TALLER-1-GenAIãÆA-tica-2019

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Taller 1 Genética. 
Departamento de Biología Celular e Histología 
1° Unidad Académica, FMED, UBA. 
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TALLER 1 DE GENÉTICA 
Guía de actividades 
Introducción: 
Existen múltiples técnicas moleculares para determinar de manera directa la secuencia de 
nucleótidos presentes en un fragmento de ADN, que pueden utilizarse para detectar variaciones 
respecto de una secuencia tomada como patrón (secuencia wild type). Esas variaciones son 
consideradas mutaciones: cambios permanentes en la secuencia del ADN. 
En este taller analizaremos dos aplicaciones de las técnicas directas de detección de mutaciones: 
el diagnóstico molecular en el contexto de enfermedades producidas por mutaciones en genes 
únicos y el uso en medicina forense (filiación, criminalística, etc). 
Las técnicas analizadas en este taller son: PCR, PCR alelo específica y secuenciación de Sanger. 
Para interpretar correctamente los resultados de las técnicas moleculares deben comprenderse 
sus fundamentos bioquímicos y tener en cuenta las características de las secuencias presentes 
en el genoma humano. 
 
PARTE 1. Aplicación de técnicas directas para la detección de mutaciones en el diagnóstico 
molecular. PCR, PCR alelo específica y secuenciación de Sanger. 
 
La Fibrosis quística constituye una patología multisistémica producto de la alteración en el 
transporte de iones en las células epiteliales. Afecta principalmente, a la secreción de las 
glándulas exócrinas y a los epitelios de los aparatos respiratorio, digestivo y reproductor. Desde 
un enfoque genético clásico, se la define como una entidad monogénica mendeliana de herencia 
autosómica recesiva. Esto significa que padecen la enfermedad quienes poseen en su genoma 
dos variantes alélicas patogénicas del gen involucrado, heredadas por vía materna y paterna 
respectivamente. 
En el año 1989 puedo determinarse que el gen involucrado en esta patología codifica un canal 
iónico que fue denominado CFTR1 (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator: 
Regulador transmembrana de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística). 
Variante alélica wild type: El locus del gen CFTR está ubicado en 7q31.2; presenta una longitud 
de 230 kb, contiene 27 exones. Su producto es un ARNm de 6.5 kb, que es traducido en la 
proteína canal cftr. Esta proteína es transportada a la membrana plasmática y está involucrada 
en el transporte de iones Cl- y HCO3- , y en la regulación de múltiples canales iónicos (entre ellos 
Canal epitelial de sodio: ENac); en consecuencia, participa en diferentes procesos celulares (Ej.: 
respuestas celulares a AMPc; transporte de cloruros; modificación del pH intracelular; 
hiperpolarización de membrana, exocitosis, entre otros)2. 
Variantes alélicas patogénicas: Desde su identificación, se han descripto alrededor de 1.900 
variantes de secuencia (mutaciones) del gen CFTR. Los tipos de mutaciones que se relacionan 
con fenotipos clínicos enfermos son mayormente: mutaciones sin sentido (corren el marco de 
lectura produciendo codones de terminación prematuros), mutaciones en sitios que regulan 
procesos de splicing (ARNm más cortos o con estructura inestable, conlleva a una alta velocidad 
de degradación sin traducción); o mutaciones con cambio de sentido (cambian la secuencia 
aminoacídica alterando la estructura/función proteica). Estos tipos de mutaciones generan 
 
1 Riordan, J.R.et al.(1989) Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of 
complementary DNA. Science 
2 Para mayor información sobre los procesos celulares que involucran a la proteína cftr consultar: 
http://www.uniprot.org/uniprot/P13569 
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desde un punto de vista funcional celular pérdida de función (alelos nulos o alelos 
hipofuncionantes). La mutación más prevalente en afectados es c.1521-1523delCTT// 
p.Phe508del (mutación que a nivel del ADN representa la pérdida de 3pb entre los nucleótidos 
1521-1523 del exón 10 y a nivel proteico se expresa como la ausencia del aminoácido 
fenilalanina en la posición 508, generando un defecto en el plegado proteico que altera su 
transporte a su localización definitiva en la membrana plasmática, comportándose como un 
alelo nulo. Esta mutación presenta una prevalencia del 70% en población de Europa del norte. 
En Argentina también es la mutación más frecuente con una prevalencia del 59% en los 
afectados 
 
Una niña de 8 años presenta signos compatibles con fibrosis quística, pero el diagnóstico es 
controversial. Se decide realizar una prueba de diagnóstico molecular para determinar la 
presencia de la mutación p.Phe508del. La prueba consiste en amplificar mediante PCR una 
región del gen que contiene el triplete CTT del exón 10. Los productos de amplificación se 
resuelven luego en un gel de poliacrilamida. 
A continuación, se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia y 
4: de la niña con diagnóstico presuntivo de fibrosis quística (probando): 
 
 
 
 
1.1 Interprete el patrón de bandas para cada individuo de la familia. ¿Pude explicarse el 
diagnóstico clínico del probando con esta prueba? 
 
Basándose en los resultados obtenidos, se decidió buscar la presencia de la segunda mutación 
más frecuente, llamada G551D, que provoca un cambio de un aminoácido de glicina (G) por un 
ácido aspártico (D) en la posición 551 de la cadena polipeptídica. Para realizar la búsqueda de la 
mutación G551D se utilizó PCR alelo específica. 
 
1.2 Explique el fundamento de la PCR alelo específica. ¿Qué resultados esperaría ver si la 
mutación G551D estuviera ausente en la muestra analizada? ¿Y si estuviera presente? ¿Cómo 
distinguiría la presencia de la mutación en homocigosis y heterocigosis? 
El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica para la mutación G551D 
C1, C2: controles (individuos de genotipo conocido) 
1: padre del probando 
2: madre del probando 
3: hermano del probando 
4: probando 
 
M: marcadores de peso molecular 
CA, CB: controles (individuos de genotipo conocido) 
1: padre del probando 
2: madre del probando 
3: hermano del probando 
4: probando 
 
C1 C2 1 2 3 4 
 
M CA CB 1 2 3 4 
 
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1.3 ¿Qué conclusiones puede sacar de esta prueba para la familia analizada? 
 
Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que en conjunto permiten explicar 
el 84% de los casos. No se pudo encontrar una de estas mutaciones en la familia estudiada. 
Por esa razón, se decidió secuenciar el gen CFTR en los miembros de la familia utilizando el 
método de secuenciación de Sanger. Se detectó una variación respecto de la secuencia wild 
type, en la posición 113 del exón 3. Esta mutación fue hallada en muestras de la madre y del 
probando, pero no en muestras del padre y del hermano del probando. 
A continuación, se muestra el fragmento de la secuenciación que compara la secuencia wild type 
(izquierda) y la mutada (derecha) 
 
1.4 Explique el fundamento de la técnica de secuenciación de Sanger. 
1.5 Observe los fragmentos de la secuenciación. ¿Por qué hay un ‘doble pico’ en la posición en 
dónde se observa la mutación? 
1.6 ¿Explica la mutación hallada el diagnóstico clínico de fibrosis quística? Justifique. 
 
 
 
 
 
PARTE 2. Aplicación en medicina forense I: Análisis de polimorfismos en secuencias no 
codificantes. El uso de secuencias repetitivas en tándem (STR). 
 
A excepción de los gemelos monocigóticos, el material genético de cada individuo es único. Se 
ha estimado que dos genomas humanos, escogidos al azar, difieren aproximadamente en 1 cada 
500 nucleótidos. Esa variabilidad interindividual puedeser estudiada a nivel genotípico 
mediante el análisis directo del ADN. 
Uno de los objetivos del estudio de la variabilidad de ADN es su aplicación en pruebas de filiación 
(paternidad, otras relaciones filiales como abuelidad), o en la identificación de muestras 
pertenecientes a un individuo humano específico (hechos delictivos, medicina forense). Para 
ello se ha utilizado un subgrupo de secuencias repetitivas en tándem (STR: Short Tandem 
Repeat) denominadas ‘microsatélites’. 
 
2.1 ¿Por qué no se utiliza el análisis de ADN de regiones codificantes con fines forenses? 
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En la siguiente tabla se observan ejemplos de STR utilizados en estudios de paternidad 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El polimorfismo de los STR puede determinarse mediante la amplificación de estos por medio 
de la técnica de PCR y el análisis posterior del tamaño de los productos de amplificación por 
electroforesis en gel. A continuación, se observan ejemplos de tres STRs (M: marcadores de peso 
molecular. 1-8: Distintos individuos analizados). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nombre del STR Cromosoma Rango de n repeticiones 
TPOX 2 6-13 
D2S1338 2 11-28 
D3S1358 3 9-20 
FGA 4 15-51 
CSF1PO 5 6-16 
D5S818 5 7-16 
D7S820 7 6-15 
D8S1179 8 8-19 
TH01 11 3-14 
VWA 12 10-24 
D13S317 13 5-15 
PENTA E 15 5-26 
D16S539 16 5-15 
D18S51 18 7-27 
D19S433 19 5-20 
D21S11 21 24-38 
PENTA D 21 2-18 
M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M 
 
M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M 
 
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2.2 ¿Por qué al analizar un microsatélite particular algunos individuos presentan una única 
banda (ejemplo: individuo 5, para el microsatélite D7S820), mientras que hay otros que 
presentan dos bandas (ejemplo: individuo 7, para el mismo microsatélite)? 
2.3 ¿Cuáles son los mecanismos biológicos que permiten explicar el alto polimorfismo 
poblacional de los microsatélites? 
 
Microsatélites en estudios de filiación: 
Para estimar el grado de certeza con que se asigna la paternidad es necesario contrastar la 
probabilidad de que los alelos de un STR presentes en el hijo provengan del presunto padre 
versus la probabilidad que los haya recibido de cualquier otro individuo en la población. De 
acuerdo con eso, se calcula la razón entre ambas probabilidades, denominada índice de 
paternidad (IP). Si al comparar los perfiles del hijo/a con los del presunto padre hay dos o más 
STR en que los que no se observan alelos que tengan el mismo número de repeticiones, se 
excluye la paternidad sin necesidad de realizar un cálculo probabilístico. 
2.4 Observe la siguiente tabla perteneciente a un caso en que se quiere establecer una relación 
de paternidad entre un niño y un presunto padre A (p-padre A), versus presunto padre B (p-
padre B). Los valores representan el número de repeticiones observadas en los alelos de los 
microsatélites estudiados, que han sido determinados mediante la técnica de PCR con posterior 
electroforesis en gel. ¿Qué conclusiones obtiene? ¿Alguno de los dos es el padre biológico del 
niño? Justifique. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nombre del 
STR 
Alelos de 
la madre 
Alelos 
del hijo 
Alelos del 
p-padre A 
Alelos del 
p-padre B 
TPOX 8 8 8 8 8 11 8 11 
D2S1338 19 19 19 20 20 22 21 22 
D3S1358 15 15 15 16 15 16 15 18 
FGA 23 25 23 23 21 23 21 22 
CSF1PO 11 12 11 12 12 12 6 16 
D5S818 11 13 12 13 11 12 11 11 
D7S820 10 11 11 12 12 12 12 12 
D8S1179 11 13 11 15 13 15 11 13 
TH01 9 9 6 9 6 7 7 8 
VWA 16 17 17 18 15 18 15 16 
D13S317 8 11 8 13 12 12 11 11 
D16S539 11 14 11 14 11 13 12 12 
D18S51 17 18 17 18 13 17 14 16 
D19S433 13 15 15 15 15 15 13 14 
D21S11 29 31 29 31 29 30 24 25 
 M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M 
 
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Para seguir practicando: 
Se sugiere realizar el ejercicio 1 de la “Guía complementaria de actividades 
de práctica y autoevaluación”