CURSO-virtual-FFyB-2021-4ta-clase

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ELECTROFORESIS CAPILAR
Métodos y aplicaciones
Nora M. Vizioli
Modos de operación en CE
Comparación con cromatografía líquida
Cromatografía líquida Electroforesis 
Elución: separación basada en la partición entre una 
fase móvil y una fase estacionaria. Fase reversa, 
intercambio iónico, fase normal, interacción 
hidrofóbica
Elución : separación basada en la diferencia de 
velocidad por zonas. 
CZE: Electroforesis capilar zonal; MEKC: cromatografía 
electrocinética micelar; CEC: electrocromatografía
capilar.
Tamiz molecular: separación basada en el movimiento 
a través de una fase estacionaria según forma y 
tamaño. 
Cromatografía de exclusión (SEC)
Tamiz molecular: separación basada en el movimiento 
a través de una fase estacionaria o inmovilizada (gel) 
según forma y tamaño. 
Electroforesis capilar en geles (CGE)
Cromatografía de enfocado: separación basada en 
gradiente de pH generado por una fase móvil a través 
de una fase estacionaria de intercambio iónico.
Isoelectroenfoque capilar (CIEF): separación por el 
movimiento a través de una gradiente estacionario de 
pH en el buffer de corrida.
Cromatografía de desplazamiento: separación basada 
en la movilización de una zona de fuerte adsorción 
(desplazador) a través de una fase estacionaria. La 
moléculas de la muestra se mueven como zonas al 
frente del desplazador con la velocidad del solvente.
Isotacoforesis capilar (CITP): separación basada en la 
movilización de un gradiente de campo eléctrico entre 
un electrolito líder y uno terminal haciendo que todas 
la moléculas de la muestra se muevan como zonas 
conectadas con concentración constante y a la misma 
velocidad.
Urinary Porphyrins
Weinberger et al, J. Chromatogr. 516 (1990) 271
A) CZE, B) Gradient RPLC
Uroporphyrin
Weinberger and Lurie
Anal. Chem. 63 (1991) 
823
Para empezar, formular preguntas…
• ¿Es el analito soluble en agua y en la mayoría de los electrolitos en 
concentraciones de hasta 1 mg/mL?
• Si no es totalmente soluble en agua, ¿se solubiliza con pequeñas 
cantidades (hasta 25% v/v) de metanol o acetonitrilo?
• Las moléculas pequeñas y neutras se solubilizan con SDS 100 mM?
• Para una muestra de proteínas, ¿se soluciona el problema con urea 7 M 
o un agente dispersante como etilenglicol?
• ¿El soluto es ionizable (pKa)?
• ¿Se encuentra en una mezcla?¿Cuántos componentes se esperan y en 
qué concentración?
Diagrama tentativo de elección de un 
método por CE
Solubidad
¿Carga?
¿Cromóforo?
CZE c/UV indirecta o 
˂200 nm
CZE, MEKC MEKC, CEC Derivatizar
¿Cromóforo?
Sí
Sí SíNo No
No
Aplicaciones
• Drogas básicas en sangre total
Condiciones: 
Capilar: 60 cm (50 cm al detector) 75 µm 
d.i. sílica fundida
BGE: fosfato 100 mM pH 2,38
Inyección: 10 kV, 16 s
Corrida: 18 kV, 25°C
Detección: 200 nm
a) Estándares en agua pura
b) Extracto de sangre porcina con 10 
ng /mL de cada droga
c) Blanco con 50 ng/mL de metoxamina
(estándar interno)
Aplicaciones
Alimentos
Aplicaciones
Alimentos
Aplicaciones
Alimentos
Aplicaciones
Alimentos
Aplicaciones
Alimentos
Aplicaciones
Alimentos
Análisis farmacéutico
Electrocromatografía quiral
Ciclodextrinas altamente sulfatadas
Enantiómeros de (A) terbutalina, (B) salbutamol, 
y (C) bambuterol separados en el mismo sistema 
empleando HS-β-CD.
5.00 10.00
1.0
2.0
A
b
so
rb
an
ce
 (
A
U
, 
x
1
E
+
0
0
4
)
Time (min)
Res = 23.4
CH3
NH2
Separación de enantiómeros de 
anfetamina usando ciclodextrinas
altamente sulfatadas.
Aplicaciones de separaciones quirales
Aplicaciones de separaciones quirales
Pseudoefedrina en 5% de HS-
γ-CD
Amina en desarrollo usando HS-γ-CD
Otros selectores quirales utilizados: antibióticos, crowns, celulosa derivatizada, 
proteínas, ácidos biliares, etc.
Control de calidad de heparinas
De: PACE Setter Online
Análisis de heparina (calidad Eur.Ph.) 
marcada con 0 y 0,2% (p/p) de OSCS.
El asterisco indica el pico de OSCS. 
BGE: Tris-fosfato 850 mM (pH 3.0). 
Concentración de muestra: 50 mg/mL
Capilar: 25 μm id x 60 cm longitud.
Temperatura: 35°C
Introducción de muestra: 2.0 psi, 48 s
Muestra de heparina 
contaminada H1
Muestra de heparina 
contaminada H2
SDS-PAGE
ͯ Manual y tedioso
ͯ Toxicidad de reactivos
ͯ Pobre precisión
ͯ Pobre resolución
ͯ Semi-cuantitativo
CE-SDS
✓ Automatizado
✓ Alta precisión
✓ Alta resolución
✓ Cuantitativo
Pureza de anticuerpos
Minutes
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5
0.06
0.07
0.08
0.09
0.10
0.11
0.12
10K
20K
35K
50K
100K
150K
225K
r= 0.999332
35.0
Separación de estánadares de peso molecular
CE-SDS - IgG en condiciones reductoras (UVabs @ 220nm)
usando un kit para cSDS-gel
Minutes
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
A
U
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
5
432
6
1
4
3
1
5
6
2
Pureza de anticuerpos
Pureza de anticuerpos
LC: cadena liviana
NG: cadena pesada no glicosilada
HC: cadena pesada
10 kD: estándar interno
Condiciones Reductoras Condiciones No-reductoras
Heterogeneidad de carga
• Importancia:
• Existen modificaciones en las isoformas de la proteínas debidas a la 
inestabilidad que pueden causar cambios en su pI
• Desamidación: amidas neutras pasan a carboxilo (-)
• Glicosilación, fosforilación
• Métodos tradicionales:
– Isoelectroenfoque en geles
– Cromatografía de intercambio iónico (IEX)
• Separa por relación carga/ radio hidrodinámico
Análisis rápido de heterogeneidad de carga por CZE
ánodo cátodo
Minutes
23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5
A
U
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
UV - 280nm
Neutral Lot4_New Capillary-SLS-Day 1-CIEF_IgGNIST-Raptor
Minutes
8.25 8.50 8.75 9.00 9.25 9.50 9.75
A
U
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
PDA - 214nm
NIST 1 mg_mL NIST conditions 40 cm effective length 0_03Tween20
CZE cIEF
Isoelectroenfoque capilar (cIEF)
Separación por punto isoeléctrico (pI)
Anolyte
H3PO4
4 5 6 7 8 9 10
8 95
Catholyte
NaOH
100
OH -H3O
+
pH Gradient
cIEF
Minutes
22 24 26 28 30 32 34 36
A
U
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
UV - 280nm
Neutral Lot4_New Capillary-SLS-Day 1-CIEF_IgGNIST-Raptor
pI 10,0
pI 9,5
pI 4,1
CZE – Determinación de isoformas de EPO
Fast N-Glycan Sample Prep for CE-LIF Analysis
Preparación de muestra en 60 minutos
DB 7.71
10.018
8.78
9.13
FA2BG2S2
• Elucidación estructural basada en la base de datos GU
Fast N-Glycan Sample Prep for CE-LIF Analysis
CESI – Integra CE con ionización por electrospray (ESI)
CE-MS
• Eficiencia de ionización mejorada y supresión iónica reducida
Referencias
• J. Landers, ed. Handbook of Capillary and Microchip Electrophoresis and 
Associated Microtechniques, CRC Press, Taylor and Francis, 2008.
• N.A. Guzman, ed. Capillary Electrophoresis Technology, Chromatographic
Science Series Vol. 64, Marcel Dekker, 1993.
• P/ACE Setter The worlwide newsletter for capillary electrophoresis. 
https://wsrprd.beckmancoulter.com
• www.sciex.com ˃ ce features and benefits
• High Performance Capillary Electrophoresis, Agilent Technologies, 2014.
• www.agilent/chem/CE
• www.lumexinstruments.com ˃ Capillary Electrophoresis System