of a 
chytrid fungusinfection involved inthe decline of the common Wildlife Toad 
(Alytes obstetricians) in protectedareas of central Spain. Biol Conserv 97: 331-
337 
 
BURROWES, P.A., R.L. JOGLAR & D.E. GREEN.2004. Potential causes for 
amphibian declines in Puerto Rico. Herpetologica, 60(2):141–154 
 
BUSTAMANTE, M.R, S.R. RON, & L.A. COLOMA. 2005. Cambios en la 
diversidad en sietecomunidades de anuros en los andes del Ecuador. 
Biotropica 37 (2): 180-189 
BUTLER, JM. 2005. Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of 
STR, Academic Press pg 63-84 
47 
 
COLEMAN, W & G, TSONGALIS. 2006. Molecular Diagnostics: For the Clinical 
Laboratorian, Humana Press. pg. 47-56 y 65-74 
CAREY, C. 1993. Hypothesis concerning the causes of the disappearance of 
boreal toads from theMountains of Colorado. Conservation Biology 7, N° 2 
 
COLLINS, J.P. & A. STORFER. 2003. Global amphibian declines: sorting the 
hypotheses. Diversityand distributions. 9:89-98 
 
DASZAK, P., L. BERGER, A.A. CUNNINGHAM, A.D. HYATT, D.E GREEN. & R. 
SPEARE. 1999. Emerging infectious diseases and amphibian population 
declines. Emerging InfectiousDiseases;5:735-748 
 
DASZAK, P., A. A. CUNNINGHAM & A.D. HYATT 2000. Emerging Infectious 
Diseases of Wildlife -Threats to biodiversity and human health. Science 287 pg. 
443-449 
 
DASZAK, P & A.CUNNINGHAM. 2003. Anthropogenic change, biodiversity loss, 
and a newagenda for emerging diseases. Journal of Parasitology 
89(Suppl):S37-S41. 
 
GREEN, E. & C. SHERMAN. 2001. Diagnostic histological findings in Yosemite 
Toads (Bufocanorus) from a Die-off in the 1970s. J. Herpetol. 35 (1): 92-103 
 
JOHNSON, M. & R. SPEARE. 2003. Survival of Batrachochytrium 
dendrobatidis in water:quarantine and control implications. Emerging Infectious 
Diseases; 9(8):922-925 
 
JOHNSON, M.L. & R. SPEARE. 2005. Possible modes of dissemination of the 
amphibian chytridBatrachochytrium dendrobatidis in the environment. Dis Acuat 
Org 65: 181-186 
 
LA MARCA, E., K.R. LIPS, S. LOTTERS, R. PUSCHENDORF, R. IBAÑEZ, R. 
SCHULTE, C. MARTY, F. CASTRO, J. MANZANILLA-PUPPO, J. E. GARCÍA-
PEREZ, F. BOLAÑOS, G. CHAVES, J.A.S. POUND, E. TORAL & B. E. 
YOUNG. 2005. Catastrophic population declines andextinctions in neotropical 
Harlequin Frogs (Bufonidae: Atelopus). Biotropica 37(2): 190–201 
 
LIPS, K. R. 1998. Decline of tropical montane amphibian fauna. Conservation 
Biology 12(1): 106- 117 
 
LIPS, K. R. 1999. Mass mortality and population declines of anurans at an 
upland site in westernPanama. Conservation Biology 13 (1): 117-125 
 
LIPS, K.R., J.K. REASER, B.E.YOUNG & R. IBAÑEZ. 2001. Amphibian 
monitoring in LatinAmerica: Aprotocol Manual. Herpetological Circular N° 30 
 
 
LIPS, K. R., J. R. MNDELSON, A. MUÑOZ-ALONSO, L. CANSECO-
MARQUEZ, D.G. MULCAHY. 2004. Amphibian population declines in montane 
48 
 
southern México: resurveys of historical localities. Biological Conservation 119 
pg. 555-564 
 
LIPS, K. R., P. A. BURROWES, MENDELSON J.R. & G. PARRA-OLEA. 2005. 
Amphibiandeclines in Latinoamerica widespread population declines, 
extinctions and impacts. Biotropica 
 
LONGCORE, J.E., PESSIER, A. P & D. K. NICHOLS. 1999. Batrochochytrium 
dendrobatidis gen.et sp. nov., a chytrid pathogenic to amphibians. Mycologia 
1999; 91: 219-227 
 
LYNCH, J. D. & RUIZ-CARRANZA. 1996. New sister species of 
Eleutherodactylus from thecordillera occidental of southwestern Colombia 
(AMPHIBIA: SALIENTIA: Leptodactylidae). Revistala Academia Colombiana de 
Ciencias Exactas, Físicas y Naturales 20(77): 347-363 
 
MORELL, V. 1999. Are Pathogens Felling Frogs? Science 284:728-731 
 
NICHOLS D.K., A. PESSIER & J.E. LONGCORE. 1998. Cutaneous 
chytridiomycosis in amphibian,an emerging disease. Procedings AAZ and 
AAWV Joint Conference 
 
PARKER, J. M., I. MIKAELIAN, N. HAHN, AND H. E.DIGGS. 2002. Clinical 
diagnosis and treatmentof epidermal chytridiomycosis in African clawed 
frogs (Xenopus tropicalis). Comparative Medicine 52: 265–268 
 
POUNDS, J.A., BUSTAMENTE, M.R., COLOMA, L.A., J.A. CONSUEGRA, 
M.P.L. FODGEN, P.N FOSTER, E. LA MARCA, K.L. MASTERS, A. MERINO-
VITERI, R. PUSCHENDORF, S.R. RON, A. SANCHEZ-AZOFEIFE, C.J. STILL 
& B.E. YOUNG. 2006. Widespread amphibian extinction fromepidemic disease 
driven by global warming. Nature 439: 161-167 
 
RETALLICK, R.W.R., H. MCCALLUM, & R. SPEARE. 2004. Endemic infection 
of the amphibianchytrid fungus in a frog community post-decline. PLOS Biology 
2(11):351 
 
RON, S. R. 2005. Predicting the distribution of the amphibian pathogen 
Batrachochytriumdendrobatidis in the New World. Biotropica 37(2):209-221 
 
RUEDA-ALMONACID, J.V., J.D. LYNCH & A. AMÉZQUITA. 2004. Libro rojo de 
los anfibios deColombia. Serie Libros Rojos de Especies Amenazadas de 
Colombia. Conservación InternacionalColombia, Instituto de Ciencias Naturales 
– Universidad Nacional de Colombia, Ministerio delMedio Ambiente. Bogotá, 
Colombia. 384 pp. 
 
SPEARE, R & BERGER, L. (2000). Global distribution of chytridiomycosis in 
amphibians. http://www.jcu.edu.au/ school/phtm/PHTM/frogs/chyglob.htm. 
Consultado Junio 2010 
 
VAN ELLS, T., J. STANTON, A. STRIEBY, P. DASZAK, A.D. HYATT & C. 
49 
 
BROWN. 2003. Use ofimmunohistochemistry to diagnose chytridiomycosis in 
dyeing poison dart frogs (Dendrobatestinctorius). Journal of Wildlife 
Diseases;39(3):742-745 
 
VELASQUEZ, B. 2006. ANÁLISIS DE LA PRESENCIA DE Batrachochytrium 
dendrobatidis (Chytridiales) EN ANUROS DE DOS LOCALIDADES DEL VALLE 
DEL CAUCA. Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el 
título de Bióloga. Santiago de Cali. Universidad del Valle. 115 páginas 
 
VELASQUEZ, B., CASTRO, F., BOLIVAR, W & M. HERRERA. 2008. Infección 
por el hongo quitrido Batrachochytrium dendrobatidis en anuros de la Cordillera 
Occidental de Colombia. Herpetotrópicos Vol. 4(2):65-70 
 
VOYLES, J., YOUNG, S., BERGER, L., CAMPBELL, C., VOYLES, W., 
DINUDOM, A., COOK, D., WEBB, R., ALFORD, R., SKERRAT, L & R. 
SPEARE. 2009. Pathogenesis of chytridiomicosis, a cause of catastrophic 
amphibian declines. Science Vol 326 
 
WOODHAMS, D.C & R.A. ALFORD. 2005. Ecology of Chytridiomycosis in rain 
stream frogassemblages of Tropical Queensland. Conservation Biology 19 
(5)1449-1459 
 
50 
 
ANEXO. GELES DE AGAROSA CON RESULTADOS DE PCR 
 
Foto 1. Patrón para observar resultados de PCR. MP: marcador de peso,(+) 
control positivo-hongo, (-) control negativo-agua. El hongo se manifiesta en los 
300 pares de bases. 
 
 
Foto 2. Resultados para localidad San Pedro, se observan cuatro individuos 
positivos.