CEBI-A4-3

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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN 
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL 
FCEyN-INTI 
Materia de Articulación CEBI_A4
Química Biológica 
Docente a cargo:Marta Blanca Mazzetti
CEBI_A4_3 : Enzimas
Enzimas
Un poco de historia…
Se reconocen catalizadores biológicos al 
estudiar la degradación de carnes por 
secreciones estomacales
Se observa conversión de almidón a azúcar 
1700s
1800s Se observa conversión de almidón a azúcar 
por saliva y extractos vegetales 
La fermentación de azúcar a alcohol 
por levaduras es catalizada por 
fermentos que son inseparables de 
las células vivas de levadura
1800s
1850s
Un poco de historia…
Buchner: extractos de levaduras pueden 
fermentar azúcar a alcohol
Sumner: aísla y cristaliza ureasa ⇒ todas las 
1897
1926
ENZIMAS (Gk enzymos = levado)Kühne
Sumner: aísla y cristaliza ureasa ⇒ todas las 
enzimas son proteínas
Pepsina, tripsina y otras enzimas digestivas 
se aíslan y cristalizan y son proteínas
1926
1930s
1930s Haldane: interacciones débiles entre enzima 
y sustrato podrían usarse para catalizar 
reacción
Los Protagonistas…
¿ Qué sabemos hoy de las enzimas ?
� Exceptuando las ribozimas, son todas proteínas
� Actividad catalítica requiere proteína nativa
� Tamaño muy variable: PM entre 104 - 106
� Algunas requieren componente químico adicional 
para su actividad
COFACTOR o COENZIMA
Algunos cofactores son iones metálicos…
…Otros son moléculas orgánicas complejas
Coenzimas que transfieren Coenzimas que 
COENZIMAS
Coenzimas que transfieren 
grupos de átomos
Coenzimas que 
transfieren electrones
Coenzimas que transfieren electrones
Coenzimas que transfieren grupos de átomos
Muchas coenzimas son 
metabolitos de las vitaminas
¿ Qué son las vitaminas ?
� Compuestos que son esenciales para la 
salud y que no pueden ser sintetizados por el 
organismo
� Deben ser incorporados en la dieta� Deben ser incorporados en la dieta
� Su deficiencia genera enfermedades por carencia
� Se dividen en dos grupos de acuerdo con 
su solubilidad
Vitaminas Liposolubles
Vitaminas Hidrosolubles
Vitaminas HidrosolublesVitaminas Hidrosolubles
Volvamos a nuestras enzimas…Volvamos a nuestras enzimas…
Clasificación de enzimas…
E.C.w.x.y.z.
Un ejemplo…la hexoquinasa
ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa-6-fosfato
E.C.2.7.1.1.E.C.2.7.1.1.
transferasa
fosfotransferasa
P-transferasa con HO como aceptor
D-glucosa como aceptor del P 
Las enzimas son catalizadores extraordinarios 
� Condiciones de funcionamiento
� Especificidad
� Magnitud de la aceleración de la velocidad de reacción
¿ Cómo funcionan las enzimas ?¿ Cómo funcionan las enzimas ?
S
ST
Energía Libre (G)
E
n
e
rg
ía
 re
q
u
e
rid
a S
P
Dirección de Reacción
E
n
e
rg
ía
 re
q
u
e
rid
a
T = Estado de transición
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166
E S+ P+SE E
¿Qué pasa en presencia de una enzima?
E S+ P+SE E
La enzima estabiliza el Estado de Transición 
EST
ST
Cambio en Energía
E
n
e
rg
ía
 re
q
u
e
rid
a
 (n
o
 ca
tá
lisis)
E
n
e
rg
ía
 d
ism
in
u
ye
 (ca
tá
lisis)
S
P
ES
ES
EP
Dirección de Reacción
E
n
e
rg
ía
 re
q
u
e
rid
a
 (n
o
 ca
tá
lisis)
E
n
e
rg
ía
 d
ism
in
u
ye
 (ca
tá
lisis)
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166
¿ Cómo lo logra ?
Sitio activo
El sitio activo…El sitio activo…
�� Proporciona una superficie catalíticaProporciona una superficie catalítica
�� EEstabiliza estado de transiciónstabiliza estado de transición
�� Transforma el estado de transición en productoTransforma el estado de transición en producto
B
BA Superficie catalítica
A
Juang RH (2004) BCbasics
¿ Cómo estabiliza el sitio activo el estado de transición ?
Posee grupos reactivos+
Evita influencia del agua
-
Juang RH (2004) BCbasics
Optimiza interacción con S
La enzima no es perfectamente 
complementaria al sustrato sino al 
estado de transición
(Linus Pauling, 1946)
X
Ajuste inducido
(Koshland, 1958)
Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252
Hexoquinasa
D-glucosa
El sitio activo…El sitio activo…
�� Proporciona una superficie catalítica
�� Estabiliza estado de transición
�� Transforma el estado de transición en producto
B
BA Superficie catalítica
A
Juang RH (2004) BCbasics
Cinética EnzimáticaCinética Enzimática
Orden 0
VoV
[S]
Orden 1
ES
Otra vez un poco de historia…
Victor Henri: reacción E + S → ES etapa 
necesaria en catálisis enzimática
Michaelis y Menten: Teoría General de la 
Catálisis Enzimática 
1903
1913
Las condiciones de M-M
E + S ES
k
1
k
2
E + P
k
3
k
4
rápida lenta*
ESTADO ESTACIONARIO: producción y consumo 
del complejo ES proceden a la misma velocidad ⇒
se mantiene constante la concentración de ES
S P
C
o
n
ce
n
tra
ció
n
E
ES
Tiempo de reacción
C
o
n
ce
n
tra
ció
n
Juang RH (2004) BCbasics
ET
EE
Vo
Vm
Vo = Vm
Vo = Vm [S]
[S]
½ Vm
Km
Vo = Vm [S]
Km
Vo = Vm [S]
Km + [S]
Y siguiendo con la hexoquinasa…
Glucosa + ATP → Glc-6-P + ADP
Glucosa Alosa Manosa
CHO
H-C-OH
HO-C-H
CHO
H-C-OH
H-C-OH
CHO
HO-C-H
HO-C-H
Km = 8 8.000 5 mM
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
Juang RH (2004) BCbasics
Cinética MichaelianaCinética Michaeliana
Vo
Vm
Vo = Vm
Vo = Vm [S]
[S]
½ Vm
Km
Vo = Vm [S]
Km
Vo = Vm [S]
Km + [S]
¿ Qué pasa con MM cuando la reacción catalizada tiene más de un 
sustrato ?
ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa-6-fosfato
Distintos mecanismos posibles…
¿Cómo hacemos en la 
práctica para obtener práctica para obtener 
Vm y Km?
Recopilando…
1)1) Usar una cantidad definida de Enzima → E
2)2) Agregar sustrato en varias concentraciones → S
3)3) Determinar Producto a Tiempo Fijo (P/t) → v
o
4)4) Estimar Vmax yKm
Vmax
Km S
v
o
1/S
1
v
o
Doble recíproca
Gráfico Directo
1
Vmax
- 1 
Km
1/2
Ju
a
n
g 
R
H
 (
2
0
0
4
) 
B
C
b
a
si
cs
¿Cómo medimos la cantidad de 
enzima?
UNIDAD ENZIMÁTICA
UNIDAD ENZIMÁTICA (UE)
Cantidad de enzima que cataliza formación de determinada 
cantidad de producto en la unidad de tiempo, en 
condiciones de velocidad máxima 
UE
Actividad
Específica = Proteína (mg)Específica
=
¿Cómo puedo comparar la 
eficiencia de distintas eficiencia de distintas 
enzimas?
E + S ES E + P
k
2
k
1 k3
En condiciones saturantes Vm = k3 ETEn condiciones saturantes Vm = k3 ET
k catalítica
Número de recambio
Algunos ejemplos…
kcat / km
Constante de especificidad
Inhibición de la 
actividad enzimática
Algunos inhibidores son irreversibles…
Se unen covalentemente (o no) o 
destruyen grupo funcional clave para 
catálisis
Inhibidores suicidas
Diseño racional de fármacos
Un ejemplo real…la Enfermedad del Sueño
Trypanosoma brucei
Inhibidor suicida de la Ornitín decarboxilasa
primera enzima en biosíntesis poliaminas 
Difluorometilornitina
¡¡¡Y otros inhibidores son 
evidentemente reversibles!!!!!
Existen distintos tipos de inhibición 
reversible…
I
I
S
S
S IIII
IIII
IIII II
S
Competitiva No-competitiva Incompetitiva
E
E
Compite por 
Sustrato
D
ib
u
jo
 G
u
ía
E
I
S
IS
Sitio diferente
Compite por 
Sitio activoInhibidorD
ib
u
jo
 G
u
ía
E
cu
ac
ió
n 
y 
D
es
cr
ip
ci
ón
[II] se une a [E] libre solo,
y compite con [S];
aumento de [S] elimina
la Inhibición por [II]. 
[II] se une a [E] libre o [ES] 
complejo; aumento de [S] no
elimina [II] inhibición.
[II] se une al [ES] complejo 
Solo; aumento [S] favorece
la inhibición por [II].
E + S→ES →E + P
+
II
↓
EII
←
↑
E + S→ES →E + P
+ +
II II
↓ ↓
EII+S→EIIS
←
↑ ↑
E + S→ES →E + P
+
II
↓
EIIS
←
↑
I
Inhibición Reversible
IIII II
Competitiva No-competitiva Incompetitiva
G
rá
fic
o
 D
ir
e
ct
o Vmax Vmax
v
o
v
o
II II
Vmax
II
Vmax’Vmax’
Km
G
rá
fic
o
 D
ir
e
ct
o
D
o
b
le
 R
e
cíp
ro
ca
Km Km’ [S], mM [S], mM Km [S], mMKm’
Vmax no cambia
Km aumenta
Vmax disminuye
Km no cambia
Vmax & Km disminuyen
II
1/[S]1/Km
1/v
o
1/Vmax
IIII
1/v
o
1/Vmax
1/[S]1/Km 1/[S]1/Km
1/Vmax
1/v
o
= Km’
Una aplicación clínica y curiosa de la inhibición 
competitiva…
¡ Emborrachar a los individuos intoxicados con metanol !
�
Alcohol
deshidrogenasa
metanol Formaldehído �
deshidrogenasa
etanol es inhibidor competitivo
Infusión lenta y continuada de etanol ☺
Otra aplicación clínica importante de la inhibición 
competitva: las sulfamidas
-COOHH2N-
Precursor
Acido
fólico
Acido p-aminobenzoico (PABA)
Bacterias necesitan 
PABA para 
-SONH2H2N-
Precursor fólico
Sulfanilamida
biosíntesis de ácido 
fólico
Estructura similar al PABA, 
inhibe el crecimiento bacteriano.
Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197
Cinética Michaeliana: Resumen
v
o
= Vmax [S]
K
m
+ [S]
&
1er orden
Orden cero
Directo
k
cat
Número de
recambio
k
cat
/K
m
Significa:
K
m
V
max &
Competitiva
No-competitiva
Incompetitiva
Doble recíprocaAfinidad con
substrato
Velocidad
Máxima In
h
ib
ició
n
k
3
[Et]
UE
1 µmol
min
Juang RH (2004) BCbasics
Grupos específicos en el sitio activo contribuyen a la catálisis a través de 
distintos mecanismos
� Catálisis covalente
� Catálisis con ión metálico� Catálisis con ión metálico
� Catálisis ácido-base
Catálisis ácido-base
Asp102
His57
Ser195
Tríada CatalíticaTríada Catalítica
HH
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A1
NC[HOOC] C C [NH ]
O
N
C
C
N
[HOOC]
H
O
C
C
N
C
C
[NH2]
Chequear especificidad de sustrato
Asp102
His57
Ser195
HH
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A2
O
Primer Estado de Transición
H
H
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A3
O
Intermediario Acil-Enzima
H
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D1
O
Intermediario Acil-Enzima Agua
H
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D2
O
O
Segundo Estado de Transición
O
H
H
Mecanismo de Catálisis de Quimotripsina D3
O
OO
H
Des-acilación
C
arga en el Sitio A
ctivo
Ser
195
His 57
Asp 102
H–O–CH2
O
C–O -
=
H–N N
C C
C
H
H
CH2
A
d
a
p
te
d 
fr
o
m
 A
lb
e
rt
s 
e
t 
a
l (
2
0
0
2
) 
M
o
le
cu
la
r 
B
io
lo
gy
 o
f t
h
e
 C
e
ll 
(4
e
) 
p
.1
5
8
Ser Activa
Ser
195
His 57
Asp 102
-O–CH2
O
C–O–H
=
N N–H
C C
C
H
H
CH2
A
d
a
p
te
d 
fr
o
m
 A
lb
e
rt
s 
e
t 
a
l (
2
0
0
2
) 
M
o
le
cu
la
r 
B
io
lo
gy
 o
f t
h
e
 C
e
ll 
(4
e
) 
p
.1
5
8
Catálisis Acido-Base
(2
0
0
0
) 
L
e
h
n
in
ge
r 
P
rin
ci
p
le
s 
o
f 
B
io
ch
e
m
is
tr
y 
(3
e
) 
p
.2
5
2
Induce el estado de transición
O
N
H
+
Catálisis
Acido-base Catálisis
Acida
A
d
a
p
te
d 
fr
o
m
 A
lb
e
rt
s 
e
t 
a
l (
2
0
0
2
) 
M
o
le
cu
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r 
B
io
lo
gy
 o
f t
h
e
 C
e
ll 
(4
e
) 
p
.1
6
7
N
H
+
Especificidad
H
O
H
A
d
a
p
te
d 
fr
o
m
 N
e
ls
o
n
 &
 C
o
x
(2
0
0
0
) 
L
e
h
n
in
ge
r 
P
rin
ci
p
le
s 
o
f 
B
io
ch
e
m
is
tr
y 
(3
e
) 
p
.2
5
2
C
O
=
N
H
H
C
H
N
H
C
- OOH
O
H
-δ
+δ
H
O
H
C
O
=
N
H
H
C
H
C
O
=
N
H
H
C
H
C
O
=
N
H
H
C
H
Lenta Rápida Rápida Muy rápida
Catálisis
Básica
Ambas
A
d
a
p
te
d 
fr
o
m
 A
lb
e
rt
s 
e
t 
a
l (
2
0
0
2
) 
M
o
le
cu
la
r 
B
io
lo
gy
 o
f t
h
e
 C
e
ll 
(4
e
) 
p
.1
6
7
N
H
C
- OO
H
O
H
Mecanismo Concertado de Catálisis
3 4
O-
H
+ H
COO-
(270)
Glu
(248)
Tyr
O-
H
Carboxipeptidasa A
SITIO
ACTIVO
SITIO
ACTIVO
Sitio para
especificidad
Bolsillo
del Sitio
Activo
NC
1
2
5
O
His
(196)
His (69)
Glu
(72)
+Arg (145)
C-terminal
Chequear por
C-terminal
Cadena
peptidica del
Sustrato
RNCN C
COO-
O-
C
2+
Zn
Ju
a
n
g 
R
H
 (
2
0
0
4
) 
B
C
b
a
si
cs
O O
N–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C
R H R’
Quimotripsina Tiene Un Sitio de Especificidad
O -
CC
Ser
Sitio ActivoSitio Activo
Sitio de
Especificidad
Sitio de
Especificidad Sitio Catalítico
Juang RH (2004) BCbasics
Especificidad de la Familia de Ser-Proteasas
Tripsina Quimotripsina Elastasa
corta en Lys, Arg corta en Trp, Phe, Tyr corta en Ala, Gly
B
o
ls
ill
o
 P
ro
fu
n
d
o
 y
 C
a
rg
a
d
o
O O
–C–N–C–C–N–
C
C
O O
–C–N–C–C–N–
C
O O
–C–N–C–C–N–
CH3
COO-
C
Asp
COO-
C
Asp
Sitio Activo
Bolsillo No-polar
B
o
ls
ill
o
 P
ro
fu
n
d
o
 y
 C
a
rg
a
d
o
N
e
g
a
tiv
a
m
e
n
te
Bolsillo Poco Profundo
y
no-polar
C
C
C
NH3
+
CH3
Ju
a
n
g 
R
H
 (
2
0
0
4
) 
B
C
b
a
si
cs
Especificidad Espacial
D
A
sp3
B
C
D
B
C
DB
C
Estos dos triángulos 
no son idénticos
La estructura tetrahédrica
de los orbitales del carbono
tiene una tensión estérica
que conforma la unidad
base de la conformación
proteica
Juang RH (2004) BCbasics
Superficie Enzima
Enzimas 
Regulatorias
Retroalimentación negativa
Enzimas 
Alostéricas
Gk: allos = otros
steros = forma
Enzimas Alostéricas
�Proteínas multiméricas y complejas
�Modulador y S se unen a distintas subunidades
�Unión modulador produce cambio conformacional que altera 
�Modulador puede ser positivo o negativo
�Un sitio específico para cada modulador
actividad enzimática
�Modulador puede ser el mismo S (homotrópico) 
o no (heterotrópico)
Un ejemplo real: aspartato transcarbamilasa
12 cadenas polipeptídicas
2 clusters catalíticos con 3 cadenas
3 clusters regulatorios con 2 cadenas
Enzima Alostérica Aspártico transcarbamilasa
+
Forma Activa relajada
ATCasa
COO-
CH2
HN-C-COO-
H H
-
--
-
O
H2N-C-O-PO3
2-
=
O
H2N-C-
=
COO-
CH2
N-C-COO-
H H
-
--
-
AspartatoCarbamil
fosfato
Carbamil aspartato
Forma tensa Inactiva
ATCasaH H H H
ATP
CTP
Metabolismo
Nucleicos
Feedback 
inhibición
CTP
CTP
CTP
CTP
CTP
CTP
Juang RH (2004) BCbasics
Cinética alostérica
Cooperatividad
Dos modelos para explicar este comportamiento…
Concertado
(Monod)
Ajuste inducido
(Koshland)
2 formas R y T en equilibrio que 
se desplaza a un lado u otro 
según presencia modulador 
1 forma única que va ajustando su 
actividad de acuerdo con entrada 
modulador
S y modulador + sólo se unen a R
Modulador – sólo se une a T
El modulador puede afectar K0.5…
El modulador puede afectar Vm…
Volvamos a la ATC…
E
fe
cto
 C
u
rva
 S
ig
m
o
id
e
a
 
Efector positivo (ATP)
lleva curva sigmoidea 
a hiperbólica
Efector Negativo 
(CTP) mantiene 
CTP
ATP
v
v
o
Si exageramos 
la curva 
sigmoidea
Vemos el punto
On/Off 
claramente 
Una enzima alostérica 
puede “detectar” la 
concentración en el 
ambiente y ajustar su
actividad 
v
o
[Sustrato]
Off On
Juang RH (2004) BCbasics
Enzimas reguladas por 
clivaje proteolítico
�Proteólisis expone sitio activo
�Regulación irreversible
�Se necesita otro mecanismo para inactivar
Inhibidor que se une fuertemente a sitio activo
Enzimas reguladas por 
modificación covalente
Grupos de átomos unidos o removidos generalmente 
por otras enzimas
Fosforilaciones catalizadas por proteín quinasas 
específicas
Fosforilación tiene que ser reversible
Fosfo proteín fosfatasas
Un ejemplo: la glucógeno fosforilasa
(glucosa)n + Pi → (glucosa)n-1 + glucosa-1-P
A veces una misma enzima tiene varios sitios de 
fosforilación
(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P
GP
(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P
GS
Rápida Respuesta a Concentración 
Azúcar en Sangre
Glucógeno fosforilasa Glucógeno sintasa
A
ct
iv
id
a
d
 E
n
zi
m
á
tic
a
A
ct
iv
id
a
d
 E
n
zi
m
á
tic
a
0 2 4 6 8
Tiempo (min)
Glucosa
Adapted from Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.597