Identificação de leveduras em lagos da Universidade do Valle

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AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN MOLECULAR Y CARACTERIZACIÓN 
PARCIAL DE LEVADURAS ASOCIADAS A LOS LAGOS DE LA UNIVERSIDAD 
DEL VALLE (SEDE MELÉNDEZ) CALI, COLOMBIA 
 
 
 
 
LINA MARCELA SILVA BEDOYA 
 
 
 
 
 
 UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2012 
 
 
 
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN MOLECULAR Y CARACTERIZACIÓN 
PARCIAL DE LEVADURAS ASOCIADAS A LOS LAGOS DE LA UNIVERSIDAD 
DEL VALLE (SEDE MELÉNDEZ) CALI, COLOMBIA 
 
LINA MARCELA SILVA BEDOYA 
marfisilva@gmail.com 
 
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al título de Biólogo 
con mención en Microbiología 
 
Director: 
ESTEBAN OSORIO CADAVID 
Biólogo Ph.D. 
 
Co-director 
MAURICIO RAMÍREZ CASTRILLÓN 
Biólogo 
 
 UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2012 
 
UNIVERSIDAD DEL VALLE 
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS 
PROGRAMA ACADÉMICO DE BIOLOGÍA 
SANTIAGO DE CALI 
2012 
 
 
 
LINA MARCELA SILVA BEDOYA (1986) 
 
 
 
 
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE 
LEVADURAS ASOCIADAS A LOS LAGOS DE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE 
(SEDE MELÉNDEZ) CALI, COLOMBIA 
 
 
 
TEMAS Y PALABRAS CLAVE: 
Microbiología, Levaduras, Identificación Molecular, Lagos, Universidad del Valle, 
MSP-PCR, Fingerprinting, Región D1/D2 LSU. 
 
ii 
 
 
NOTA DE APROBACIÓN 
 
 
El trabajo de grado titulado “AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN MOLECULAR Y 
CARACTERIZACIÓN PARCIAL DE LEVADURAS ASOCIADAS A LOS LAGOS 
DE LA UNIVERSIDAD DEL VALLE (SEDE MELÉNDEZ) CALI, COLOMBIA”, 
presentado por la estudiante LINA MARCELA SILVA BEDOYA, para optar al título 
de Biólogo con mención en Microbiología, fue revisado por el jurado y calificado 
como: 
APROBADO 
 
 
Esteban Osorio Cadavid, Ph.D. Mauricio Ramírez Castrillón 
Director Co-director 
 
 
__________________________ 
Felipe García Vallejo, Ph.D. 
Jurado 
 
 
 
iii 
DEDICATORIA 
A mis padres por su esfuerzo, amor y apoyo incondicional 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
AGRADECIMIENTOS 
A mis padres por haberse esforzado en darme lo mejor siempre. 
A mi familia por su apoyo incondicional. 
A mis amigos Ana Carolina y Alejandro por todos los buenos momentos 
compartidos. 
A Edier Alberto Soto Medina por su ayuda durante los muestreos. 
Al profesor Esteban por su orientación, apoyo y enseñanzas. 
A Mauricio por la capacitación y toda la colaboración durante mi trabajo de grado. 
A los Laboratorios de Biología, Biología Molecular, Genética Humana, 
Microbiología Industrial y Ambiental y a mis compañeros de la Sección de 
Genética por toda la ayuda técnica y asesorías brindadas. 
Agradezco a la Vicerrectoría de Investigaciones pues este trabajo hace parte de 
un proyecto de investigación financiado por la convocatoria interna 2011 (CI: 
7821). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
TABLA DE CONTENIDO 
 Página 
1. RESUMEN………………………………………………………………………….. 1
2. INTRODUCCIÓN………………………...…………………………………….….. 2
3. MARCO TEÓRICO……………………………………………………………...... 5
3.1. Sobre el organismo de estudio………………………………………………… 5
3.2. Sobre el lugar de estudio……………………………………………….………. 6
3.3. Caracterización molecular por MSP-PCR…………………………….………. 9
3.4. Identificación por secuenciación de la región D1/D2……………….……….. 9
4. OBJETIVOS……………………….……………...….………………….……….... 11
4.1. Objetivo general…………………………………………………..………….….. 11
4.2. Objetivo específico……………………………..……………………………..... 11
5. MÉTODOS………………………..………………………………………………... 12
5.1. Muestreo………………………………………………………………………..... 12
5.2. Aislamiento de cepas…………………………………………………….……… 12
5.3. Caracterización fenotípica……………………………………………………… 13
5.4. Extracción de ADN Genómico…………………………………………………. 13
5.5. Caracterización Molecular……………………………………………………… 14
5.6. Amplificación del dominio D1/D2…………………………………………........ 15
5.7. Secuenciación, análisis e Identificación molecular………………………….. 15
5.8. Análisis estadístico…………………………………………………………....... 16
6. RESULTADOS…………………………………………………………………….. 17
6.1. Muestreo……………………………………………………………………....…. 17
vi 
6.2. Caracterización fenotípica……………………………………………………… 20
6.3. Extracción de ADN Genómico…………………………………………………. 26
6.4. MSP-PCR con el iniciador GTG5………….…………………………………… 27
6.5. Amplificación del dominio D1/D2…………………………………………........ 30
6.6. Identificación de los aislados…………………………………………………… 31
6.7. Análisis estadístico………………………………………………………………. 33
7. DISCUSIÓN………………………………………………………………………… 35
8. CONCLUSIONES………………………………………………………………….. 47
9. LOGROS………………………………………………………………………….... 48
10. LITERATURA CITADA………………………………………………………….. 49
11. ANEXOS…………………………………………………………………………... 54
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vii 
ÍNDICE DE FIGURAS 
FIGURA 1. Porcentaje de aislados por muestreo en el Lago Central y Lago 
 Estación…………………………………………………….………….… 
 
17
FIGURA 2. Comparación de temperatura entre el Lago Central y el Lago 
 Estación………………..………………………………………………… 
 
18
FIGURA 3. Comparación de pH entre el Lago Central y el Lago Estación…….. 19
FIGURA 4. Comparación de conductividad entre el Lago Central y el Lago 
 Estación………………..…………………………………….…………...
 
19
FIGURA 5. Verificación de amplificación de la MSP-PCR con el primer 
 GTG5……………………………………………………………………... 
 
27
FIGURA 6. Dendrograma con las agrupaciones establecidas con las bandas 
 amplificadas usando el primer GTG5 para el Lago Central…………
 
28
FIGURA 7. Dendrograma con las agrupaciones establecidas con las bandas 
 amplificadas usando el primer GTG5 para el Lago Estación……… 
 
29
FIGURA 8. Gráfica de riqueza y abundancia por muestreo en el Lago 
 Central…………………………………………………………………… 
32
FIGURA 9. Gráfica de riqueza y abundancia por muestreo en el Lago 
 Estación…………………………………………………………………. 
 
32
FIGURA 10. Gráfica de riqueza y abundancia en ambos lagos…………....….. 33
FIGURA 11. Comparación de la diversidad, dominancia y equitabilidad entre 
 los lagos…………………………………………………………………
 
34
FIGURA 12. Análisis de conglomerados……………….………………………….. 34
 
 
viii 
ÍNDICE DE TABLAS 
TABLA 1. Especies de árboles que bordean los lagos de la Universidad del 
 Valle, sede Meléndez…………….…………….……………………… 
 
9 
TABLA 2. Caracterización fenotípica de los aislados de los lagos Central y 
 Estación………………………………………………………....………
 
20
TABLA 3. Alineamiento de secuencias obtenidas con el algoritmo BLAST 
 para los aislados del Lago Estación. Las accesiones mostradas 
 son las que presentaron la máxima identidad disponible en la 
 red……………………………………………………………………….. 
 
 
 
30
TABLA 4. Alineamiento de secuencias obtenidas con el algoritmo BLAST 
 para los aislados del Lago Central. Las accesiones mostradas 
 son las que presentaron la máxima identidad disponible en la 
 red……………………………………………………………………….. 
 
 
 
31
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ix 
ÍNDICE DE ANEXOS 
ANEXO 1. Panorámica de los lagos de la Universidad del Valle con los puntos
 de muestreo para cada lago…………………………………………….
 
54
ANEXO 2. Dendrogramas por similitud de presencia/ausencia de bandas de 
 los agrupamientos basados en la morfología…………………………
 
55
ANEXO 3. Accesiones al GenBank de las secuencias obtenidas de los 
 aislados……………………………………………………………………
 
60
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
1. RESUMEN 
En Colombia, el conocimiento de la comunidad levaduriforme ha sido limitado 
pues los estudios se han enfocado principalmente en especies de interés clínico. 
Los sedimentos representan hábitats degran importancia para el estudio de la 
diversidad de levaduras, principalmente para aquellas con potencial 
biotecnológico, industrial y biorremediador. El objetivo principal de este estudio fue 
identificar y comparar la diversidad de especies de levaduras asociadas a los 
lagos de la Universidad del Valle, por este motivo se realizó el aislamiento de las 
levaduras presentes en tres muestreos de sedimento y uno de agua para cada 
lago. Los agrupamientos se realizaron teniendo en cuenta la morfología celular y 
de colonia de las levaduras. Se complementó el estudio empleando técnicas 
moleculares basadas en la amplificación de ADN por PCR utilizando un solo 
microsatélite (GTG5) como iniciador (MSP-PCR). Se secuenció el ADNr de la 
región D1/D2 del gen 26S de un aislado representativo de cada grupo, para su 
identificación. Por estos métodos se identificaron las siguientes especies: 
Hanseniaspora thailandica, Saccharomyces cerevisiae, Candida diversa, 
Rhodotorula mucilaginosa, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, 
Torulaspora pretoriensis, Yarrowia lypolitica, Candida glabrata, Tricosporon 
jirovecii, Cryptococcus podzolicus, Trichosporon laibachii, Cyberlindnera saturnus, 
Candida albicans, Cryptococcus rajasthanensis y Candida pseudolambica. 
También se encontraron dos posibles nuevas especies de levaduras de los 
géneros Issatchenkia y Bullera. En conclusión los lagos de la Universidad del Valle 
presentan diferencias significativas en diversidad y composición de especies. 
2 
2. INTRODUCCIÓN 
 
Las levaduras son organismos ubicuos y su presencia en ambientes acuáticos 
tanto marinos como terrestres ha sido demostrada ampliamente desde hace varias 
décadas (van Uden and Ahearn 1963). A diferencia de otros hongos, las levaduras 
pueden ser encontradas potencialmente en cualquier parte de un sistema 
acuático; han sido aisladas de sedimentos (Boguslawska-Was y Dabrowski 2001) 
en todos los niveles de la columna de agua e incluso en la zona pelágica de los 
océanos (Wurzbacher et al. 2010). Y aunque por varios años se pensó que las 
levaduras eran organismos transitorios que habían sido lavados del filoplano o de 
la zona litoral, ahora hay información clara sobre su residencia permanente en 
aguas abiertas (Wurzbacher et al. 2010). 
 
El número de células de levaduras está relacionado con el estado trófico del 
cuerpo de agua, y varía de 0.5 a 47 UFC/ml en promedio para lagos oligotróficos e 
hipertróficos respectivamente (Woolet & Hendrick 1970). También, ciertas 
especies de levaduras, pueden ser usadas como bioindicadores para varias clases 
de contaminación antropogénica en ambientes acuáticos (Hagler 2006). Sin 
embargo, la composición de especies y su abundancia son irregulares entre 
muestras y entre las diferentes profundidades de la columna de agua (van Uden & 
Ahearn 1963, Hedrick et al. 1964). 
 
Altos conteos de células de levaduras han sido encontrados a grandes 
profundidades y cerca al fondo de los lagos, pero las condiciones específicas de 
3 
los lagos que favorecen su crecimiento son todavía desconocidas (Wurzbacher et 
al. 2010). Una primera aproximación al conocimiento del ecosistema presente en 
el sedimento de los lagos es la identificación de las especies que lo habitan, y para 
este propósito ya se han desarrollado técnicas moleculares que complementan las 
técnicas dependientes de cultivo que usualmente son empleadas. 
 
Como la identificación por morfología y fisiología de las levaduras es usualmente 
inexacta, en los últimos años se ha implementado el análisis de la secuencia de la 
región D1/D2 del ADN ribosomal 26S (Kurtzman y Robnett 1998). Este fragmento 
consiste de 600 a 650 pb aproximadamente y dos cepas pueden considerarse de 
la misma especie si difieren en seis o menos bases (99% de similitud) (Kurtzman 
and Robnett 1998; Fell et al. 2000). La secuencia de esta región y la de la región 
ITS1-5.8S-ITS2 son las más usadas para la identificación molecular de hongos 
tanto filamentosos como unicelulares, y son consideradas códigos de barras 
genéticos para estos organismos (Eberhardt 2010). 
 
Como complemento a la identificación con la región D1/D2, se han desarrollado 
métodos rápidos para el agrupamiento de aislados similares de levaduras, como lo 
es la técnica MSP-PCR Fingerprinting, la cual se basa en la amplificación de ADN 
por PCR utilizando un solo iniciador (GTG5, GAC5 o M13). Con este método se 
obtiene un patrón de bandas definido para cada especie el cual sirve para su 
agrupamiento de manera rápida y económica. Esta técnica se ha implementado 
satisfactoriamente en Ascomycetes y Basidiomycetes (Gadanho & Sampaio 2002; 
Rodrigues & Fonseca 2003; Libkind 2007; Lopes et al. 2007). 
4 
 
Además de aportar al conocimiento de este tipo de ecosistema acuático, el 
análisis de diversidad de levaduras también es útil para dar idea de las posibles 
funciones de utilidad que podríamos aprovechar de ellas. Las condiciones 
variables de oxígeno, la disponibilidad de nutrientes y las interacciones con otros 
microorganismos a las que están sometidas en los sedimentos de los lagos 
(Wurzbacher et al. 2010) las hacen interesantes en términos industriales y de 
biotecnología. 
 
Entre los lagos artificiales de la Universidad del Valle hay diferencias bióticas y 
abióticas marcadas que probablemente influyen en la composición de especies 
que habitan sus sedimentos y aguas. El estudio de esta diversidad de especies 
puede ampliar el conocimiento de estos ecosistemas y, a largo plazo, brindar 
posibles avances y descubrimientos en industria y biotecnología. Por esta razón, 
el propósito de esta investigación fue identificar y comparar la diversidad de 
especies de levaduras asociadas a los lagos de la Universidad del Valle, Cali 
(Colombia) usando la técnica MSP-PCR Fingerprinting y la secuenciación de la 
región D1/D2 del gen ribosomal rDNA 26S. 
 
 
 
 
 
 
5 
3. MARCO TEÓRICO 
3.1. Sobre el organismo de estudio 
Se denomina levadura a cualquier hongo unicelular que se reproduzca 
vegetativamente por gemación o fisión, pero comúnmente se toma como sinónimo 
de Saccharomyces cerevisiae y se asume erróneamente que todas las levaduras 
llevan a cabo el proceso de fermentación convirtiendo azúcar en alcohol y dióxido 
de carbono (New Oxford American Dictionary 2005; Buzzini & Vaughan-Martini 
2006). Esto posiblemente se deba a la estrecha relación que ha tenido la 
humanidad con este proceso, que se refleja en la etimología de la palabra inglesa 
“yeast”. Esta palabra tiene origen alemán, deriva de la palabra “Gischt” que 
significa “espuma” (New Oxford American Dictionary 2005), la cual está presente 
durante el proceso de fermentación por la producción de gas. 
 
Hasta el momento a las levaduras se les han encontrado varios usos diferentes 
además de la fermentación para la producción de bebidas alcohólicas o 
panadería. Actualmente también se usan para producir enzimas, vitaminas, 
polisacáridos capsulares, carotenoides, alcoholes polihídricos, lípidos, 
glycolípidos, ácido cítrico, etanol, dióxido de carbono y otros compuestos 
sintetizados por la introducción de ADN recombinante en las células de levadura 
(Demain et al. 1998). Algunos de estos productos son comercializados y otros son 
potencialmente valiosos en biotecnología pero todavía faltan muchos estudios 
para descubrir la totalidad de beneficios que le pueden traer las levaduras a la 
especie humana. 
 
6 
Además de su rol en la alimentación e industria, las levaduras tienen un rol 
importante en la naturaleza que todavía no ha sido comprendido en su totalidad. 
Por su naturaleza, las levaduras están limitadas en el rango de hábitats que 
pueden ocupar pues requieren nutrientes minerales esenciales para la constitución 
de sus células y cantidades significantes de una fuente de energía y carbón 
orgánico de bajo peso molecular. Y aunque tienen unaalta proporción 
superficie/volumen que favorece la absorción rápida de los nutrientes, su 
característica unicelular las hace mejor adaptadas a sustratos líquidos o húmedos 
y a superficies irregulares (Lachance & Starmer 1998). 
 
Las características anteriores se complementan con los amplios rangos de pH y 
temperatura a los cuales las levaduras pueden crecer y nos permiten predecir que 
los hábitats de las levaduras probablemente son ricos en carbono orgánico simple, 
líquidos o con alta humedad, ácidos u ocasionalmente alcalinos y complejos 
nutricionalmente. Tales condiciones son cumplidas por tejidos de plantas en 
descomposición como hojas, flores y exudados de raíces, también algunas 
levaduras pueden estar mejor adaptadas a las condiciones dentro del cuerpo de 
algunos animales donde pueden actuar como comensales intestinales (Lachance 
& Starmer 1998). 
 
3.2. Sobre el lugar de estudio 
Entre los lugares que cumplen estas condiciones están los lagos de agua dulce 
naturales y artificiales. Los lagos están divididos en diferentes zonas, y cada zona 
puede albergar animales, plantas y comunidades de microorganismos específicas. 
7 
Es importante diferenciar entre aguas abiertas y costas pues hay diferencias 
significativas en la influencia que reciben de la zona terrestre que circunda al lago. 
Debido a la gran cantidad de materia orgánica que recibe la zona costera, ésta es 
un “hot spot” para diversos tipos de microorganismos que participan en su 
descomposición, mientras que la zona pelágica alberga sólo las especies más 
especializadas o sirve como medio para la dispersión de propágulos (Wurzbacher 
et al. 2010). 
 
Levaduras se han encontrado en lagos con diferente carga de materia orgánica, 
desde lagos oligotróficos en la Patagonia argentina (Brandão et al. 2011), lagos 
mesotróficos en estados unidos (van Uden & Ahearn, 1963), lagos que en algún 
punto reciben descargas de aguas negras (Meyers et al. 1970) y lagos turísticos 
con actividades recreativas en Brasil (Medeiros et al. 2008). En la mayoría de los 
casos se han encontrado especies del género Rhodotorula, Candida y 
Cryptococcus. Especies patógenas de estos géneros se encuentran en lagos 
contaminados por actividades antrópicas y pueden servir como indicadores 
biológicos para establecer el grado de contaminación de estos cuerpos de agua 
(Hagler, 2006). 
 
Los lagos de la Universidad del Valle fueron creados hace aproximadamente 30 
años con propósitos decorativos y experimentales. El agua que nutre estos lagos 
proviene del Río Meléndez que nace a 3100 m.s.n.m. en el Parque Nacional 
Natural Farallones de Cali en la Cordillera Occidental y su calidad es apta para 
consumo humano hasta que entra en la zona urbana del municipio, donde los 
8 
índices de calidad disminuyen considerablemente con la cantidad de materia 
orgánica que recibe y el bajo nivel de oxígeno disuelto que le queda a sus aguas 
(CVC 2008). 
 
Por la mala calidad de las aguas del Río Meléndez, al Lago Central de la 
Universidad del Valle se le adicionó un sistema de aireamiento por chorros de 
agua en el año 2007 para disminuir lo olores provenientes de la descomposición 
de sus aguas. El agua que rebosa de este lago pasa por un canal al Lago de la 
Estación Experimental del Departamento de Biología. Los lagos se encuentran en 
un ecosistema de bosque seco y la vida animal que habita ambos lagos es similar, 
hay cultivo de peces, patos, gansos, iguanas y caracoles pero si se distinguen un 
poco en la composición de plantas que los rodea. La vegetación que rodea los 
lagos es en su mayoría árboles leñosos (Tabla 1) y algunos pastos, los cuales 
aportan gran cantidad de hojarasca a sus aguas. 
 
 
 
 
 
 
9 
Tabla 2. Especies y abundancia de árboles que bordean los lagos de la 
Universidad del Valle, sede Meléndez. (Fuente: Grupo de Investigación Semillero 
Ecológico de la Universidad del Valle el cual hizo un inventario de las especies 
arbóreas ubicadas en todo el campus de la U, entre los años 2008 a 2010, datos 
no publicados). 
LAGO ESTACIÓN No. Individuos LAGO CENTRAL No. Individuos
Samanea saman 4 Samanea saman 1
Artocarpus communis 1 Syzygium malaccense 10
Bravaisia integerrima 1 Senna siamea 1
Calliandra pittieri 1 Pithecellobium dulce 2
Ceiba pentandra 1 Terminalia catappa 1
Citrus reticulata 1 Mangifera indica 4
Clitoria fairchildiana 1 Syzygium jambos 1
Euphorbiaceae 1 Persea americana 2
Ficus benjamina 1 Myrtaceae 7
Guazuma ulmifolia 3 Guazuma ulmifolia 1
Leucaena leucocephala 1 Clitoria fairchildiana 2
Melicoccus bijugatus 2 Luehea seemannii 1
Pithecellobium dulce 7 Melicoccus bijugatus 1
Psidium guajava 1 
Swinglea glutinosa 2 
Trichanthera gigantea 1 
 
3.3. Caracterización molecular por MSP-PCR 
Para facilitar la identificación de los aislados de levaduras en estudios de gran 
magnitud, se han desarrollado técnicas rápidas para el agrupamiento de aislados 
similares. Una de estas técnicas consiste en la amplificación aleatoria de ADN por 
PCR usando cebadores sintéticos como (GTG)5, M13 o (GACA)4. Con este 
método, se han agrupado satisfactoriamente por patrones de bandas aislados de 
los géneros Rhodotorula (Gadanho & Sampaio 2002; Andrade et al. 2006; Libkind 
2007; Guamán & Carvajal 2009), Taphrina (Rodrigues & Fonseca 2003) y varias 
especies de Candida (Lopes et al. 2007). 
 
 
10 
Aunque la técnica de MSP-PCR ha sido exitosa para algunos géneros de 
levaduras, no es tan eficiente en la discriminación entre Debaryomyces 
polymorphus y Pichia carsonii pues presentan el mismo patrón de bandas 
(Andrade et al. 2006). También se presentan diferencias en la eficiencia de 
discriminación entre las diferentes especies al usar diferentes cebadores 
(Gadanho & Sampaio 2002; Rodrigues & Fonseca 2003; Andrade et al. 2006; 
Libkind 2007; Guamán & Carvajal 2009). Una vez establecidos los diferentes 
grupos por la similitud de bandas, se procede a identificarlos por medio de la 
secuenciación de la región D1/D2 del gen ribosomal 26S de sólo un representante 
de cada grupo de aislados, ahorrando tiempo y costos. 
 
3.4. Identificación por secuenciación de la región D1/D2 
La secuencia de la región D1/D2 se ha utilizado desde hace ya varios años para la 
identificación de levaduras y existe tal cantidad de secuencias en las bases de 
datos que esta secuencia es considerada su código de barras genético no oficial 
(Eberhardt 2010, Seifert 2009). Varios estudios han demostrado su eficacia en la 
identificación de levaduras basidiomycetes y ascomycetes aisladas de diferentes 
sustratos como vinos (Alves-Baffi et al. 2011), comidas y bebidas (Beh et al. 2006; 
Spencer et al. 2011), muestras clínicas (Linton et al. 2007) y veterinarias (Garner 
et al. 2010), flores y hojas de plantas (Saluja & Prasad 2007, Nakase et al. 2002), 
glaciares (Pathan et al. 2010), y lagos (van Uden & Ahearn, 1963; Meyers et al. 
1970; Shivaji et al. 2008; Medeiros et al. 2008; Brandão et al. 2011). 
 
 
11 
4. OBJETIVOS 
4.1. Objetivo General 
Identificar y comparar la diversidad de especies de levaduras asociadas a los 
lagos de la Universidad del Valle. 
 
4.2. Objetivos específicos 
Aislar y agrupar por caracteres morfológicos y moleculares a las levaduras 
asociadas al sedimento de los lagos de la Universidad del Valle sede Meléndez. 
 
Identificar los grupos de levaduras usando las secuencias de la región D1/D2 del 
ADN ribosomal. 
 
Comparar la diversidad de especies de levaduras entre ambos lagos de la 
Universidad del Valle sede Meléndez. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
5. MÉTODOS 
 
5.1. Muestreo 
Los muestreos se llevaron a cabo en el lago ubicado dentro de la Estación 
Experimental del Departamento de Biología de la Universidad del Valle y en el 
Lago Central de la Universidad del Valle sede Meléndez. Se realizaron 3 
muestreos de sedimento y 1 de agua a 30 cm de profundidad (epilimnion), con un 
intervalode dos meses entre ellos y con un día de diferencia entre lagos. Se 
tomaron 5 muestras por lago: Cuatro a 2 m del borde y una en el centro. 
 
Se tomaron muestras de aprox. 100ml de sedimento mediante un vaso metálico 
estéril sujeto a una vara extensible (3m). La muestra se depositó en un frasco 
estéril con rosca para su transporte al Laboratorio de Biología Molecular de 
Microorganismos. En la toma de muestras de agua se utilizó un frasco estéril el 
cual se abría a 30cm por debajo de la superficie del agua y se volvía a cerrar a 
esa profundidad una vez lleno con 100ml del agua. 
 
La toma de datos físico-químicos del agua de los lagos se llevó a cabo en el 
Muestreo 4. Se tomaron datos de temperatura, conductividad y pH con una sonda 
YSI modelo 85. 
 
5.2. Aislamiento de cepas 
De cada muestra de sedimento se realizaron tres diluciones seriadas (10-1, 10-2 y 
10-3) en agua peptonada y se sembraron, con perlas de vidrio, 200 μL de cada 
13 
dilución en medio de cultivo YPD Agar (1% extracto de levadura, 2% peptona 
micológica, 2% de glucosa, 2% agar) suplementado con 25mg/L de penicilina y 
cloramfenicol. De las muestras de agua se sembraron 500 μL sin dilución. 
 
Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 o 3 días y se aislaron 
las colonias más representativas de cada punto de muestreo para su análisis 
morfológico y genético. Las cepas de levaduras encontradas fueron conservadas 
en caldo YPD suplementado con glicerol 30% a -20°C en el banco de levaduras 
del Laboratorio de Biología Molecular de Microorganismos de la Universidad del 
Valle. 
 
5.3. Caracterización fenotípica 
Los aislados se analizaron según criterios morfológicos de acuerdo a las 
descripciones realizadas por Boekhout et al. (2004). Se evaluaron la morfología de 
colonia, celular y el modo de reproducción vegetativa. Con las similitudes 
morfológicas se establecieron grupos de posibles especies iguales para ser 
verificados por caracterización molecular por MSP-PCR-Fingerprinting usando el 
primer GTG5. 
 
5.4. Extracción de ADN Genómico 
La extracción del ADN de los aislados se realizó utilizando la metodología descrita 
por Osorio-Cadavid et al. (2009). La cuantificación de ADN se realizó mediante 
espectrofotometría a 260nm y se determinó la pureza mediante la relación 
14 
espectrofotométrica 260/280nm usando NanoDrop 2000 (v1.0, Termo Scientific, 
Estados Unidos) 
 
5.5. Caracterización Molecular 
Una vez definidos los grupos por medio de la morfología y extraído su ADN, se 
realizaron MSP-PCR-Fingerprinting usando el primer GTG5 para verificar su 
similitud genética. Se tomaron 5uL (aproximadamente 1ng/μL) de ADN genómico 
diluído y se resuspendió en 20μL de mezcla de PCR: 0.5μM GTG5, 0.1mM dNTPs, 
1X NH4+, 3mM MgCl2, y 1.2U de Taq Polimerasa. en un termociclador (M.J. 
Research, USA), bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94ºC 
por 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 15segundos, 
apareamiento a 55ºC por 45 segundos, y extensión a 72ºC por 90 segundos, con 
una extensión final de 6min a 72ºC. 
 
La calidad de la amplificación fue evaluada en geles de agarosa al 1.5% y 
visualizadas con Bromuro de Etidio a 240nm. Los tamaños de bandas fueron 
contrastados con un marcador de peso molecular de 250pb (Invitrogen, USA) y 
fueron analizados usando el software UVIGelStartMw v11 © 1995. Se realizó un 
análisis de Cluster de acuerdo al índice de correlación de Pearson y el algoritmo 
de agrupamiento UPGMA usando el Software estadístico PAST (ver. 2.14, 
Hammer et al. 2001). Los dendrogramas resultantes fueron analizados y 
comparados con los grupos establecidos morfológicamente para confirmarlos o 
modificarlos. Se tomaron como agrupamientos los aislados que tuvieran un 80% o 
más de similitud. 
15 
5.6. Amplificación del dominio D1/D2 de la Subunidad Grande Ribosomal 26S 
Un aislado representante de cada uno de los grupos establecidos fue 
seleccionado para este procedimiento. La amplificación del dominio D1/D2 de la 
subunidad grande del gen ribosomal 26S rDNA fue llevada a cabo de acuerdo a 
Lopez et al. 2010. Para la amplificación del dominio D1/D2 se usaron los primers 
NL1 (5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´) y NL4 (5´-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3´). 
 
Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador (Multigene-Labnet, USA) 
bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94ºC por 5 minutos, 30 
ciclos de desnaturalización a 94ºC por 1 min, apareamiento a 55ºC por 30 seg, y 
extensión a 72ºC por 1 min, con una extensión final de 10 min a 72ºC (Osorio-
Cadavid et al., 2008). 
 
5.7. Secuenciación, análisis e Identificación molecular de levaduras 
Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados por la empresa 
MACROGEN (USA) bajo condiciones estandarizadas por ellos. Una vez 
obtenidas, las secuencias fueron ensambladas y editadas mediante el software 
ChromasPro v.1.42®, y comparadas con las secuencias reportadas en el 
GenBank usando el algoritmo “Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)”. La 
identificación fue realizada de acuerdo al criterio establecido por Kurtzman y 
Robnett (1998). 
 
 
16 
5.8. Análisis estadístico 
Los datos fueron procesados con el Software estadístico PAST (ver. 2.14, 
Hammer et al. 2001). Su interpretación estuvo basada en el análisis de varianza 
con un limite de confianza de p=0,05. Se usaron los indices de Shannon (H), 
Simpson (D) y equitabilidad (E). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
6. RESULTADOS 
6.1. Muestreo 
En total se encontraron 141 aislados, 74 pertenecientes al Lago Central y 67 al 
Lago Estación. De estos aproximadamente el 10% se encontraron en el primer 
muestreo, 34% en el segundo muestreo, 36% en el tercer muestreo y 20% en el 
cuarto muestreo (Figura 1). Los muestreos (Ver Anexo 1) se efectuaron de Marzo 
a Junio del 2011, en la segunda semana de cada mes. 
No. de AISLADOS/MUESTREO
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4
N
o.
 d
e 
A
is
la
do
s
LAGO CENTRAL LAGO ESTACIîN
 
Figura 1. Porcentaje de aislados por muestreo en el Lago Central y el Lago 
Estación 
 
El conteo aproximado de Unidades Formadoras de Colonias para las levaduras 
encontradas fue de 1200 células/g para sedimento y 8 x 104 células/L para agua. 
El bajo porcentaje de aislados del primer muestreo se debe a que se estaba 
evaluando el Propionato de calcio como aditivo para el medio de cultivo para la 
disminución del crecimiento de hongos filamentosos, pero disminuyó igualmente el 
18 
crecimiento de las levaduras y se descontinuó su uso. El bajo porcentaje del 
cuarto muestreo se debe a que se hizo a partir de agua y las levaduras se 
encontraban en menor abundancia, según el conteo de células/ml. 
 
Los parámetros físico-químicos obtenidos durante el cuarto muestreo se 
compararon por medio de una ANOVA, brindando diferencias significativas entre 
los dos lagos. Los valores promedio de temperatura, pH y conductividad para 
ambos lagos así como los valores de p menores a 0,05 se pueden observar en las 
Figuras 2, 3 y 4. 
 
 
Figura 2. Comparación de Temperatura entre el Lago Central y Estación. 
 
19 
 
Figura 3. Comparación de pH entre el Lago Central y Estación. 
 
 
 
Figura 4. Comparación de conductividad entre el Lago Central y Estación. 
 
 
20 
 
6.2. Caracterización fenotípica 
Con los aislados encontrados se realizó un agrupamiento inicial por características 
morfológicas de colonia y de células, obteniendo 14 grupos con varios aislados 
iguales y 2 grupos con aislados únicos. En la Tabla 2 se muestran los 
agrupamientos establecidos morfológicamente, los aislados pertenecientes a cada 
agrupamiento, fotografías macroscópicas y microscópicas de cada morfología 
diferente y su descripción respectiva de acuerdo a Boekhout et al. (2004). 
Tabla 3. Caracterización fenotípica de los aisladosde los lagos Central y Estación 
Agrupamiento Aislado Figura Descripción 
 
Textura colonia: Friable 
Apariencia colonia: Rugosa 
opaca 
Color colonia: Blanco 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Convexa 
Forma: Circular 
1 LE048 
LE008 
LE011 
LE012 
LE015 
LE021 
LE022 
LE025 
LE030 
LE031 
LE033 
LE041 
LE047 
LE050 
LE057 
LE063 
LE070 
LC015 
LC076 
 
 
Forma de la célula: 
Redonda 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: NO 
 
40X 
2 LC007 
LC014 
LC025 
LC026 
LC027 
LC028 
LC029 
LC037 
 
Textura colonia: 
Mantequillosa 
Apariencia colonia: Lisa 
brillante 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Convexa 
Forma: Circular 
21 
 LC038 
LC045 
LC054 
LC055 
LC058 
LC062 
LC063 
LC071 
LE010 
LE023 
 
 
Forma de la célula: 
Redonda 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: NO 
40X 
 
Textura colonia: 
Membranosa 
Apariencia colonia: Rugosa 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: Filiforme 
Elevación: Convexa 
Forma: Filamentosa 
3 LE034 
LE040 
LE077 
 
Forma de la célula: 
Cilíndrica 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: SI 
40X 
 
Textura colonia: 
Mantequillosa 
Apariencia colonia: Opaca 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Elevada 
Forma: Circular 
4 LE045 
LE024 
LE026 
LE028 
LE042 
LC057 
LC058 
LC059 
LC075 
 
Forma de la célula: 
Redondas 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: NO 
40X 
22 
 
Textura colonia: Mucoide 
Apariencia colonia: Lisa 
Brillante 
Color colonia: Rosado 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Convexa 
Forma: Circular 
5 LE001 
LE009 
LE029 
 
Forma de la célula: Ovalada 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: NO 
40X 
 
Textura colonia: 
Mantequillosa 
Apariencia colonia: opaca 
Color colonia: Blanco 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Convexa 
Forma: Circular 
6 LC009 
LC010 
LC012 
LC013 
LC030 
LC032 
LC039 
LC043 
LC067 
LC052 
LC073 
LC082 
LC085 
LE002 
LE003 
LE004 
LE005 
LE016 
LE027 
LE043 
 
 
Forma de la célula: 
Redonda 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: NO 
40X 
7 LC008 
LC044 
LE006 
 
Textura colonia: Rugosa 
Apariencia colonia: Opaca 
Color colonia: Blanco 
Margen colonia: Erosionado 
Elevación: Convexa 
Forma: Circular 
23 
 
 
Forma de la célula: Apicada 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: NO 
40X 
 
Textura colonia: 
Mantequillosa 
Apariencia colonia: Lisa 
opaca 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Convexa 
Forma: Circular 
8 LC014 
LC024 
LC061 
LC070 
LC074 
LC079 
LC088 
LC091 
LC096 
LE014 
LE032 
LE046 
LE049 
LE051 
LE052 
LE056 
LE060 
LE061 
LE064 
LE071 
 
 
Forma de la célula: 
Cilíndrica Reproducción 
asexual: Gemación 
Filamentos: NO 
40X 
 
Textura colonia: Friable 
Apariencia colonia: Rugosa 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: Erosionado 
Elevación: Plana 
Forma: Circular 
9 LC016 
LC033 
LC053 
LE054 
 
Forma de la célula: 
Cilindrica 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: SI 
40X 
24 
 
Textura colonia: 
Mantequillosa 
Apariencia colonia: Opaca 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Elevada 
Forma: Circular 
10 LC017 
LC022 
LE007 
LE044 
LC098 
LE059 
LE065 
LE069 Forma de la célula: Apicada 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: NO 
40X 
 
Textura colonia: Friable 
Apariencia colonia: Hirsuta 
Color colonia: Blanco 
Margen colonia: Ondulado 
Elevación: Elevada 
Forma: Irregular 
11 LC018 
LC019 
 
Forma de la célula: 
Elipsoidal 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: SI 
40X 
12 LC021 
LC066 
LC069 
 
Textura colonia: Friable 
Apariencia colonia: Hirsuta 
Color colonia: Blanco 
Margen colonia: Ondulado 
Elevación: Elevada 
Forma: Irregular 
25 
 
 
Forma de la célula: 
Redonda 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: SI 
40X 
 
Textura colonia: Friable 
Apariencia colonia: Rugosa 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: 
Filamentoso 
Elevación: Elevada 
Forma: Circular 
13 LC046 
LC047 
LC056 
LC068 
 
 
Forma de la célula: 
Redonda 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: SI 
40X 
 
Textura colonia: 
Mantequillosa 
Apariencia colonia: Lisa 
Brillante 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Elevada 
Forma: Circular 
14 LC049 
LE053 
LE062 
LE066 
LE068 
LE072 
LE073 
LE074 
LE075 
LE076 
LE078 
LC072 
LC077 
LC078 
LC080 
LC081 
LC083 
LC084 
LC086 
LC087 
LC089 
LC090 
 
Forma de la célula: 
Cilindrica 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: SI 
40X 
26 
 LC092 
LC093 
LC094 
LC095 
LC097 
 
 
Textura colonia: Friable 
Apariencia colonia: Rugosa 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: 
Filamentoso 
Elevación: Convexa 
Forma: Circular 
15 LC064 
 
Forma de la célula: 
Elipsoidal 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: SI 
40X 
 
Textura colonia: 
Mantequillosa 
Apariencia colonia: Lisa 
Color colonia: Crema 
Margen colonia: Entero 
Elevación: Umbonada 
Forma: Circular 
16 LC065 
 
Forma de la célula: Ojiva 
Reproducción asexual: 
Gemación 
Filamentos: NO 
40X 
 
 
6.3. Extracción de ADN genómico y cuantificación 
A todos los aislados se les extrajo su ADN genómico y se tomaron medidas de 
concentración y pureza de ADN para 5 muestras escogidas aleatoriamente, 
empleando espectrofotometría a 260nm y relación 260/280nm respectivamente. El 
27 
promedio obtenido fue de 1200ng/μl de ADN y con una pureza de 2.14 lo cual 
indica que el ADN está en buena cantidad y calidad como para su uso en pruebas 
de biología molecular. 
 
 
6.4. MSP-PCR con el iniciador GTG5 
Partiendo de los grupos establecidos por morfología, se realizó la técnica MSP-
PCR con el iniciador GTG5 y en la Figura 5 se muestran los patrones de bandas 
obtenidos para uno de los grupos de aislados. En esta imagen se observa la 
variabilidad y similitud que existe entre los diferentes aislados, la cual permite 
realizar agrupamientos previos a la identificación molecular. Las bandas obtenidas 
estuvieron en un rango de 200 a 2200pb y de 1 a 10 bandas por aislado. 
 
 
 
 
 
Figura 5. Verificación de amplificación de la MSP-PCR con el iniciador GTG5 
 
 
En las Figuras 6 y 7 se muestran los agrupamientos establecidos para cada lago 
con las bandas obtenidas por la técnica MSP-PCR usando el primer GTG5. Con 
los datos del peso de las bandas de cada perfil se realizó una matriz de datos 
binarios basados en la presencia/ausencia de bandas, sobre la cual se hicieron los 
análisis. Los grupos se tomaron con base a un 80% o más de similitud. 
 
28 
 
Figura 6. Dendrograma con las agrupaciones establecidas con las bandas 
amplificadas usando el primer GTG5 para el Lago Central 
29 
 
Figura 7. Dendrograma con las agrupaciones establecidas con las bandas 
amplificadas usando el primer GTG5 para el Lago Estación. 
 
 
 
30 
6.5. Secuenciación dominio D1/D2 rDNA 26S 
Una vez verificados los grupos por MSP-PCR con el iniciador GTG5 se escogió un 
aislado representativo de cada grupo al cual se le amplificó y secuenció la región 
D1/D2 del gen ribosomal 26S. Este procedimiento también se realizó con aislados 
que presentaban patrones de bandas únicos los cuales, de acuerdo al criterio 
establecido por Kurtzman (2006), se asignaban hasta el nivel de especie (tanto en 
ascomicetos como basidiomicetos) si presentaban una identidad máxima superior 
o igual al 99% con las secuencias depositadas en el Genbank. 
 
Los aislados identificados, la especie a la que pertenecen, el porcentaje de 
similitud que presentaron y el número de accesión con la cual coincidieron se 
muestran en las Tablas 3 y 4 para el Lago Estación y el Lago Central 
respectivamente. Las secuencias obtenidas fueron depositadas en el GenBank 
(Ver Anexo 3) 
Tabla 3. Alineamiento de secuencias obtenidas con el algoritmo BLAST 
para los aislados del Lago Estación. Las accesiones mostradas son las que 
presentaron la máxima identidad disponible en la red. 
AISLADO ESPECIE % SIMILITUD No. ACCESIÓN
LE001 Rhodotorula mucilaginosa 100% AF189959 
LE004 Candida glabrata 99% EU543685LE005 Torulaspora delbrueckii 100% HE616749 
LE008 Issatchenkia siamensis 100% FJ473448 
LE010 Candida diversa 99% HQ149317 
LE013 Saccharomyces cerevisiae 100% EU557024 
LE025 Issatchenkia siamensis 100% FJ432601 
LE030 Issatchenkia siamensis 100% FJ473448 
LE034 Lecythophora aff. decumbens 99% FN428875 
LE040 Lecythophora aff. decumbens 99% FN428875 
LE045 Candida pseudolambica 99% HQ111494 
LE048 Issatchenkia siamensis 100% FJ473448 
LE053 Cryptococcus podzolicus 100% FJ743620 
LE057 Issatchenkia siamensis 99% FJ473448 
31 
LE064 Hanseniaspora uvarum 99% EU326137 
LE078 Cryptococcus rajasthanensis 100% AM262981 
 
Tabla 4. Alineamiento de secuencias obtenidas con el algoritmo BLAST 
para los aislados del Lago Central. Las accesiones mostradas son las que 
presentaron la máxima identidad disponible en la red. 
AISLADO ESPECIE % SIMILITUD No. ACCESIÓN
LC007 Candida diversa 100% HQ149317 
LC010 Saccharomyces cerevisiae 99% JN938921 
LC012 Saccharomyces cerevisiae 99% JN938921 
LC015 Yarrowia lipolytica 100% FJ527860 
LC021 Trichosporon jirovecii 100% EU882089 
LC024 Williopsis saturnus 100% FN428868 
LC039 Candida albicans 100% FJ627956 
LC043 Torulaspora delbrueckii 100% HE616749 
LC045 Candida diversa 100% EF550213 
LC052 Hanseniaspora thailandica 100% AB617998 
LC058 Candida diversa 100% EF550213 
LC062 Candida diversa 100% HQ149317 
LC064 Trichosporon laibachii 100% EU833234 
LC077 Bullera aff. coprosmaensis 100% FN428945 
LC081 Cryptococcus laurentii 100% EF635635 
LC097 Cryptococcus rajasthanensis 100% AM262981 
 
6.6. Identificación de los aislados 
En las Figuras 8 y 9 se muestran las especies de levaduras asociadas a los lagos 
de la Universidad del Valle a partir de todos los análisis anteriores, siendo 
clasificados de acuerdo al muestreo del que fueron aisladas (muestreos 1 a 4). En 
el Lago Central se encontraron un total de 15 morfologías distintas, 4 de las cuales 
no fueron identificadas hasta el nivel de especie; en el Lago Estación se 
encontraron un total de 15 morfologías distintas, 4 de las cuales no fueron 
identificadas hasta el nivel de especie. Algunos de estos aislados posiblemente 
son especies nuevas. 
 
En la Figura 10 está la comparación entre especies y sus abundancias 
encontradas en el Lago Central y en el Lago Estación. Algunas especies se 
encuentran presentes en ambos lagos. 
32 
 
ABUNDANCIA DE AISLADOS POR MUESTREO
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Bullera aff. Coprosmaensis
Candida albicans
Candida diversa
Candida sp. 13
Candida sp. 16
Candida sp. 7
Cryptococcus laurentii
Cryptococcus rajasthanensis
Pichia sp. 10
Pichia sp. 11
Pichia sp. 9
Hanseniaspora thailandica
Saccharomyces cerevisiae
Torulaspora delbrueckii
Trichosporon jirovecii
Trichosporon laibachii
Cyberlindnera saturnus
Yarrowia lipolytica
ES
PE
C
IE
No. de AISLADOS
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4
Figura 8. Gráfica de riqueza y abundancia por muestreo en el Lago Central 
 
ABUNDANCIA DE AISLADOS POR MUESTREO
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Candida diversa
Candida glabrata
Candida pseudolambica
Candida sp. 7
Cryptococcus podzolicus
Cryptococcus rajasthanensis
Hanseniaspora uvarum
Issatchenkia siamensis
Lecythophora aff. Decumbens
Pichia sp. 10
Pichia sp. 9
Rhodotorula mucilaginosa
Torulaspora delbrueckii
Torulaspora pretoriensis
ES
PE
C
IE
No. de AISLADOS
Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 4
 
Figura 9. Gráfica de riqueza y abundancia por muestreo en el Lago Estación 
33 
 
ABUNDANCIA DE AISLADOS POR LAGO
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Bullera aff. Coprosmaensis
Candida albicans
Candida diversa
Candida glabrata
Candida pseudolambica
Candida sp. 13
Candida sp. 16
Candida sp. 7
Cryptococcus laurentii
Cryptococcus podzolicus
Cryptococcus rajasthanensis
Hanseniaspora uvarum
Hanseniaspora thailandica
Issatchenkia siamensis
Lecythophora aff. Decumbens
Pichia sp. 10
Pichia sp. 11
Pichia sp. 9
Rhodotorula mucilaginosa
Saccharomyces cerevisiae
Torulaspora delbrueckii
Torulaspora pretoriensis
Trichosporon jirovecii
Trichosporon laibachii
Cyberlindnera saturnus
Yarrowia lipolytica
ES
PE
C
IE
No. de AISLADOS
LAGO ESTACIîN LAGO CENTRAL
 
Figura 10. Gráfica de riqueza y abundancia en ambos lagos 
 
 
6.7. Análisis estadístico 
Los valores representados gráficamente en la Figura 11 indican las diferencias 
significativas que existen entre los Lagos Central y Estación de acuerdo a la 
diversidad, dominancia, riqueza y equitabilidad de las levaduras encontradas. En 
la Figura 12 se presenta la gráfica de análisis de conglomerados en donde existen 
diferencias significativas en la composición de especies de levaduras presentes en 
los lagos. 
 
 
34 
2,32
0,87 0,88
2,625
0,91 0,91
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
H D E
Lago Estaci—n Lago Central
p= 0,036
p= 0,038 p= 0,3
 
Figura 11. Comparación de la diversidad, dominancia y equitabilidad entre los 
lagos 
 
 
Figura 12. Análisis de conglomerados. El grupo encerrado en un circulo 
representa al Lago Central. 
 
 
 
 
35 
 
7. DISCUSIÓN 
 
En las últimas décadas el estudio de la diversidad de levaduras ha experimentado 
avances muy importantes en términos de su entendimiento, caracterización y 
reorganización taxonómica. Sin embargo, se estima que el 99% de la diversidad 
potencial de este grupo de organismos eucarióticos sigue desconocida. Por este 
motivo es necesario incrementar los esfuerzos para estudiar la diversidad de 
levaduras, especialmente en países mega diversos de las regiones tropicales y del 
hemisferio Sur del planeta, pues a la fecha la mayoría de las especies catalogadas 
han sido descubiertas en países del hemisferio Norte (Carvajal-Barriga et al. 
2011). 
 
El conteo de células por litro arrojó que la abundancia de las levaduras presentes 
en el agua de los lagos de la Universidad del Valle es alta y consistente con un 
ecosistema eutrófico, al estar por encima de 1000 células/L (Hagler 2006). En 
sedimento, el conteo de levaduras fue mucho más alto que en agua y es 
consistente con la aproximación de Hagler (2006) quien afirma que el conteo en 
sedimento es aproximadamente 10 veces mayor al del conteo en agua. Este alto 
conteo indica que el método de aislamiento usado fue eficiente considerando que 
sólo una pequeña parte de los organismos conocidos es cultivable en medios 
artificiales y bajo condiciones de laboratorio. 
 
 
 
 
36 
Además de la abundancia de las levaduras, se analizó su diversidad inicialmente 
por medio de agrupamientos morfológicos basados en las diferentes clases de 
colonias y de células. Estos agrupamientos se comprobaron con la técnica MSP-
PCR (ver Anexo 2) con la que se confirmó la similitud genética entre los aislados 
de los Agrupamientos 1 y 3, los otros agrupamientos no presentaron similitudes 
mayores al 80% entre los aislados que los componían. Estas diferencias genéticas 
se intensificaron con la identificación por secuenciación de varios aislados de cada 
grupo, resultando estar compuestos de varias especies diferentes que la 
morfología en sí no pudo diferenciar. 
 
Para comprobar la reproducibilidad de la técnica MSP-PCR entre diferentes PCRs, 
se escogieron varios aislados de cada agrupamiento a los cuales se les repitió el 
procedimiento hasta cuatro veces distintas usando las mismas diluciones de ADN. 
Los resultados obtenidos fueron muy variables pues la presencia de bandas era 
mayor o menor entre las diferentes PCRs, generando confusiones al analizar los 
datos por medio de los dendrogramas basados en matrices presencia/ausencia 
(ver Anexo 2 y Figuras 6 y 7). Un posible margen de error que afecta la matriz 
presencia/ausencia es el que presenta el software utilizado para analizar los pesos 
de las bandas presentes en los geles, pues el peso de las bandas puede variar en 
30 pb (UviGelStart, v11, 1995). 
 
Por la variabilidad genética que presentaron losaislados de cada grupo con la 
técnica MSP-PCR, se optó por identificar molecularmente varios aislados de los 
grupos más abundantes. Las secuencias de la región D1/D2 del ADN ribosomal 
37 
26S indicaron que varias de las agrupaciones morfológicas establecidas estaban 
conformadas por especies diferentes, como es el caso del Agrupamiento 6 el cual 
resultó conformado por 4 especies diferentes (S. cerevisiae, C. albicans, C. 
glabrata y T. delbrueckii). Este hecho respalda las diferencias genéticas que se 
presentaron en este grupo por la técnica MSP-PCR con el iniciador GTG5. Caso 
contrario es el del Agrupamiento 2 (Ver Anexo 2), en donde la gran mayoría de los 
aislados presentaban similitudes menores al 70% pero que la identificación dieron 
el mismo resultado como C. diversa. 
 
El Agrupamiento 1 fue el más consistente entre su morfología y variabilidad 
genética pues los aislados presentaron similitud mayor del 80% entre las bandas y 
por secuenciación resultaron ser la misma especie (I. siamensis). Vale mencionar 
que en el dendrograma de este agrupamiento se observó un aislado que 
presentaba muy poca similitud genética con los demás del grupo y que por la 
secuencia de la región D1/D2 resultó ser una especie diferente (Y. lipolytica). 
 
Estos resultados son consistentes con lo establecido previamente por Andrade y 
colaboradores (2006), quienes consideraron que la variabilidad genética que 
presentaron algunos aislados de una misma especie por la técnica de MSP-PCR 
(específicamente con el iniciador GTG5) puede ser debido a la alta sensibilidad de 
este iniciador que es capaz de diferenciar entre cepas de una misma especie. 
De la técnica MSP-PCR con el iniciador GTG5 se puede inferir que no es confiable 
como método de agrupamiento para especies desconocidas pues puede presentar 
resultados redundantes a la hora de identificar por secuenciación las diferentes 
38 
especies. 
 
La secuenciación de la región D1/D2 del ADN ribosomal resultó ser una forma de 
identificación de las especies de levaduras muy eficiente, logrando la identificación 
a nivel de especie con un 99% o más de similitud para todos los aislados 
analizados, al compararlos con las secuencias del GenBank y posteriormente con 
las secuencias de las cepas tipo de sus respectivas especies. Varios aislados 
coincidieron con especies que todavía no han sido descritas oficialmente por los 
investigadores que las descubrieron (I. siamensis, B. aff. coprosmaensis y L. aff. 
decumbens) por lo cual sus nombres científicos todavía no son válidos. Se espera 
contribuir con algunos datos a la descripción de I. siamensis y de B. aff. 
coprosmaensis. 
 
La diversidad de especies presentes en cada lago presentó diferencias 
significativas según el índice de Shannon (p<0.05) (Figura 11). Este índice nos 
revela que ambos lagos tienen diversidades bajas por estar entre 0 y 3 pero que 
no son iguales por la mayor cantidad de especies encontradas en el Lago Central 
(18 especies). Los parámetros físico-químicos observados contemplaron la 
temperatura, el pH, la conductividad y la cobertura de los árboles alrededor de 
ambos lagos y, posiblemente, las diferencias significativas encontradas en estos 
dos ambientes (Figuras 2, 3 y 4) hacen que cada lago brinde los recursos y 
condiciones necesarios para sostener la misma riqueza de especies de levaduras 
pero que no permitan que igual diversidad de especies se desarrolle. 
 
39 
Aunque la flexibilidad ecológica de las levaduras les permite ocupar todos los 
hábitats acuáticos por su capacidad para tolerar amplios rangos de salinidad, 
temperatura y acidez en el medio que las rodea (Boguslawska-Was & Dabrowski 
2001) algunas posiblemente pueden ser más sensibles a estos cambios. Un 
posible ejemplo de levaduras con alta flexibilidad ecológica puede ser el de las 
levaduras que se encuentran en ambos lagos. La composición de especies entre 
los lagos fue similar en un 23% al compartir las especies C. diversa, C. 
rajasthanensis, T. delbrueckii y otras tres que no fue posible identificarlas hasta el 
nivel de especie, pertenecientes a los géneros Pichia y Candida. Una posible 
causa de la presencia de estas especies en ambos lagos puede ser el hecho de 
que hay un flujo de agua desde el Lago Central hacia el Lago Estación el cual 
puede servir de medio de transporte, especialmente para las especies 
encontradas en agua. 
 
Es importante notar que la gran mayoría de las especies compartidas se 
encontraba en mayor abundancia en el Lago Central y que no todas las especies 
encontradas en el agua del Lago Central se encontraron en el Lago Estación. Esto 
implica que las diferencias significativas obtenidas en los parámetros físico-
químicos del agua, además de la flexibilidad ecológica intrínseca de cada especie, 
también pueden estar seleccionando las especies que logran pasar al Lago 
Estación. Estas diferencias en las condiciones del agua pueden explicar el 
resultado del análisis de conglomerados (Figura 12) en donde se formó un grupo 
separado para cada lago estadísticamente validados por el análisis de similitud 
40 
ANOSIM (R= 0.642, p< 0.05), revelando que existen diferencias significativas en la 
composición de especies de levaduras presentes en los lagos. 
 
Los grupos formados concuerdan con el índice de Simpson (Figura 11) y la Figura 
10 en donde se observa que en cada lago dominan especies distintas como es el 
caso de I. siamensis para el Lago Estación y C. diversa para el Lago Central en 
primer lugar. En segundo lugar, dominan H. uvarum para el Lago Estación y C. 
saturnus para el Lago Central, seguidas de especies únicas para cada lago que se 
encuentran en menor abundancia. 
 
La mayoría de las levaduras identificadas se encuentra usualmente en la 
naturaleza, principalmente en el suelo, exceptuando algunas con potencial 
patógeno que se encuentran con frecuencia asociadas a heces de animales y 
contaminaciones antropogénicas (Hagler 2006). Dentro de las especies 
identificadas se presentan varias con posible potencial biotecnológico, industrial y 
ambiental, según lo reportado en la literatura para cada una de ellas. Un ejemplo 
es el caso de C. saturnus encontrada en el Lago Central. Esta es una especie con 
distribución mundial, frecuentemente aislada de suelo, agua dulce y hojarasca que 
ha demostrado potencial como biocatalizador por oxidar alcoholes racemicos 
secundarios, contribuyendo al desarrollo de modelos para el entendimiento de la 
actividad de estos microorganismos y para comparar los requerimientos de 
especificidad de sustrato de las enzimas involucradas (Carballeira et al 2004). 
 
41 
Torulaspora delbrueckii también es una especie distribuida mundialmente que ha 
sido aislada de suelo, corteza de árboles, comidas y frutas fermentadas. Esta 
especie fue aislada también de inflorescencias de mango (Mangifera indica) 
(Gaviria 2012, datos no publicados) que es el segundo árbol más abundante 
alrededor del Lago central (Ver Tabla 1). Es posible que las condiciones del Lago 
Central permitan que esta levadura al caer junto algunas inflorescencias, 
permanezca y se reproduzca en el agua y sedimento de este lago (ver Figura 8). 
Por su habilidad de fermentación, su poca perdida de viabilidad después de largos 
períodos de congelamiento y el aporte de olores y sabores nuevos al vino, esta 
especie de levadura resulta interesante para la industria panadera, pastelera y 
vinícola (Kurtzman et al 2011). 
 
Hanseniaspora uvarum ha sido aislada de suelo, insectos, frutas, agua dulce y 
marina, considerándola una levadura de distribución mundial. También fue aislada 
específicamente de frutos de Pomarroso (Sizygium malaccense) (Usman 2012, 
datos no publicados), especie de árbol más abundante alrededor del Lago Central. 
Sin embargo, esta especie no se presentó en los aislados de este lago, pero si en 
los aislados del Lago Estación dondeno existe esta especie de árbol (Ver Tabla 
1), dando lugar a otras posibles fuentes de origen diferentes a los frutos de este 
árbol. Es posible que esta y otras especies que también han sido aisladas 
previamente en suelos, sean capaces de vivir en el sedimento y suspendidas en la 
columna de agua. Algunas cepas de esta especie tienen importancia enológica 
pues producen enzimas que se encargan de liberar compuestos aromáticos en los 
vinos (Kurtzman et al 2011). 
42 
 
Además de encontrarse especies con potencial biotecnológico se encontraron 
especies potencialmente patógenas, reconocidas como bioindicadores de la 
calidad del agua. Según Dynowska (1997), Candida sp., Rhodotorula sp., 
Cryptococcus sp., Trichosporon sp. son levaduras que sirven como bioindicadores, 
pero que la presencia de estas no debe limitarse a su análisis solamente como 
indicadores. En los lagos se encontraron levaduras pertenecientes a todos estos 
géneros y existe la posibilidad de que entren por medio del afluente del río 
Meléndez o por las heces de la fauna de cada lago. 
 
En el Lago Central se encontraron más especies potencialmente patógenas como 
C. albicans, C. laurentii, T. Jirovecii y T. laibachii. Todas estas especies han sido 
aisladas de muestras clínicas pero también son comunes en la naturaleza, un 
ejemplo es C. albicans. Esta especie es reconocida mundialmente por producir 
micosis en humanos, especialmente candidiasis en personas con sistema 
inmunológico comprometido (Cooper 2011) pero también se ha aislado de 
hojarasca en descomposición (Kurtzman et al. 2011) y frutos de Pomarroso 
(Sisygium malaccense), árbol más abundante alrededor del Lago Central (Ver 
Tabla 1) (Usman 2012, datos no publicados). 
 
En el lago Estación también se encontró una levadura patógena perteneciente al 
género Candida y con similitudes a C. albicans. Candida glabrata es un 
considerada un patógeno emergente, muy común en infecciones nosocomiales en 
pacientes inmuno-comprometidos. Usualmente afecta la cavidad oral, tracto 
43 
urogenital, torrente sanguíneo y los aislados analizados presentaron una 
resistencia innata a antimicóticos del tipo “azole” (Kurtzman et al. 2011). 
 
En los lagos también se encontraron otras especies pertenecientes al género 
Candida que hasta ahora no han presentado potencial patógeno. C. 
pseudolambica se considera una especie cosmopolita pues ha sido aislada de 
suelos y de bivalvos que se estaban alimentando de árboles de Mangle 
(Rhizophora mangle) (Kurtzman et al. 2011). C. diversa ha sido aislada de mosto 
de uvas y de jugo de naranjas y se conoce de su inhabilidad para asimilar los 
carbohidratos estándar excepto la glucosa, pero no se han llevado a cabo más 
estudios sobre estas dos especies que permitan conocer sobre su ecología o 
potencial biotecnológico (Kurtzman et al. 2011). 
 
Cryptococcus laurentii es otra especie potencialmente patógena que se ha aislado 
de suelo, agua marina, madera en descomposición (Kurtzman et al. 2011) y 
últimamente fue aislada de frutos de Mango (Mangifera indica) (Usman 2012, 
datos no publicados) que se presenta alrededor del Lago Central. Esta especie 
también tiene importancia en biotecnología pues algunos aislados han presentado 
características potencialmente deseables para el control de levaduras y hongos 
contaminantes en procesos y productos alimenticios (Kurtzman et al 2011). 
 
Especies del género Trichosporon se encuentran en el segundo lugar de 
patogenicidad, después del género Candida al que pertenece C. albicans 
(Chagas-Neto et al 2008). En el Lago Central se encontraron las especies T. 
44 
jirovecii y T. laibachii, ambas consideradas patógenas por frecuentar muestras 
clínicas y heces de animales. La especie T. jirovecii fue descrita a partir de una 
cepa aislada de uñas humanas (Kurtzman et al 2011), lo cual indica su posible 
origen antropogénico por la entrada de aguas del río Meléndez al Lago Central. 
T. laibachii ha sido aislada de guano de murciélagos (Kurtzman et al. 2011), 
mamíferos que posiblemente son abundantes alrededor del Lago Central por la 
cantidad de árboles frutales como Mango y Pomarroso que existen en su borde. 
 
Rhodotorula mucilaginosa es posiblemente la especie de levadura más ubicua. Se 
ha encontrado en todos los hábitats posibles, incluso en la atmósfera (Kurtzman 
2011) y lagos oligotróficos (Brandão et al. 2011). También es considerada una 
especie indicadora por presentarse en ciertas micosis humanas, junto con otras de 
este género cuya característica principal es la producción de compuestos 
carotenoides que les brindan su color rosáceo distintivo (Hagler 2006). Por el 
hecho de ser especies indicadoras y por presentar un color fácil de diferenciar, el 
conteo de colonias rosadas se ha propuesto como un método rápido para el 
análisis de la calidad de agua (Hagler 2006). 
 
Además de ser consideradas especies patógenas, estudios han demostrado que 
especies de los géneros Cryptococcus y Trichosporon pueden también presentar 
un papel muy importante en procesos de biorremediación de metales pesados 
pues tienden a incorporarlos en su metabolismo, extrayéndolos del medio 
ambiente (Botha 2006). Se han encontrado aislados de C. podzolicus capaces de 
resistir hasta 500ppm de Cobre y varios aislados han presentado producción de 
45 
epóxido hidrolasas con características prometedoras para la obtención de 
epóxidos enantiopuros y dioles vecinales durante la hidrólisis enantio-selectiva de 
epóxidos racémicos para la preparación de compuestos activos biológicamente 
(Kurtzman et al. 2011). 
 
Otra especie considerada patógeno emergente pero con usos demostrados en 
biorremediación y biotecnología es Yarrowia lipolytica. Esta especie es 
predominantemente marina y está considerada como patógeno emergente porque 
recientemente se ha encontrado relacionada con algunas micosis humanas 
(Kurtzman et al. 2011). Y. lipolytica es reconocida por degradar grasas (de ahí su 
nombre) y n-parafinas, características deseables en procesos de biorremediación 
y que también hacen que su presencia sea tomada como posible indicadora de 
contaminación industrial de agua y suelo (Hagler 2006). Algunos aislados de esta 
especie han demostrado tolerancia a grandes concentraciones de Cromo (III) 
(Raspor y Zupan 2006). 
 
A parte de estas últimas especies ampliamente descritas en la literatura, se 
encuentra Hanseniaspora thailandica una especie nueva recientemente descrita 
por Jindamorakot y colaboradores (2009). Estos investigadores aislaron esta 
especie de varios sustratos naturales como excremento de insectos, flores de 
Sonneratia caseolaris, líquenes y frutos descompuestos de Psidium guajava. Esta 
especie también fue aislada recientemente por Usman (2012, datos no publicados) 
a partir de frutos de Mango (Mangifera indica) y Pomarroso (Sizygium 
malaccense), las dos especies de árboles más abundantes alrededor del Lago 
46 
Central. Este sería el primer reporte de la presencia de esta especie en 
sedimentos de un lago artificial. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
47 
8. CONCLUSIONES 
 
La técnica de MSP-PCR con el iniciador GTG5 no es recomendable para el 
agrupamiento inicial de especies desconocidas. 
 
La secuencia de la región D1/D2 del ADN ribosomal es un método eficiente para la 
identificación molecular de especies de levaduras. 
 
Los lagos Central y Estación de la Universidad del Valle sede Meléndez tienen una 
composición de especies diferentes a pesar de su cercanía y flujo de agua desde 
el Lago Central hacia el Lago Estación. 
 
Las diferencias significativas en los parámetros físico-químicos de los lagos 
pueden estar seleccionando las especies de levaduras que los habitan. 
 
La fauna y flora alrededor de los lagos puede influenciar la diversidad de especies 
de levaduras presentes en ellos. 
 
Varias levaduras aisladas delos lagos resultaron ser especies nuevas no descritas 
todavía. 
 
Las especies de levaduras aisladas de los lagos presentan potencial en 
biotecnología y biorremediación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
48 
9. LOGROS 
 
Este estudio es pionero en la investigación de la diversidad de especies de 
levaduras en sedimentos y agua de lagos en Colombia. 
 
Se estableció contacto con investigadores de la Universidad de Oklahoma en 
Estados Unidos y la Universidad de Kasertat en Tailandia para una posible 
colaboración en la descripción de las especies Bullera aff. coprosmaensis e 
Issatchenkia siamensis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
49 
10. LITERATURA CITADA 
 
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Antonie van Leeuwenhoek 36. Págs. 427–435 
 
WURZBACHER, C. M., F. BÄRLOCHER, H. P. GROSSART. 2010. Fungi in lake 
ecosystems. Aquatic Microbial Ecology 59: 125–149. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
54 
11. ANEXOS 
 
 
ANEXO 1. Panorámica de los lagos de la Universidad del Valle sede Meléndez 
mostrando la ubicación de los puntos de muestreo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lago Central 
 
Lago Estación 
55 
ANEXO 2. Dendrogramas de los agrupamiento establecidos por 
presencia/ausencia de las bandas obtenidas por MSP-PCR con el primer GTG5. 
 
 
56 
 
 
57 
 
 
58 
 
 
59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
60 
ANEXO 3. Accesiones al GenBank de las secuencias obtenidas de los aislados. 
 
Fecha de envío: 16/02/2012 
BankIt1514304 Seq1 JQ672585 
BankIt1514304 Seq2 JQ672586 
BankIt1514304 Seq3 JQ672587 
BankIt1514304 Seq4 JQ672588 
BankIt1514304 Seq5 JQ672589 
BankIt1514304 Seq6 JQ672590 
BankIt1514304 Seq7 JQ672591 
BankIt1514304 Seq8 JQ672592 
BankIt1514304 Seq9 JQ672593 
BankIt1514304 Seq10 JQ672594 
BankIt1514304 Seq11 JQ672595 
BankIt1514304 Seq12 JQ672596 
BankIt1514304 Seq13 JQ672597 
BankIt1514304 Seq14 JQ672598 
BankIt1514304 Seq15 JQ672599 
BankIt1514304 Seq16 JQ672600 
BankIt1514304 Seq17 JQ672601 
BankIt1514304 Seq18 JQ672602 
BankIt1514304 Seq19 JQ672603 
BankIt1514304 Seq20 JQ672604 
BankIt1514304 Seq21 JQ672605 
BankIt1514304 Seq22 JQ672606 
BankIt1514304 Seq23 JQ672607 
BankIt1514304 Seq24 JQ672608 
BankIt1514304 Seq25 JQ672609 
BankIt1514304 Seq26 JQ672610 
BankIt1514304 Seq27 JQ672611 
BankIt1514304 Seq28 JQ672612 
BankIt1514304 Seq29 JQ672613 
BankIt1514304 Seq30 JQ672614 
BankIt1514304 Seq31 JQ672615 
BankIt1514304 Seq32 JQ672616 
BankIt1514304 Seq33 JQ672617 
BankIt1514304 Seq34 JQ672618 
BankIt1514304 Seq35 JQ672619 
BankIt1514304 Seq36 JQ672620 
BankIt1514304 Seq37 JQ672621 
BankIt1514304 Seq38 JQ672622