Anexo-EspectrofotometrAa-2022

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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA/LUZ/CÁTEDRA DE FÍSICA/FFYB/ UBA
ANEXO: ESPECTROFOTOMETRÍA
Este Anexo permitirá complementar los contenidos discutidos a lo largo del
Recorrido de Espectrofotometría. Específicamente, ampliará el capítulo
Instrumentación del recorrido, detallando las características de cada una de las
partes constituyentes de un espectrofotómetro. Este análisis es fundamental para el
abordaje posterior de los controles espectrofotométricos.
INSTRUMENTACIÓN
Haciendo un poco de historia, el primer método utilizado conocido con el nombre
de colorimetría, consistía en la comparación visual del color de disoluciones con
una serie de patrones de la misma sustancia disuelta en concentraciones
conocidas. Para tal procedimiento, eran empleados frecuentemente tubos de fondo
plano llamados tubos de Nessler. Estos estaban calibrados de manera que se
conseguía un paso de luz uniforme. Y como fuente de radiación se solía emplear la
luz solar transmitida a través de los fondos de los tubos.
Los métodos colorimétricos visuales presentan varias desventajas: debe utilizarse
siempre un patrón o una serie de patrones; además el ojo no es capaz de
componer colores si está presente en la disolución una segunda sustancia
coloreada; finalmente, el ojo no es tan sensible a pequeñas diferencias en la
tonalidad o intensidad de color como un dispositivo fotoeléctrico.
Por estas razones surgieron instrumentos tales como el fotocolorímetro de un sólo
haz y luego el de doble haz y por último, los espectrofotómetros de simple y doble
haz, siendo éstos dos últimos los de uso más difundido.
Para comprender el funcionamiento de los distintos métodos instrumentales
veamos el siguiente esquema básico, donde se diagrama en bloques un fotómetro:
Figura 1. Esquema básico de un fotómetro: (A) una fuente estable de energía radiante, (B) una
ranura de entrada, (C) un selector de longitud de onda, (D) una ranura de salida, (E) un dispositivo
para contener la cubeta (donde se coloca la muestra), (F) un detector de energía radiante, (G) un
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dispositivo para leer la señal eléctrica generada por el detector.
Así, un fotómetro es el instrumento más sencillo, consistente en un detector
fotoeléctrico, una fuente de luz y cubetas. Estos métodos fotométricos están
restringidos a la región visible del espectro y para restringir la longitud de onda de
la radiación de la fuente se emplean filtros. Dichos instrumentos son llamados
también colorímetros fotoeléctricos o fotocolorímetros.
Inicialmente se fabricaron fotómetros de un sólo haz y luego los fotómetros de
doble haz. Los segundos presentan la ventaja de que el haz de luz es dividido en
dos haces, y así uno de ellos pasa por la muestra y se dirige luego al detector,
mientras que el otro haz va a un segundo detector que sirve de referencia ya que
está ubicado a la salida de la lámpara. Este haz será la referencia de 0 absorbancia
(100% T), y servirá para establecer las lecturas de absorbancia con respecto a este
valor, independientemente de las fluctuaciones de la intensidad que experimente la
fuente de luz que alimenta el equipo, a diferencia de lo que ocurre con los
instrumentos de un sólo haz, en los que las variaciones de intensidad de luz de la
fuente no pueden ser percibidas y corregidas.
Desde el punto de vista eléctrico, por su funcionamiento, el fotómetro de doble haz
es un circuito potenciométrico, como lo vemos en la siguiente figura:
Figura 2. Esquema de un Fotómetro de doble haz (fotocolorímetro)
Básicamente, el dispositivo consta de una lámpara de wolframio, una lente para
suministrar un haz de luz paralelo, las dos células fotovoltaicas, que forman parte
del circuito potenciométrico y el espejo que divide al haz. Así el haz de luz atraviesa
por un lado la solución y llega al detector, mientras que el otro haz (100% T) es
dirigido a un segundo detector: la célula fotovoltaica de referencia. La intensidad
luminosa transmitida en ambos casos es transformada por las células fotovoltaicas
en señales eléctricas y la señal de la fotovoltaica proveniente del tubo de medida
es comparada con la señal de la fotovoltaica de referencia, por medio de un circuito
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potenciométrico.
Si se usa un filtro como selector de longitud de onda, se dispone sólo de luz
monocromática a longitudes de onda discretas y el instrumento se denomina
“fotómetro”. Si en cambio se dispone de un monocromador (esto es un prisma o
una red de difracción) como selector de longitudes de onda, el instrumento puede
proveer luz monocromática en un intervalo continuo de longitudes de onda y se
denomina “espectrofotómetro”. Lo analizamos en la siguiente sección.
Una clasificación básica de los instrumentos empleados en fotometría puede ser la
siguiente:
a- Espectrofotómetros
b- Fotómetros a filtro
c- Fotómetros a filtros interferenciales
d- Fotómetros espectrales
Estas distintas categorías, cada cual con su “pro” y su “contra” pueden analizarse
en base a dos características fundamentales:
A- Tipo de emisor
B- Tipo de monocromador
a- Cuando analizamos el tipo de emisor o fuente de energía radiante tenemos
que considerar dos categorías fundamentales:
I- Emisores discontinuos (lámpara de descarga gaseosa)
II- Emisores continuos (lámpara incandescente).
I- Con respecto a los emisores discontinuos, donde por lo general se trabaja en el
UV, las lámparas de descarga gaseosa más utilizadas son las de mercurio y
cadmio.
Estas lámparas de gases luminosos, al presentar determinadas λ (longitudes de
onda) espectrales, proporcionan un reducido número de λ de trabajo. No obstante
ello, aquí no es necesario un sistema monocromador como en el caso de las
lámparas incandescentes, lo que es una ventaja. Además, estas lámparas abarcan
una zona del UV donde se realizan una gran cantidad de medidas para reacciones
de tipo enzimático, determinaciones que son fundamentales en análisis clínicos.
II- Entre las lámparas incandescentes la más común es la de tungsteno, que
abarca un espectro de emisión desde 350 nm a 3,5 μm.
Como la lámpara de tungsteno emite la mayor parte de su energía en el IR
cercano, frecuentemente se inserta un filtro absorbente de calor entre la lámpara y
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el porta-muestras en el caso del fotómetro de filtro para poder absorber la mayor
parte de la radiación IR.
Las lámparas incandescentes, al proporcionar un espectro continuo, permiten
obtener un amplio rango de λ de trabajo, muy útil cuando se desea realizar distintas
determinaciones. Requieren de un eficiente sistema de monocromación para
seleccionar la λ para cada determinación en particular.
Las lámparas de tungsteno se emplean para mediciones en el visible y en el IR
cercano, mientras que para mediciones en el UV se utilizan lámparas de gases
luminosos.
b- Monocromadores
La calidad de monocromación de un aparato es de vital importancia y en este
sistema radica buena parte del precio de un fotómetro. Así, por ejemplo, en el
análisis enzimático y en las técnicas cinéticas en general, se requieren
determinaciones de diferencias de absorbancias generalmente pequeñas, a la λ
óptima, con gran precisión y veracidad. Por ello es fundamental una buena
monocromación.
El grado de monocromaticidad de un filtro o de un monocromador más refinado se
representa mediante la anchura de banda media. Esto se define como la amplitud
de longitud de onda transmitida a la mitad de la transmisión de la punta del filtro o
lo que equivale al intervalo de longitud de onda en la que la transmitancia es la
mitad de la máxima.
Figura 3. Anchura de banda media
Otros parámetros de monocromaticidad son: transmitancia a la longitud de onda
nominal y longitud de onda nominal que aparecen señalados en el esquema.
Así, la anchura de banda media es una medida de la pureza espectral de un
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monocromador.
Para determinar la absorción o emisión de energíaes necesario que se puedan
aislar las λ deseadas y excluir el resto de la fuente de energía radiante. Existen
numerosas vías para llevar a cabo este fin; veamos los dispositivos más utilizados:
I- Filtros
II- Prismas
III- Redes de difracción
I- Filtros: el dispositivo más sencillo es un filtro que generalmente está compuesto
de un metal disuelto o suspendido en vidrio. Por ejemplo, las sales de cromo darán
en el vidrio un color rojo, y las sales de cobalto darán un color azul.
Distintos tipos de filtros:
- Filtros de vidrio: Un filtro de vidrio no es realmente un monocromador, ya que
transmite una escala relativamente amplia de λ.
Su uso está muy extendido porque son perfectamente adecuados para numerosos
fines, los más empleados tienen una anchura de banda media de alrededor de 50
nm y un transmitancia % máxima del 20%.
Existen tres tipos de filtros de vidrio:
a- de paso de banda ancha
b- de delimitación neta de perfil puntiagudo
c- de paso de banda estrecha. Estos últimos se componen casi siempre de dos o
más filtros de perfil neto, con la intención de quitar la mayor cantidad de
radiaciones no deseadas. Así se puede usar un filtro neto para producir un filtro de
paso de banda estrecha. Veamos los distintos tipos en el esquema siguiente:
Figura 4. Distintos tipos de filtros de vidrio: a-
de paso de banda ancha, b- de delimitación
neta de perfil puntiagudo, c- de paso de
banda estrecha
- Filtros de interferencia: otro tipo de
filtro de paso de banda estrecha es el
filtro de interferencia que se compone
de un emparedado de dos piezas
medio plateadas de vidrio, con un
material dieléctrico entre ambas capas plateadas (ver figura). El principio es el
mismo que subyace en el juego de colores de una pompa de jabón, o sea la
interferencia. Cuando la luz blanca choca contra la fina película, es en parte
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reflejada en la superficie del frente de la película mientras que la que penetra en
ella es reflejada por la superficie interior. Éste último rayo ha viajado más que el
primero, una distancia igual a dos veces el espesor de la película. Si al salir, este
segundo rayo está en fase con el primero, la intensidad resultante será duplicada,
mientras que si se encuentra fuera de fase, la intensidad resultante es el resultado
de la destrucción de uno por el otro y no veremos luz. Por lo tanto, cuando la luz
blanca choca contra la película parte será aumentada y otra será disminuida,
formándose colores que vemos en una pompa. Así, volviendo al filtro, es el grosor
de la capa dieléctrica quien determina la λ que pasará a través de ella. Solamente
las λ que sean múltiplos de éste grosor, estarán en fase, y por lo tanto, emergerán.
Cualquier otra λ quedará bloqueada debido a las”diferencias de fase” existentes y
no será transmitida.
Figura 5. Esquema de la sección transversal de un filtro de interferencia.
Los soportes de vidrio están parcialmente plateados.
Estos filtros tienen una anchura de banda media muy estrecha de 5 a 10 nm. Se
emplean principalmente en fotometría de llama o en autoanalizadores. La máxima
transmitancia es del 40 al 60%.
- Filtros de interferencia de múltiples capas: Están constituidos por sucesivas capas
intercalándose capas de alto índice de refracción y de bajo índice de refracción.
Con éstos se obtiene un ancho de banda de 1 a 1,5 nm y una transmitancia del
70%.
- Cuñas de interferencia: Consisten en un par de placas especulares,
transparentes, separadas, en parte, por una capa de un material dieléctrico en
forma de cuña. La longitud de las placas es de 50 a 200 mm. La radiación varía de
forma continua. Si se escoge la posición lineal adecuada a lo largo de la cuña,
puede aislarse un ancho de banda de unos 20 nm.
II - Prismas:
Utilizan la refracción o desviación de la energía radiante para separar las distintas
longitudes de onda emitidas por fuentes de energía radiante como la lámpara de
tungsteno y las presentan como un espectro del que pueden seleccionarse las
longitudes de onda deseadas.
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Las longitudes de onda más cortas son desviadas o se refractan en grado menor
que las longitudes de onda más largas. Esto produce un espectro no lineal, con una
acumulación relativa de las longitudes de onda más largas. Además un prisma
produce un espectro curvo. Estas dos características inherentes al prisma
requieren unos dispositivos ópticos y mecánicos relativamente complejos para
seleccionar una posición espectral dada con una anchura de banda relativamente
pequeña.
Al no ser lineal el espectro producido, para certificar la calibración de las longitudes
de onda se deben controlar por lo menos tres longitudes diferentes cuando se
realiza en control de centro de banda.
En general se utilizan prismas de vidrio flint para visible y de sílice para UV.
III - Redes de difracción
Estas redes separan por difracción la mezcla de longitudes de onda.
¿Qué es una red de difracción? Es una superficie limpia y pulida, ópticamente
plana, en la que se han grabado, con un instrumento de diamante, un gran número
de surcos paralelos y muy próximos entre sí (donde se producirán las difracciones),
pudiendo variar estos de pocos centenares a varios cientos por pulgada,
dependiendo de la zona de trabajo. Cuantas más líneas o surcos por pulgada haya,
mayor será la dispersión de la red. Como esta red es muy cara se producen
réplicas que se hacen a partir de una red patrón mediante un proceso de moldeado
con una resina líquida que mantiene, de forma casi perfecta la exactitud óptica de
la red original en una superficie limpia de dicha resina.
¿Y qué es la difracción? Es el proceso por el cual un haz paralelo de radiación “se
curva” cuando pasa por un obstáculo puntiagudo o a través de una abertura
estrecha.
Figura 6.
Una red de difracción se basa en el
principio de que los rayos de luz se
desvían alrededor de un ángulo
agudo, dependiendo del grado de
inclinación, la longitud de onda
obtenida. Por lo tanto se produce
una gran cantidad de finos
espectros, uno por cada línea de
red que se ilumine con un rayo
constituido por muchas longitudes
de onda. A medida que las
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longitudes de onda emergen, dan lugar a la formación de frentes de ondas; donde
se corten éstos, las longitudes de onda en fase se reforzarán entre sí y las que no
están en fase se agotarán y desaparecerán, dejando un despliegue uniforme de
longitudes de onda bien dispuestas. La anchura de banda media en las redes
oscila entre 35 y 0,5 nm. Estas redes producen un espectro lineal a diferencia de
los prismas, por ello cuando se realiza el control de centro de banda deben
controlarse sólo dos longitudes de onda.
Dentro de las redes de difracción están las Redes holográficas: se basan en el uso
del rayo láser. Los rayos, procedentes de un par de láseres idénticos, inciden con
ángulos apropiados sobre una superficie vidriada recubierta con un material
fotorresistor. Las franjas de interferencias resultantes de los dos rayos sensibilizan
al fotorresistor de manera que éste pueda disolverse, dejando una estructura de
surcos que pueden recubrirse con aluminio u otra sustancia reflectora para dar
lugar a una red de reflexión. Estas redes son baratas y son utilizadas en los
aparatos actuales; generalmente se trabaja con copias de excelente fidelidad, con
respecto de la patron.
Las redes de difracción presentan un serio inconveniente: la luz parásita.
¿Y qué es la luz parásita? Podemos definirla como la energía radiante de las
longitudes de onda no deseadas que alcanza el detector, es decir, es la radiación
electromagnética “de longitud de onda distinta” a la seleccionada por el
monocromador que llega al detector, pasando o no por la muestra. O sea, es luz de
“distinto color” que la nominal.
La principal causa de luz parásita es originada en el monocromador, por difracción
de la luz incidente por suciedad o por imperfecciones en las superficies de la red de
difracción, yaque es el tipo de monocromador donde aparece con mayor
intensidad pues presentan miles de superficies ópticas a diferencia de los prismas
que tienen pocas caras y por lo tanto el porcentaje de luz parásita resulta ser
mucho menor. En general el porcentual de luz parásita es mayor en los extremos
del espectro visible. Así el efecto tiene más importancia alrededor de los 400 nm
(que es la zona más sensible) y de los 700 nm. Habría, debido al fenómeno de
difracción que permite obtener los espectros del visible en las redes de difracción,
una “superposición de extremos” de longitud de onda. Podríamos explicarlo como
la aparición de unos pocos fotones rojos en la zona de fotones azules y viceversa,
en la zona de fotones rojos aparecen unos pocos fotones azules.
Una forma de disminuir la luz parásita consiste en el uso de un monocromador
doble, pasando el rayo a través de dos monocromadores en serie se logra la
disminución del efecto, por ello en algunos aparatos se utilizan “prefiltros”.
Las redes holográficas, debido a su mayor perfección en la forma y dimensiones de
las líneas, dan espectros con menor radiación parásita.
Una vez analizados la fuente y el sistema de monocromación del equipo, los otros
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componentes son:
c- Tubos de lectura
También denominados cubetas, se pueden considerar dos tipos: cuadradas y
redondas.
Redondas: fueron muy usadas y adecuadas para la mayoría de los fines en
análisis clínicos. Por su forma tienen errores variables de refracción y reflexión
(como una lente); además, el espesor en general no es uniforme y presentan una
superficie irregular por no estar pulidas. Por todo esto, lo más aconsejable es usar
siempre un mismo tubo y orientarlo siempre de la misma forma.
Cuadradas: tienen la ventaja de tener las caras ópticas plano-paralelas y una vía
luminosa constante. Carecen generalmente de aberraciones ópticas tales como el
efecto de la lente y los errores variables de refracción. Las hay de cuarzo, que son
muy caras y de plástico que son más económicas pero que se pueden rayar con
más facilidad. Igualmente, para trabajar en el UV se utilizan las de cuarzo, pues el
plástico absorbe en esta región del espectro.
Por otra parte, las cubetas se ofrecen en tres versiones: normal, semimicro y
micro. Esto posibilita el uso de volúmenes de lectura que van desde 3 ml hasta
sólo 50 μl. Debe tenerse en cuenta que el volumen mínimo de lectura depende no
sólo del tipo de cubeta usada, sino también de la ubicación y tamaño de la rendija
por donde el aparato emite el haz de luz.
d- Portacubetas
Hay equipos que tienen portacubetas para sólo una cubeta o tubo de medida; otros
tienen tres portacubetas para poder leer siempre contra blanco y testigo, o bien dos
muestras sucesivas.
También existen equipos que permiten regular la temperatura a la que se realizan
las determinaciones. Hay además aparatos que presentan la posibilidad de
termostatización a través de un sistema de tubos por donde circula agua; o
temostatización en seco por medio de un sistema “Peltier”. Este sistema es
fundamental en análisis clínicos, para determinaciones enzimáticas.
e- Tipo de lectura y salidas accesorias
La lectura de absorbancia o transmitancia % se realizaba tradicionalmente en
forma analógica (escala con aguja). Para lograr una mejor lectura en los equipos
analógicos, entre ambas escalas hay un espejo, para que al hacer la medida evita
el error de paralaje (no se debe apreciar sombra de la aguja).
Los espectrofotómetros actuales tienen salida digital bajo tres formatos:
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Absorbancia, Transmitancia o concentración.
También hay equipos provistos de conexiones o interfases para PC, impresora,
graficadora, etc.
f – Detectores
La energía electromagnética puede detectarse transformándola en energía
eléctrica. Para llevar a cabo dicho mecanismo se utiliza un transformador de
energía, este puede ser una celda fotovoltaica, un tubo fotoemisor o un detector de
estado sólido.
Las celdas fotovoltaicas no requieren de una fuente externa de voltaje, sino que se
basan en el paso de electrones internos para producir una corriente en un circuito
externo. Son sensibles entre los 400 y 800 nm. Son más sensibles para las
longitudes de onda mayores y las fallas se perciben en las longitudes de onda más
cortas. Estas células tienden a perder cierto grado de sensibilidad en los primeros 5
a 10 minutos de la operación, y después quedan bastante estables, a medida que
alcanzan el equilibrio térmico.
Los tubos fotoemisores están conectados a una fuente de suministro de energía
externa. La principal característica es que son de elevada sensibilidad con bajos
niveles de energía.
Los detectores de estado sólido están constituidos por materiales semiconductores.
Son muy sensibles y trabajan en un rango muy amplio de longitudes de onda:
desde los 330 a los 990 nm. Son muy pequeños, baratos y no presentan los
habituales problemas en presencia de humedad que tienen los fototubos; tampoco
necesitan una estabilización prolongada para realizar las primeras lecturas. Son los
que se utilizan en los aparatos actuales.
g- Rendijas
Las rendijas de un monocromador juegan un papel importante para determinar las
características de funcionamiento y calidad del monocromador.
Hay dos rendijas: la de entrada y la de salida. La rendija de entrada sirve como
colimador de radiación: enfoca la luz sobre la red de difracción o prisma sobre el
cual puede ser dispersada a partir de un mínimo de luz directa. La rendija de salida
determina el ancho de banda de la luz seleccionada del espectro de dispersión.
Aumentando el ancho de la rendija de salida, el ancho de banda de la luz
emergente se hace más amplio, con lo cual aumenta la intensidad de la energía
pero disminuye la pureza espectral.
En los monocromadores de red de difracción, en general las dos rendijas tienen el
mismo ancho. Por el contrario, los monocromadores a prisma tienen ranura de
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salida variable. Existe una relación entre la resolución del monocromador y el
ancho de las rendijas: a menor ancho de rendija, mayor resolución del
monocromador.
Instrumentos espectrofotométricos empleando radiación ultravioleta y visible:
En el comercio se encuentran varios modelos de espectrofotómetros que operan en
la región visible del espectro, algunos de éstos pueden ser usados también en la
región del UV, equipados con óptica de cuarzo y fototubos sensibles a esta
radiación. Dentro de estos instrumentos, hay una gran variedad que no sólo
depende de la región de longitudes de onda que cubren, sino también de la calidad
de los componentes, de las características de manejo y por ende diferente costo.
Veamos ahora un esquema básico de un espectrofotómetro de simple haz que
trabaja entre 350 y 650 nm.
El sistema monocromador consiste en una red de difracción, lentes y un par de
rendijas fijas. Debido a que la red produce una dispersión que es independiente de
la longitud de onda, se obtiene una anchura de banda constante de 20 nm a lo
largo de toda la región en que opera.
Figura 7. Esquema interno de un Jenway 6300
El instrumento emplea un sólo fototubo. Su salida es amplificada y utilizada para
mover el indicador de un medidor calibrado en términos de T y A.
Para seleccionar la longitud de onda con la cual se va a trabajar se varía la
posición de la red por medio de un brazo que sale del selector de longitudes de
onda, pasando la λ (longitud de onda) elegida por la ranura de salida.
La luz monocromática obtenida atraviesa el tubo que contiene la muestra e incide
en el fototubo. Allí la energía luminosa es convertida en una señal eléctrica
amplificada.
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Cuando se retira la muestra del equipo, cae automáticamente un oclusor en el
camino de la luz que impide que la luz llegue al fototubo cuando no hay muestra.
Justamente este mecanismo se usa para determinar el 0%de transmitancia.
Mediante un obturador mecánico se procede a un “apantallamiento” del detector:
una placa de metal tapa al detector impidiendo la llegada de luz a éste y
consecuentemente se obtiene una lectura de 0% de transmitancia (lo que
corresponde a infinito de absorbancia).
En ausencia de radiación muchos detectores presentan una pequeña “corriente
oscura”, por lo tanto, el ajuste de 0% de transmitancia se produce mediante la
aplicación de una señal opuesta de tal magnitud que dé una lectura de cero en la
escala; ello se logra con la perilla de cero T. Si por medio de la correspondiente
perilla “control de cero” no puede llevarse a cero de transmitancia, ello significa que
entra luz por algún lado al aparato, y se detecta mediante la medida de luz espuria
Para que la lectura directa en el equipo se realice en T es básico realizar estos dos
ajustes: 0 y 100% de T.
En los espectrofotómetros Jenway estos controles se realizan oprimiendo las teclas
correspondientes.
Hasta acá hemos visto los componentes básicos de los espectrofotómetros, sus
características y la función que cumplen. Existen muchas variantes de estos
equipos, pero el fundamento sobre el que operan es siempre el mismo.