Cromatografia de líquidos: métodos e parâmetros

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MÉTODOS DE SEPARACIÓN
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Dra. Araceli Peña Alvarez
M. en C. Aranys Borja Urzola
2019
¿Cómo ocurre el proceso cromatográfico en la 
cromatografía de líquidos?
La fase móvil (un líquido) circula en contacto con
la fase estacionaria ( sólido u otro líquido
inmiscible). Los analitos se mezclan con la fase
móvil y avanzan a través del sistema a una velocidad
que depende de la afinidad que tengan por cada
una de las fases (móvil y estacionaria)
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Soluto A
R
e
s
p
u
e
s
t
a
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PÁRAMETRO FÓRMULA DEFINICIÓN
Tiempo de 
retención
tR
Suma el tiempo en que el 
analito permanece en la fase 
móvil y que interacciona con 
la fase estacionaria
Factor de 
capacidad
𝒌 =
𝒕𝑹 − 𝒕𝒎
𝒕𝒎
Medida de la retención del 
analito
Selectividad 𝜶 =
𝒌𝟐
𝒌𝟏
Potencial del sistema 
cromatográfico para separar 
dos compuestos. Diferencia 
de afinidad de los solutos en 
la fase estacionaría
Resolución 𝑹𝒔 =
𝒕𝟐 − 𝒕𝟏
𝟏/𝟐(𝒘𝟏 +𝒘𝟐)
Distancia entre dos picos 
adyacentes y determina la 
calidad de la separación de 
dos compuestos
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PÁRAMETRO FÓRMULA DEFINICIÓN
Número de 
platos 
teóricos
N = 𝟏𝟔 (
𝒕𝑹
𝒘
)𝟐
N = 𝟓. 𝟓𝟒𝟓 (
𝒕𝑹
𝒘𝟏/𝟐
)𝟐
Determina la eficiencia de la 
columna y refleja el poder 
de separación
Altura 
equivalente 
de platos 
teóricos
𝑯 =
𝑳
𝑵
Eficiencia con que funciona 
el sistema cromatógrafico
Velocidad 
lineal de la 
fase móvil
ഥ𝒖 =
𝑳
𝒕𝒎
Velocidad con la que la fase 
móvil pasa a través de la 
columna
Ecuación de 
Van Deemter 𝑯 = 𝑨+
𝑩
ഥ𝒖
+ 𝐂ഥ𝒖
Para cada sistema 
cromatográfico existe un flujo 
(velocidad lineal) para el cual 
la altura del plato teórico es 
mínima
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CLASIFICACIÓN
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CROMATOGRAFÍA DE 
LÍQUIDOS
PLANAR COLUMNA
ADSORCIÓNFASES 
QUÍMICAMENTE 
UNIDAS
INTERCAMBIO 
IÓNICO
EXCLUSIÓN
Fase 
normal
Fase 
Reversa
Capa fina
En papel
Sistema de inyección
Sistema de Bombeo 
Depósitos de disolventes
Columna
Detector
Adquisición de datos
FASE 
MÓVIL
FASE 
ESTACIONARIA
Sistema de 
gradiente o 
isocrático
Alta presión 
(500-5000 psi)
VÁLVULAS
Control de 
temperatura 
(OPCIONAL)
Volumen fijo
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Fase móvil 
(reservorio de 
disolventes)
Inyector
Bombas
Columna
Detector
Reservorio 
para 
desechos
Registrador 
de datos
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PROPIEDADES DE LA FASE MÓVIL
❑ BAJA VISCOSIDAD (mayor difusividad)
❑ ALTA PUREZA, ECONÓMICO Y ACCESIBLE
❑ NO TÓXICO, NO CORROSIVO
❑ COMPATIBLE CON EL SISTEMA CROMATOGRÁFICO Y CON 
EL DETECTOR
❑ PUEDE SER DE DOS TIPOS, dependiendo de la naturaleza de la fase 
estacionaria
Fase normal: No polar (fase estacionaria polar)
Fase reversa: Polar ( fase estacionaria apolar)
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COMPOSICIÓN DE LA FASE MÓVIL
ISOCRÁTICA
La composición de la fase 
móvil permanece igual
GRADIENTE
La composición de la fase 
móvil cambia con el tiempo
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¿PARA QUÉ SE USAN LOS GRADIENTES?
1. Separar mezclas complejas con analitos de diferente polaridad
Elución isocrática Elución con cambio brusco de la 
composición de la fase móvil
Elución con 
gradiente lineal
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¿PARA QUÉ SE USAN LOS GRADIENTES?
2. Reducir el tiempo de análisis y mejorar la resolución de los picos
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❑MATERIALES INERTES que no reacciones con la fase móvil (ej, acero 
inoxidable o teflón)
❑AMPLIO RANGO DE PRESIONES (500- 5000 psi)
La presión debe permanecer constante con el tiempo
❑AMPLIO RANGO DE CAUDALES ( 0.5- 10 mL/min)
❑EL CAUDAL DEBE DE SER CONSTANTE A LO LARGO DEL 
TIEMPO para no afectar la reproducibilidad de los tiempos de retención
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REQUISITOS:
❑ Volúmenes pequeños y reproducibles (volumen fijo)
❑Originar la menor dispersión física del volumen inyectado
❑Su funcionamiento no debe interferir en las condiciones
hidrodinámicas del sistema: no interrumpir el flujo, no
variar la presión y el caudal
1. INYECTORES MANUALES
2. INYECTOR AUTOMÁTICO Slide 15
INYECTORES DE BUCLES (LOOPS)
Válvula de 6 pasos
2 de entrada
2 de salida
2 conectada entre sí mediante un BUCLE
CARGA INYECCIÓN
https://www.youtube.com/watch?v=W9zVpcHPGnE
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https://www.youtube.com/watch?v=W9zVpcHPGnE
❑TUBO DE ACERO INOXIDABLE
❑EMPACADAS
❑ANALÍTICAS O SEMIPREPARATIVAS
Convencionales Empaquetamiento pelicular (por recubrimiento/ 
Porosidad superficial)
Empaquetamiento de micropartículas porosas
Microcolumnas Microtubulares abiertas
Microcapilares parcialmente empaquetadas
Microcolumnas totalmente empaquetadas
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COLUMNAS 
PARA HPLC
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❑LONGITUD: 5- 25 cm
❑DIÁMETRO DE LA COLUMNA (4 mm son las más populares)
❑DIÁMETRO DE PARTÍCULA (10, 5, 3 µm)
Al disminuir el tamaño de partícula, decrece la 
permeabilidad de las columnas; y esto permite 
trabajar a presiones altas
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Proceso H
Difusión de Eddy Cedp
Transferencia de masa (Fase móvil) Cmdp
2u/Dm
Difusión longitudinal CdDm/u B/u
Transferencia de masa (Fase 
estacionaria)
Csmdp
2u/Dm Cu
Transferencia de masa Fase móvil-fase 
estacionaria
Csdf
2u/Ds Du
Cd,Ce, Cm, Cs, Csm = Coeficientes de H; dp= diámetro de 
partícula; df= diámetro de la columna; u= velocidad de la 
fase móvil 
𝑯 = 𝑨+
𝑩
ഥ𝒖
+ 𝐂ഥ𝒖H
Influencia del 
diámetro de 
partícula en H
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❑REDUCE EL TIEMPO DE ANÁLISIS
❑MEJORA LA REPRODUCIBILIDAD DE LOS TIEMPOS DE 
RETENCIÓN
❑MENOR VISCOSIDAD, MENOR PRESIÓN
❑MENOS ENSANCHAMIENTO Y MENOR COLEO EN LOS 
PICOS
❑PUEDE DISMINUIR LA SENSIBILIDAD
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❑ ALTA SENSIBILIDAD 
❑ RESPUESTA RÁPIDA A LOS CAMBIOS DE 
CONCENTRACIÓN
❑ RANGO LINEAL (AMPLIO)
❑ ESTABLE RESPECTO AL RÚIDO
❑ BAJA SENSIBILIDAD A VARIACIONES DE FLUJO, PRESIÓN 
Y TEMPERATURA
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DETECTORES USADOS EN HPLC
❑ DETECCIÓN UV-Visible
Longitud de onda fija
Longitud de onda variable
Arreglo de diodos
❑DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN
❑DETECTOR FLUORESCENCIA
❑DETECTOR ELECTROQUÍMICO
❑ CONDUCTIVIDAD
❑ SISTEMAS ACOPLADOS (MASAS/INFRARROJO)
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RESPUESTA UNIVERSAL
EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN ES UNA CARACTERÍSTICA 
PROPIA DE CADA COMPUESTO
Principio: se mide la diferencia en el índice de refracción 
del disolvente (fase móvil) cuando este, contiene al analito
Limitaciones: Su funcionamiento se complica al usar 
gradientes como fase móvil
Aplicaciones: carbohidratos, grasas, polímeros
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RESPUESTA NO - UNIVERSAL
PARÁMETRO ESPECÍFICO PARA CADA COMPUESTO
Principio: absorción de energía a una longitud de onda 
específica para cada grupo funcional
Es el detector más utilizado en HPLC
SE PUEDE UTILIZAR CON 
GRADIENTES
DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS
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Permite conocer en cualquier momento del análisis el 
espectro UV-Visible de los analitos que eluyen de la columna
Fuente de 
radiación
Lente 
condensadora
Célula de 
flujo
Matriz de 
fotodiodos
Red de difracción
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EMICIÓN DE UNA RADIACIÓN DE MAYOR LONGITUD DE 
ONDA QUE LA ABSORBIDA
Sensibilidad 1000 veces mayor que el detector UV-Visible
RESPUESTA: ESPECÍFICO
Aplicaciones: hidrocarburos aromáticos policíclicos (HPA), 
técnicas de derivatización
➢ CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN (LÍQUIDO-
SÓLIDO)
PRINCIPIO: Adsorción de los analitos en una superficie
que contiene grupos funcionales activos
FASES ESTACIONARIAS: Sílica gel (pH 2-8); alúmina
(pH 2-12)
FASES MÓVILES: Disolventes no-polares (ej: hexano)
APLICACIONES: compuestos no polares, semi-polares,
solubles en disolvente no-polares Slide 30
➢ CROMATOGRAFÍA FASES QUÍMICAMENTE UNIDAS
FASE NORMAL Y FASE REVERSA
FASE REVERSA
FASE MÓVIL: POLAR
FASE ESTACIONARIA: APOLAR
ELUCIÓN: Los compuestos POLARES son eluidos con mayor
facilidad que los APOLARES
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HEXANO
TOLUENO
TRICLOROMETANO
DICLOROMETANO
ÉTER
ACETATO DE ETILO
ACETONITRILO
METANOL
AGUA
P
O
L
A
R
I
D
A
D
P
O
L
A
R
I
D
A
D
FUERTE
DÉBIL FUERTE
DÉBIL
FASE 
NORMAL
FASE 
REVERSA
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𝐥𝐨𝐠𝑷 = 𝑳𝒐𝒈(
𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐 𝒐𝒄𝒕𝒂𝒏𝒐𝒍
𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐 𝒂𝒈𝒖𝒂
) expresa la hidrofobicidad
Cuanto mayores el valor del Log P (entre -1 y 1) más 
hidrófoba es una mólecula
MECANISMO:
❑ Adsorción de analito en la fase estacionaria
❑ Comportamiento de partición (reparto)
Para aumentar la retención, se aumenta la 
polaridad de a fase móvil
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❑Solubilidad del analito en la fase móvil
❑Afinidad por la fase estacionaria
o Cuanto mas soluble es agua es un compuesto mayor es 
la retención
o El tiempo de retención aumenta a medida que aumenta el 
número de átomos de carbono
o Los compuestos de cadena ramificada se eluyen 
primero que los isómeros
o La insaturación disminuye la retención
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FASE MÓVIL: APOLAR
FASE ESTACIONARIA: POLAR
ELUCIÓN: Los compuestos APOLARES son eluidos con
mayor facilidad que los POLARES
FASE NORMAL
La fase estacionaria presenta sitios activo de alta 
polaridad y las interacciones que se producen con el 
soluto son especificas del grupo activo
Sílice o alúmina, modificadas con grupos ciano, 
amino, diol
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BIBLIOGRAFÍA
❑ Lough, W, J; Wainer, I.W. 1996. High Performance 
Liquid Chromatography. Fundamental Principles and 
Practice. Blackie Academic & Professional
❑Hamilton, R.J; Sewell, P.A. 1977. Introduction to high
performance liquid chromatography. Chapman & Hall
❑Uwe D, Neue. 1997. HPLC COLUMNS. Theory, 
Technology, adn Practice. Wiley-VCH
❑ Snyder, L.R; Kirkland, J.J. 1997. Introduction to Modern 
Liquid Chromatography. 2nd Edition. Wiley-
Interscience