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i ANÁLISIS DE LA ORGANIZACIÓN MOLECULAR Y EVOLUCIÓN DEL GEN 5S rADN TIPO II EN ELASMOBRANQUIOS Y SUS IMPLICACIONES FILOGENÉTICAS SERGIO IVÁN CASTRO PIEDRAHITA UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALESY EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI 2012 ii ANÁLISIS DE LA ORGANIZACIÓN MOLECULAR Y EVOLUCIÓN DEL GEN 5S rADN TIPO II EN ELASMOBRANQUIOS Y SUS IMPLICACIONES FILOGENÉTICAS SERGIO IVÁN CASTRO PIEDRAHITA Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Biólogo Director HEIBER CÁRDENAS HENAO Biólogo, Ms. C Codirector JOSE SERGIO HLEAP LOZANO Biólogo, Ms. C UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA SATIAGO DE CALI 2012 iii UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA SANTIAGO DE CALI SERGIO IVAN CASTRO PIEDRAHITA, 1988 ANÁLISIS DE LA ORGANIZACIÓN MOLECULAR Y EVOLUCIÓN DEL GEN 5S rADN TIPO II EN ELASMOBRANQUIOS Y SUS IMPLICACIONES FILOGENÉTICAS TEMAS Y PALABRAS CLAVE: Elasmobranquios, relaciones filogéneticas, gen 5S rADN tipo II, análisis de estructura molecular. iv Nota de Aprobación El trabajo de grado titulado “Análisis de la organización molecular y evolución del gen 5S rADN tipo II en elasmobranquios y sus implicaciones filogenéticas” presentado por el estudiante SERGIO IVÁN CASTRO PIEDRAHITA, para optar por el título de Biólogo, fue revisado por el jurado y calificado como Aprobado _________________________________ HEIBER CÁRDENAS Director _________________________________ JOSE SERGIO HLEAP Codirector _________________________________ RANULFO GONZÁLEZ Jurado v DEDICATORIA Este trabajo se lo dedico a dos persona a quienes les agradezco por ayudarme a crecer en todo sentido, por el apoyo y por sus concejos. La primera es mi madre, quien siempre estuvo a mi lado y apoyándome durante todo mi estudio, y la segunda es mi tía Rosario (Charo) quien siempre estuvo animándome a alcanzar grandes objetivos. vi AGRADECIMIENTOS Sería muy ingrato de mi parte no darles las gracias a ciertas personas que me ayudaron, acompañaron y aconsejaron durante todo el trabajo. A Ronny Orobio, Diego Solarte y Fernando Díaz quienes me asesoraron y ayudaron mientras se me presentaban dilemas técnicos en el laboratorio. A Ángela Mendoza, quien además de también ayudarme dándome consejos técnicos, hizo que las rutinas de laboratorio no fueran estresantes por su gran compañía. A la fundación SQUALUS por darme acceso a las muestras y también por sus consejos y observaciones en la propuesta de trabajo. A mi codirector Sergio Hleap por darme la oportunidad, no simplemente de tener un proyecto de trabajo de grado, sino también por introducirme en el fantástico mundo de los condrictios. También agradezco a mi director Heiber Cárdenas, persona a quien admiro por su carismática personalidad y por su profundo conocimiento en tantos temas, por tener el tiempo y la paciencia de dirigir mi trabajo de grado. vii TABLA DE CONTENIDO Página 1 RESUMEN………………………………………………………………… 1 2 INTRODUCCIÓN………………………………………………………… 3 2.1 Clasificación taxonómica dentro de la clase Chondrichthyes.…….. 3 2.2 Historia natural de la clase Chondrichtyes………………………….. 4 2.3 Filogenia de elasmobranquios: estado del arte…………………….. 7 2.4 Subunidad 5S del ADN ribosomal……….………………………… 13 3 MARCO TEÓRICO……………………………………………………… 15 3.1 El uso de genes ribosomales en análisis filogenéticos……………… 15 3.2 Modelo de transcripción molecular del gen 5S rADN....................... 16 3.3 Modelo de evolución molecular del gen 5S rADN………...….…… 18 3.4 Evolución del gen a través de la Clase Pisces………………….…… 21 4 OBJETIVOS………………………………………………………………. 23 4.1 General……………………………………………………………… 23 4.2 Específicos………………………………………………………….. 23 5 MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………… 23 viii 5.1 Recolección de muestras y almacenamiento………………………… 23 5.2 Proceso de extracción de ADN……………………………………… 24 5.3 Estandarización de la amplificación por PCR del gen 5S rADN tipo II 25 5.4 Análisis filogenéticos……………………………..………………… 26 5.5 Análisis de la estructura molecular del gen 5S rADN tipo II............ 28 6 RESULTADOS…………………………………………………………… 28 6.1 Estandarización de la PCR................................................................. 28 6.2 Relaciones filogenéticas.…………..................................................... 30 6.3 Análisis de la organización molecular................................................ 32 7 DISCUSION……………………………………………………………… 38 7.1 Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR......... 38 7.2 Relaciones filogenéticas entre elasmobranquios................................ 39 7.2.1 Relaciones intraordinales: Rajiformes................................. 40 7.2.2 Relaciones intraordinales: Myliobatiformes......................... 42 7.3 Cambios en la organización molecular del gen 5S rADN tipo II en elasmobranquios................................................................................... 44 ix 7.3.1 Región conservada: Mutaciones en el ICR, pequeñas variaciones y señal de reconocimiento de parada de la polimerasa III..................................................................... 44 7.3.2 Región NTS, microsatélites y caja TATA………………. 49 8 CONCLUSIONES………………………………………………………… 51 9 PERSPECTIVAS…………………………………………………………. 52 10 LITERATURACITADA…………………………………………………. 53 x INDICE DE FIGURAS Y TABLAS LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1: Relaciones filogenéticas en la historia de vida de los peces a través del tiempo. A) Filogenia que representa el pensamiento evolutivo del año 1900 según Romer & William (1976). B) Hipótesis filogenética de los peces según Romer & Williams (1976). C) Hipótesis filogénica para peces según Shaeffer & Williams (1977)…………………………….. 6 FIGURA 2: Propuesta de clasificación y evolución de los órdenes actuales de elasmobranquios según Compagno (1977)…………………………… 8 FIGURA 3: Estudios que soportan la hipótesis Hipnoescualea. A) Resultado principal obtenido por Shirai (1992) bajo el método cladístico que lo llevó a proponer la hipótesis Hipnoescualea. B) Filogenia basada en la morfología de la vena coronaria hecha por Muñoz (1994).………………………………….. 9 FIGURA 4: Clasificación de los órdenes actuales de rayas y torpedos dentro del super órden Batoidea según Compagno (1977)………………………. 10 FIGURA 5: Algunas hipótesis de las relaciones entre los elasmobranquios propuestas por diferentes autores. Las últimas tres propuestas están basadas en secuencias moleculares. Modificado de Naylor et al. (2005)…………. 12 xi FIGURA 6: Organización molecular del gen 5S rADN. La región conservada consta de 120 pb, mientras que la región NTS es variable en longitud………………………………………………………………. 13 FIGURA 7: Relación entre los tres tipos de polimerasa III y ubicación de sus promotores. El promotor tipo I del gen 5S ARN de Xenopus laevis consiste de un ICR. El promotor tipo II del gen tARN Leu de X. laevis está conformado de un BoxA y un BoxB separados. El promotor tipo III del gen U6 snARN de Homo sapiens consiste de un elemento de secuencia distal (DSE), un elemento de secuencia proximal (PSE) y una caja TATA. Modificado de Schramm & Hernández (2002).………………. 16 FIGURA 8: Esquema del mecanismo de reclutamiento de la polimerasa III para el gen 5S rADN. Donde se indica: a) la interacción de las proteínas unidas a los promotores internos del ADN, b) las interacciones proteína – proteína entre los factores de transcripcióny c) los contactos entre la polimerasa III y los factores de transcripción por medio de interacciones proteína – proteína. ………………………………………………………………... 18 FIGURA 9: Modelo de evolución concertada por mecanismo de conversión génica. Las flechas blancas representan las regiones conservadas del gen, mientras que las líneas entre dos flechas representan la región variable o NTS. El punto negro simboliza la mutación. Las barras negras y lineadas representan los extremos del locus para el gen. Modificado de Liao (1999)…………………………………………… 20 xii FIGURA 10: Hipótesis de la evolución del gen 5S rADN en vertebrados. Modificado de Pinhal et al. (2011)………………………………….. 22 FIGURA 11: Localidades donde se hizo la recolección de muestras en el Pacífico vallecaucano………………………………………………………….. 24 FIGURA 12: Resultados obtenidos de la amplificación por PCR del gen 5S rADN. A) Bandas generadas por los cebadores Cart5S de 300 pb aproximadamente. B) Bandas generadas por los cebadores 5SRajid de aproximadamente 1500 pb. CN: control negativo; MP: marcador de peso…….……………………………………………………………… 30 FIGURA 13: Resultado a gran y pequeña escala de las relaciones filogenéticas obtenidas a partir del gen 5S rADN tipo II por máxima verosimilitud (ML). Los números representan los valores del remuestreo en proporciones..………………………………………………………...… 31 FIGURA 14: Secuencia de nucleótidos para el gen 5S rADN tipo II en las especies estudiadas. A) Alineamiento global obtenido por MUSCLE implementado en MEGA v5.0. B) Vista ampliada y resumida de la alineación de la región conservada para todas las especies estudiadas…………………………………………………… 35 FIGURA 15: Secuencia parcial de la región NTS de las especies del género Urotrygon adyacente al principio de la región conservada la cual inicia después del nucleótido marcado como cero.……………. 37 xiii FIGURA 16: Patrón de mutación probable en la región conservada del gen 5S rADN tipo II. Las posiciones 18, 24, 35, 60 y 112 representan las mutaciones observadas en la secuencia de nucleótidos de la figura 13……………. 44 FIGURA 17: Modelo general de la estructura secundaria del gen 5S rARN para organismos eucariotas según Barciszewska et al. (2000) y adaptado para las secuencias obtenidas en elasmobranquios. Resumen de los efectos de algunas mutaciones en la capacidad de unión de la TFIIIA y el polipéptido zf4-7: los nucleótidos comprendidos entre las líneas delgadas son críticos para la unión del TFIII, mientras que aquellos contenidos dentro de las líneas gruesas son críticos para la unión del polipéptido zf4-7 según McBryant et al. (1995). Los nucleótidos remarcados representa las principales mutaciones observadas para la región conservada.…………………………………………………… 47 xiv LISTA DE TABLAS Pagina TABLA 1: Jerarquía taxonómica de la clase Chondricthyes según Nelson (2006).……………………………………………………………….. 4 TABLA 2: Cebadores utilizados para la amplificación por PCR de la región 5S rADN……………………………………………………………… 26 TABLA 3: Lista de secuencias génicas del 5S rADN obtenidas para 10 especies de Elasmobranchii desde la base de datos del NCBI.……………….. 27 1 1. RESUMEN El estudio de las relaciones filogenéticas en elasmobranquios ha tenido gran interés entre los investigadores por considerarlos como un grupo antiguo de gnatostomados, siendo útiles para entender la condición ancestral de los vertebrados. No obstante, pese a su amplia historia evolutiva y su importancia ecológica y comercial, a nivel filogenético, los elasmobranquios son pobremente entendidos. Por ello, el objetivo principal de este estudio fue realizar una filogenia para elasmobranquios basada en el gen 5S rADN tipo II, un marcador molecular útil e informativo en estudios filogenéticos, además de tener una interesante historia evolutiva molecular dentro de este grupo. También se mapeó sus cambios moleculares sobre la filogenia obtenida. El estudio contó con 12 especies de elasmobranquios, representantes de tres órdenes, y demostró que la relación entre tiburones y peces óseos era más estrecha que entre tiburones y rayas. Aunque no fue posible concluir en el rechazo de alguna de las hipótesis establecidas acerca de las relaciones entre tiburones y rayas debido a la falta de más representantes de otros órdenes que comprende a los Elasmobranchii, se obtuvo indicios de una posible evolución independiente entre Batoidea y Selachii. A nivel intraordinal, las relaciones dentro del clado Rajiformes fueron consistentes con otros estudios en los cuales se demuestra que las especies estudiadas pertenecen a un evento temprano de radiación. Por otro lado, para el clado Myliobatiformes, las familias Urotrygonidae y Potamotrygonidae se pudieron diferenciar, lo cual puede deberse a la historia evolutiva en la adaptación de nuevos ambientes para este clado. Los análisis a nivel molecular demuestran que la región conservada presenta mutaciones especie-específicas originadas bajo la hipótesis de que la estructura secundaria del gen es más importante que la secuencia de nucleótidos, además de la existencia de 2 ciertas regiones importantes que interactúan con los promotores internos del gen para el inicio de la transcripción y que están restringidas a las mutaciones. Interesantemente, para el clado de los Rajiformes, se encontró que la secuencia de parada para la polimerasa III es diferente al resto de especies y que posiblemente es una adaptación a una mejor eficacia. En general, dentro de la región NTS se encontró que la cantidad de microsatélites, al igual que la cantidad de repeticiones dentro de estos están correlacionados positivamente con la longitud de la región NTS, lo cual puede confirmar que estos microsatélites juegan un papel importante en la función y dinámica de este gen. Con respecto a la caja TATA, se encontró que para las especies del genero Urotrygon dicha caja no estaba presente dentro de la región esperada según la tendencia observada en otros estudios, lo que puede sugerir que dicha caja no juega un papel esencial para la transcripción en este género. 3 2. INTRODUCCIÓN 2.1.Clasificación taxonómica dentro de la clase Chondrichthyes. La clase Chondrichthyes (condrictios) es un grupo de vertebrados acuáticos destacados principalmente por presentar un esqueleto cartilaginoso impregnado de calcio el cual parece ser producto de una perdida secundaria debido a que en los primeros agnatos vertebrados ya estaba presente el hueso. Este punto de vista está apoyado por restos de hueso presente en las escamas y en los dientes (Kardong 2007). Otra de las características de esta clase son las escamas placoideas las cuales tienen forma dentada y no muestran huellas de crecimiento. Estas escamas se forman inicialmente bajo la piel e irrumpen en la superficie. La clase Chondrichthyes está representada por las subclases Holocephalii (conocidas como quimeras) y Elasmobranchii (grupo que comprende a los tiburones y rayas). Holocephalii comprende un único orden (Chimaeriformes) y se diferencia de Elasmobranchii en que sus mandíbulas superiores están firmemente fusionadas al cráneo y en que sus cubiertas branquiales no están expuestas en la superficie sino cubiertas por un opérculo de repliegue cutáneo. Los Elasmobranchii son un grupo, que a diferencia de los Holocephalii, está conformado por 13 órdenes, ocho de los cuales están dentro del super orden Selachii (conocidos regularmente como tiburones) y los cinco restantes dentro del super orden Batoidea (conocidos generalmente como rayas) (Tabla 1). 4 Tabla 1. Jerarquía taxonómica de la clase Chondricthyes según Nelson (2006). Clase Chondrichthyes Subclase Holocephalii Elasmobranchii Superorden -------------------Selachii Batoidea Orden Chimaeriformes Hexanchiformes Squaliformes Pristiophoriformes Squatiniformes Lamniformes Carcharhiniformes Orectolobiformes Heterondontiformes Echinorhiniformes* Chlamydoselachiformes** Myliobatiformes Rajiformes Pristiformes Torpediniformes Rhinobatiformes*** * Algunos autores proponen que el orden Equinorhiniformes debe ser considerado como una familia (Echinorhinidae) dentro del orden Squaliformes. ** Algunos autores consideran a la familia Chlamydoselachidae (Hexanchiformes) como un nuevo orden: Chlamydoselachiformes. *** Otros autores consideran a la familia Rhinobatidae (Myliobatiformes) como un orden: Rhinobatiformes 2.2.Historia natural de la clase Chondrichtyes A principios del siglo XX las relaciones filogenéticas entre los organismos estaba influenciada por el concepto de que la ontogenia recapitula la filogenia como lo había propuesto Haeckel (Richards 2008). Bajo este pensamiento y con el escaso registro fósil disponible para ese entonces, la historia natural de los condrictios se estableció en la ontogenia de algunas características morfológicas como la mandíbula y el proceso de calcificación del esqueleto cartilaginoso, lo cual llevó a la conclusión de que los condrictios, placodermos y ostracodermos eran grupos hermanos descendientes de algún grupo de ciclostomos (Romer & Williams 1976) (Figura 1A). 5 Posteriormente, en la década de los 70´s, después de muchos hallazgos fósiles de condrictios, se obtuvo un mayor material con el cual hacer estudios filogenéticos con base en la morfología de varios caracteres derivados. Este material disponible ayudó a que Romer & Williams (1976) retomara la hipótesis de Stensiö (1925, 1934, 1969) quien postuló que los tiburones tuvieron su origen a partir de un gnatostomado placodermo (Figura 1B) por degeneración del esqueleto en vista de que los Stegoselachii (un grupo de placodermos) sufrieron una osificación reducida, las espinas de las aletas se redujeron, los huesos dérmicos dieron lugar a estructuras similares a los dentículos de los condrictios y las amplias aletas pares se fueron modificando hasta llegar a ser similares a la de los Selachii. No obstante, para esa misma época, y también a partir de métodos cladísticos, Shaeffler & Williams (1977) propusieron que los condrictios eran un grupo hermano de los placodermos (Figura 1C), agrupándolos en un clado que fue propuesto por Stensiö (1963) denominado Elasmobranquiformes. Este grupo se habría originado de un gnatostomado no placodermo con base a tres características presentes entre placodermos, elasmobranquios y gnatostomados, como la presencia del hiomandibular (derivado del segundo arco branquial y uno de los componentes del arco hioideo), la vena capitis lateralis y el nervio hiomandibular, características sinapomórficas observadas por Goodrich en 1930. Desde entonces y hasta ahora, la hipótesis acerca del origen de los condrictios se sigue debatiendo entre estas dos propuestas (Jarvik 1980, Denison 1983, Maisey 1984a, Lund & Grogan 1997, Dores et al. 2011). Dentro de los condrictios, las subclases Elasmobranchii y Holocephali se han considerado grupos hermanos a partir de una relación monofilética en vista de algunas sinapomórficas como un endoesqueleto cartilaginoso que se calcifica en un patrón poligonal, un esqueleto 6 dérmico representado por dentículos con un patrón particular de enameloide, dentina y tejido basal, los pterigopodios pélvicos de diseño único y cartílagos labiales entre otras (Shaeffler & Williams 1977). Figura 1) Relaciones filogenéticas en la historia de vida de los peces. A) Filogenia que representa el pensamiento evolutivo del año 1900 según Romer & Williams (1976). B) Hipótesis filogenética de los peces según Romer y Williams (1976). C) Hipótesis filogenética para peces según Shaeffer & Williams (1977). Con respecto a Selachii y a Batoidea, existen algunas hipótesis acerca de las relaciones entre y dentro de cada uno de estos dos grupos. La visión más aceptada entre estos grupos 7 es que tanto Batoidea como Selachii derivaron de un grupo dentro de los Neoselachii (tiburones morfológicamente modernos) basales proveniente de un grupo similar al del fósil Ctenacanthus del Devónico (Maisey 1975, Compagno 1977). Una propuesta equivalente fue hecha por Shaeffler & Williams (1977) a partir de estudios cladísticos con numerosos fósiles, pero su investigación solo explica el origen de los Neoselachii a partir de un grupo relacionado con el fósil Ctenacanthus mas no las derivaciones y relaciones entre Selachii y Batoidea. A pesar de estas diferencias, existe un consenso entre la comunidad científica que acepta la hipótesis de que la subclase Elasmobranchii representa el estado basal de los vertebrados (Janvier, 1996; Naylor et al., 2005), lo que hace a este grupo interesante para estudios enfocados en entender las características de las condiciones ancestrales de los vertebrados y es por esto que la elaboración de filogenias se vuelve una herramienta útil para deducir cuáles son las especies representantes de la condición basal de este grupo de organismos y adicionalmente para razonar acerca de la historia natural de este grupo (Naylor et al. 2005). 2.3.Filogenia de elasmobranquios actuales: estado del arte Existen diferentes hipótesis acerca de las relaciones entre los grupos que conforman a la subclase Elasmobranchii. Compagno (1973, 1977) propuso que cuatro linajes de elasmobranquios derivaron independientemente de un Neoselachii basal: Squalimorphii (Hexanchiformes + Squaliformes + Pristiophoriformes), Rajomorphii (Batoidea), Squatinomorphii(Squatiniformes) y Galeomorphii (Lamniformes + Carcharinhiformes + Orectolobiformes + Heterodontiformes) (Figura 2). Esta clasificación aun es válida en la 8 taxonomía actual aunque algunos autores, como Nelson (2006), distingue a los individuos de la familia Echinorhinidae (Squaliformes) como un nuevo orden: Equinorhiniformes. Figura 2. Propuesta de clasificación y evolución de los órdenes actuales de elasmobranquios según Compagno (1977). Aunque existen estudios que apoyan esta hipótesis (Maisey 1984b, Nelson 1994, Martin 1995), también existen otros puntos de vista como el de Dunn & Morrissey (1995) quienes defienden la hipótesis difilética que consiste en que solo dos grupos evolucionaron independientemente (los Selachii y los Batoidea), soportado por diversos estudios (Bigelow & Schroeder, 1953, Seret 1986, Kitamura et al. 1996, Douady et al. 2003, Inoue et al. 2010). Por otro lado, existe una tercera hipótesis que consiste en que Batoidea derivó de algún Selachii como lo propone Shirai (1992) quien observó una estrecha relación entre los grupos Squatiniformes, Pristiophoriformes y Rajiforme (este último como representante de Batoidea) usando métodos cladísticos, asignándolos a un grupo denominado Hipnoscualos y concluyendo que los Squatiniformes son un grupo hermano del clado Rajiformes + Pristiophoriformes (Figura 3A). Igualmente, Muñoz et al. (1994) respalda la hipótesis de la estrecha relación entre Batoidea y los Squatiniformes basándose en el estudio de la estructura anatómica de la arteria coronaria (Figura 3B). 9 Figura 3. Estudios que soportan la hipótesis Hipnoescualea. A) Resultado principal obtenido por Shirai (1992) bajo el método cladístico que lo llevó a proponer la hipótesis Hipnoescualea. B) Filogenia basada en la morfología de la vena coronaria hecha por Muñoz (1994). Sin embargo, y pese a que la hipótesis de que Batoidea derivó de algún Squatiniforme tiene apoyo en otros estudios (de Carvalho 1996, de Carvalho & Maisey 1996, Shirai 1996) y llegó a ser aceptada (McEachran et al. 1996, Moyle & Cech 2000), también existen otros estudios que rechazan esta hipótesis (Douady et al. 2003, Winchellet al. 2004, McEachran & Aschliman 2004). No obstante, en los trabajos que respaldan tanto la hipótesis Hipnoscualea como la hipótesis difilética, se pueden observar discrepancias acerca de las relaciones entre los órdenes que comprende a los Selachii (Winchell et al. 2004, Naylor et al. 2005) reflejando lo complicado que es establecer las relaciones filogenéticas dentro de los Elasmobranchii, siendo más problemático cuando se trabaja con datos morfológicos debido a las limitaciones que este método presenta como la convergencia morfológica 10 (Sibley & Ahlquist 1987), la ausencia de rigor estadístico en los análisis morfológicos (Sytsma 1990) entre otros (Fechhelm & McEachran 1984, Martins 1995). Dentro del súper orden Batoidea, el estudio de las relaciones filogenéticas no ha sido tan complicado como los de Selachii. Compagno (1977) propuso la existencia de cinco clados: 1) Torpediniformes, 2) Pristiformes, 3) Rajiformes, 4) Rhinobatiformes y 5) Myliobatiformes. La hipótesis de las relaciones filogenéticas entre estos ordenes como se refleja en la figura 4 ha sido aceptada y apoyada con posteriores estudios (Winchell et al. 2004). Shirai (1996) propone que los Pristiformes son el clado menos derivado dentro de Batoidea, mientras que McEachran & aschliman (2004) consideran que son los Torpediniformes. No obstante, ambos están de acuerdo en que el orden Myliobatiformes se considera el clado más derivado, aunque aún no es clara su relación con respecto a los demás ordenes (Muñoz 1994, Lovejoy 1997, Lovejoy et al. 1998, Dunn et al. 2003, Winchell et al. 2004). Figura 4. Clasificación de los órdenes actuales de rayas y torpedos dentro del super orden Batoidea según Compagno (1997). La línea discontinua en Myliobatiformes refleja la falta de consenso acerca de las relaciones de este orden con respecto a los demás. 11 Los casos mencionados anteriormente se consideran como los más aceptados y debatidos entre la comunidad científica, pero actualmente es posible encontrar más de nueve hipótesis de las relaciones filogenéticas dentro de la clase de los Condrictios obtenidas a partir de diferentes estudios: (1) La hipótesis de Compagno (1973) el cual considera una evolución independiente entre Squalimorphii, Rajimorphii, Squatinomorphii y Galeomorphii. (2) La hipótesis de Maisey (1984a) quien propone la evolución independiente entre Batoidea , Galeomorphii y Squalimorphii + Squatinomorphii + Chlamydoselachiformes. (3) La propuesta de Theis & Reif (1985) quienes consideran a Chalmydoselachiformes + Hexanchiformes como grupo hermano de Batoidea + ((Heterodontiformes + Pristiophoriformes + Squaliformes) + (Squtiniforms + Orectolobiformes + Lamniformes + Carchariniformes)). (4) La hipótesis de Dingerkus (citado por Seret 1986) la cual es similar a la de (5) Shirai (1992) y a la de (6) de Carvalho (1996) en proponer la relación Hipnoescualea (Squaliformes + (Squatiniformes + (Pristiophoriformes + Batoidea))). Las propuestas de (7) Dunn & Morrissey (1995), (8) Kitamura et al. (1996) y (9) Douady et al. (2003) quienes en general consideran a Batoidea como grupo hermano de los Selachii (Figura 5). Todas estas hipótesis tienen en común en que, o apoyan a la hipótesis difilética o apoyan la hipótesis hipnoescualea. 12 13 2.4. Subunidad 5S del ADN ribosomal El gen 5S del ADN ribosómico (rADN) consiste de una región dispuesta en tándem que contiene una sección codificadora conservada de 120 pb seguida de una región no transcripta (NTS) que varía en longitud entre especies (Long & David 1980, Nederby et al. 1993) (Figura 6) y en la cantidad de copias por arreglo (Lewin 1997). Figura 6. Organización molecular del gen 5S rADN. La región conservada consta de 120 pb, mientras que la región NTS es variable en longitud. La región codificadora es conservada tanto en su longitud como en la secuencia de los nucleótidos debido a la función esencial de la proteína en la estabilización de la estructura del ribosoma y en el aumento de la actividad de la enzima peptidil-transferasa (Barciszewska et al. 2001). Dentro de esta región se encuentra el promotor de la transcripción el cual es tripartito (BoxA, IE y la BoxC) (Pieler et al. 1985) contenido en lo que se suele llamar la Región de Control Interno (ICR por sus siglas en inglés). En elasmobranquios, estos tres elementos se hallan entre los nucleótidos 50-64 pb, 67-72 pb y 80-97 pb, respectivamente (Pasolini et al. 2006). La región codificadora también contiene al final la señal de terminación consistente en un residuo poli-T reconocido por la polimerasa III durante la transcripción. Por otro lado, en la región NTS se observa una gran 14 variación debido a que esta región muta más rápido en comparación a la región conservada bajo un modelo de evolución concertada (Drouin & de Sá, 1995) posiblemente siendo las adiciones y eliminaciones nucleótidas las principales causantes de la variación observada en lugar de las sustituciones nucleótidas (Campo et al. 2009). Martins & Galetti (2001a) hallaron en individuos del genero Leporinus (Characiformes: Anastomidae) un NTS con una longitud de 80 pb, lo cual hasta ahora se considera la longitud más pequeña hallada entre eucariotas, concluyendo que esta puede ser la condición mínima necesaria para el mantenimiento del arreglo y la dinámica del gen 5S rADN en el genoma, conteniendo en esta corta longitud las secuencias requeridas para la expresión y regulación del gen. Aunque la secuencia del ADN que no transcribe producto alguno como lo es la región NTS parece no tener algún valor para el genoma, se ha demostrado en mamíferos que dentro de esta región existe una secuencia TATA que puede jugar un papel importante en la regulación de la expresión génica del 5S rADN (Nederby et al. 1993, Suzuki et al. 1996) mientras que en los peces la secuencia es similar a TATA sugiriendo que esta secuencia tiene una posible influencia en el nivel de transcripción del gen 5S rADN (Pendas et al. 1994, Murakami & Fugitani 1998, Rocco et al. 1999, Martins & Galetti, 2001b). No obstante, pocas especies de elasmobranquios han sido estudiadas a nivel molecular, en especial para este gen. Por ello, uno de los objetivos de este trabajo fue contribuir en el estudio del gen 5S rADN tipo II en elasmobranquios con dos nuevas especies: Utrotygon aspidura (Gilbert & Jordan, 1882) y Urotrygon rogersi (Jordan & Starks, 1895), además de analizar a nivel molecular dicho gen y mapear sus cambios moleculares sobre la filogenia obtenida a partir del mismo gen. 15 3. MARCO TEÓRICO 3.1. El uso de genes ribosomales en análisis filogenéticos Los genes ribosomales tienen una organización típica que consiste en una región codificadora seguida de otra no codificadora las cuales, juntas, se organizan en tándem dentro de unidades de repetición en la región organizadora nucleolar (NOR) (Long & David 1980), donde el número de repeticiones varía entre los diferentes organismos (Mindell & Honneycutt 1990). Frecuentemente, la sección codificadora es utilizada para establecer las relaciones filogenéticas de organismos relativamente distanciados con tiempos de divergencia largos (Kimura & Ohta 1973, Hori 1975) debido a su baja tasa de sustitución por nucleótido (0,18 sustitucionesx10- 9 años -1 ) (Hori et al. 1977). La sección no codificadora o también llamada NTS (del inglés Nontranscribed Spacer) es utilizada para establecer las relaciones filogenéticas de taxa cercanos debido su tasa de mutación de 0,58 % x 10 -6 años -1 (Hoshikawa et al. 1983, Suzuky et al. 1994) similar a la de los pseudogenes y secuencias no funcionales (Li et al. 1985). Se ha determinado que para esta región los causantes de la variación son debidas más a las adiciones y eliminaciones de los nucleótidos en lugar de las sustituciones (Campo et al.2009). Dado que el marcador filogenético ideal debe mostrar poca variación intraespecífica comparado a la variación interespecífica, los genes ribosomales son buenos candidatos por cumplir este criterio gracias a su modo de evolución concertada (Hillis & Davis 1988, Baverstock & Moritz 1990). Otra ventaja de los genes ribosomales es la presencia de la 16 región codificadora con la cual se puede establecer un punto común de inicio en la alineación de las secuencias, garantizando así la comparación de nucleótidos homólogos. 3.2. Modelo de transcripción molecular del gen 5S rADN El gen 5S rADN, al igual que aquellos que codifican para el ARN de transferencia (tRNA) y el ARN del adenovirus (VA ARN), son denominados genes clase III en referencia a que son transcriptos por la polimerasa III. Estos genes se caracterizan por codificar pequeños ARN estructurales o catalíticos de una longitud no mayor a 400 pb. La polimerasa III se divide en tres tipos acorde a la forma como se organizan los promotores internos del gen que se transcribirá (Figura 7). Específicamente, para el gen 5S rADN, éste es transcripto por la polimerasa III tipo I que obedece a los tres promotores internos (es decir, que se encuentran dentro de la región codificante) denominados BoxA, IE y BoxC y que no necesita estrictamente una caja TATA. 17 Figura 7. Relación entre los tres tipos de polimerasa III y ubicación de sus promotores. El promotor tipo I del gen 5S ARN de Xenopuslaevis consiste de un ICR. El promotor tipo II del gen tARN Leu de X. laevis consiste de un BoxA y un BoxB separados. El promotor tipo III del gen U6 snARN de Homo sapiens consiste de un elemento de secuencia distal (DSE), un elemento de secuencia proximal (PSE) y una caja TATA. Modificado de Schramm & Hernandez (2002). A diferencia del resto de genes transcriptos por la polimerasa III que requieren solo dos factores de transcripción, el gen 5S rADN necesita tres factores para reclutar finalmente la polimerasa III (Segall et al. 1980). El proceso inicia con el factor de transcripción IIIA (TFIIIA) el cual reconoce el ICR del gen. Luego la unión entre el TFIIIA por medio de los dedos de zinc al ADN permite la llegada del factor de transcripción IIIC (TFIIIC) (Lassar et al. 1983) por lo que el TFIIIA es considerado como un elemento con la capacidad de alterar las propiedades de reconocimiento del TFIIIC (Schraman & Hernandez 2002). Después de la llegada del TFIIIC, llega el factor de transcripción IIIB (TFIIIB), el cual finalmente, permite el reclutamiento de la polimerasa III a través de las interacciones proteína – proteína (Figura 8). Esta polimerasa transcribe el ADN hasta una señal de parada constituida por una región poli-T. Estudios en levaduras han demostrado que el TFIIIB es suficiente para reclutar la polimerasa III y que quizás la única función de los TFIIIA y TFIIIC es reclutar el TFIIIB para que se una al ADN (Kassavetis et al. 1990). 18 Figura 8. Esquema del mecanismo de reclutamiento de la polimerasa III para el gen 5S rADN. Donde se indica: a) la interacción de las proteínas unidas a los promotores internos del ADN, b) las interacciones proteína – proteína entre los factores de transcripción y c) los contactos entre la polimerasa III y los factores de transcripción por medio de interacciones proteína – proteína. 3.3. Modelo de evolución molecular del gen 5S rADN El modelo de evolución molecular atribuido al 5S rADN, al igual que para el resto de genes ribosomales es el de evolución concertada (Ohta & Dover 1984). En este modelo se propone que los genes de los miembros de una especie son más similares entre sí, en comparación con los miembros de otras especies sugiriendo que estos genes no evolucionan de forma independiente unos de otros sino que tienden a la homogenización (Zimmer et al. 1980, Dover 1982, Elder & Turner 1995). Los mecanismos que subyacen en el modelo de evolución concertada y que generan la homogenización dentro de las especies corresponden a: sobre cruzamiento desigual entre 19 las unidades de repetición, aunque este mecanismo ha sido desestimado por Walsh (1987) y subsecuentemente por Sthephan (1989); la transposición replicativa, la amplificación y la conversión génica (Liao et al. 1997); esta última con un mayor apoyo desde su propuesta (Hillis et al. 1991). Liao et al. (1997) en su estudio del gen RNU2 en primates (el cual también es multigénico y obedece al mismo modelo de evolución) propone un mecanismo de evolución concertada consistente en que una unidad de repetición sufre una mutación en la región no codificadora. Dicha mutación se expande al resto de unidades de repetición por mecanismos de homogenización intracromosómica. Posteriormente una unidad de repetición con la mutación pasa al otro cromosoma homólogo por mecanismo de conversión génica intercromosómica donde finalmente (por el mismo proceso de homogenización intracromosómica), la mutación se expande por el nuevo locus del nuevo cromosoma a través de las unidades de repetición (Figura 9). No obstante, existen evidencias de que la homogenización intracromosómica es más común que la recombinación intercromosómica (Schlötterer & Tautz 1994, Murti et al. 1994, Polanco et al. 1998) y que esta última no involucra las regiones que flanquean el gen (Liao et al. 1997). Esto sugiere que este paso es debido al proceso de conversión génica ya que este consiste en la transferencia no-reciproca de información genética entre secuencias similares en donde las regiones adyacentes no están involucradas (Schimenti 1999). 20 Figura 9. Modelo de evolución concertada por mecanismo de conversión génica. Las flechas blancas representan las regiones conservadas del gen, mientras que las líneas entre dos flechas representan la región variable o NTS. El punto negro simboliza la mutación. Las barras negras y lineadas representan los extremos del locus para el gen. Modificado de Liao (1999) También existe evidencia que la conversión génica para ser efectiva no necesita altas frecuencias (Ohta & Dover 1983). Otros estudios han demostrado que el mecanismo de conversión génica está estrechamente relacionado con las enzimas participantes en la recombinación cromosómica (Rec-A, Rec-B, Rec-C y Rec-D) y en la reparación del mal emparejamiento (MustS, MustH, MustL y MustU), de modo que las primeras promueven la 21 conversión génica, mientras que las segundas la inhiben en cierto grado (Abdulkarim & Hughes 1996). Del mismo modo, los microsatélites presentes en estos genes pueden jugar un papel importante en la conversión génica al considerarse como sitios de inició para el proceso (Hibner et al. 1991, Liao & Weiner 1995). Pese a que la conversión génica puede explicar la homogeneidad de las unidades de repetición, este mecanismo no explica el número de copias presente en las especies, el cual tiende a ser diferente. No obstante, el entrecruzamiento desigual si puede explicar estos cambios en el número de copias (Pukkila & Skrzynia 1993), por lo que es posible que ambos mecanismos actúen sobre este gen (Dover & Tauz 1986, Dover 1986). Recientemente, Rooney & Ward (2005), Freire et al. (2010) y Pinhal et al. (2011) propusieron que además del modelo de evolución concertada, este gen también actúa bajo el modelo de evolución de nacimiento y muerte génica. Este modelo asume que son creados nuevos genes por repetidas duplicaciones génicas en diferentes partes del genoma, donde algunos de los genes duplicados son mantenidos en el genoma por un largo tiempo, mientras que otros son eliminados o pierden su función (Nei & Hughes 1992, Nei et al. 1997, Nei et al. 2000). 3.4. Evolución del gen a través de la Superclase Pisces. Existen pocos estudios que tengan en cuenta suficientes especies representantes de los diferentes taxa que componenla Clase Pisces (Martins & Galetti 2001a, Pasolini et al. 2006, Pinhal et al. 2009, Pinhal et al. 2011). No obstante, a partir de estos se ha llegado a observar dos tipos de 5S rADN cada uno expresado de forma diferente en células somáticas y oocitos, donde este último se considera derivado del tipo somático por duplicación génica 22 (Komiya et al. 1986). Martins y Galetti (2001) llevaron a cabo el primer estudio recopilatorio que determinó la presencia común de los dos tipos de 5S rADN para seis ordenes de la Superclase Pisces. Posteriormente, Pasolini et al. (2006) en el estudio del gen 5S rADN en especies de la familia Rajidae también hallaron el mismo patrón, lo que añadió a la subclase de los elasmobranquios la regla del sistema dual de este gen. Pinhal et al. (2011) establecieron la primera hipótesis para explicar estos resultados. Esta consistía en que el ancestro agnato de los condrictios y de los osteíctios + tetrápodos dio origen, por medio del modelo de evolución de nacimiento y muerte génica, al gen 5S rDNA tipo II a partir de una duplicación génica del 5S rDNA tipo I, donde este último gen es compartido por todos los organismos estudiados, mientras que el gen 5S rADN tipo II de los elasmobranquios al parecer evolucionó independientemente de los otros organismos formando un clado apartado solo para elasmobranquios (Figura 10). 23 No obstante, en la familia Potamotrygonidae (Myliobatiformes), el gen tipo I al parecer perdió funcionalidad convirtiéndose así en un pseudogen (Pinhal et al. 2011). 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general Analizar la organización molecular del gen 5S rADN tipo II y sus cambios a través de la evolución con base en su filogenia dentro de los elasmobranquios. 4.2. Objetivos específicos 1 Estandarizar la amplificación por PCR de la región 5S rADN en las especies Urotrygon rogersi y Urotrygon aspidura 2 Analizar los posibles cambios en la estructura y organización del gen 5S rADN tipo II en la historia evolutiva de los elasmobranquios. 3 Contribuir en la filogenia de los elasmobranquios basados en el gen 5S rADN tipo II con una nueva familia, Urotrygonidae. 4 Establecer un árbol filogenético con base en el gen 5S rADN tipo II que permita visualizar las relaciones evolutivas de los elasmobranquios. 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Recolección y almacenamiento de muestras Se recolectaron 10 muestras de Urotrygon rogersi y 10 de U. aspidura mediante pesca artesanal de camarón en aguas someras en las localidades de Juanchaco y La Bocana cerca de Bocas del Tigre (3°52’ Norte – 77°18’ Oeste) en el Pacifico vallecaucano (Figura 11). 24 De cada individuo se extrajo aproximadamente 1 cm 3 de tejido muscular y se preservó en buffer de Longmire (Longmire et al. 1997) según lo reporta Hleap et al. (2009). Las muestras fueron mantenidas a -80ºC hasta la extracción de ADN. Figura 11. Localidades donde se hizo la recolección de muestras en el Pacífico vallecaucano. 5.2. Proceso de extracción de ADN La extracción de ADN se realizó empleando el protocolo con proteinasa K seguido de la purificación fenol/cloroformo, teniendo en cuenta lo siguiente: (1) el tejido muscularse desmenuzó en morteros con cuchillas estériles, consecutivamente se adicionó 500 µl de buffer de extracción (50 mM tris pH 7.5, 1 mM EDTA, NaCl 100 mM, 1% SDS), 50 µl de proteinasa K (200 µg/ml) y se incubó a 58 °C por 12 horas. (2) A cada muestra se le 25 adicionó un volumen igual de solución de fenol (fenol: cloroformo: alcohol isoamílico en 25:24:1 partes por volumen, respectivamente) y se incubó a temperatura ambiente (22 °C) por 5 minutos. (3) Las muestras se centrifugaron a 10000 g por 5 minutos, se rescató la fase acuosa y se agregó un volumen igual a lo rescatado de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, y se dejó reposar a 22 °C por 5 minutos y se volvió a centrifugar a 9000 g por 5 minutos y de nuevo se rescató la fase acuosa. (4) A esta se le agregó un volumen igual de lo rescatado de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1 en volumen), se mezcló y se incubó a 22 °C por 5 minutos y se centrifugó a 7000 g por tres minutos. (5) La nueva fase acuosa resultante fue transferida a un tubo nuevo y se le agregó un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y se incubó por 5 minutos a 22 °C, después se centrifugó a 7000 g por 5 minutos y de nuevo se rescató la fase acuosa. (6) Posteriormente, a cada muestra se le agregó 45 µL de acetato de sodio 3 M y 1 ml de etanol frio, las cuales se incubaron entre 10-20 minutos a -20 °C y se centrifugó a 8000 g por 20 segundos. (7) para cada muestra se secó el pellet y se incubó con 250 µl de TE (10 mM tris pH: 8, 1 mM EDTA pH: 8) a 65 °C por 30 minutos. Estas condiciones fueron reportadas por Milligan (1998) y estandarizadas para peces cartilaginosos por Hleap et al. (2009). La verificación y cuantificación de la extracción del ADN, se llevó a cabo mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa al 1% a 100 V por 40 minutos. 5.3. Estandarización de la amplificación por PCR del gen 5S rADN tipo II. Para la amplificación por PCR del gen 5S rADN se utilizó dos conjuntos de cebadores: el par Cart5S y el par 5SRajid (Tabla 2). El proceso de estandarización se hizo partiendo de las condiciones propuestas por los respectivos diseñadores de los cebadores (Pinhal et al. 2008, Pasolini et al. 2006). 26 Tabla 2. Cebadores utilizados para la amplificación por PCR de la región 5S rADN. Conjunto Cebador Secuencia (5’ → 3’) Referencia 1 Cart5S1F CAC GCC CGA TCC GGT CCG ATC Pinhal et al. (2008) Cart5S1R CAG GCT AGT ATG GCC ATA GGC 2 5SRajid-F GGA ATA CCA GGT GCC GTA GG Pasolini et al. (2006) 5SRajid-R GGT ATT CCC AGG CGG TCT Los productos de la PCR se examinaron usando electroforesis en gel de agarosa al 1,0% a 100V por 40 minutos y se visualizaron por tinción de bromuro de etidio e iluminados por luz ultravioleta. Una vez estandarizadas las condiciones para amplificar por PCR la región 5S rADN se procedió a hacer PCR para 10 muestras de cada especie con los cebadores 5SRAJID y a purificarlas por el método polietileno glicol (PEG) precipitación/purificación (Lis 1980). Finalmente, las muestras fueron secuenciadas por medio del servicio de secuenciación estándar de MACROGEN INC en Korea. Durante cada proceso de PCR se utilizó un control negativo con el fin de evitar posibles falsos positivos por contaminación. 5.4. Análisis filogenéticos. La elaboración de las relaciones filogenéticas se hizo con las secuencias génicas del 5S rADN tipo II obtenidas de las especies Urotrygon aspidura y Urotrygon rogersi y también con las secuencias reportadas en el GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) de las especies Rhizoprionodon lalandii (Muller & Henle, 1839), Rhizoprionodon porosus (Poey, 1861), Raja asterias (Delaroche, 1809), Raja clavata (Linnaeus, 1758), Dipturus oxyrinchus (Linnaeus, 1758), Raja miraletus (Linnaeus, 1758), Raja polystigma (Regan, 1923), Potamotrygon motoro (Muller & Henle, 1839), Potamotrygon falkneri (Castex & Maciel, 27 1963) y Paratrygon aiereba (Muller & Henle, 1839) (Tabla 3). Para las especies de la familia Potamotrygonidae, los primeros 50 nucleótidos de la región conservada no estaban disponibles, por lo que se asumió que eran similares a los de las especies del genero Urotrygon. También es importante tener en cuenta que para las cinco especies de Myliobatiformes, las secuencias obtenidas y reportadas son incompletas. Para las especies del género Potamotrygon y Paratrygon, solo se pudo amplificar aproximadamente 680 pb de los ~1600 pb según lo reporta Pinhal et al. (2011), mientras que para las especies del genero Urotrygon solo se pudo amplificar aproximadamente 1100 pb de los ~1500 pb. Tabla 3. Lista de secuencias génicas del 5S rADN obtenidas para 10 especies de Elasmobranchiidesde la base de datos del NCBI. Especie Numero de secuencias génicas del 5S rADN Numero de acceso Orden Rhizorprionodon lalandii 19 FJ517239 – FJ517257 Carchariniforme Rhizoprionodon porosus 16 FJ517223 – FJ517238 Carchariniforme Potamotrygon motoro 6 JF792331 – JF792336 Myliobatiforme Potamotrygon falkneri 3 JF92328 – JF 92330 Myliobatiforme Paratrygon aiereba 5 JF92323 – JF92327 Myliobatiforme Raja asterias 5 DQ020522 – DQ020526 Rajiforme Raja clavata 6 DQ020527 – DQ020532 Rajiforme Dipturus oxyrinchus 6 DQ020541 – DQ 020546 Rajiforme Raja miraletus 4 DQ020537 – DQ020540 Rajiforme Raja polystigma 4 DQ020533 – DQ020536 Rajiforme Estas secuencias fueron alineadas con MUSCLE (Edgar 2004) implementado en el software MEGA versión 5 (MEGA5) (Tamura et al. 2011). Debido a que la alineación de posiciones homologas es una de las consideraciones claves de la filogenia (Swofford & 28 Olsen 1990), se eliminaron regiones donde la alineación era cuestionable o producía “ruido”, como los microsatélites contenidos dentro del NTS. Posteriormente, para deducir el mejor modelo de sustitución, las secuencias fueron sometidas al software jMoldeltest versión 0.1.1 (Posada 2008) con la siguiente configuración: 11 esquemas de sustitución, igual base de frecuencias (+F) y tasa de variación (+I) y (+G) estimadas. El árbol consenso de máxima verosimilitud (ML) fue inferido con el software Garli versión 2.0 (Zwickl 2006) bajo el modelo de sustitución obtenido con un remuestreo (bootstrap) de 500 repeticiones y con 2 repeticiones independientes de búsqueda (searchrepl). El árbol consenso fue recuperado con el software SumTrees (Sukumaran & Holder 2010). 5.5. Análisis de la estructura molecular del gen 5S rADN tipo II El análisis se llevó a cabo por comparación directa de las secuencias génicas entre las especies, enfocadas especialmente en las regiones de control interno que abarca la Box A, el elemento interno (IE), y la Box C. También se analizaron las regiones microsatélites (SSR) secuencias TATA y señal de parada de la polimerasa III. Todos los eventos fueron mapeados en la filogenia para inferir patrones evolutivos de la estructura del gen. 6. RESULTADOS 6.1. Estandarización de la PCR. Las condiciones óptimas del premix para amplificar el gen 5S rADN por medio de los cebadores Cart5S1F y Cart5S1R fueron 1X de Buffer Taq, 1,5 mM de Mg, 200 pmol de dNTP´s, 15 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq polimerasa. Las condiciones de PCR incluyeron una etapa inicial de desnaturalización de ADN a 95 °C por cinco minutos 29 seguido de 35 ciclos que consistieron en una desnaturalización de ADN a 95 °C por un minuto, una etapa de alineación a 56,5 °C por 30 segundos y una etapa de extensión a 72 °C por un minuto. Por último, se hizo una extensión final (post dwell) a 72 °C por cinco minutos. El segundo par de cebadores 5SRAJID-F y 5SRAJID-R permitieron la amplificación por PCR de la región 5S rDNA tipo II bajo las siguientes condiciones: 1X Taq Buffer, 1 mM de Mg, 200 pmol de dNTP´s, 10 µM de cada cebador y una unidad de Taq polimerasa. El ciclo térmico óptimo consistió en una desnaturalización de ADN a 95 °C por tres minutos seguido de 30 ciclos de 95 °C por 30 segundos (desnaturalización), luego 56,5 °C por 30 segundos (alineamiento), seguido de 72 °C por un minuto (extensión) y una extensión final (post dwell) de 72 °C por 7 minutos. Los resultados de las amplificaciones por PCR mostraron que los cebadores Cart5S amplifican una banda de 300 bp, mientras que los cebadores 5SRAJID amplifican una banda de 1,5Kbp para las dos especies del genero Urotrygon según el marcador de peso utilizado (Figura 12). 30 6.2. Relaciones filogenéticas. Los resultados de Jmodeltest indicaron que las secuencias se ajustan mejor al modelo transicional con igual frecuencias de bases, distribución gamma y sitios invariantes (TIM3ef+I+G). Con base en ese modelo se construyó el árbol filogenético mediante máxima verosimilitud (figura 13). Este árbol filogenético muestra una separación entre los súper ordenes Selachiformes y Batoidea y una separación entre Rajiformes y Myliobatiformes dentro de Batoidea. 31 Figura 13. Resultado a gran y pequeña escala de las relaciones filogenéticas obtenidas a partir del gen 5S rADN tipo II por máxima verosimilitud (ML). Los números representan los valores del remuestreo en proporciones. Dentro de Rajiformes, se puede observar cuatro grupos donde tres de ellos están constituidos por individuos de la misma especie, mientras que otro está constituido por individuos de R. clavata, R. asterias y R. miraletus. El marcador 5S rADN tipo II pudo distinguir entre las dos familias Myliobatiformes. Dentro de la familia Potamotrygonidae, 32 la especie Paratrygon aiereba se muestra como ancestral con respecto a las especies Potamotrygon falkneri y Potamotrygon motoro. 6.3. Análisis de la organización molecular. En la figura 14A se puede observar el alineamiento global del gen 5S rDNA tipo II donde se contempla el número total de nucleótidos y de individuos estudiados. En esta figura, es notable la poca diferenciación de la región NTS dentro de Rajiformes, en contraste a la diferenciación entre las dos especies del genero Urotrygon. Las secuencias génicas de los individuos estudiados, incluidas las secuencias de la dos especies del genero Urotrygon, pueden ser observadas en la figura 14B para la región conservada donde solo se muestra un esquema general de las secuencias (no se muestra todos los individuos estudiados por especie). En esta figura se puede notar las cinco mutaciones presentes en la región conservada. Estas mutaciones corresponden a los nucleótidos 18, 24, 35, 60 y 112 Un hallazgo interesante es que en ambas especies del genero Urotygon no se encontró una caja TATA (o similar a esta) dentro de la región -21 y -31 (corriente arriba con respecto a la región conservada) donde se ha visto presente para otros elasmobranquios (Pasolini et al. 2006, Pinhal et al. 2009) (Figura 15) En los elementos de unión del promotor, la BoxA muestra variaciones. En el nucleótido 51, R. porosus tiene una transición G→A, mientras que P. aiereba la mutación es una transversion G→T. Para R. clavata, en el nucleótido 59, se puede observar una mutación transicional G→A. Finalmente, el cambio que más resalta en la Box A está en el nucleótido 60, donde para los individuos del genero Rhizoprionodon es una adenina, mientras que para el resto de Batoideos es una guanina. En la Box C se puede observar variaciones presentes 33 en individuos de U. rogersi y P. aiereba, donde el nucleótido 84 tiene una transición de T→C. Del mismo modo, para algunos individuos del género Rhizoprionodon, se observa una transición pero esta vez de C→T en el nucleótido 92. A diferencia de los demás, en el IE no se observa mutaciones entre los individuos estudiados. Con respecto a los microsatélites, para los individuos del género Rhizoprionodon se encontró un área conservada para repeticiones (TCCC)n entre los nucleótidos 366 – 391. Para las especies del orden Rajiformes se encontró que las cinco especies estudiadas compartían tres regiones microsatélites comprendidas entre los nucleótidos 149 – 225, 247 – 311 y 427 – 571. Para las especies de los géneros Potamotrygon y Paratrygon también se hallaron tres regiones microsatélites. La primera región está comprendida entre los nucleótidos 123 y 167 por repeticiones (GCT)n, la segunda empieza alrededor de los 340 nucleótidos con tres repeticiones de (TCC)n y la tercera región empieza en el nucleótido 575 con repeticiones de (CA)n imperfectas seguido de otro conjunto de repeticiones (CG)n. En las especies del genero Urotrygon se encontraron dos regiones microsatélites comunes. La primera se encuentra entre los nucleótidos 205 – 223 conel motivo (CTCTTT)n, la segunda entre los nucleótidos 264 y 290 y comprende repeticiones de (TGC)n. Por otro lado, para U. rogersi se halló dos regiones microsatélites características para esta especie, una región compuesta por motivos (GACGCA)n entre los nucleótidos 676 y 699 y otra región compuesta por motivos (TG)n entre los nucleótidos -157 y -147 con respecto al inicio de la región conservada (Figura 16). Del mismo modo, para U. aspidura se encontró una región microsatélite única entre los nucleótidos -137 y -113 que corresponden al motivo (AGGGG)n. No obstante, es necesario tener en cuenta que las secuencias para las especies del orden Myliobatiformes son incompletas. 34 Con respecto a la señal de parada de la polimerasa III, se halló que las especies Rajiformes tienen una cola poli-T más larga que el resto de elasmobranquios estudiados, siendo hasta de siete u ocho nucleótidos mientras que para el resto de especies de elasmobranquios es de solo cuatro nucleótidos (figura 14B). Tanto en las especies Rajiformes como en las especies de Rizhoprionodon, se ha encontrado secuencias similares a la caja TATA según lo reportado por Pasolini et al. (2006) y Pinhal et al. (2009) respectivamente aunque estos autores se basaron principalmente en una posición homóloga localizada entre los -30 y -25 nucleótidos con respecto al 5S ARN de las secuencias TATA halladas para peces Osteíctios. No obstante, para las especies del género Urotrygon no se encontró alguna secuencia similar a la caja TATA entre los nucleótidos esperados (Figura 15). 35 36 37 Figura 14. Secuencia de nucleótidos para el gen 5S rADN tipo II en las especies estudiadas. A) Alineamiento global obtenido por MUSCLE implementado en MEGA v5.0. B) Vista ampliada y resumida de la alineación de la región conservada para todas las especies estudiadas. Figura 15. Secuencia parcial de la región NTS de las especies del genero Urotrygon adyacentes al principio de la región conservada la cual inicia después del nucleótidos marcado como cero. 38 7. DISCUSIÓN 7.1. Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR. Los cebadores 5SRAJID amplificaron una banda con peso de 1,5K bp correspondiente al gen 5S rADN tipo II para ambas especies de Urotrygon pero esto es debido a que este cebador fue diseñado específicamente para amplificar el 5S rADN tipo II, mientras que el cebador Cart5S amplificó una banda de 0,3K bp correspondiente al gen 5S rADN tipo I. No obstante en otros estudios tanto para peces osteíctios (Martins & Galetti 2001a), tiburones (Pinhal et al. 2009) y rayas (Pasolini et al. 2006), incluso para especies que pertenecen al mismo orden de las especies U. aspidura y U. rogersi (Pinhal et al. 2011) se ha tenido como resultado dos bandas correspondientes a los genes 5S rADN tipo I y tipo II por medio de cualquier conjunto de cebadores diseñados para amplificar esta región pese a reportarse una leve diferencia entre estos dos tipos de genes (Campo et al. 2009, Pasolini et al. 2006, Pinhal et al. 2009a,b). Por tanto, los resultados obtenidos en este estudio sugieren una diferenciación entre ambos tipos de 5S rADN (tipo I y tipo II) presentes en las especies de Urotrygon. De hecho, esta observación, aunque congruente con los resultados de Pinhal et al. (2011) para especies de la familia Potamotrygonidae, puede rechazar su hipótesis. Según Pinhal et al. (2011), el gen 5S rADN tipo I de las especies de la familia Potamotrygonidae pudo haberse perdido o pudo haberse convertido un pseudogen como consecuencia del proceso del modelo de evolución por nacimiento y muerte génica en el curso de la evolución durante el evento de transición del ambiente marino al de agua dulce. Por tanto, el hecho de que el cebador Cart5S halla amplificado una sola banda para ambas especies del genero Urotrygon puede reflejar la pérdida o variación del gen 5S rADN tipo I con respecto al tipo II. Esto, sumado a que la familia Urotrygonidae es considerada dentro de un 39 clado antecesor de la familia Potamotrygonidae (McEachran et al. 1996, Dunn et al. 2003) dado que su nicho ecológico aún está restringido al ambiente marino, es razonable pensar que la pérdida del gen 5S rADN tipo I no está influenciado simplemente por el cambio tipo de ambiente acuático. Al parecer este gen ha sufrido una variación profunda durante el curso de la evolución en el ambiente marino, y no en su transición a un ambiente de agua dulce como lo explica Pinhal et al. (2011). Aun así es necesario un estudio más profundo, quizás a nivel de la secuenciación génica del gen 5S rADN tipo I que permita analizar los posibles cambios moleculares que se dieron y su comparación directa con el gen 5S rADN tipo II para esclarecer su proceso de pérdida o variabilidad dentro del orden de los Myliobatiformes. 7.2. Relaciones filogenéticas entre elasmobranquios. Debido a que este trabajo no contó con especies representantes de los órdenes a los cuales se les atribuye los ancestros de los Batoideos como los Pristiophoriformes o los Squatiniformes (Shirai 1992), el árbol filogenético no puede deducir un patrón de derivación que apoye de forma concluyente las hipótesis de la historia evolutiva de los Elasmobranchii como la Hipnoscualea o la hipótesis difilética. No obstante, al examinar los diferentes estudios que tratan de elucidar esta historia evolutiva, se puede observar que los estudios morfológicos apoyan la hipótesis Hipnoescualea (Shirai 1992, 1996, Muñoz et al. 1994, De Carvalho 1996, De Carvalho & Maisey 1996, McEachran et al. 1996, Moyle & Cech 2000) mientras que los estudios moleculares apoyan la independencia de Batoidea con respecto a Selachii (Lawson et al. 1995, Douady et al. 2003, Winchell et al. 2004). Por lo tanto, es posible asumir que las 40 semejanzas morfológicas entre Batoidea con los Squatiniformes o Pristiophoriformes puedan deberse a una adaptación convergente a la vida bentónica (Kitamura et al. 1996, Winchell et al. 2004). De hecho Maisey et al (2004) afirma que los registros fósiles de los Neoselachii están más acordes con las filogenias elaboradas con datos moleculares que con las filogenias hechas a partir de datos morfológicos. La diversificación dentro de los Batoideos observada en la figura 13 está acorde con estudios que contemplan que el orden Rajiforme es un clado hermano de los Myliobatiformes y que ambos son los más derivados dentro de Batoidea, siendo estos descendientes de algún ancestro de Rhinobatiforme (Compagno 1977, McEachran et al. 1996, Wincheli et al. 2004) aunque existen estudios que lo clasifican como grupo hermano contenidos en un clado Rajiformes + Myliobatiformes + Rhinobatiformes (Rocco et al. 2007). Desafortunadamente, este estudio no contó con más representantes de otros órdenes que contribuyan a esclarecer la historia evolutiva de los Batoidea. Quizás para futuros estudios, se recomienda tener presente especies tanto del orden Torpediniformes considerados grupo ancestral de los Batoidea según la hipótesis difilética (Compagno 1973, 1977, 1999, Maysei 1984b, Muñoz 1994, Rocco et al. 2007), como representantes del orden Squatiniformes, considerados grupo ancestral según la hipótesis Hipnoescualea (Shirai 1992, Muñoz et al. 1994), para poder contrastar ambas hipótesis directamente. 7.2.1. Relaciones intraordinales: Rajiformes Estrictamente dentro del clado de los Rajiformes, la figura 13 no muestra ningún patrón de derivación y considera a cada una de las especies como un gran clado hermano, lo que hace imposible determinar cuál de las especies estudiadas representan algún estado basal entre 41 ellas según el gen 5S rADN tipo II. Los estudios de Capetta (1987), Carroll (1988) y McEachran & Dunn (1998) basados en registros fósiles, concluyen que este orden tuvo una rápidadiversificación durante finales del cretácico, hace 65 millones de años, llegando a dar origen hasta 220 taxa extintos haciendo que las filogenias basadas en morfología no sean fáciles al tratar de establecer las relaciones más allá de una resolución a nivel de subfamilia (McEachran & Dunn 1998). Lo mismo sucede cuando se intenta inferir con genes mitocondriales ribosomales como el 16S (Valsecchi et al. 2005) para las especies actuales. Capetta (1987) y Carroll (1988) apuntan a que la falta de divergencia ha hecho incluso que la morfología actual de los Rajiformes no sea muy distinta de la morfología de los fósiles de sus ancestros de hace 65 millones de años. Otra consideración importante que puede influir en este resultado es que todos los individuos de este orden son del mismo clado filogeográfico del Mediterráneo Central (Pasolini et al. 2006) (tribu Rajini), lo cual abre la posibilidad de que las relaciones filogenéticas entre estas especies sean muy estrechas. Una situación similar fue la obtenida por Robles et al. (2005) con especies del genero Acipencer (Actinopterygii: Acipenseriformes) quien pudo detectar mutaciones especie especificas en la región NTS del 5S rADN entre diferentes clados filogeográficos, pero no entre especies del mismo clado filogeográfico. Finalmente, Valsecchi et al. (2005) por medio de un estudio molecular basado en la región control (CR) y en el 16S ribosomal, llegaron a estimar que el tiempo de divergencia de las especies de la tribu Rajini puede ser menor a siete millones de años, originándose desde el Neógeno, estimación corroborada por eventos paleogeográficos y paleoclimáticos que dieron una nueva formación de la fauna del mar Mediterráneo luego de la crisis salina ocurrida en el Mioceno (Rögl 1998, Taviani 2002, Duggen et al. 2003). En particular, la 42 baja diferenciación molecular observada entre las especies R. asterias y R. clavata apoya la hipótesis de estas especies tienen un reciente origen (Stehmann & Bürkel 1984, Tinti et al. 2003) al igual que la mayoría de la fauna actual del Mediterráneo (Tinti et al. 2000, Bernardi et al. 2004). Por tanto, es posible atribuir los resultados a una falta de divergencia génica que no se ha podido llevar a cabo debido a que los representantes de este orden para este estudio son del mismo clado filogeográfico, también porque este clado ha tenido una gran radiación pero en la cual no se han explorado nuevos nichos a parte del ambiente marino bentónico y que además son de un tiempo relativamente reciente teniendo en cuenta que los tiburones tienen registros fósiles que datan desde hace 416 millones de años en el Devónico (Shaeffer & Williams 1997). Sin embargo, actualmente otros autores proponen que los modernos tiburones tienen un origen más temprano entre 250 millones de años (Klug 2010) y 195 millones de años (Maisey et al. 2004, Kriwet & Klug 2008). Por estas mismas razones, quizás este clado ha conducido a que la mitad de este orden sea clasificado bajo un género, Raja (McEachran & Dunn, 1998). 7.2.2. Relaciones intraordinales: Myliobatiformes. A diferencia de los resultados obtenidos para el clado Rajiformes, el gen 5S rADN tipo II para el clado de los Myliobatiformes resulto informativo y con capacidad de discriminar entre las especies estudiadas. Pese a que el orden Myliobatiformes tiene registros fósiles que datan casi del mismo tiempo al de los Rajiformes (Albers & Weiler, 1964, Cappetta et al. 1993, Underwood et al. 1999, de Carvalho et al. 2004, Kriwet et al. 2007) este clado ha sufrido una divergencia más notable debido a los diferentes tipos de ambientes que han 43 habitado desde entornos completamente marinos o marginalmente salobres, hasta ambientes parciales o completamente hipotónicos (Martin 2005). Una de las principales razones para establecer el grado de derivación de los Potamotrygonidae implica los cambios que esta familia ha sufrido debido al cambio radical de ambiente, pasando desde ambiente marino a los ambientes de agua dulce de Suramérica, lo cual incluye cambios morfológicos (Nishida 1990, Muñoz 1994, Lovejoy 1996, McEachran et al. 1996), fisiológicos, como la inhabilidad de retener altas concentraciones de urea para minimizar la perdida de líquido debido a la alta salinidad (Thorson et al. 1967, Thorson 1970), degenero de la glándula rectal (Thorson et al. 1978) y modificaciones en las ampollas de Lorenzini (Raschi & Mackanos 1989). Existen varias propuestas acerca del grupo taxonómico a partir del cual se dio inicio a la invasión de ambientes de agua dulce dando origen a los individuos de la familia Potamotrygonidae. Una de las hipótesis propone al género Urobatis, género que junto con Urotrygon se consideran monofileticos (Lovejoy 1996), como antecesor de los Potamotrygonidae (Brooks et al. 1981). No obstante, el ambiente al cual se limita este género es netamente marino, por lo que implica un cambio ambiental abrupto. Por otro lado, la hipótesis que propone Lovejoy (1996) es más parsimoniosa al proponer al género Himantura (Dasyatidae) como el grupo antecesor de los Potamotrygonidae debido a su fisiología eurihalina, donde incluso, algunos autores reportan superposición del rango hialino entre las especies Himantura schmardaey Potamotrygon yepezi en el Lago Maracaibo (Fernández & Espinosa, 1970a,b, Thorson et al. 1983). Además, el árbol filogenético obtenido concuerda con la hipótesis de la historia evolutiva de los Myliobatiformes propuesta por Lovejoy (1996) en donde la invasión a los ríos de Sur 44 América la dio primero el género Paratrygon, seguido por los géneros Potamotrygon y Plesiotrygon. 7.3. Cambios de la organización molecular del gen 5S rADN tipo II en elasmobranquios. 7.3.1. Región conservada: Mutaciones en el ICR, pequeñas variaciones y señal de reconocimiento de parada de la polimerasa III Basados en el árbol filogenético obtenido, las mutaciones presentes en la región codificadora puede resumirse como se muestra en la figura 16. Las mutaciones en los nucleótidos 18, 60 y 112 son características de los Batoideos estudiados mientras que las mutaciones 24 y 35 son características de los Rajiformes. Esto, 45 sumado a las secuencias especie específicas de la región variable, ha hecho de este gen un marcador importante para la discriminación de especies (Pinhal et al. 2008, Toniato et al. 2009, Rodrigues et al. 2010) gracias a su modelo de evolución concertada. Basados en el trabajo de Barciszewska et al. (2000), la correlación observada entre los nucleótidos 18 y 60 parece seguir la estructura secundaria del gen (Figura 17). En Selachii, el nucleótidos 18 (dT) se empareja con el nucleótido 60 (dA), mientras que en Batoideos, el mismo nucleótido 18, esta vez mutado a dC se empareja con el nucleótido 60 que también ha cambiado a dG. Sin embargo, la misma estructura secundaria falla al intentar explicar la ausencia de correlación entre la mutación del nucleótido 112 y el nucleótido 7. Por otro lado, las mutaciones de los nucleótidos 24 y 35 según la estructura secundaria, son libres de mutar sin tener correlación con algún otro nucleótido de la región 5S rARN, mientras que las regiones de los lazos B y C que contienen las mutaciones 24 y 35 respectivamente, son consideradas de baja prioridad para la unión de los dedos de zinc de la TFIIIA (McBryant et al. 1995). La correlación de las mutaciones entre los nucleótidos 18 y 60 indica que la hélice II en la estructura secundaria del 5S rARN (figura 17) es importante para la transcripción debido a que en esta hélice el séptimo dedo de zinc del FTIIIA se adhiere (Clements et al. 1993, Neely et al. 1999). De hecho, se ha determinado que un fragmento mínimo de 5S ARN que incluya la hélice I, II y V y también los lazos A y E son suficientes para la unión del FTIIIA (McBryant et al. 1995, Theunissenet al. 1998), componente esencial para el complejo de iniciación de la transcripción de la polimerasa III (Hanas et al. 1992, Pieler & Theunissen 1993, Shastry 1996). 46 Dentro de la región de control interno, la mutación del nucleótido 60 (dG en Batoideos; dA en Selaquios) es la única que involucra uno de los promotores, el Box A. Esto es debido quizás, que a diferencia del Box C, las mutaciones que se dan en el IE y en el Box A tienen relativamente pequeños efectos en la afinidad de unión al TFIIIA (Pieler et al. 1987, Sands & Bogenhagen 1987, You et al, 1991, Veldhoen et al, 1994). Por tanto, es posible que esta correlación entre las mutaciones de los nucleótidos 18 y 60, y el bajo efecto que tiene las mutaciones en el Box A en la afinidad de la TFIIIA permite respaldar las conclusiones obtenidas por You et al. (1991) y McBryant et al. (1995) al afirmar que es más importante la estructura secundaria del gen que la secuencia de nucleótidos para la unión del TFIIIA. Por otro lado, para la Box C se ha demostrado que este elemento interactúa con los tres primeros dedos amino-terminales de la TFIIIA los cuales constituyen un polipéptido necesario para tener una alta afinidad al 5S rADN (Christensen et al. 1991, Liao et al. 1992). Quizás por ello esta región ha sido poco variable entre los organismos estudiados. La mayoría de las variaciones observadas entre todos los individuos (figura 14B), corresponden a mutaciones de baja importancia para la unión con el TFIIIA y/o específicamente para el polipéptido que contiene únicamente los dedos de zinc de cuatro a siete (zf4-7) (figura 17) (McBryant et al. 1995). Estos nucleótidos variables (obviando los discutidos previamente) corresponden a las posiciones 6, 35, 40, 51, 52, 59 ,84, 92, 94, 100 y 112. De estos, el 73% se encuentran en regiones poco importantes para la unión de del TFIIIA y/o el polipéptido zf4-7. 47 Figura 17. Modelo general de la estructura secundaria del gen 5S rARN para organismos eucariotas según Barciszewska et al. (2000) y adaptado para las secuencias obtenidas en elasmobranquios. Resumen de los efectos de algunas mutaciones en la capacidad de unión de la TFIIIA y el polipéptido zf4-7: los nucleótidos comprendidos entre las líneas delgadas son críticos para la unión del TFIII, mientras que aquellos contenidos dentro de las líneas gruesas son críticos para la unión del polipéptido zf4-7 según McBryant et al. (1995). Los nucleótidos 48 remarcados representa las principales mutaciones observadas para la región conservada. La ausencia de mutaciones esenciales en los promotores y la presencia de un extenso residuo de timidina (dT) al final del gen 5S rADN tipo II sugiere que este gen es aún funcional en las especies consideradas en este estudio. Aunque la extensión de los residuos dT en Rhizoprionodon y Myliobatiformes está dentro del rango esperado para eucariotas (Allison & Halls 1985), la extensión para las especies de Rajiformes es un caso excepcional por ser el doble de extensos. No obstante, se han estudiado casos similares en algunos genes transcriptos por la polimerasa III como el tRNA Lys de conejos y de X. laevis y el VA RNAII del adenovirus, los cuales contienen extensos residuos dT lo que puede indicar una adaptación a una terminación más eficiente. Al parecer, un mayor contenido de nucleótidos dT en la señal de terminación hace que la señal de parada de la polimerasa III sea menos sensible a la influencia de secuencias vecinas (Bogenhagen & Brown 1981). Por ejemplo, se ha observado que secuencias vecinas a los residuos poli-dT ricas en nucleótidos dC o dG hacen que la eficacia de la terminación para la polimerasa III sea mejor, mientras que nucleótidos dA cerca de los residuos poli-dT, tanto posteriores como por anteriores, disminuyen la eficacia de la terminación (Bogenhagen & Brown 1981).No obstante, existen excepciones donde se ha visto que una extensión de residuos dA justo después de la señal de terminación ha aumentado la eficacia de la terminación en el gene tRNA Lys de X. laevis (Mazabraud et al. 1987). Sin embargo, las secuencias tanto posteriores como anteriores a la región poli-dT del 5S ARN de los Rajiformes no son muy diferentes a las del resto de elasmobranquios estudiados por lo que es muy difícil concluir que la amplia extensión de timidina observada para este taxón pueda ser debida a alguna secuencia vecina que 49 interfiera con la eficacia de la señal de parada para la polimerasa III. Al contrario, ésta posee varios nucleótidos dC adyacentes lo cual aumenta la eficacia (Bogenhagen & Brown 1981). Sin embargo, la cantidad de residuos poli-dT observados a través de todo el NTS para Rajiformes resalta en comparación al resto de especies (Figura 14A) y esto pueda dar una posible explicación al por qué la gran extensión de la señal de terminación para la polimerasa III en este clado. Teniendo en cuenta los casos en que se ha visto que la polimerasaIII suele obviar la señal de parada original y en su lugar reconoce los “cluster” poli-dT posteriores lo cual genera fragmentos transcriptos más largos de lo normal (Akusjarvi et al. 1980), es posible sugerir que el exceso de residuos de timidina en la señal de parada original para Rajiformes haya evolucionado con el fin de mejorar la eficacia de la terminación de la transcripción. Casos similares han sido reportados, como las señales de terminación de las especies Saccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae, las cuales para una eficiente terminación requieren fragmentos de 5 y 6 timidinas, respectivamente (Hamada et al. 2000). No obstante, existen estudios que sugieren que estos casos donde la transcripción va más allá de la primera señal de parada puede terminar en la evolución de nuevas especies de RNA (Haussecker et al. 2010, Liao et al. 2010). 7.3.2 Región NTS, microsatélites y caja TATA. Para cada una de las especies, se puede observar que la región NTS del 5S rADN II es conservada a pesar de la alta tasa de mutación establecida (Hoshikawa et al. 1983, Suzuky et al. 1994). Esta observación puede ser explicada, bien bajo el modelo de evolución concertada que gobierna este gen, o bien porque esta región no es libre de presiones selectivas como otras secuencias no codificantes, como lo propone (Pinhal et al. 2009), en vista de que existen algunos elementos dentro de esta región NTS que juegan un papel 50 importante en la regulación del gen (Nederby et al. 1993, Hallenberg & Frederiksen 2001). De hecho en peces se ha demostrado la presencia de una secuencia similar a la caja TATA aproximadamente entre -20 y -30 pb (corriente arriba) (Pendas et al. 1994, Murakami & Fugitani 1998, Inafuku et al. 2000) lo cual sugiere una posible influencia en el nivel de transcripción pese a que puede haber alta variación en la similitud entre taxa. No obstante aunque esta caja está presente en Rhizoprionodion y en las otras especies del orden Rajiformes, para ambas especies del género Urotrygon no se pudo identificar dentro del rango esperado una caja similar a TATA (Figura 15). Esta observación puede indicar que dichas cajas en realidad no sean factores esenciales y que su mera presencia pueda ser casual en vista de que siempre son cajas similares (no exactas) y que entre taxa no se observe una consistencia definida. Además, es importante tener en cuenta que la polimerasa III que transcribe al 5S rADN es de tipo I, la cual se caracteriza por que todos sus promotores son internos y que además no necesita de una caja TATA para la transcripción (Schramm & Hernández 2002). Aun así, es necesario hacer estudios directos que determinen si dichas cajas en realidad son importantes para la transcripción de la polimerasa III tipo I ya que también existen estudios donde se ha visto promotores híbridos como el gen U6 snRNA de Saccharomyces cerevisiae
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