M.Cromatogrficos_6700

Vista previa del material en texto

Universidad Nacional Autónoma de México 
 
Facultad de Química 
Química Analítica Instrumental II 
 
 
 
 
Técnicas Cromatográficas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Diciembre de 2007 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 1 
 
Capítulo 1. 
Introducción a los métodos de separación 
1.1 Introducción a la cromatografía 
En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al descubrimiento de lo 
que hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de pigmentos vegetales en la parte 
superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar éter, observó que la 
mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendían a través de la columna a 
diferentes velocidades. 
Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera 
que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo 
largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se 
mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En el 
experimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que cada uno de 
ellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes más afines a la fase 
estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos 
retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o 
papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, 
logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química. 
Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los métodos 
cromatográficos según el estado físico de la fase móvil: 
Cromatografía líquida. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un 
sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien un 
líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-
líquido). Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en 
columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un 
tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor 
uniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior 
de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía líquido-
líquido. 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 2 
 
Cromatografía de gases. En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase 
estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte 
(cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única 
manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna 
puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase 
estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo 
(hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor 
capacidad de separación. De acuerdo con el mecanismo de retención, la cromatografía se puede 
clasificar en los siguientes tipos: 
 adsorción (normal, de fase reversa) 
 partición líquido-líquido 
 intercambio iónico 
 permeación sobre gel 
 de afinidad 
Las áreas de aplicación son muy diversas y abarcan prácticamente todas las actividades en las que 
interviene la química, por ejemplo: se emplea en: 
El análisis de drogas y fármacos en fluidos biológicos como la saliva, la sangre, la orina; 
Seguir la transformación de las sustancias responsables de la transmisión neurológica; 
Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente; 
Descifrar la composición de los combustibles fósiles; 
Realizar el control de calidad de los productos químicos y farmacéuticos manufacturados; en fin, la lista 
de ejemplos es interminable. 
1.2 Cromatografía en papel 
La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis 
cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. La 
fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en 
un extremo colocando pequeñas gotas de la disolución y evaporando el disolvente. Luego el disolvente 
empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. La separación se realiza en función de la 
afinidad de los solutos con las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se 
aplicó la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Las 
sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicos 
 
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_cualitativo&action=edit
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_cualitativo&action=edit
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_cualitativo&action=edit
http://es.wikipedia.org/wiki/Disolvente
http://es.wikipedia.org/wiki/Capilaridad
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 3 
 
La cromatografía en papel es una técnica utilizada para análisis inorgánico cualitativo, permite llevar 
a cabo la separación e identificación de iones, trabajando con cantidades mínimas de sustancia. 
Pertenece al tipo de “Cromatografía de partición” se fundamenta en que las sustancias problema, 
pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno 
permanece fijo en la superficie del papel “fase estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil 
constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos 
de cromatografía, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de 
separación de zonas y sectores. 
 
Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas 
manchas características sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una 
lámpara fluorescente, los contornos se marcan con lápiz. Como medida en cromatografía sobre papel se 
emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia 
por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por 
la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). 
𝑅𝑓 =
𝑋
𝑆
 [1] 
En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de 
elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase móvil, en la que 
irá disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en función de los componentes 
que se pretenden separar. 
1.3 Cromatografía en capa fina 
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un 
adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un 
adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 4 
 
aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso 
también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. 
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionariaserá un 
componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que 
los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. 
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente: 
hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído 
aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas 
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos 
cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es más simple. El 
tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es 
generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el 
cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea 
un método adecuado para fines analíticos. 
Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del 
adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se 
le puede añadir un adherente. 
En la elección del eluyente influyen varios factores: 
 Precio. 
 Pureza. 
 No utilizar mezclas de eluyentes 
(reproducibilidad). 
 No utilizar compuestos muy volátiles. 
 Evitar que contengan trazas de metales 
(catalizadores). 
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y 
probar con eluyentes cada vez menos polares. 
 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 5 
 
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con 
los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo 
con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. 
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los 
componentes orgánicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el 
tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado. 
 
1.4 Cromatografía de permeación en gel 
La cromatografía de permeación en gel, también conocida como cromatografía de exclusión es 
una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatográfica empacada de tal manera que las 
partículas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con el fin de 
que las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en su forma y tamaño y no en el peso 
molecular. 
Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los poros y son 
arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de “cama 
de vacío” de la fase móvil. Por el contrario, las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porque 
tiene más espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de difusión hacía los poros que tienen 
accesibles. Las moléculas de tamaños intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la 
cantidad de poros por los que puedan pasar. 
Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos están 
los polímeros macromoleculares semirígidos, los entrecruzados, las sílices rígidas ó las de “poro 
controlado”. Los materiales semirígidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso 
ya que se limitan a una presión de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen 
un tamaño usual de 5µm, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son 
compatibles con sistemas no acosos. 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 6 
 
Otro tipo de empacamiento hidrofílico poroso es preparado mediante una polimerización por 
suspensión de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten 
presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes 
orgánicos polares. 
Disolventes. La cromatografía de exclusión requiere un solo disolvente durante el análisis en el cual se 
pueda disolver la muestra. El único inconveniente que pude presentarse con los disolventes es la 
relación de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidad 
de la fase móvil se pueden dar, una distorsión en los picos cromatográficos y cambios anómalos en los 
tiempos de retención. 
1.5 Cromatografía de exclusión de iones 
Una variante de la cromatografía de permeación en gel o cromatografía de exclusión, es cuando 
se realiza para la exclusión de iones. Mediante esta modificación, se tienen separaciones que dependen 
de factores como tamaño de partícula de la resina, forma iónica e incluso distribución de isómeros. Esto 
permite separar especies que de otra forma eluirían al mismo tiempo. Las separaciones se llevan a cabo 
en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad como eluyentes, ácidos minerales 
diluidos. 
Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de 
muestras fisiológicas en donde la mayoría de los ácidos del ciclo de Krebs están presentes, puede ser 
hecho fácilmente mediante el uso de una columna de exclusión aniónica. El uso de las columnas de 
exclusión aniónica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separación de oligosacáridos 
usando agua como eluyente a una temperatura de 90ºC, aplicando también la separación por exclusión 
estérica. 
1.6 Cromatografía de intercambio iónico 
La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene 
grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimérica. Los grupos funcionales enlazados 
permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retención más 
común es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase móvil con el grupo cargado de la 
fase estacionaria. 
En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catiónicas. 
Los más comunes son los sulfónicos, los cuales son fuertemente ácidos y tiene las propiedades de los 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 7 
 
ácidos fuertes cuando está en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para el 
intercambio con especies aniónicas. Los más comunes son las aminas cuaternarias, las cuales son 
fuertemente básicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos grupos 
funcionales están totalmente disociados. Así, sus propiedades de intercambio son independientes del pH 
de la fase móvil. 
La cromatografía de intercambio iónico puede efectuarse con alguno de los varios tipos de 
empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor, 
sobre una cuenta de vidrio con diámetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen 
recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de sílice en el que se impregna o 
enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja: 
0.01- 0.1 meq/g. 
El intercambiador puede también estar enlazado a macropartículas de sílice por medio de reacciones de 
sililación o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso. 
El proceso primario en la cromatografía de intercambio iónico involucra la adsorción/desorción de 
materiales iónicos cargados en la fase móvil con una fase estacionara permanentemente cargadas (de 
signo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en contacto con una solución 
que contiene iones K+, existe un equilibrio: 
resina, H + K+ resina, K+ + H+ 
Las diferencias de retención están gobernadas esencialmente por las propiedades físicas de los iones 
solvatados. La fase de resina presenta preferencia por: 
1. El ion de carga mayor. 
2. El ion conmenor radio solvatado. 
3. El ion que tenga mayor polarizabilidad. 
Aplicaciones de intercambio catiónico: 
Los cationes inorgánicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietéticos bajos 
en sodio, y en muestras de orina. 
Aplicaciones de intercambio aniónico: 
Se pueden separar los ácidos HCN, carbónico, silícico y bórico de los ácidos fosfórico, sulfúrico y 
clorhídrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro. 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 8 
 
1.7 Cromatografía de fluidos supercríticos 
La temperatura crítica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existir 
en la fase líquida independientemente de la presión. La presión crítica es la presión de vapor de una 
sustancia a su temperatura crítica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su 
temperatura y de su presión crítica (punto crítico) se denomina fluido supercrítico. 
Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre 
las características de esa sustancia en estado gaseoso y en estado líquido. 
Comparación de las propiedades de los fluidos supercríticos con las de gases y líquidos. (Los datos sólo 
indican el grado de magnitud). 
 GAS FLUIDO SUPERCRÍTICO LÍQUIDO 
Densidad (g/cm
3
) (0,6-2)*10
-3 
0,2- 0,5 0,6- 2 
Coeficiente de difusión (cm
2
/s) (1-4) * 10
-1 
10
-3 
– 10
-4 
(0,2 – 2)* 10
-5 
Viscosidad (g cm-
1
 s-
1
) (1-3)* 10
-4 
(1-3) * 10
-4 
(0,2- 3)* 10
-2 
Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografía de gases, 
líquidos y fluidos supercríticos, así como la extracción de fluidos supercríticos. Una propiedad importante 
de los fluidos supercríticos, que está relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su 
notable capacidad para disolver moléculas grandes no volátiles. Por ejemplo, el dióxido de carbono 
supercrítico disuelve fácilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 átomos de carbono. Una segunda 
propiedad notable de los fluidos supercríticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser 
fácilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la 
atmósfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercríticos es que son 
baratos, inocuos y no son sustancias tóxicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la 
atmósfera sin efectos ambientales dañinos. 
La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una modalidad híbrida entre la cromatografía 
de gases y de líquidos que combina algunas características de cada una de ellas. Esta técnica es una de 
los tres tipos importantes de cromatografía en columna, ésta permite la separación y determinación de 
compuestos que no son manipulados ni por la cromatografía de gases ni por la de líquidos: compuestos 
no volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografía de gases es inaplicable y (2) los 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 9 
 
compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las técnicas espectroscópicas o 
electroquímicas empleadas en cromatografía de líquidos. 
Los equipos instrumentales para la cromatografía de fluidos supercríticos son bastante parecidos 
en lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dos 
diferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada y 
además proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase móvil; (2) un restrictor o un 
dispositivo de contrapresión, que se utiliza para mantener la presión en la columna en el nivel deseado y 
para convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un gas, y arrastrarlo al detector. 
Las variaciones de presión en cromatografía de fluidos supercríticos tienen un efecto muy 
marcado sobre el factor retención o de capacidad, k’. Este efecto es una consecuencia del incremento de 
la densidad de la fase móvil a medida que aumenta la presión. Tal incremento de la densidad origina un 
aumento de la capacidad disolvente de la fase móvil, lo cual acorta los tiempos de elución. La mayoría de 
los perfiles de presión utilizados en cromatografía de fluidos supercríticos son: presión constante 
(isobárica) para un período de tiempo dado seguida de un aumento lineal o asintótico de la presión hasta 
alcanzar el valor de la presión final. 
Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunque 
las primeras son las más empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de sílice fundida 
con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas 
tienen una longitud de 10 a 20 m y un diámetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la película varía 
entre 0.05 1 micrómetro. 
Fases móviles. La fase móvil más utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto de 
moléculas orgánicas no polares. Además, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no 
tóxica, fácilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases móviles cromatográficas. 
La temperatura crítica del CO2 ES 31° C y su presión crítica 72,9 atmósferas, lo cual permite jugar con una 
banda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operación de un equipo de 
HPLC moderno. Sustancias como etano, butano, óxido nitroso, diclorodifluorometano, éter dietílico, 
amoníaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases móviles de cromatografía de fluidos 
supercríticos. 
Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la 
cromatografía de gases, detectores de ionización de llama. Este detector es de respuesta universal a 
compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad. Los espectrómetros de masas también se pueden 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 10 
 
adaptar como detectores más fácilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de 
absorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de 
llama. 
La cromatografía de fluidos supercríticos se ha aplicado a la separación de un amplio conjunto de 
sustancias, entre los que se cuentan productos naturales, fármacos, alimentos, pesticidas y herbicidas, 
tensoactivos, polímeros, aditivos de polímeros, combustibles fósiles y explosivos y propelentes. 
1.8 Cromatografía de afinidad 
La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad de 
fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de soporte porque 
están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener una 
estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes 
disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida. 
Estos ligandos se clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención de analitos, 
esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las 
proteínas no específicas se han lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con solución 
que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva, generalmente 
por el acoplamiento o alteración de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, 
se necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican 
las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la proteína para 
continuar con la regeneración de la columna cromatográfica. 
La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención de 
proteínasafines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un campo 
restringido para la separación. 
Esquema de cromatografía de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de proteínas 
que se añaden a la columna, la cual contiene un ligando específico ligado al polímero, para la proteína de 
interés. En el segundo matraz se encuentra una solución de ligando, el cual se añade a una probeta para 
que eluya a la proteína de interés. La bureta de en medio indica que las proteínas deseadas se lavan a 
través de la columna. 
Los puntos rojos representan la proteína de interés, los negros, el ligando y las bolas beige 
unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polímero. 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 11 
 
 
1.9 Cromatografía de líquidos de alta resolución 
La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación más ampliamente 
utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, 
es ideal para la separación de especies no volátiles o termolábiles y por su gran aplicabilidad a sustancias 
que son de interés en la industria. Algunos ejemplos son: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, 
hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies 
organometálicas y gran variedad de sustancias inorgánicas. La fase móvil es un líquido y la fase 
estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable. 
1.10 Electroforesis 
Los orígenes de ésta técnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logró separar 
mezclas de proteínas (micelas cargadas eléctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso 
al que se aplicaba un campo eléctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separación de cualquier 
especie cargada o alrededor de una doble capa eléctrica. 
El fundamento de la técnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla de 
especies cargadas. Por aplicación de un campo eléctrico entre los extremos del soporte poroso las 
especies se separan en función de sus cargas y su movilidad iónica en ese medio. Cuanto más elevado 
sean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separación; sin embargo valores altos de 
estas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporación del disolvente y 
acumulación de sales del tampón, lo cual es indeseable. 
Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que 
son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente 
escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han 
utilizado alúmina, lana de vidrio, almidón, agar-agar, gel de sílice, etc. 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 12 
 
Electroforesis capilar 
La sección transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drástica al realizar 
la electroforesis en el interior de un tubo capilar de diámetro interno menor a 0.1mm y una longitud de 
50cm a 1m. Es efectivo llevar de ésta forma la técnica porque la resistencia eléctrica de la disolución es 
tan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes más altos sin 
calentamiento excesivo. La técnica tiene gran poder de resolución y se han desarrollado métodos para 
llevar a cabo la electroforesis incluso en moléculas neutras no iónicas. 
Además, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual 
modo que en una cromatografía en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen de 
muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y después de la separación, cada uno de los 
analitos está en volúmenes inferiores al nanolitro. Con volúmenes de líquido tan pequeños, muy pocos 
métodos de detección se pueden usar eficazmente. 
 
1.11 Bibliografía 
-Braithwaite, A. Métodos cromatográficos, 4ª ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Páginas 216 چ
217, 271-272. 
 Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jesús Hernández Méndez, Química Analítica چ
Cualitativa, Ed. Thompson, España, 2003 pp 321-322. 
 .Garrido, A., Fundamentos de química biológica. Interamericana Mc Graw-Hill. España. 1991 چ
 Kenneth A. Rubinson, Judith F. Rubinson, Análisis Instrumental, Ed. Prentice Hall, España 2004, pp چ
730-739. 
 ,Lehninger, Albert. L. Principios de Bioquímica. Segunda Edición. Ediciones Omega. Barcelona, 1995 چ
pp 137 
Fig. 1. Diagrama de las partes básicas de un 
instrumento de electroforesis capilar con detección 
espectroscópica. 
La muestra penetra por la parte de la izquierda 
introduciendo el final del capilar en la disolución de 
la muestra y cargándolo, bien hidrodinámicamente, 
bien electrocinéticamente. Toda la unidad de la 
ilustración funciona a temperatura constante. El 
capilar está enrollado alrededor de un soporte. 
Durante el análisis los niveles de las dos disoluciones 
tampón deben ser iguales como se indica con la 
línea punteada) para evitar el flujo de masa debido a 
una diferencia de presión. 
Introducción a los métodos de separación 
 
Capítulo 1 13 
 
 McCABE / SMITH /HARRIOTT. “Operaciones Unitarias en Ingeniería Química” 1991. Cuarta Edición en چ
Español. Editorial McGraw Hill S.A. España 
 .PERRY, ROBERT H. “Manual del Ingeniero Químico” 1992. Sexta Edición. Tercera Edición en Español چ
Editorial McGraw Hill. México 
 ,Skoog A. Douglas. Principios de análisis instrumental, 5ª ed., Saunders Collage Publishing, Espana چ
2001, págs.: 785- 791 y 831- 836. 
 ,Willard Hobart, Métodos instrumentales de análisis. 7ª. Ed., Compañía de publicaciones Wadsworth چ
California, 1988, Páginas 644-650. 
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.ht چ
m 
 http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf چ
 http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina چ
 http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel چ
http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml 
 
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm
http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina
http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 14 
 
Capítulo 2 
Parámetros cromatográficos 
2.1 Glosario 
Anchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un 
separador de banda. 
Banda: Es una situación ideal, es una distribución gausiana. La cantidad de compuesto que sale de 
cromatografico o de una columna electroforética. 
Coeficiente de difusión: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s. 
Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribución de un soluto entre dos fases, 
para definir el coeficiente de partición solo se utiliza una forma de un soluto (kD). 
Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un método para un interferente dado en 
comparación con su sensibilidad para el analito (KA,I). 
Cola: prolongación final de un pico cromatográfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy 
activos en la fase estacionaria. 
Constante de disociación: constante de equilibrio de una reacción en la que un complejo metal- ligando 
se disocia para formar un ión metálico libre y un ligando (kD). 
Constante de equilibrio: K’ Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor 
numérico de K’ depende de la fuerza iónica del medio. 
Cromatografía: separación en la que los solutos se distribuyen entre fase móvil y estacionaria.Cromatografía gaseosa: técnica cromatográfico en la que la fase móvil es un gas. 
Cromatograma: registro de la señal de detección en función del tiempo de elusión o del volumen. 
Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatográfico, se suele 
expresar en términos de la altura H, de los platos o del número N de platos teóricos. En la medida en que 
la distribución del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos está dada por la varianza 
dividida entre la longitud de la columna del empacado. 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 15 
 
Ensanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplaza 
desde el punto de inyección al detector. 
Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k’). 
Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad 
de la columna para uno de ellos (α). 
Factor de separación: medida de la eficacia de una separación en lo que se refiere a la separación entre 
el analito y el interferente. 
Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posición fija. 
Fase móvil: fase extractarte que se desplaza a través del sistema. 
Número de platos teóricos: característica de una columna cromatográfica que se emplea para medir su 
eficiencia. 
Plato teórico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una 
columna, como si estuviera compuesta de pequeñas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto 
entre las fases móvil y estacionaria 
Relación de distribución: cociente que expresa la concentración total de soluto en una fase en relación 
con una segunda fase; en su definición participan todas las zonas del soluto (D). 
Resolución: separación entre dos bandas cromatográficas (R). 
Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un método que se mide ante el cociente de 
selectividad del mismo. 
Tiempo de retención: es el tiempo entre la inyección en una columna cromatográfica y la llegada a un 
pico de analito al detector. 
Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a través de la columna. 
 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 16 
 
Un parámetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso, 
una operación o un resultado. La parametrización de datos en cromatografía, como en otros métodos 
facilita la tabulación y la comunicación de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posición y la 
resolución de las bandas de una cromatografía. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente con 
descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separación. 
2.2 Constantes de Distribución 
Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre un 
fenómeno de distribución, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases. 
De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. La 
constante asociada es la llamada constante de distribución, que se define para un soluto A como: 
𝐷𝐴 =
 𝐴 1
 𝐴 2
 
donde [A]1 y [A]2 son la concentración de A en la fase 1 y 2 respectivamente. Concretamente, en 
cromatografía la fase 1 es la fase estacionaria y la fase 2 es la fase móvil y el soluto A es el analito de 
interés. Esta constante es específica para cada compuesto con cada determinada fase estacionaria y fase 
móvil. 
2.3 Factores de influencia en la retención 
La retención que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferencia 
de polaridades entre las fases estacionaria y la móvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellas 
según su coeficiente de distribución. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con 
polaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribución distintos, la retención será diferente para 
cada uno. 
En la cromatografía de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del tiempo de 
retención del “pico de aire”. En la cromatografía de líquidos, cualquier compuesto no retenido puede 
usarse como muestra para medir el to. 
El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retención 
ajustado o corregido, t’R. 
t'R = tR – to 
 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 17 
 
Una medida conveniente y útil de la retención del soluto está dada por el factor de capacidad (o 
factor de retención), k’ 
𝑘´ =
𝑡´𝑟
𝑡0
 
 
FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retención diferentes, así como el tiempo muerto. 
Los valores de k’ no tienen un significado simple en un gradiente de elución o en temperatura 
programada, y usualmente no son reportados cuando esos procedimientos son usados. Los valores de k’ 
pueden ser determinados a partir del tiempo de retención, tR. 
En los modos de retención de cromatografía se tiene: k’ > 0, que significa que no hay bandas 
eluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es útil expresar el tiempo de retención o el volumen en 
términos del factor de capacidad, k’. 
tR = to (1+ k’) 
VR = Vm (1 + k’) 
La retención del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedan 
afectar a la misma. El fenómeno de adsorción depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea ésta 
se fomentará la desorción, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del análisis. 
2.4 Retención y Equilibrio en Cromatografía 
El soluto se encuentra en un equilibrio de distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y 
dependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retención del mismo. Una separación 
cromatográfica típica se muestra en la figura 2. La separación está fuertemente afectada por la 
proximidad de bandas adyacentes en el cromatograma. 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 18 
 
Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separación, α, donde 
dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2: 
α = k2 / k1 
El factor de separación, α, es usualmente identificado con la selectividad del sistema 
cromatográfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retención para dos 
compuestos específicos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significaría que no hay 
separación, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retención muy largos se 
traducen en tiempo desperdiciado durante la operación experimental. Los valores de α depende de los 
dos solutos y de 
1) La composición química de la fase estacionaria. 
2) La composición química de la fase móvil (excepto en cromatografía de gases). 
3) La temperatura. 
En cromatografía de fluidos supercríticos, la presión también puede afectar a α al cambiar la densidad de 
la fase móvil. 
 
FIG. 2. Separación de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografía de líquidos. 
2.5 Eficiencia de separación de una columna 
Las columnas cromatográficas consisten en un número de zonas adyacentes en cada una de las 
cuales hay suficiente espacio para que un analito esté en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas 
zonas se conoce con el nombre de plato teórico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una 
columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 19 
 
valor numérico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La 
altura del plato está relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de 
la columna, X: 
𝐻 =
σ2
X
 
donde σ es un estándar de desviación de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simétricos la 
anchura de la base es igual a 4σ y la anchura del pico al punto de inflexión,ωi es igual a 2σ. Por lo tanto 
el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico. 
El número de platos teóricos en la columna entera viene dado por: 
𝑁 =
𝐿
𝐻
=
𝐿 ∗ 𝑋
σ2
 
donde L es la longitud de la columna. 
Si consideramos la posición del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es ω, 
obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con más pendiente del pico, es igual a 4σ, la 
ecuación anterior se convierte en 
𝑁 =
16 ∗ 𝐿2
W2
 
Si en lugar de medir L y ω en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuación quedará: 
𝑁 = 16 
𝑡𝑅
𝑊
 
2
 
La medición del ancho del pico es más confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico, 
con lo cual se puede utilizar 
𝑁 = 5.545 
𝑡𝑅
𝑊1/2
 
2
 
También puede hacerse en función de la altura y área del pico 
𝑁 = 2𝜋 
𝑡𝑅
á𝑟𝑒𝑎
𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 
 
2
 
Es importante que tanto 𝑡𝑅, W ó W1/2 ó 
á𝑟𝑒𝑎
𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 se expresen en las mismas unidades ya 
que N es adimensional. 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 20 
 
Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de película delgados y 
columnas de poco diámetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la 
fase móvil también afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad óptima para obtener el 
máximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de éste para no perder demasiado 
tiempo en análisis. 
2.6 Procesos de ensanchamiento de banda 
El número de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento de la 
banda cromatográfica. Cuando inyectamos un pequeño volumen de analito en una columna forma una 
banda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La anchura 
de pico aumenta con la raíz cuadrada de la longitud que la banda ha recorrido. Según la ecuación de Van 
Deemter 
𝐻 =
𝐴 + 𝐵
𝑣 + 𝐶 ∗ 𝑣
 
A representa el término de caminos múltiples. Esto es porque las moléculas no siguen 
únicamente un camino, hay multicanales, que se deben a la densidad de empacado de la fase 
estacionaria y afecta según el tamaño y forma de la partícula. 
B representa la difusión axial, la cual depende de la movilidad de las moléculas en las fases. El 
soluto se difunde desde la zona central que es la más concentrada hacia las regiones más diluidas. En 
esto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el término 
A. Para encontrar la velocidad óptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en función 
de v. 
Por último, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario éste término porque en 
realidad los fenómenos que ocurren están fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fase 
móvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las moléculas de 
analito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre la 
transferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas. 
2.7 Resolución 
La separación relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolución, Rs. La resolución se define 
como 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 21 
 
𝑅𝑠 =
𝑡2 − 𝑡1
1
2
(𝑤1 + 𝑤2)
 
Aquí, t1 y t2 se refieren a los tiempos de retención (tR) de la primera y la segunda banda, y W1 y W2 
son el ancho de dichas bandas. La figura 3 ilustra la separación de dos bandas adyacentes como una 
función de sus valores de Rs y su tamaño relativo. Se observa que la separación mejora sistemáticamente 
a mayores valores de Rs, y la separación es generalmente mejor para dos bandas de igual tamaño (y el 
mismo valor de Rs.). Esto es, mayores valores de Rs se requerirán normalmente para la separación de las 
bandas desiguales. 
 
Fig 3. Separación de dos bandas como una función de la resolución (Rs) y el tamaño relativo de banda. 
La resolución depende de la retención y selectividad de manera proporcional. A mayor 
selectividad y retención k´, mayor resolución. Para tener una buena separación se recomienda utilizar k´ 
> 2, y generalmente se trabaja con α ≈1. 
Para el análisis cuantitativo es deseable (pero no siempre práctico) alcanzar la resolución de al 
menos Rs = 1.5, desde que esto corresponde a la separación a la línea base de bandas de tamaño similar. 
La separación de la línea base hace que los sistemas de datos midan el tamaño de cada banda 
apropiadamente y esto significa una cuantificación fiable. 
Una resolución pobre puede deberse a que el método utilizado no es apropiado, pues no 
discrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporción a la columna cromatográfica. 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 22 
 
2.8 Cuantificación en cromatografía 
Para llevar a cabo un análisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables, 
tanto para la construcción de la curva de calibración como para el tratamiento del analito mismo. 
Primero es necesario llevar a cabo un análisis cualitativo, en el cual se encuentren las condiciones 
óptimas. Para evaluar esto, se calculan los parámetros cromatográficos de cada ensayo que sirven como 
referencia. De ésta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condiciones 
posibles, acercándose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo más exactos que ésta técnica 
nos permite. 
Si no se obtiene una buena resolución, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad de 
muestre, sino puede probarse utilizando una fase móvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otra 
fase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo, 
y analizar la naturaleza química de las distintas fases así como solutos, para probar con otra fase sea 
estacionaria o móvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operación mejor, y que una vez 
encontradas las mejores condiciones, no deben alterarse. 
Para realizar la curva de calibración puede usarse el método de estándar externo o interno, 
siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operación. 
2.9 Resumen 
La cromatografía es una técnica de separación que se basa en la diferencia de distribución que 
existe entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y móvil. Así, cada soluto tendrá un 
tiempo de retención distinto y podrán analizarse por separado. 
Los parámetros cromatográficos son claves para el diseño de un análisis, pues son herramientas 
que ayudan a evaluar las condiciones en las que se está llevando a cabo. 
Cada soluto tendrá asociado un tiempo de retención distinto que se puede expresar como el 
factor de capacidad, y la relación de los tiempos de retención o factores de capacidad de los solutos nos 
indicará si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolución se podrá evaluar si la separación 
entre los tiempos de retención se los solutos es suficiente o excesiva. El cálculo de los platos teóricos nos 
indicará la eficiencia del sistema. 
Una vez evaluados los parámetros cromatográficos, se podrá determinar si el cromatograma 
obtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condición para optimizarlo. 
Parámetros cromatográficos 
 
Capítulo 2 23 
 
2.10 Bibliografía 
Heftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and related 
differential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edición, EUA, 1992, pp. 2-14 
Rojo Callejas F., Manual de Química Analítica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Química UNAM, 
México 2002 
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia 
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf 
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-
14/skoog/26d.html 
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografiahttp://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-14/skoog/26d.html
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-14/skoog/26d.html
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 24 
 
Capítulo 3 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
3.1 Procedimientos de empaquetamiento 
En cromatografía de fase líquida, la fase móvil es un líquido y éste desciende a través de la 
columna. La fase estacionaria es frecuentemente un líquido que recubre el interior de un tubo capilar o 
la superficie de partículas sólidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismas 
partículas sólidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, el 
reparto de solutos entre las fases móvil y estacionaria dan lugar a la separación. 
 
Fig 1. Representación esquemática de una separación cromatográfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad 
que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna más tiempo. 
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena 
con partículas que contienen la fase estacionaria y los materiales más usados para los tubos de las 
columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulación más fácil. 
Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase 
estacionaria cubriendo las paredes interiores. 
En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un sólido poroso con gran área superficial, 
inerte y con una buena resistencia mecánica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varían, 
entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (más empleado en CG), alúminas, resinas de 
intercambio iónico o compuestos de sílice como SiO2 amorfo, sin embargo, éste debe de someterse a un 
tratamiento para hacerlo aún más inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es característico que 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 25 
 
el tamaño de las partículas y de los poros deben ser lo más uniforme posible. El procedimiento del 
empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos: 
1. Colocación de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y 
compacta en la columna (longitud y diámetro apropiados). 
2. Verificación de ausencia de espacios vacíos en la columna (para evitar que los picos del 
cromatograma sean más anchos y de menor eficiencia. 
2.2 Aplicación de la muestra 
Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicación de 
la disolución de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, ésta se 
queda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza el 
desplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a poco 
y, empujado por la disolución que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si el 
disolvente utilizado para la elusión es el mismo que la disolución problema, los platos teóricos 
comprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase móvil en equilibrio con ellos y las 
concentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona sólo es aparente en sus extremos 
por lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene más espesor de un plato 
teórico. 
2.3 Procedimientos de elución 
La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es 
prácticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como el 
desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. 
Para el caso específico de cromatografía de adsorción, existe una ordenación de los disolventes de 
acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie 
eluotrópica. La fuerza eluyente es una medida de energía de adsorción del disolvente, supuesto valor 
cero para el sistema pentano/sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente 
respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. 
Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la 
columna. 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 26 
 
La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal, 
que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente más 
polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se 
caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Un 
disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografía de fase inversa elimina las colas 
de los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningún soluto 
originando colas. La cromatografía de fase inversa también es menos sensible a impurezas polares (como 
el agua), que pueda haber en el eluyente. 
2.4 Elución isocrática y gradiente 
La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un 
disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una 
elución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, 
produciendo un gradiente continúo. 
 
Fig 1. Las moléculas del disolvente y las moléculas del soluto compiten entre sí en su reacción con los puntos activos 
de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, más fácilmente se desplaza el soluto. 
2.5 Cromatografía de absorción y de partición de columna 
Estas son dos técnicas de análisis cromatográfico, la diferencia entre ellas es que la retención del analito 
en la columna depende de la naturaleza de su interacción con la fase estacionaria. 
En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito, 
con la fase estacionaria, en la de absorción, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la de 
partición de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria. 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 27 
 
 
2.6 Cromatografía de adsorción 
La absorción es un fenómeno de superficie, por lo tanto físico, en el cual diversas sustancias son 
atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie 
interfacial, formándose una película del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea 
sólido o líquido, aunque este proceso implica una interacción de diferentes fuerzas, sean estas físicas o 
químicas, por ello se habla de fisisorción, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material es 
solo física, y quimisorción, cuando la retención implica enlaces con el adsorbente. Así pues, en la 
cromatografía de adsorción, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si 
es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el 
analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los demás componentes se eliminen. 
Durante la separación, se filtra una solución a través de una columna de adsorbente, que es la 
fase móvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria sólida, formando una “cama” de 
partículas que se dividen de modo que el área de absorción sea máxima, o sea, se distribuyen a lo largo 
del sólido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorción. 
El equilibrio entre la fase estacionaria y móvil permite la separación delanalito. Si vemos la 
ilustración de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la 
fase sólida, los huecos en ella son los sitios de absorción, donde el analito interacciona con la fase 
estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque 
generalmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de 
magnesio. 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 28 
 
 
Aplicaciones. Esta es una de las técnicas cromatográficas mas antiguas, su uso depende del 
tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza química, en particular se usa para la 
separación de compuestos isoméricos, especies no polares, hidrocarburos alifáticos, y para compuestos 
con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrógeno fuertes, por ello es utilizada para 
separar azúcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas así como oligosacáridos, y también 
se ha usado para obtener proteínas biliares. 
2.7 Cromatografía de partición de columna 
Esta técnica se basa en la retención del analito en una columna sólida como granos de fibra o 
cualquier otro material inerte químicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente 
afín al analito; y una fase móvil liquida o gaseosa; cuando la fase móvil pasa a través de la columna, el 
equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al 
final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fase 
móvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los círculos, alrededor de los cuales hay una 
capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito, 
donde este se disuelve. 
 
Las moléculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la móvil, a esto se le llama 
partición puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoquímica del sistema, entre 
las dos fases. La retención depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la 
matriz sólida, y de que tanto la fase móvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el 
analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 29 
 
de solvente adherida a la matriz sólida, y como vemos también, el analito se distribuye entre la capa de 
solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como esta 
sobre una columna, por ello se le llaman partición de columna. 
 
La solubilidad en ambas fases esta dada por el coeficiente de partición, KD: 
𝐾𝐷 =
 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙 
𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎
 
Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene 
diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separación del analito de la mezcla 
se logra por migración diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de la 
columna, el reparto en esta será mayor que en la fase móvil. 
Aplicaciones. Esta técnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o líquidos 
inmiscibles. 
2.8 Cromatografía en gel. 
La separación basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin carga 
durante una migración osmótica a través de geles. La filtración en gel es el método de separación que 
consiste en la separación de moléculas basado en el tamaño relativo de las mismas. 
En la cromatografía en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimérica cuyos poros se 
llenan con el solvente que se usará en la fase móvil. 
El flujo de la fase móvil provocará que moléculas mayores pasen a través de la columna 
libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículas más pequeñas tardarán más tiempo en 
salir dependiendo de la penetración que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergen 
de la columna de acuerdo a masa molecular relativa. 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 30 
 
 
El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del líquido afuera de la matriz de gel 
(V0, volumen de la fase móvil que eludirá a una molécula completamente excluida ), el volumen del 
líquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm). 
El volumen de elusión (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: ide VKVV  0 
Kd es el coeficiente de distribución volumétrica: ied VVVK /)( 0 
Kd caracteriza el comportamiento de retención del soluto. Representa la fracción del volumen del gel 
que es accesible a la molécula en cuestión. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una 
serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene: 
 
En un rango pequeño de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una línea recta: 
MBAKd log 
La separación por cromatografía en gel está influenciada por las propiedades de los poros de la 
red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material 
para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polímeros 
entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente 
suave. Los aerogeles son sólidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el 
vidrio y silica porosos. El nombre de los geles más comúnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 31 
 
Aplicaciones. Desalinización: Largas moléculas de origen biológico son separadas de especies 
ionizables o inorgánicas. Un ejemplo en la separación de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex. 
La cromatografía en gel se utiliza para separar proteínas, péptidos, ácidos nucléicos, 
polisacáridos, enzimas, hormonas y los químicos en polímeros, para determinar distribuciones de pesos 
moleculares en mezclas de polímeros. 
2.9 Cromatografía de intercambio iónico. 
El intercambio iónico es un proceso donde una solución de un electrolito se pone en contacto 
con una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies 
iónicas de carga similar del analito. Ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solución y 
un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. 
Las resinas cambiadoras de iones están constituidas por una red tridimensional de cadenas 
polímeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una fase 
insoluble con sitios iónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se 
mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condición de 
que se mantenga la electroneutralidad. Una resina típica se prepara por polimerización de estireno y 
divinilbenceno. 
Cambiadores catiónicos. Los grupos funcionales ácidos se pueden introducir fácilmente, tienen el 
protón disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones 
positivos. 
Cambiadores aniónicos. Si se introducen grupos funcionales básicos, la resina intercambia aniones. Los 
cambiadores aniónicos se preparan con aminas, obteniéndose in grupo amonio, y por tanto, un medio 
básico. 
Las propiedades más importantes que determinan el funcionamiento de una resina: 
o Tamaño de las partículas – velocidad de intercambio y permeabilidad de la columna. 
o Naturaleza de los grupos funcionales – tipo de los iones intercambiables. 
o Fuerza de los grupos funcionales – coeficiente de distribución. 
o Número de grupos funcionales– capacidad de la resina. 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 32 
 
A partir de la sustitución de cantidades equimolares de iones de cargas iguales, se obtienen 
equilibrios de intercambio. Se aplica la ley de acción de masa, donde K(coeficiente de selectividad), es la 
constante de equilibrio del sistema. Y donde el coeficiente de distribución KD: 
][
][


H
HRK
KD 
Efecto del pH del eluyente. La carga eléctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir 
por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relación de distribución o evitar un 
intercambio total. El efecto del pH sobre la elusión: 
 
Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metálicos dando iones complejos 
de carga negativa. En esta forma, los cationes metálicos que se separen mal en cambiadores catiónicos, 
se pueden complejar y separar en cambiadores aniónicos. 
Aplicaciones. Eliminación de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasándola a 
través de un cambiador de cationes, y después a través de un cambiador de aniones. 
Separación de aminoácidos. La naturaleza anfótera de este grupo permite cambiar el signo de su carga o 
eliminar la carga neta, de modo que un ácido determinado se puede intercambiar en una resina 
aniónica, en una resina catiónica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solución. 
2.10 Cromatografía covalente 
Es un sistema especial de cromatografía, el cual es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que se 
forma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolécula a separar, las 
separaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura” típico de la biología molecular; por lo cual es 
muy utilizado en esta área, además de tener un pequeño inconveniente de que al ser tan selectiva, solo 
se puede separar un solo analito. 
 
 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 33 
 
2.11 Conformación de la cromatografía covalente 
a) Ligandos: Se trata de biomoléculas que se encuentran en una base sólida, siendo estas las 
responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2 
maneras: Ligandos específicos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y 
los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las 
lectinas y nucleótidos. 
b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe 
poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carácter suficientemente 
hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, 
en especial para trabajar a alta presión, estos soportes generalmente geles orgánicos derivados de los 
polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG. 
2.12 Fundamento de la cromatografía de afinidad 
Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la 
columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado 
covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este 
ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a la 
elusión de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el 
acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase móvil que desactiva el acoplamiento por 
alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; 
generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos de esta 
manera se eluye el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la 
columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil siendo una etapa 
rápida. 
 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 34 
 
2.13 Cromatografía Flash 
Es un método cromatográfico, el cual nos permite separar de una manera rápida, fiable y económica; 
principalmente utilizada para la separación y purificación de proteínas. 
La Cromatografía Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para la 
separación puede llevarse a cabo con relativa rapidez. 
El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuración de las columnas (variables por el 
usuario), una bomba peristáltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiación 
ultravioleta para detectar las biomoléculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente de 
elusión, las válvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyección de la muestra, la selección 
de la columna o corriente de inversión, y un controlador con una función de integración 
computadorizada, en el cual se muestran los resultados de el análisis. 
 
Aplicaciones. En farmacia la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) se utiliza para la 
depuración de grandes cantidades de diferentes biomoléculas (es decir, las proteínas y el ADN). 
2.14 Resumen 
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con 
partículas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho 
con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de 
dos sencillos pasos: a) colocación de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b) 
Verificación de compactación (no espacios vacíos). 
El desplazamiento de la muestra a través de la columna, depende de la afinidad por ésta y del disolvente 
empleado para el proceso. 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 35 
 
La elución es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tipos 
de elusiones: Elusión por gradiente (cambio continuo de la composición del eluyente en sentido de 
aumento de fuerza eluyente) y elusión isocrática (un solo disolvente). 
Cromatografía de adsorción: esta técnica aprovecha el fenómeno de la absorción de sustancias en una 
superficie para separar analitos de mezclas al hacerlos pasar por una columna con un material 
adsorbente, que retiene el analito cuando este pasa a través de su superficie. 
Cromatografía de partición de columna: sta técnica permite separar analitos al hacerlos pasar por una 
columna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente químicamente similar al analito, en el que este 
queda disuelto y retenido cuando pasa la fase móvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases, 
en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna. 
Cromatografía en gel: consiste en la filtración en gel que consiste en la separación de moléculas basado 
en el tamaño relativo de las mismas. El flujo de la fase móvil del sistema provocará que moléculas 
mayores pasen a través de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículas 
más pequeñas tardarán más tiempo en salir dependiendo de la penetración que tengan sobre el mismo. 
Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa. 
Cromatografía de intercambio iónico: el intercambio iónico es un proceso donde una solución de un 
electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina son 
remplazados por las especies iónicas de carga similar del analito. Se tiene una fase insoluble con sitios 
iónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su 
alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga. 
Cromatografía covalente: las separaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura”típico de la 
biología molecular; por lo cual es muy utilizado en esta área, además de tener un pequeño 
inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Permite la separación de 
anticuerpos y enzimas. 
Cromatografía Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para la 
separación puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una técnica muy utilizada en el área de 
bioquímica ya que nos permite separar biomoléculas y proteínas. 
 
Cromatografía en fase líquida a columna abierta 
 
Capítulo 3 Página 36 
 
2.15 Bibliografía 
BERMEJO, F. - Química Analítica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma 
edición, Madrid 1991. 
HARRIS, D. - Análisis Químico Cuantitativo - Ed. Reverté - 2ª edición - España, 2001. 
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Química Analítica - 7ª ed - McGraw Hill – México, 2001. 
ROUESSAC - Métodos y técnicas instrumentales modernas. Análisis Químico - McGraw Hill – USA, 2003. 
SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosíntesis and Functions - Addison-Wesley - New 
York, 1975. 
PECSOK, Robert – Métodos Modernos de Análisis Químico – Editorial Limusa – México, 1981. 
BRAITHWAITE, SMITH – Chromatografic Methods – 4° edición - Chapman & Hall – UK, 1994. 
http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm 
http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf 
http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf 
http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm 
www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/ 
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes 
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes 
www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm 
 
http://www.monografias.com/trabajos15/reparacion-pc/reparacion-pc.shtml#BIOS
http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm
http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf
http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf
http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm
Cromatografía de gases 
 
Capítulo 4 37 
 
Capítulo 4 
Cromatografía de gases 
Esta técnica permite el análisis rápido y exacto de gases, vapores líquidos; permite identificar los 
componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado 
notablemente en separación, identificación y determinación de compuestos volátiles (gases y líquidos) 
de puntos de ebullición de hasta 350-400°C. El método tiene las ventajas de ser sensible, rápido y 
sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra información cuantitativa exacta con cantidades 
muy pequeñas de muestra. 
En cromatografía de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna 
cromatográfica. La elución se produce por el flujo de un fase móvil de un gas inerte a diferencia de los 
otros tipo de cromatografía, la fase móvil no interaccionan con la moléculas del analito; su única función 
es la de transportar el analito a través de la columna.Existen dos tipos de cromatografía de gases:la 
cromatografía Gas-Sólido (GCS) y la cromatografía gas liquido (GLC).La cromatografía gas liquido tiene 
gran aplicación en todos los campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente como 
cromatografía de gases (GC). 
En la cromatografía gas sólido se produce la retención de los analitos de una fase estacionaria 
como consecuencia de la absorción física. La cromatografía gas sólido ha tenido una aplicación limitada 
debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de 
elusión con colas muy significativas (como consecuencia del carácter no lineal del proceso de absorción), 
de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas 
especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografía gas líquido se basa en la distribución del 
analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquido inmovilizada sobre la superficie de un sólido 
inerte. 
4.1 Instrumentación 
Los componentes básicos de un instrumento para la cromatografía de gases se muestran a 
continuación, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposición se utiliza 
cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la 
presencia de las moléculas de analito. 
Cromatografía de gases 
 
Capítulo 4 38 
 
Gas portador. Entre los gases portadores deben ser químicamente inertes, se encuentran el 
helio, nitrógeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de 
presión, manómetros y medidores de caudal. Además el sistema de gas portador contiene a menudo un 
tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente 
mediante un regulador de presión de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algún tipo de 
regulador de presión o regulador de flujo instalado en el cromatógrafo. 
 
Sistema de inyección de muestra. La eficacia de la columna requiere que la muestra 
sea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un <tapón> de vapor, la inyección lenta de la 
muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolución .El 
método mas común de inyección de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una 
muestra liquida o gaseosa a través de un diafragma o <septum> de goma de silicona en una cámara de 
vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara demuestra normalmente esta 
unos 50°C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra. 
 
Configuración de la columna y del horno para la columna. En cromatografía de 
gases se usan dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha la 
mayor parte de las cromatografía de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en la 
actualidad esta situación está cambiando rápidamente y parece probable que en un futuro próximo, 
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0f/Inyector_gc.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0f/Inyector_gc.png
Cromatografía de gases 
 
Capítulo 4 39 
 
excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnas 
abiertas más eficaces y rápidas. Las columnas cromatográficas varían desde menos de 2 hasta 50m de 
longitud o más. Están construidas con acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. 
La temperatura de la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha de 
regularse a las décimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno de 
temperatura controlada , la temperatura optima de la columna depende del punto de ebullición de la 
muestra y del grado de separación requerida. 
Sistemas de detección. El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientes 
características. 
1.- adecuada sensibilidad 
2.- buena estabilidad y reproducibilidad 
3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud 
4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 
400°C 
5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal 
6.-alta fiabilidad y manejo sencillo 
7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamente 
predecible para uno o más tipos de soluto 
8.-no destructivo de la muestra. 
Resolución (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolución de la columna y 
que se denomina resolución de la columna y se define: 
𝑅𝑠 =
2 𝑡𝑟2 − 𝑡𝑟1 
𝑊𝑏1 +𝑊𝑏2
 
Si se toma W como el ancho medio de los picos, la ecuación queda: 
𝑅𝑠 =
2 𝑡𝑟2 − 𝑡𝑟1 
𝑊
 
Para los picos que están próximos entre sí Wb1 y Wb2 serán lo suficientemente parecidos como 
para que baste medir sólo uno. 
 
Cromatografía de gases 
 
Capítulo 4 40 
 
Como lo muestra la figura, la