tesis-n2541-AlconadaMagliano

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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. 
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Tesis de Posgrado
Enzimas de Fusarium oxysporumEnzimas de Fusarium oxysporum
f.sp. melonis involucradas en laf.sp. melonis involucradas en la
degradación de la pared celular dedegradación de la pared celular de
las plantas superioreslas plantas superiores
Alconada Magliano, Teresa María
1992
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Biológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico
Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding
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Cita tipo APA:
Alconada Magliano, Teresa María. (1992). Enzimas de Fusarium oxysporum f.sp. melonis
involucradas en la degradación de la pared celular de las plantas superiores. Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
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Cita tipo Chicago:
Alconada Magliano, Teresa María. "Enzimas de Fusarium oxysporum f.sp. melonis involucradas
en la degradación de la pared celular de las plantas superiores". Tesis de Doctor. Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1992.
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mailto:digital@bl.fcen.uba.ar
UNIVERSIDAD DE BÚENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACPAS Y NATURALES
Enzimas de Fusarium oxysporumf. sp. melonis
involucradas en la degradación
de la pared celular
de las plantas superiores
Lic. Teresa Marfa Alconada Magliano
Directores: Dra. María Jesús Martínez Hernández
Dr. Miguel Angel Galvagno
Departamento de Ciencias Biológicas /
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales /e 3/5
Universidad de Buenos Aires ¿97/
Tesis presentada para optar por el tftulo de 7
Doctor de la Universidad de Buenos Aires
1992
A nie queridos padres
A¡1 linda familia
Por 1a suerte de tenerlos
Agradecimientos:
Una etapa concluye, y con ella muchos recuerdos, situaciones,
el paso de mucha gente amiga, algunos alejados por la
distancia, pero siempre queridos y recordados, otros que son
mi presente cotidiano, a todos ellos, los que de una forma u
otra me han acompañado, enseñado, ayudado y han sido parte de
mis dias en en estos años de trabado, compartiendo buenos
momentos, alegrias, y a, veces también momentos dificiles,
gracias, gracias por que sola no hubiera podido realizar esta
Tesis, la cual me alegra haber podido concluir, pero lo que
realmente me alegra, es toda la gente que ella encierra, el
vinculo afectivo creado cotidianamente con todos ustedes.
No puedo dejar de recordar en este momento a la Facultad de
Ciencias Naturales y Museo de mi ciudad, La Plata, en donde me
Licencié, a todos mis compañeros, amigos, y profesores con
quienes comparti años muy especiales, muchos nombres de esa
época se vienen a mi memoria, nombres de amigos que siempre
estaran, y entre ellos el tuyo, Angélica Arambarri, mi
profesora y amiga de esos dias, a vos que siempre te
preocupaste por mis decisiones, que siempre me tendiste una
mano.
Fue en el Centro de Investigaciones Biológica del CSIC , en
Madrid, donde me inicie en la investigación, y con ello el
comienzo de esta Tesis; mi agradecimiento infinito a la Dra.
Fuensanta Reyes, quién me dio la oportunidad de formar parte de
su grupo de trabado, de ser uno más de ellos, de aprender.
A vos, Maria Jesús Martinez, a vos que me enseñaste mucho,
muchisimo sobre enzimas, pero que fundamentalmente te brindaste
como persona, que me enseñaste lo que reconforta el ser
solidario, compañero,el dar sin esperar recibir, gracias por
tu ayuda. tu amistad, tu cariño.
A Paco Guillen, Giovanni, Jose Luis Copa Patiño, a ustedes que
bien se reian de mi en esos dias, tal vez por no saber casi
tomar una pipeta, o tal vez por lo raro que les parecia que
hablaba. a ustedes que tanto me hicieron reir, mis primeros
compañeros de trabado, comono los voy a recordar ahora.
A Covadonga Vázquez, Maribel Pérez Leblic, Tere Raposo.
Carlos. Carmen Muñoz, Elisa, Angel Martinez, Aldo, por haber
sido parte responsable de mis buenos dias madrileños.
Y finalmente aqui, en la Facultad de Ciencias Exactas Y
Naturales de la UBA,aqui, en este lugar tan contradictorio,
este mundotan especial, reflejo tal vez de nuestra realidad,
al que me costó incorporarme, pero que finalmente aprendi a
querer y valorar, donde tuve la suerte de conocer a tanta gente
amiga y hospitalaria.
Te agradezco Miguel Angel Galvagno el haberme dado la
posibilidad de concretar aqui este trabajo, por el tiempo que
me dedicaste, por lo que me enseñaste.
Gracias por la compañia diaria a todos los de Botánica y
Micología, por su ayuda, por su amistad , a Laura Levin,
Marcela Ramos , Andrea Vega, Luis Diorio, Diana, Alejandro
Pardo, Andrea Sívori, Paula Magnslli, Verónica Suárez y
especialmente a Flavia Forschiani y María Esther Ranalli.
Gracias también a Carlos Lima, por su rotavopor. liofilizador,
y otros préstamos.
Y a vos Maria Delia Bertoni, que me hiciste un lugarcito en el
laboratoro 7, a vos que me acompañaste todo este tiempo, y
sobre todos cuando llegué aqui sin conocer a nadie, muchas
gracias.
No Nuria Romero, no te he olvidado, es que tal vez te merezcas
un parrafo sólo para ti, te acordes al principio, vos siempre
pelando semillitas, casi ni les sacabas la mirada, creo que
tardamos 1 o 2 años en diridirnos la palabra,y ahora mi fiel y
gran amiga Nur, gracias por todo, y también por los dibujos
para 1a Tesis.
Mi mas profundo y sincero agradecimiento a toda la gente de
Biologia Molecular, mi segundo laboratorio, y a las chicas de
Mucor, gracias por su compañia y amistad diaria. por todo el
material prestado, por sus consejos, por todo el cariño que me
brindan, gracias a Cristina Paveto, Maria Leonor Cantore.
Silvia Moreno, Andrea Samela. Alicia Zelada. Damian Romero,
Elba Pereira. Vanina, Silvia Rosi.
Y a ustedes, Lilian Montero, Giorgia Egidy y Pedro Fernandez
Murray, mis super y queridos amigos, para quienes sobran las
palabras.
Agradezco muy especialmente a la Dra Susana Passeron por
haberme permitido el uso y casi abuso del laboratorio de
Biología Molecular, por haberse acercado a mi manifestándome
interés por mi futuro y brindarme su ayuda.
Agradezco a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la
Universidad Nacional de Buenos Aires por haberme permitido
realizar aqui este trabado, y al Consejo Nacional de
Investigaciones Cientificas y Técnicas por haberme otorgado una
beca en investigación.
A todos, muchas gracias.
INDICE
INTRODUCCION
. Pared celular de los vegetales.
. Degradación enzimática de la pared celular vegetal.
Relación con la fitopatogenidad.
Inducción-represión de los sistemas enzimáticos
. Autólisis. Relación con la producción de enzimas
extracelulares.
. Ubicación sistemática de ¡usarium oxysporum.
Caracterización de FUsarium oxysporum.
6.1. Marchitez vascular.
PECTINASAS
7.1. Generalidades.
7.2. Composiciónquimica de los sustratos pécticos.
7.3. Clasificación y modode acción de las pectinasas.
7.4. Rol de las enzimas pécticas en la interacción.
hospedador-patógeno.
7.5. Purificación de las pectinasas extracelulares.
CELULASAS
8.1. Generalidades.
8.2. Composición quimica de la celulosa.
Tipos de celulosa.
8.3. Clasificación y modode acción de las celulasas.Problemas en su estudio.
8.5. Mecanismosque operan en la solubilización
microbiana de la celulosa cristalina o nativa.
8.6. Sineraismo.
8.7. Relación entre estructura y actividad.
8.8. Purificación de las celulasas extracelularss.
a) A
. XILANASAS
9.1. Generalidades.
9.2. Composiciónquimica del xilano.
Tipos de xilano.
9.3. Clasificación y modode acción de las xilanasas.
9.4. Consideraciones para su estudio.
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9.5. Relación entre estructura y actividad.
9.6. Purificación de las xilanasas extracelulares.
10. Uso de las enzimas degradadoras de pared en
procesamientos de biomasa.
10.1. Enzimas involucradas en la conversión de
biomasa.
10.1.1. Celulasas.
10.1.2. Hemicelulasas (xilanasas).
10.1.3. Pectinasas.
OBJETIVOS
MATERIALES Y METODOS
maximum-(nm
. Organismoutilizado en este estudio. Procedencia.
Mantenimiento
Preparación de inóculos.
. Medios de cultiv0;
Condiciones de cultivo. Tomade las muestras.
Determinación de azúcares reductores.
Determinación de proteinas.
Estimaciónde la proteina intracelular (total).
Solucionesbuffer utilizadas.
. Valoraciones de las actividades enzimáticas.
9.1. Pectinasas.
9.1.1. Actividad Galacturonasa.
9.1.1.a. Actividad Exopoligalacturonasa.
9.1.1.b. Actividad Exopolimetilgalacturonasa.
9.1.2. Actividad Pectinliasa.
9.1.3. Actividad Pectatoliasa.
9.1.4. Actividad Endopolimetilgalacturonasa.
9.1.5. Actividad Endopoligalacturonasa.
9.2. Celulasas.
9.2.1. Actividad B-glucosidasa.
9.2.2. Actividad Exo-1,4-B-slucanasa (avicelasa).
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9.2.3. Actividad Endo-1,4-B-slucanaea
(carboximetilcelulasa).
. Xilanasas.
9.3.1. Actividad endoxilanasa.
9.3.2. Actividasd B-xiloxidaea.
9.4. Tabla de las enzimas estudiadas.
10. Métodos de concentración de proteinas.
11.
12.
10.1. Precipitación de proteinas.
10.2. Ultrafiltración.
Caracterizaciones enzimáticas.
11.
ll
11.
11.
11.
11.
11.
11.
11.
1.
.2.
3.
7.
8.
9.
pH óptimo.
Estabilidad al pH.
Influencia del buffer utilizado sobre la
actividad enzimática.
. Temperatura óptima.
. Termoestabilidad.
. Variación de la actividad enzimática con la
concentración de enzima y con el tiempo de
incubación.
Efecto de iones metálicos y EDTA.
Constante de Michaelis-Menten.
Inhibición por producto.
Purificación y determinación de parámetros
moleculares e hidrodinamicos.
12.1.
12.2.
12.3.
12.4.
Cromatografía de exclusión molecular.
12.1.a. Baja eficacia: Sephacryl 8-300,
Sephacryl 8-200 y Sephadex G-200.
12.1.b. Alta eficacia: Superosa 6.
Cromatografía de intercambio iónico.
12.2.a. Baja eficacia: DEAE-Sepharosa.
12.2.b. Alta eficacia: MonoQ.
Ultracentrifuaación en gradientes de sacarosa.
Determinación y cálculo de parametros
moleculares e hidrodinamicos.
a. Radio de Stokes.
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75
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14.
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16.
17.
18.
b. Coeficiente de sedimentación.
c. Peso molecular.
Parámetros de las proteinas marcadores.
13.1. Valoración de las proteinas marcadoras.
Técnicas electroforeticas.
14.1; Electroforesis.
14.2. Isoelectroenfoque.
14.3. Tinción de proteinas.
Maceraciónde tejidos vegetales.
Obtención de protoplastos vegetales.
Drogasutilizadas.
Abreviaturas.
RESULTADOS Y DISCUSION
A - PECTINASAS
1. Parámetros estudiados durante el crecimiento
vegetativo de FUsarium oxysporumf.sp.melonis.
1.1. Variaciones de peso seco, pH, proteinas
extracelulares y sustancias reductores.
1.2. Actividades enzimáticas.
1.2.1. Actividades exopoligalacturonasas
(frente a pectina y ác.poliaalacturónico).
1.2.2. Actividades endopoligalacturonasa
(frente a pectina y ác.poliaalactur6nico).
1.2.3. Actividades liasas (frente a pectina y
ác.poligalacturónico).
2. Precipitación de proteinas.
3. Caracterizaciones de la actividad exoPG
(exopoliaalacturonasa frente a ac.poliaa1ac­
turónico) en el crudo enzimático.
3.1. pH óptimo.
3.2. Estabilidad al pH.
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76
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BO
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B4
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87
B7
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89
90
90
3.3. Influencia del buffer utilizado sobre la
actividad enzimática. 92
3.4. Temperatura óptima. 93
3.5. Termoestabilidad. 93
3.6. Variación de la actividad enzimática con
la concentración de enzima y con el tiempo
de incubación. 95
3.7. Efecto de iones metalicos y EDTA. 97
3.8. Constante de Michaelis-Menten. 99
4. Purificación. 99
4.1. Cromatografía en Sephadex G-200. 100
4.2. Cromatografía en MonoQ. 101
5. Técnicas electroforéticas. 102
6. Caracterizaciones de la actividad exoPG(exopoliga­
galacturonasa frente a ácido poligalacturónico)
purificada. 104
7. Discusión. 105
B - CELULASAS 111
1. Parámetros estudiados durante el crecimiento
vegetativo de Fbsarium oxysporumf.sp.melonis. 111
1.1. Variaciones de proteinas intracelulares,
pH , proteinas extracelulares y sustancias
reductoras. 111
1.2. Actividades enzimáticas: B-glucosidasa.
avicelasa y carboximetilcelulasa. 112
2. Precipitación de proteinas. 114
3. Caracterizaciones de la actividad B-glucosidasa
en el crudo enzimático. 114
3.1. pH óptimo. 115
3.2. Estabilidad al pH. 115
3.3. Influencia del buffer utilizado sobre la
actividad enzimática. 117
3.4. Temperatura óptima. 117
3.5. Termoestabilidad. 118
3.7.
3.8.
. Variación de la actividad enzimática con
la concentración de enzima y con el tiempo
de incubación.
Efecto de iones metalicos y EDTA.
Constante de Michaelie-Menten.
C — XILANASAS
1. Parámetros estudiados durante el crecimiento
vegetativo de Fbsarium oxysporumf.sp.melonis.
1.1. Variaciones de peso seco.pH,proteinas extra­
celulares y sustancias reductoras.
. Actividades enzimáticas B-xiloxidasa y
endoxilanasa.
2. Precipitación de proteínas.
3. Caracterizacionee de las actividades B-xiloxi­
dasa y endoxilanasa en el crudo enzimático.
3.
0)
CO q
COCOCOCD 0|wa
1.
. Estabilidad al pH.
. Temperatura óptima.
. Termoestabilidad.
. Variación de la actividad enzimática con
pH óptimo.
la concentración de enzima y con el tiempo
de incubación.
. Efecto de iones metálicos y EDTA.
Inhibición por producto.
. Constante de Michaelis-Menten: Km.
D - CELULASAS Y XILANASAS
1. Separación y caracterización de las actividades
enzimáticas B-¡lucosidasa, B-xiloxidasa y
endoxilanasa.
1.1. Cromatografía en DEAE-Sepharosa.
1.2. Cromatografía en Sephacryl 8-300.
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140
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1.2.1. Cromatografía en Sephacryl 8-300 de la
actividad B-glucosidasa.
1.2.2. Cromatografía en Sephacryl 8-300 de 1a
actividad B-xiloxidasa.
1.2.3. Cromatografía en Sephacryl 8-300 de 1a
actividad endoxilanasa.
1.3. Ultracentrifugación en gradientes de
sacarosa de las actividades B-glucosidasa,
B-xiloxidasa y endoxilanasa.
1.4. Determinación y calculo de parametros
moleculares e hidrodinamicos de las acti­
vidades B-glucosidasa, B-xiloxidasa y endo­
xilanasa.
1.4.1. Radio de Stokes.
1.4.2. Coeficiente de sedimentación.
1.4.3. Peso molecular.
. Purificación de las actividades enzimáticas
B-glucosidasa. B-xiloxidasa y endoxilanasa.
. Purificación de la actividad enzimática
B-glucosidasa.
3.1. Cromatografía en Sephacryl 8-200.
3.2. Cromatografía en MonoQ.
3.3. Cromatografía en Superosa 6.
. Técnicas electroforéticas.
4.1. Electroforesis.
4.2. Isoelectroenfoque.
. Caracterizaciones de la actividad B-glucosidasa
purificada.
. Purificación de 1a actividad B-xiloxidasa.
6.1. Cromatografía en Sephacryl 8-200.
. Purificación de la actividad endoxilanasa.
7.1. Cromatografía en Sephacryl 5-200.
7.2. Cromatografía en MonoQ.
7.3. Cromatografía en Superosa 6.
. Electroforesis.
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170
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171
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9. Caracterizaciones de la actividad endoxilanasa
purificada.
10. Discusión.
10.1. Celulasas.
10.2. Xilanasas.
E - Actividades enzimáticas con diferentes fuentes
hidrocarbonadas en el medio de cultivo.
E.1. Discusión.
F —Maceración de tejidos vegetales y obtención de
protoplestos vegetales.F.1 - Maceraciónde tejidos vegetales.
F.2 - Obtención de protoplastos vegetales.
F.3 - Discusión.
G - Tablas comparativas de las principales carac­
terizaciones de las actividades enzimáticas
estudiadas.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
176
177
177
186
192
200
200
205
206
210
213
217
INTRODUCCION
1. PARED CELULAR DE LOS VEGETALES
La pared celular es un componentetípico de la célula vegetal.
Por su estructura compleja y ordenada tiene entre otras funcio­
nes la de servir de barrera que defiende a las células de las
invasiones microbianas. Los componentes químicos que forman di­
chas paredes significan un sustrato para la degradación enzi­
mática por parte de los organismos fitopatógenos, los cuales
cuentan con distintos grupos de enzimas que atacan los diversos
componentesde las paredes celulares. La celulosa es la sustan­
cia mas abundante del reino vegetal, y constituye el mayor com­
ponente estructural de las paredes celulares vegetales. En las
paredes celulares vegetales la celulosa se asocia con otros
polisacáridos: las hemicelulosas y sustancias pécticas. La lig­
nina, polímero de unidades fenilpropanoide, incrusta las pare­
des de muchos tipos de células, impartiendo rigidez a la pared
celular.
La arquitectura de la pared celular, esta en gran parte deter­
minada por la celulosa. Este "marco celulósico" consta de un
sistema de fibrillas, formado por móleculas de celulosa. Las
fibrillas son de diferente magnitud: macrofibrillas, microfi­
brillas y subunidades de microfibrillas. En la pared primaria
las fibrillas de celulosa estan orientadas al azar, y en la pa­
red secundaria están en forma ordenada constituyendo distintas
capas dada su diferente orientación.
Tradicionalmente la pared celular de las plantas se ha dividido
en tres regiones de acuerdo a su estructura y función: lamini­
lla media, pared primaria y pared secundaria (Esau,1982).
La laminilla media es una región donde las paredes de las célu­
las están en contacto entre si. La pared primaria tiene una or­
ganización definida y es la más dinámica de las capas. La pared
secundaria cuando se forma. es la porción de la pared que se
deposita cuando ya ha terminado la elongación celular. De una
región a «otra de la pared celular, varía en forma gradual,
tanto la composición quimica comoel grado de organización.
Las sustancias pécticas son los principales constituyentes de
la laminilla media y elementos estructurales de la pared prima­
ria. Las hemicelulosas son los principales componentes de la
matriz de la pared primaria y secundaria, encadenando las
fracciones péctica y celulósica. La lignina llena los espacios
dentro del marco fibrilar de celulosa y se une químicamente a
los polisacáridos.
puentes de Ca*2 entre
moléculas de pectina
molécula de
ácido psctico
glicoproteïnas
molécula de
pectina
molécula de
hemicelulosa
microfibrillas de celulosa
figura i : Esquemade la interconección existente sn la pared
celular primaria de vegetales superiores, entre las fibrillas
de celulosa y la matriz de hemicelulosas y sustancias pécticas.
Las moléculas de hemicelulosa (por ejemplo xilanos) se unen por
puentes hidrógeno a la superficie de las microfibrillas de
celulosa. Algunas de estas hemicelulosas se unen a las
moléculas de acido péctico a travez de cadenas cortas de
pectina. Existen gliooproteinas adheridas a las moléculas de
pectina.
pared secundaria
pared primaria
Direccionde
laafibras
laminilla media
Fibrillae de celulosa
Matriz
HemiCGIUloaa lignina-hemicelulosa
figura ii : Arquitectura molecular de tejidos leñoeoe.
A. Haz de células leñoeae contiguaa!
B. Corte de una célula leñoea mostrando las capas que constitu­
yen la pared celular.
C. Sección de la pared celular secundaria mostrando la relación
de hemiceluloea y lignina con las fibras de celulosa.
2. DMCION ENZIHATICA DE LA PAREDCELULARVEGETAL.
RELACION CON LA FITOPATOGENIDAD.
La degradación de los polisacaridos y otros componentes de las
paredes celulares de las plantas por enzimas extracelulares de
hongos y bacterias es un aspecto fundamental de la patogénesis
en un amplio espectro de las enfermedades de las plantas
(Bateman et al.1976; Wood,1976). Aunqueel papel de estas enzi­
mas puede ser solamente secundario en términos de especifici­
dad o inducción de sintomas, su producción inicial o continuada
puede determinar si la infección tiene lugar o no (Albersheim
et al.1969, Tseg et a1.,1968).
Comovimos, la pared celular de las plantas esta formada por
una estructura compleja y ordenada que constituye una barrera
que defiende a las células de las invasiones microbianas. Un
comportamiento característico de muchos organismos fitopatóge­
nos es la facultad de producir una serie de enzimas capaces de
degradar los polímeros constituyentes de las paredes celulares
de las plantas, pudiendo asi las células fúngicas penetrar en
la célula vegetal. Por lo general, estas enzimas se producen
inductivamente, son extracelulares. muy estables y están pre­
sentes en tejidos infectados.
La capacidad de muchos hongos patógenos de plantas para produ­
cir estas enzimasen cultivo, no es suficiente para adscribir a
estas un papel en la patogenicidad. Sin embargoel estudio in­
vitro de la secreción de enzimas puede ser una indicación del
tipo de enzimas que un patógeno es capaz de producir en rela­
ción con la infección y la enfermedad (Byrde,1979).
La celulosa y hemicelulosa constituyen aproximadamente el 70%
de la biomasa de las paredes celulares en las plantas y su de­
gradación a azúcares por enzimas fúngicas y microbianas es ex­
tensivamente estudiado (Khandkeet al.,1989).
La descomposición de las paredes celulares de las plantas du­
rante la invasión a tejidos y patogénesis es un rasgo
característico de numerosos hongos fitopatógenos (Collmer y
Keen,1986; Keon y Waksman.1991). Estos hongos son capaces de
producir una bateria de enzimas degradadoras de paredes celula­
res, ya sea en condiciones de cultivo o en tejidos de plantas
infectados. Pudiendo ser estos organismos ideales para la pro­
ducción y caracterización de enzimas involucradas en los pro­
cesos de bioconverción industrial (Riou et al.,1992).
3. INDUCCION-REPRBSION DE LOS SISTEMAS ENZIHATIOOS
Los estudios de microorganismos capaces de degradar y crecer
sobre polímeros de paredes celulares originan la cuestión de
comoestos pueden reconocer los sustratos en su medio ambiente
cuando estas moléculas de alto peso molecular no pueden pene­
trar la membranay la pared celular.
Está generalmente aceptado que en la regulación de la sintesis
de enzimas degradadoras de sustratos poliméricos los bajos ni­
veles constitutivos de hidrolasas de polisacáridos interactúan
con los polímeros produciendo pequeños fragmentos solubles
"señales" , los cuales entran a la célula e inducen la sintesis
de las correspondientes enzimas, permitiendo asi la utilización
de los polisacaridos (Reese,1977; Sternberg y Mandels, 1979;
Hrmovaet al.,1991; Riou et al.,1992). Los mas efectivos in­
ductores in-vitro de celulasas incluyen soforosa, celobiosa y
lactosa (Mandela et al.,1960, 1962; Nisizawa et al.,1971;
Fritscher et al.,1990), y los de las xilanasas comprendenxi­
lobiosa y variados xilooligosacaridos (Biely y Petrakova,1984;
Hrmovaet al.1984), además de los no metabolizables alkil y
aril-B-D-xilósidos (Nakanishi et al.,1976; Biely et al.,1980).
El ácido galacturónico ha sido postulado como el inductor de
las actividades pécticas en diversas especies de Fusarium y Bo­
trytis (Cooper y Wood, 1975; Aguilar y Huitron,1987; Leone y
Van den Heuvel,1987; Riou et al.,1992). Aunque estos mecanismos
no han sido aún totalmente aclarados. Martinez y col.(1986),
consideraron que la presencia de acidos urónicos en el micelio
de hongos fitopatógenos y saprófitos pudiera estar relacionado
con la inducción de enzimas pécticas y la patogenicidad de esos
hongos.
Cooper et al. (1977) establecieron que el mecanismoregulato­
rio de la inducción por parte de las enzimas pécticas, genera­
das por los hongos, es generalmente iniciada por poligalactu­
rOnidos,acido galacturónico y sus análogos.
La inducción y represión catabólica de enzimas pécticas ha sido
establecida para Vérticillium albo-atrum y Fhsarium oxysporum
f.sp. lycopersici. La producción de enzimas pécticas aumenta
con el agregado de galacturonato en niveles controlados, pero
estas actividades decrecen ante un agregado ilimitado (Collmer
y Keen,1986).
Otra explicación para la inducción de la sintesis de enzimas
degradadoras de polisacáridos enfatiza en la necesidad de un
contacto fisico entre la célula y los polisacaridos (Berg y
Pettersson, 1977; Binder y Ghose,1978).
Comodijimos, los principales componentes de la madera incluyen
celulosa y hemicelulosas (xilanos, mananos, xiloglucanos, glu­
comananos, galactoglucomananos) unidos a la lignina, exten­
diéndose a través de la pared celular de las plantas. Dado que
la estructura quimica de los componentes de la madera es alta­
mente compleja, no esta aclarado totalmente el verdadero ca­
rácter de los inductores naturales de celulasas y xilanasas en
las plantas. Estos inductoree naturales puedenestar represen­
tados no sólo por homodisacaridos tales comola celobiosa y xi­
lobiosa, sino también por varios heterodisacáridos, originados
por ejemplo de xiloglucanos (ej. 4-O-B-D-xilopiranosil L-arabi­
nosa). Hrmovaet al. (1991), demostraron que utilizando los ho­
modisacáridos celobiosa (o sus isómeros) y xilobiosa en
T.reese1 GW9414y A.terreus la inducción de las respectivas
actividades enzimáticas se encuentra baJo control regulatorio
separado. Esto resultó de interés para investigar mezclas de
disacáridos, tales comoglucosilxilosas y xilosilglucosas, como
inductores de ambos tipos de hidrolasas de polisacaridog. De­
terminándose la especificidad del sustrato y el númerode dis­
tintas formas enzimáticas de las celulasas y xilanasas induci­
das por los diferentes disacáridos.
Diversos organismos productores de celulasas han demostrado
sensibilidad a los catabolitos resultantes de la hidrólisis de
celulosa. Experimentalmente se observó que la glucosa o celo­
biosa limitan o inhiben la producción de enzimas celuloliticas
en Vérticillum albo-atrum, Trichoderma Viride, T.reesei, Peni­
cillum italicum, Sporotrichum thermophile (Khandre et al.,1988;
Wood,1990). El efecto ya sea inductor o represor de la
celobiosa para las actividades celulasa, varia en los
distintos microorganismos, dependiendo en ciertos casos su
efecto, de la concentración a la cual se encuentra.
Es aceptado en la generalidad de los casos que la producción de
enzimas extracelulares es reguladad por un mecanismode induc­
ción y represión catabólica. el cual difiere de un microorga­
nismo a otro (Ryu y Mandels,1980; Collmer y Keen,1986).
4. AUTOLISIS. RELACION CON LA PRODUCCION DE ENZIHAS
EXTRACEUULARBS.
El crecimiento de los hongos. comode cualquier otro organismo,
puede dividirse en cuatro fases definidas: latencia, exponen­
cial, estacionaria y la fase de declinación o autólisis
El crecimiento máximo de un hongo se alcanza cuando se esta­
blece el equilibrio entre los procesos de crecimiento y los de
degradación. Cuandoen un cultivo predomina el proceso degrada­
tivo se considera la existencia de autólisis. La autólisis
puede ser desencadenada por factores externos tales como, natu­
raleza y concentración de la fuente de nitrógeno y de carbono,
relación carbono/nitrógeno, condiciones de cultivo como pH y
temperatura, adición de antibióticos o vitaminas, y por facto­
res internos, como son, desoganización y envejecimiento de
OPBGnulos,acumulación de metabolitos secundarios tóxicos etc.
La acción conjunta de estos factores determinaria una autólisis
natural que se produciria comoresultado del proceso de enveje­
cimiento determinado genéticamente y de la influencia del medio
ambiente. Por lo tanto se ha. considerado que la. principal
causa de la autólisis es, aparentemente, la perdida del balance
material existente en le hifa del hongo, causado por factores
internos o externos, a los que contribuyen de manera especial
la falta de nutrientes, especialmente la de fuentes de energia.
El hongo en esta fase degrada primeramente sus sustancias de
reserva y después tiene lugar una degradación tanto del cito­
plasma como de la pared celular, produciendo los elementos ne­
cesarios para su supervivencia. La autólisis tiene lugar por
las enzimas liticas que el hongo tiene o sintetiza para llevar
a cabo este proceso degradativo con la cooperación de procesos
quimicos y fisicos, produciéndose un reciclaje de los productos
metabólicos de la degradación, por lo que la autólisis puede
ser considerada comoun camino de supervivencia en condiciones
de inanición. Debe considerarse que ademas de un aumento de
ciertas actividades enzimáticas durante esta fase, puede igual­
mente existir una inhibición o desaparición de otras activida­
des enzimáticas. Reyes et al. (1981) determinaron que durante
el proceso degradativo no solamente hay secreción de proteinas
ya existentes al medio, sino que también hay proteinas de nueva
sintesis, que ha tenido lugar en el proceso degradativo.
El conocimiento de los mecanismoque regulan la sintesis de las
enzimas que degradan la pared celular del hongo es esencial
para la interpretación del proceso autolitico. Probablemente
los inductores de la sintesis de estas enzimas, son los propios
polisacaridos existentes en la pared celular de cada hongo, o
los monómerosu oligómeros producidos en la lisis de dicha pa­
red y mantenidos en el liquido de cultivo a los bajos niveles
requeridos para la inducción, debido al reciclaje de sustancias
que tiene lugar durante la autólisis (Reese,1977).
Numerosostrabajos afirman que en la fase de autoliaig del cre­
cimiento de hongos filamentosos diversas enzimas liticas degra­
dativae incrementan su actividad en el liquido de cultivo
(Reyes y Byrde,1973; Lahoz et al.,1973), asi comoen el micelio
y en la pared celular (Polacheck y Rosenberger.1975; Reyes y
Lahoz,1977). Estas enzimas que catalizan la degradación de los
polisacaridos de la pared celular y del material citoplasmatico
de los mismos hongos, se consideran que Juegan un rol impor­
tante en los procesos de patogenicidad (Bateman y Basham,1976).
Martinez y col. (1982) describieron ciertas actividades enzima­
ticae producidas durante la fase de autólisie de crecimiento en
Botrytis cinerea, las cuales estan directamente implicadas en
la degradación de las paredes celulares de las plantas y el
efecto de estas sobre la maceración de tejidos vegetales.
La fisiología y bioquímica de la autólisis asi comolas impli­
caciones que esta fase del crecimiento pueda tener tanto en los
procesos de patogenicidad como en la obtención industrial de
metabolitos y en especial de enzimas liticas, han sido amplia­
mente estudiadas (Lahoz et al.,1976,1979,1986; Martinez et
al.,1982,1986,1988; Perez-Leblic et al.,1982; Reyes et
al.,1981,1884,1988).
5. UBICACION SISTEHATICA DE FbaarIUI OXTIPOPHD.
Pertenece a la Clase forma Deuteromycetes (hongos imperfectos),
al Orden forma Moniliales, y a la familia Moniliaceae.
F.oxysporum, fue incluido en la Sección Elegane por Wollenweber
y Reinking (1935).
Para la clasificación de Fusudum app. se tienen en cuenta
ciertas caracteristicas morfológicas comoser: tipo de creci­
miento del micelio aéreo, presencia o ausencia de microconi­
dios, macroconidios y clamidosporas, asi como su tipo de agru­
pación, coloración y forma.
10
FUBBPIHDOXTBPOPUMGata relacionado con los Ascomycetes en par­
ticular, con varios géneros del orden Sphaerialee: Neotria,
Gibberella, Chlonectria, Plecphaerella.
Fioxysporum es una de las mas variables especies de Fhsarium.
dado por sus caracteristicas macro o microscópicas. Las formas
patógenas se reconocen por su poder selectivo de infección,
considerándose formas biológicas de una misma especie, en cam­
bio las formas saprófitas son clasificadas como Fhsarium oxys­
porumúnicamente. Es decir que las especies serian determinadas
con un criterio morfológico, mientras que las formas biológicas
lo serian por sus caracteristicas patogénicas,puestas de mani­
fiesto en ensayos de inoculación artificial.
El término forma especializada (f.sp.), seria el conjunto de
cepas que atacan una especie vegetal o a lo sumo a diversas es­
pecies de un mismo género. Las formas especializadas pueden a
su vez subdividirse en razas biológicas, las cuales estarian
especializadas en variedades de una misma especie. Tanto las
formas especializadas comolas razas no son reconocibles morfo­
lógicamente, sólo la inoculación y el comportamiento frente al
hospedante, permiten su identificación.
6. CARACTERIZACIONDE Fusariun axyaporun.
El género FUseriumes considerado dentro de la Fitopalologia,
como el género que agrupa el mayor número de representantes
causales de enfermedades a las plantas en general, asi comoel
grupo más cosmopolita y de mayor difusión en el mundo. Se halla
presente en las mas diversas áreas de la tierra comoser regio­
nes tropicales. en desiertos. y en el artico (Nelson.1981).
Fvsarium spp., son eminentemente hongos terricolas, desarro­
llándose sobre detritos orgánicos, siendo por lo tanto hongos
de vida saprofitaria, pudiendo ser patógenos de una determinada
planta, cuando condiciones favorables facilitan el ataque, de­
nominándoselespor lo tanto saprófitos facultativos.
ll
5° 103 Clfleifica. Besün su modode vivir, al igual que los de­
mas hongos del suelo en dos grupos:
l. Los que viviendo en el suelo, desarrollándose como simples
saprófitos, pueden transformarse en patógenos accidentalmente.
2. Los que tienen el caracter de invasores, siendo en este
caso, organismos especializados en su patogenicidad.
Sobre las plantas causan numerosas alteraciones tales como: po­
dredumbres radicales, de tallos y de frutos, marchitez vascu­
lar, "damping-off, alteraciones cromógenas de la madera, mote­
ados en las hojas, cancrosie y tizón entre otras.
Los hospedantes que pueden ser objeto de ataque por parte de
estos microorganismos, son muy numerosos, estando comprendidos
en todos los grupos de plantas agricolas, industriales, cerea­
les, fruticolas, silvicolas, florales, etc.
Fïoxysporum se lo considera el miembro económicamente mas im­
portante del género Fhsarium, siendo igualmente de amplia dis­
tribución en el mundoy común en un amplio rango de suelos.
Fïoxysporwmflsp.melonis causa una marchitez destructiva en
melón (cucumis melo), la infección se produce en las plántulas
(antes y después de padecer damping-off) y en las plantas más
crecidas (clorosis en las hojas, crecimiento limitado y marchi­
tez generalizada). Aparecenrayas sobre los tallos, las cuales
se tornan necróticas y muestran la masa fúngica con sus esporas
de un color rosado-salmón. En algunos casos los tallos se
agrietan liberando un exhudado amarronado. Los elementos vascu­
lares se tornan roJos anaranjados y los frutos tienen un tamaño
reducido (Booth,1971; Sarasola,1975; Gerlach,1982; Agrios,1987;
Bosland.1988; Nelson,1981).
12
6.1 MARCHITEZ VASCULAR
De todas las enfermedades causadas por Fhsarium, la que produce
mayor daño es la marchitez vascular causada por formas especia­
les de .Fanmmwrum. producida sobre una amplia variedad de
plantas, entre las que se encuentran cultivos agricolas de im­
portancia económica, debido a una obliteración miceliar de los
vasos o por necrosis de los mismos.
Cadacepa individual esta estrictamente restringida en un rango
de hospedantes, generalmente limitada a una única especie o
género de planta, asi comoen el tipo de infección.
F.oxysporumes diseminado por diversas vias, a través de las
semillas (dentro o sobre ellas), en propagulos vegetativos, a
través del suelo, agua, viento y por el hombre. La formación
de clamidosporas presentes en los restos vegetales permite su
supervivencia, esperando la. presencia. del hospedante especi­
fico, y resiste igualmente asi ante condiciones ambientales
desfavorables. Las clamidosporas pueden permanecer en estado de
dormición manteniendo su viabilidad durante varios años. Luego
de germinar las clamidosporas, se produce la penetración en la
planta hospedante, ya sea a través de heridas o directamente.
Una vez que la forma especializada de Fïoxysporum ha penetrado
ya sea inter o intracelularmente a través de los tejidos de la
raiz del huésped adecuado el hongo se diriJe hacia los tejidos
vasculares, diseminandose a traves de la planta por medio del
crecimiento del micelio o por sus conidios, invade luego los
tejidos adyacentes al xilema, pudiendo llegar hasta la corteza.
En este momentopueden hacerse visibles los sintomas externos
comoagallas y grietas en las tallos, resultantes de la exten­
siva colonización y degradación de los tejidos corticales. El
control de Fïoxysporum causante de marchitez en las cosechas
está limitado al desarrollo de cultivos resistentes. En ciertos
casos estos cultivos han permancecido estables largos periodos
de tiempo, en otros casos ante razas mas virulentas de los hon­
gos se ha requerido una introducción regular de nuevos cultivos
13
resistentes. En ciertos casos una combinacion adecuada de cul­
tivos, acompañadade un tratamiento en el suelo y de medidas de
saneamiento adecuadas han dado resultados favorables al control
de esta enfermedad.
Los sintomas externos a esta enfermedad en las plantas herba­
ceas consiste de una incipiente marchitez, acompañada por una
clorosis de las hojas inferiores, los tallos y ramas pueden
igualmente presentar sintomas o permanecer asintomáticas. Los
sintomas se desplazan gradualmente hacia el ápice de la planta,
a menudo ocurren sobre un solo lado de ella, curvandose en
ciertos casos la planta hacia el lado infectado, pudiendo morir
luego la porción afectada. La infección puede seguir pro­
gresando hacia el resto de la planta. marchitándose entera­
mente para luego morir. Generalmente cada planta hospedante
especifica manifiesta sintomas determinados.
La anatomia patológica de las plantas infectadas con formas es­
peciales de F.oxysporumvaria con cada hospedante especifico.
Comoes de esperar las condiciones ambientales influyen en el
establecimiento de este fitopatógeno, las distintas razas son
afectadas por la temperatura, humedady composición de los sue­
los (Nelson,1981; Agrios,1987).
vasos colapsados
tallo enferlovasos de xilena en tallos
o pecfolos sanos
penetración
en la raiz
espora geroinando
/TM”
Q
c7 i , - \chroconidios
IlCEllD planta de ¡eláb
¡archita
clalidosporas
conidios en
aEn: hojas luertas
licelio con esporas
en el suelo
Iacroconidios
figura 111 : Ciclo patológico de la marchitez del melón por
F.oxysporumf.sp.melonis (modificado de Agrios,1987).
15
7. PECTINASAS.
7.1 GENERALIDADES.
Las enzimas pécticas son producidas en grandes cantidades por
numerosos microorganismos asociados an forma patógena a las
plantas (Bateman,1966; Rombouts,1980; Cooper,1981; Martinez et
al.,1988; Cotty et al.,1990; Alaña et al.,1990,1991; Polizeli
et al.,1991). Los polímeros pécticos, cadenas de ácidos a-D-ga­
lacturónicos con uniones (1,4) y derivados metoxilados, son
los principales constituyentes de la laminilla media y de la
pared celular primaria de las plantas superiores (McNeil,1984).
Numerososmicroorganismos patógenos atacan a las plantas hospe­
dantes mediante la secreción de enzimas pécticas produciendo
modificación de la estructura de la pared celular, incremen­
tando la accesibilidad de los componentes de la degradación ha­
cia otras enzimas, la lisis celular y la maceración de tejidos
vegetales (Collmer y Keen, 1986; McNeil et al.,1984; Coll­
mer,1988). Las enzimas pécticas (en sus múltiples formas) son
las primeras polisacaridasas en ser inducidas cuando los hongos
son cultivados sobre paredes celulares aisladas de plantas y
las primeras en producirse en tejidos infectados (Collmer et
al.,1986). Los microorganismos pectinoliticos producen una ba­
teria de diferentes enzimas pécticas según la preferencia al
sustrato, el mecanismo y el patrón de acción (Rexová-Benková
et al.,1976; Polizeli,1991).
Las enzimas pécticas son producidas por distintos hongos como
ser diversas especies de Aspergillus, ¡usarium, Penicillulm,Irichoderma y en Bbtrytis cinerea, Neurospora crasas, Scleroti­
nia sclerotiorum, Alternaria alternate, Rhizoctonia solani,
fihizopus stolonifer, verticillum albo-atrum (Ward,1988;Marti­
nez et al.,lQBB; Waksmanet al.,1991; Polizeli,et al.,1991).
Los hongos patógenos de plantas. creciendo en un medio de cul­
tivo con pectina, producen una mezcla de enzimas las cuales ca­
talizan su degradación. La composición de la mezcla enzimática
y el contenido individual de las enzimas dependerá del microor­
16
ganismo utilizado y de las condiciones de cultivo (Mikes y
Rexová-Benková.1988; Mikes.1976).
Ha sido puesta considerable atención en el estudio del rol de
las enzimas pécticas involucradas en los cambios fisiológicos y
patológicos de las plantas, asi comoel estudio de las condi­
ciones de producción de las enzimas pécticas por microorganis­
mos.
El gran interés en el conocimiento de las pectinasas se centra
en su rol en la invasión a tejidos de plantas por parte de fi­
topatógenos, en la pudrición de frutos y vegetales, en su apli­
cación en el procesamiento de alimentos y su aplicación en la
biotecnología de plantas (Polizeli et al.,1991).
La hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa en los residuos
agricolas de diverso origen es facilitada por inclusión de en­
zimas degradadoras de pectina, en las mezclas de sacarificación
(Coughlan et al., 1985,1986; Considine et al., 1988; Gilles­
pie,1988). Se considera que la remosión de la pectina facilita
a las enzimas celuloliticas y hemiceluloliticas un mayoracceso
a sus sustratos respectivos incrementándose asi la conversión.
Por lo tanto un sistema enzimático extracelular fúngico capaz
de sintetizar todas estas actividades enzimáticas seria parti­
cularmente útil en la conversión de la biomasa. Un ejemplo de
ello lo constituye Penicillum capsulastum. creciendo en un cul­
tivo estacionario al estado sólido, sobre un medio apropiado
(Considine et al.. 1985).
FUsarium oxysporumcausa marchitez sobre una amplia variedad de
plantas, correlacionandose la habilidad de este patógeno a
causar sintomas de marchitez con la composición de la mezcla de
enzimas pécticas que produce (Pérez-Artes y Tena, 1989) y por
la. cantidad individual de enzimas que degradan la pectina
(Paquin y Coulombe,1962). Han sido estudiadas varias enzimas
pécticas de este patógeno , pero en pocos casos han sido puri­
ficadas (Pérez-Artes y Tena, 1990; Cervone et al.,1989).
17
7.2. “¡POSICION QUIMICADE LOS SISI'RANS PECIICDS.
La pectina y el ácido péctico, son los sustratos naturales de
las enzimas pécticas, son heteropolisscáridos ramificados, cuya
cadena: principal esta formada por ácidos galacturónicos con
uniones d-1,4 asociada a azúcares neutros. Los grupos carboxilo
de los residuos ácidos galacturónicos son parcialmente esteri­
ficados con metanol. El grado de esterificación, la proporción
de sacáridos neutros en las cadenas laterales, y el grado de
polimerización (GP) son los principales motivos de la heteroge­
neidad de los compuestospécticos de distinto origen.
Acidopéctico: ác.a-l,4-D-poligalacturónico
(CsHsOs)n Pm: (l76.13)n
Pectina : éster metilico ac.a-l,4-D-poligalacturónico
(CvH100s)1so-zso Pm: 25.000/50.000
La protopectina, es la sustancia péctica madre insoluble en
agua la cual sufre una conversión a pectatos y pectina
(solubles en agua), y en sus productos de desdoblamiento.
(Réxova-Benkovaet sl.,1976).
coou
no u o“
H su H \b
u on
Acido pécticoAcido D-Galacturónico
figura iv : Estructura quimica del ácido D-galacturónico y del
ácido péctico.
18
7.3. CLASIFICACION Y novo DE ACCION DE LAS PECI'IRASAS.
El grupo de enzimas pécticas incluye a las pectinesterasas, las
cuales catalizan la desesterificación de la pectina, y las en­
zimas despolimerizantes, las cuales catalizan el desdoblamiento
de uniones glucosidicas a-(l,4) de las cadenas de pectina.
Las pectinesterasas pertenecen al grupo de la carboxil ester
hidrolasas.
Las despolimerazas catalizan la ruptura de las uniones a-(1,4)
glucosidicas de los sustratos pécticos, por un mecanismohi­
drolitico (enzimas hidroliticas o D-galacturonasas) o por un
mecanismode B-eliminación (enzimas transeliminasas o liasas).
Estos dos grupos han sido divididos a su vez en cuatro subgru­
pos, según (a) su preferencia a pectatos (sales de acidos péc­
ticos) o pectina (sustratos esterificados), y (b) según el pa­
trón de acción terminal (-exo) o al azar (-endo) en la ruptura
de los enlaces glucosidicos. De acuerdo a esta clasificación,
las enzimas despolimerizantes se dividen en ocho grupos, cuatro
corresponden a las hidrolasas y cuatro a las liasas o tran­
seliminasas (Neukon, 1983; White,1988; Polizeli et al.,1991).
1 - Enzimasdesesterificantes
2 —Enzimas despolimerizantes:
2.1- D-Galacturonasa o hidrolasas:
a- endo PG : endo poligalacturonasa
b- endo PMG:endo polimetilgalacturonasa
c- exo PG : exo poligalacturonasa
d- exo PMG: exo polimetilgalacturonasa
19
2.2 - Liasas o transeliminasas:
a­
b- endo PL :
c- exo PAL :
d- exo PL
endo PAL: endo pectatoliasa
endo pectinliasa
exo pectatoliasa
exo pectinliasa
Clasificación de las enzimas pécticas despolimerizantes según
Neukom(1963) de acuerdo al sustrato sobre el que actúan, 8811
mecanismo y patrón de acción:
Patrón de acción
mecanismo sustrato al azar terminal
hidrólisis pectato endo PG exo PG
pectina endo PMG exo PMG
B-eliminación pectato endo PAL exo PAL
pectina endo PL exo PL
20
extremo no reductor extremo reductor
¿bb-"0+,¿”O-"ot
endopolimetilgalacturonaealiasa
M M M M ,+O—o-O-o+ Pectma
pectin esterasa
+0-o+;_;+z>-o+ +o+.+o-o-o+_.
exopoligalacturonasa ­
“asa \ +o-o+.+o-o—¿ex0POli ala t
endopoligalacturonasa _+<17C)_C>_C>4_ 3 C Uronasa
liasa ‘f",f' ácido “\\\\1?ndopoligalacturonasa
+O-O+ * 4-6-04,- POligalac- +O-O-3I- <>+O-O-ÏÏI'I turónico
M-O- -O— 4)­
á01do ' . ¿S-4,5 ácido galacturónicogalacturónico metil ester de_ , , _ insaturado.ac1do galacturonlco
figura v : Modelo del mecanismo de acción propuesto para las
pectinasaa (Ward,1988).
21
7.4. RDL DE LAS ENZIHAS PECTICAS EN LA INTERACCION
HOSPEDANTE-PATOGENO.
Los patógenos de plantas producen un conjunto de enzimas capa­
ces de atacar los componentes celulares de las plantas. Sin
embargo un rol convincente en la patogénesis, ha sido esta­
blecido sólo para aquellas enzimas que atacan la fraccion péc­
tica de las paredes celulares de las plantas.
Se han logrado fundamentales avances al entendimiento del papel
de las enzimas pécticas en la degradación de los tejidos vege­
tales desde las revisiones a este respecto realizadas por Ba­
teman y Millar (1966) hace casi 20 años. Se ha demostrado que
las enzimas pécticas pueden macerar los tejidos de las plantas
en una forma similar a la que ocurre en enfermedades como la
pudrición blanda. Se ha demostrado que existen ciertos mecanis­
mos de defensa de las plantas hacia el ataque de los fitopató­
genos. Fragmentos de azúcares liberados de las paredes celula­
res por acción de las enzimas pécticas pueden producir reaccio­
nes de defensa en las plantas, dependiendo de esto el éxito en
el establecimiento del microorganismo. El rol de los niveles de
azúcares asi producidos en el hospedante y la represión catabó­
lica que ellos producen sobre las enzimas pécticas en los pro­
cesos de patogénesis pueden diferir de una enfermedad a otra.
Unavariedad de tejidos hospedantes han presentado inhibidores
de estas actividades o varían en la susceptibilidad a la mace­
ración con el desarrollo de cambios fisiológicos. Durante la
interacción del patógeno pectolitico y su potencial hospedante
ocurren los siguientes pasos: a) el patógeno posee genes es­
tructurales que codifican la producción de las enzimas pécti­
cas con propiedades catalíticas y fisicas particulares, b) esos
genes son expresados en una forma característica en los tejidos
infectados. c) las enzimas son exportadas desde el citoplasma
del patógeno hacia los tejidos del hospedante, d) en algunos
tejidos esas enzimas encuentran inhibidores o sustratos protec­
tores e), en otros tejidos las enzimas son activadasy degradan
22
los polímeros estructurales de la laminilla media y pared celu­
lar primaria, facilitando así la penetración y colonización del
patógeno.
El resultado de esta interaccion hospedador-patógeno puede es­
tar determinado por distintos factores que operan en cualquiera
de estos pasos (Collmer y Keen,1986).
7.5. PURIFICACION DE LAS PECTINASAS EXTRACELULARES
Varios métodos se emplean en la separación de las enzimas péc­
ticas, como ser cromatografía de intercambio iónico sobre
DEAE-celulosa, CM-celulosa, celulosa fosfato, cromatografía de
exclusión molecular sobre Sephacryl, Sephadex y cromatografía
de afinidad sobre sobre ácidos pecticos unidos por epiclohidrin
y sus amino derivados o sobre poli (hidroxialkil metacrilato)
conteniendo uniones glicosídicas a ácidos oligo-D-galactosidu­
rónicos (Mikes et a1., 1988; Alaña,1991; Martinez,1991;
Riou,1992). Dada la variabilidad en la composición de los com­
plejos enzimáticos pécticos y la necesidad en ciertos procesos
industriales de aplicar preparaciones que contengan Ciertos
componentes del complejo pectolítico o mezclas definidas en su
composición, se requieren procedimientos eficientes y rapidos
para una escala preparativa y analítica en las investigaciones
y en la industria. La cromatografía líquida de alta performan­
cia aplicada a biopolímeros , especialmente a enzimas, ha per­
mitido la aplicación de este rápido método en la separación de
enzimas pécticas de microorganismos y plantas.
Estudios tempranos en este campo sufrieron a menudo la desven­
taja de trabajar con enZimas insuficientemente purificadas. La
aplicación de modernos métodos de separación enzimática, en
distintas combinaciones. han hecho posible las separación de
complejas mezclas enzimáticas, lográndose enzimas homogéneas.
La aplicación de nuevos métodos analíticos, comoser diferen­
tes tipos de electroforesis, han permitido datos sobre sus pro­
23
piedadss moleculares y una mayor rigurosidad en los criterios
de pureza y homogeneidad (Wood .1988; Mikes et al..1988).
B. CELULASAS.
8-1.GENERALIDADES.
La celulosa. poli B-l,4-D-glucopiranósido es el principal com­
ponente de las paredes celulares de las plantas y comovimos el
más abundante compuesto orgánico sobre la tierra. El estudio de
la descomposición microbiana de la celulosa. despierta gran in­
terés dado que el producto resultante, la glucosa, es un mate­
rial fácilmente utilizable por varios microorganismos en la
fermentación industrial.
El mecanismo de descomposición de la celulosa por células mi­
crobianas no ha sido totalmente clarificado, dada la participa­
ción de distintos grupos de enzimas. La celulosa es degradada
por la acción sinérgica de las enzimas; endo-B-l,4-glucanasa
(endocelulasa), exo-B-l,4-glucanasa (exocelulasas) y la B-glu­
cosidasa (Woodward,et al.,1982; Parr,1983; Khan et al..1985;
Sharrock,1988; Jafelice et al,1989; Yoshida, et al. 1989;
Knandke.et al,1989; Woodet al.,1990; Sharma et al.,1991). Es?
tas enzimas han sido halladas y caracterizadas en una variedad
de hongos; Sporotrichum pulverulentum, Sclerotium rolfsii, Is­
laromyces emersonii, ITichodenma pseudokoningii, T.Viride, Pe­
nicillum füniculosum, Aspergillus sp. y Fbsarium sp (Parr,1983;
Yoshida et al.,1989; Khandke et al.,1989; Wood,1990). Tricho­
derma reesei y sus mutantes son los mejores productores de ce­
lulasas conocidos (Khandke et al. 1989; Wood et al. 1971,
Pnbangre et al.1983; Rao et al.1986; Zalewska-Sobezak et
al.1981; Schmid et al,1990; Haab et al.,1990). En numerosas
cepas del género ¡usarium se ha encontrado elevada actividad
celulolitica y xilanolitica (comoser en Filini, F.solani y F.
avenaceum) siendo F.oxysporum uno de los mayores productores de
24
este tipo de enzimas (Soni et al.1979; Zalewska et al.,1981;
Sutherland y Crawford,1982; Yhosida et al.1989).
8.2. COMPOSICION QUIMICA DE LA CELULOSA­
TIPOS DE CELULOSA.
La celulosa es un polímero de la glucosa que forma fibras orde­
nadas en el espacio segun una red cristalina. La estructura
química de la celulosa corresponde a una secuencia lineal de
poli-B-1,4—D-glucosa.
Las fibrillas elementales de celulosa tienen una estructura
completamente cristalina, dado que las cadenas moleculares en
la fibrilla elemental están altamente orientadas, con un alto
grado de orden y agregadas estrechamente entre si.
Se consideran dos tipos de celulosa, la nativa o cristalina ca­
racterizada por un alto grado de cristalinidad (GC) u ordena­
miento y de polimerización (GP), resultando así insoluble, ej:
avicel, fibras de algodón, papel de filtro etc.. y la celulosa
modificada. la cual resulta soluble como la celulosa amorfa,
carboximetilcelulosa, celooligosacáridos, 9to., en las cuales
el GC y GP es menor.
La celulosa amorfa es rápidamente degradada a celobiosa, en
cambio la hidrólisis de celulosa cristalina es más lenta. de­
pendiendo la velocidad de hidrólisis del grado de polimeriza­
ción y cristalinización de la celulosa (Wood,1989,1990;Woody
McCrae,1979).
25
unión hidrógeno intramolecular
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. CH, 2
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4 o OH CH. f H-O
‘ O 0 OH
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H-O H2 OH
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¿ . —H: o Í“:
’ ol
H
I
H
figura vi : Estructura quimica de la celulosa. Se muestran dos
cadenas de celulosa formadas por moléculas de glucosa con
uniones B-l,4. Las uniones hidrógeno intramoleculares
estabilizan cada cadena, las uniones hidrógeno intermoleculares
unen las cadenas entre si, confiriéndole una estructura
ordenada.
8.3. CLASIFICACION Y MODODE ACCION DE LAS CELULASAS.
Existen tres tipos principales de enzimas en los sistemas celu­
lasa que degradan la celulosa cristalina: exocelobiohidrolasa
(1,4-B-D-glucano celobiohidrolasa), endo-1,4-B-D-glucanasa
(1,4-B-D-glucanohidrolasa) y B-glucosidasa (B-D-glucosidasa,
glucohidrolasa, celobiasa). La exocelobiohidrolasa se halla
como el mayor componente en algunos sistemas celulasa, pero
está ausente en la mayoria de ellos. Las enzimas están forma­
26
das por múltiples formas, las cuales difieren en su actividad
relativa sobre una variedad de diferentes sustratos.
Actividad endo-l,4-B—D—g1ucanasa.
La ando-1.4-B-D-glucanasa hidroliza cadenas de celulosa en re­
giones internas amorfas ds ella al azar, produciendo un rápido
cambio en el grado de polimerización. Los sustratos sobre los
que actúan incluyen: carboximetilcelulosa, celulosa amorfa, ce­
looligosacáridos, no atacando en forma significativa a la celu­
losa cristalina comoser fibras de algodón o avicel. La hidró­
lisis de celulosa amorfa produce una mezcla de glucosa, celo­
biosa y otros celooligosacáridos solubles. La velocidad de hi­
drólisis de las cadenas de celooligosacaridos es alta, incre­
mentándose esta velocidad con el grado de polimerización,
siendo la glucosa y celobiosa los principales productos de la
reacción (Sharrock,1988; Woodet al. 1990).
Actividad exo-1,4-B-glucanasa.
Las exo-1,4-B-glucanasas actúan removiendo glucosa
(glucohidrolasa) o celobiosa (cslobiohidrolasa) de los extremos
no reducidos de las cadenas de celulosa. Las celobiohidrolasas
son las halladas más frecuentemente. La mayoría de las celobio­
hidrolasas liberan pequeñas cantidades de glucosa a partir de
la celulosa. El sustrato avicel es el másútil para la medición
de dicha actividad enzimática. Las fibras de algodón no son
atacadas en forma significativa. Otros sustratos sobre los que
actúa en menor grado son: papel de filtro, celulosa amorfa,
hidrocelulosa (Marsden y Gray,1986; Enari y Niku-Paavola).
Actividad B-glucosidasa.
La B-glucosidasa, es un importante componente del sistema celu­
lasa, dado que completa la hidrólisis a glucosa a partir de
27
cadenas cortas de COIOOliBOBaCBridQBy celobioga liberados por
las otras enzimas. Los sistemas celulasa con bajos niveles de
B-glucosidasa tienen bado poder de sacarificación, resultante
de la inhibición de las endoglucanasas y celobiohidrolasas por
parte de la celobiosa no degradada. La B-glucosidasa hidroliza
celooligosacaridos a una velocidad que decrececon el aumento
en el grado de polimerización, no atacando a.la celulosa nativa
(Enari y Niku-Paavola.1987; Woody Mahalingeshwara,1988)
Una de las representaciones esquematicas más frecuentemente ci­
tadas para las celulasas, es la dada por White (1983) para
Trichoderma, el sistema enzimático celulasa ha sido exhaustiva­
mente estudiado en ese género, en especial en Iïressei y sus
mutantes. Modelo que concuerda con el dado por Okazaki (1978).
La celulosa es atacada inicialmente por la endo-l,4-B—D-gluca—
nasa la cual se liga al azar internamente sobre las microfibri­
llas de celulosa en regiones amorfas, produciendo hidrólisis de
enlaces B-l,4 glucosidicos, generandoasi múltiples sitios para
el ataque por parte de las exo-1,4-B-D-glucanasas, la cuales
actúan únicamente sobre los extremos no reductores de la ca­
dena, clivando una unidad de celobiosa. Existe una cooperación
continuada entre la acción de ambas enzimas. Con la acción ter­
minal de la B-glucosidasa, la cual actúa sobre la celobiosa o
también sobre pequeños oligómeros, produciéndose asi moléculas
de glucosa. Un hongo verdaderamente celulolitico es aquel que
produce estas tres enzimas, ya que la degradación de la celu­
losa es un proceso sinergico y secuencial (White,1983; Okazaki
et al.1978).
28
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glucosa O O O O O O O O O O O----"
(GP=1)
figura vii : Modelo propuesto para el mecanismo de acción de
las celulaaas (Okazaki et a1.1978).
E1: endo-l,4-B-D-glucanasa,endocelulasa o oarboximetilcelulasa.
E2: exo-l,4—B-D-glucanasa, exocelulasa o avioelaaa.
E3: celobiasa o B-glucosidasa.
29
8.4. PROBLEMASEN SU ESTUDIO.
A pesar de los numerosos trabajos publicados sobre la puri­
ficación y caracterización, de las diferentes enzimas hi­
drolitícas que conformanlos complejos extracelulares de Ibi­
choderma reesei u otros organismos celulolíticos, el mecanismo
de acción de ellos sigue siendo aún muy limitado en su compren­
sión, atribuyéndose esto a las dificultades encontradas en la
evaluación de la homogeneidadde las distintas enzimas involu­
cradas y en la preparación de sustratos definidos para estudiar
sus propiedades hidrolíticas (Woodet al.,1990; Hagspiel et
al.,1989; Schmidet al.,1990).
Schmid y Wandrey (1990), plantean la dificultad en lograr una
enzima verdaderamente homogénea, sin isoenzimas ni contaminan­
tes del complejo multienzimático. De no lograrse una verdadera
purificación, se obtienen patrones de acción de enzimas enmas­
carados. Las enzimas presentan dintinta afinidad sobre los dis­
tintos sustratos pudiendo liberarse distintos productos según
el sustrato utilizado.
La heterogeneidad física de los sustratos y la complejidad del
sistema enzimático celulasa, hacen que la medición de estas ac­
tividades presenten numerosos problemas. El uso de sustratos
dudosamente definidos, y la presencia de un sistema enzimático
el cual a. menudo consiste de múltiples enzimas actuando en
forma sinérgica de un modo no aclarado totalmente, han hecho
que los enzimólogos desarrollaran numerosos ensayos con el fin
de esclarecer las interacciones involucradas en la descomposi­
ción de la celulosa. La existencia de diversas formas de expre­
sar las unidades de actividad, ha hecho que la comparación de
datos provenientes de distintos laboratorios sea casi imposi­
ble. La evaluación de las distintas actividades se realiza uti­
lizando una amplia variedad de sustratos de diferente grado de
polimerización, de cristalinización, y de polidispersidad (Wood
et al.,1988).
30
La especificidad del sustrato de las distintas enzimas continúa
en el presente siendo un tema no aclarado. La explicación a
este dilema podria ser la existencia de un sobrelapamiento a
la especificidad de los sustratos o que realmente enzimas que
han sido reporteadas como puras en realidad no lo son. El
grado de pureza de la celobiohidrolasa en particular ha sido
cuestionada, en consecuencia el modode acción de estas enzimas
está sujeto a un amplio debate.
En numerosos casos es dificil la clasificación de las enzimas
como estrictamente endoglucanasas y celobiohidrolasas. Por
ejemplo, algunas celobiohidrolasas al estado puro han atacado
B-glucanos en centeno (Henrissat et al. 1985) y aún CM-celulosa
(Woodet al.,1990), los cuales son sustratos en principio ata­
cables por endoglucanasas. Por el otro lado enzimas clasifi­
cadas comoendoglucanasas fueron capaces de hidrolizar celulosa
cristalina (Beldmanet al.1985; Enari y Niku-Paavola, 1987), lo
que se considera 'una propiedad de las celobiohidrolasas. La
confusión no ha terminado con esos casos, incluso se ha en­
contrado endoglucanasas que no actúan sobre celulosa amorfa
preparada como polvo molido de celulosa (Niku-Paavola et al.
1985).
Las enzimas de diferentes fuentes pueden tener diferente espe­
cificidad a los sustratos, pudiendo ser explicadas fácilmente
esas variaciones. Pero cuando la misma enzima de la misma
fuente tiene propiedades completamentediferentes, otras razo­
nes deben contemplarse. Una posibilidad es que las diferencias
puedan ser una consecuencia de la existencia de agregados o
complejos enzimáticos entre celobiohidrolasas y endoglucanasas
que son extremadamentedifíciles de separar en sus partes cons­
titutivas. Tales complejos se han encontrado en ÏTichoderma re­
sei. En este caso compuestos homogéneoselectroforéticamente
de endoalucanasa. xilanasa y B-¡lucosidasa resultaron ser hete­
rogéneos luego de su tratamiento con un reactivo de disocia­
ción de urea octil glucósido (Sprey y Lambert 1983). Se detec­
taron similares complejos entre celobiohidrolases y endosluca­
31
nases en preparaciones enzimáticae homogéneas electro­
foréticamente provenientes de P.p1noph11umy T. reesei (Woodet
al.1989), las cuales habian sido extensivamente purificadas,
lograndose separar luego a través de una columna de afinidad
preparada por acoplamiento de p-aminobenzil-1-thio-B-D-celobió­
sido a Affigel 10 (Van Tilbeurgh et al. 1984). Por lo tanto
puedenexplicarse las distintas opiniones a cerca de la especi­
ficidad al sustrato y el modo de acción, al menos en algunos
casos a la dificultad de obtener las enzimas realmente al es­
tado puro.
El fraccionamiento y otros estudios de las celulasas han mos­
trado que cada tipo de enzima es hallada usualmente en múlti­
ples formas y que los distintos tipos de enzimas actuarian si­
nérgicamente al solubilizar la celulosa cristalina (Woody Mc­
Crae, 1979). Sin embargo, es tema de debate aún el actual nú­
mero de enzimas requeridas para degradar la celulosa crista­
lina, asi como el rol que cada una desempeña en este proceso
sobre el grado de cooperación entre las distintas formas. Estos
puntos oscuros han sido motivo de continuo debate y especula­
ción con respecto al mecanismode acción de las celulasas y han
origidado interrogartes con respecto al grado de pureza y espe­
cificidad del sustrato de las preparaciones enzimáticas estu­
diadas. La nueva tendencia con fines de aclarar este tema se
centra ahora en los estudios de la relación estructura y acti­
vidad utilizando derivadoe cromogénicos de celooligosacaridos
(Claeyssens et al., 1989), por un análisis estructural de estas
proteinas (Fagerstam et al., 1984), y a través de clonado de
genes y su posterior expresión (Knowleset al.,1988).
32
8.5. HECANISDS QUE OPERA“ EN LA SOLUBILIZACION MICROBIANA DE
LA CELULOSA CRISTALINA O NATIVA.
Pareceria que operan diferentes mecanismos en la solubili­
zación microbiana de la celulosa cristalina. La hidrólisis de
la celulosa cristalina es lenta, dependiendo de su grado de
cristalinización (GC)y polimerización (GP) a diferencia de la
celulosa amorfa que es rapidamente hidrolisada a celobiosa
(Woodet al.,1989).
La caracteristica principal de los sistemasenzimáticos celu­
lasa que puedensolubilizar celulosa cristalina es la presencia
de celobiohidrolasa, en adición a las endoglucanasas de acción
al azar y las B-glucosidasas/celobiasas halladas en todos los
filtrados de cultivos fúngicos. Sólo unos pocos hongos sin­
tetizan y liberan al mediode cultivo apreciables cantidades de
celobiohidrolasa. Como se observa en Irichoderma reesei,
T.v1ride, T.kon1ngii, Fbsarium solani , ¡bnicillium tuniculo­
sum/pinophilum (Eriksson y Wood1985). La mayoria de las celu­
lasas estudiadas han mostrado contener una multiplicidad de
componentes enzimáticos (Woodet al., 1990; Coughlan, 1985). El
número de componentes depende de la fuente de los hongos y de
la manera en que han sido cultivados. Las celulasas de Iricho­
derma Viride y T.reese1 han sido las mas exhaustivamente estu­
diadas (Eriksson y Wood, 1985; Wood et al.,1990; Coughlan
1985). Ellas mostraron contener de 4 a 8 actividades endogluca­
nasas, 2 actividades celobiohidrolasas y de 1 a 2 actividades
B-glucosidasas (Coughlan 1985; Woodet al.,1990). Las celulasas
de anicillum funiculosum y Phpinophilumcontienen 2 activida­
des celobiohidrolasas (Woodet al. 1980; Woody McCrae, 1986) 5
a 8 actividades endoglucanasas (Bhat et al.1989) y 2 activida­
des B-glucosidasas (Woodet al. 1980). Otras celulasas son
igualmente heterogéneas (Streamer et al. 1975;Wood1990). Pa­
rece que sólo algunos de esos componentes son genéticamente de­
terminados, otros son artificios resultantes de una glicosila­
ción deferencial de una cadena polipéptica común (Woody Mc­
33
Crae 1972; Gum y Brown 1977), de una proteoligig parcial
(Eriksson y Pettersson, 1982), de la agregación de las enzimas
entre si o con parte de la pared celular fúngica (Sprey y Lam­
bert, 1983), o de la manipulación de las enzimas durante la pu­
rificación (Enari y Niku Paavola, 1987). Estos artificios ha­
cen que la dilucidación de estos mecanismos de acción sean ex­
tremadamente dificiles, consecuentemente existe considerable
discusión sobre la especificidad del sustrato de las enzimas,
sobre el modode acción de las enzimas individuales, particu­
larmente las celobiohidrolasas, y sobre la naturaleza de la
cooperación entre distintas enzimas. Corrientemente, existe
acuerdo en que la conversión extensiva de celulosa cristalina a
glucosa puede ser discutida en términos de una acción en coo­
peración de 2 celobiohidrolasas (CBHI y CBHII) no relaciona­
das inmunológicamente, 1 o mas endoglucanasas de acción al azar
y al menos 1 B-glucosidase (Woodet al., 1990).
La celulólisis por hongos aeróbicos de podredumbre blanda y
blanca (Eriksson y Wood, 1985) y por algunas bacterias aeróbi­
cas (Coughlan, 1990), involucra la acción sinérgica de enzimas
definidas en forma general como exoglucanasas (normalmente ce­
lobiohidrolasas, 1,4-B-D-glucano celobiohidrolasa), endogluca­
nasas (endo-l,4-9-D-glucano-4-glucanohidrolasa) y B-glucosida­
sas (Eriksson y Wood, 1985). Por otro lado la podredumbre ma­
rrón fúngica. produce endoglucanasas y no exoglucanasas y puede
actuar por un mecanismo diferente, capaz involucrando H202
(Koenings, 1975). Algunas bacterias aeróbicas (Lamed y Bayer,
1988) y posiblemente hongos anaeróbicos (Woodet al.1988) uti­
lizan un complejo enzimático multicomponente el cual contiene
endoglucanasas, las cuales tienen que ser descriptas en cada
caso particular. Los mecanismos y microorganismos que han sido
más exhaustivamente investigados son los referentes a hongos
aeróbicos y bacterias anaeróbicas. La mayoria de los estudios
se centran principalmente en la discusión de aquellas enzimas y
procesos enzimáticos por los cuales la celulosa cristalina
34
(ordenada por uniones hidrógeno) es convertida a soluble. En
esta materia aún existen numerososinterrogantes
8.6.SINERGISHO.
La acción de 2 o más enzimas actuando conjuntamente en solución
es mayor que la suma de la acción individual de ellas. de eso
se desprende que las enzimas actúan sinérgicamente. Existen dos
tipos de acción sinérgica involucradas en el pmoceso por el
cual la celulosa cristalina es transformada en soluble: la ooo­
peración entre endoglucanasa y celobiohidrolasa (llamado endo­
exo sinergismo) (Wood y McCrae, 1972:1979) y la cooperación
entre dos celobiohidrolasas (llamado exo-exo sinergismo)
(Fagerstam y Pettersson, 1984). A pesar de la intensa investi­
gación a cerca de las bases moleculares de esta accion siner­
gica, su entendimiento no es satisfactorio. Es posible que la
falta de acuerdo en este punto se deba a la amplia diversidad
de opiniones a cerca de los roles individuales de las enzimas
“purificadas”. Se demostró que el grado de acción sinérgica
observado entre celobiohidrolasa y endoglucanasa varía según el
sustrato utilizado así comocon la proporción existente entre
estas enzimas (Henrissat et al.1985). La acción sinérgica es
mayor sobre celulosa cristalina. siendo menor o ausente con ce­
lulosa hidratada amorfa, y ausente con derivados de la celulosa
soluble (Woody McCrae. 1989). No existe duda a cerca de la ne­
cesidad de una desagregación y subsecuente hidratación de las
cadenas de celulosa fuertemente compactadas en la celulosa
cristalina comopaso previo a la hidrólisis de las uniones gli­
cosidicas por parte de las celulasas. El desubrimiento de que
las celobiohidrolasas y endoglucanasas presentan dos dominios,
uno de unión y otro hidrolitico (Tommeet al.1988) sugiere que
la función de "swelling" e hidrolitica puede residir en una
única enzima. En primer lugar actuaria el componente de unión
liberando cadenas individuales y luego acturaria la porción hi­
drolitica (Knowleset al.1988). Para explicar la acción concer­
35
tada de endoglucanasas y celobiohidrolasa se ha discutido el
mecanismo en términos de una acción secuencial, donde una glu­
canasa que actuaria al azar inicia el ataque en regiones amor­
fas de la celulosa creéndose asi extremos no reductores sobre
los cuales actúan las celobiohidrolasas liberando celobiosa y
oligosacaridos (Woody McCrae 1972). Este modelo seria limita­
damente aceptado y considerado comouna simplificación. Esto no
contempla por ejemplo la escasa o ausente accion sinérgica ob­
servada entre algunas endoglucanasas y celobiohidrolasas (Wood,
1975) o la existencia de acción sinérgica entre dos celobiohi­
drolasas (Fagerstam y Pettersson 1984). No existe duda a cerca
de la necesaria adsorción de la enzima sobre la celulosa para
su solubilización (Coughlan, 1985; Klyosov et al.,1988). Klyo­
sov et al.,(1988) concluyen que sólo aquellas endoglucanasas
que tienen una fuerte afinidad por la celulosa cristalina pue­
den actuar sinérgicamente con la celobiohidrolasa. Ryu et
al.(1984), son de la opinión que el exo-endo sinergismo puede
describirse en términos de una adsorción competitiva de los dos
tipos de enzimas, manifestandose 1a cooperación óptima cuando
las enzimas se presentan en la proporción en que se hallaban en
el filtrado de cultivo. Wobdwareet al. (1988), por otro lado
demostraron que la concentración de la mezcla de ambos tipos
enzimáticos en T.reese1 fue más importante que la proporción de
las enzimas entre si. Cuando la concentración de la mezcla en­
zimática decrecia, el grado de sinergismo aumentaba a un maximo
y luego decrecia con aumentos de la concentración de enzimas.
Fagerstam y Pettersson (1984), fueron los primeron en demostrar
que CBHI y CBHII purificadas de T. reesei cooperaban en la
hidrólisis de celulosa cristalina. Este inexplicable hallazgo
fue confirmado posteriormente por otros autores en diferentes
hongos. El sinergismo entre dos celobiohidrolasas actuando en
los extremos del sustrato es dificil de explicar. Woody McCrae
(1986), han postulado que dicho mecanismo puede ser discutido
en términos de la estereoquimica de las cadenas de celulosa,
existiendo probablementedos configuraciones naturales diferen­
36
tes de los grupos terminales no reductores en la celulosa cris­
talina. Creyendo que CBHI y CBHII pueden diferir en su este­
reoespecificidad al sustrato, y que la aparente cooperacion po­
dria explicarsecomoun ataque por parte de cada tipo enzi­
mático a una clase especifica de grupos terminales no re­
ductores, existiendo por lo tanto dos tipos de grupos termina­
les no reductores según su estereoquimica.
Otra explicación que puede darse con respecto al exo-exo si­
nergimo, es que dada en muchos casos la dificil obtención de
enzimas realmente al estado puro, existan en realidad trazas de
endoglucanasas. Habiéndose obtenido en casos de correcta puri­
ficación, tres enzimas, y no dos comopreviamente se creia.
Se cree asi que la falta de acuerdo a este respecto, y las con­
tradicciones halladas en la literatura se deban en realidad a
una incompleta resolución de los complejos enzimáticos
(Wood,1989).
8.7. RELACION ENTRE ESTRUCTURA Y ACTIVIDAD.
Se ha propuesto comoresultado de estudios sobre una proteó­
lisis limitada, una organización bifuncional-biestructural en
carbohidrasas actuando sobre sustratos insolubles (celulosa,
amilosa). Una región "binding", implicada o no en una hidróli­
sis directa, se une al centro de las enzimas por un región pun­
tual, rica en prolina, treonina y serina y a menudoO-glucosi­
lada. La región central de la proteina “core” contiene los si­
tios activos (hidroliticos). La actividad contra celulosa mi­
crocristalina (avicel) es muy perjudicada por la pérdida de
esta region binding.
Modificaciones del sitio activo, estudios del mecanismoy expe­
rimento ligand-binding mejoran la comprensión en el mecanismo
de acción de algunas de estas enzimas.
Esas enzimas son a menudoexcretadas en forma glicosilada y su­
fren una degradación proteolitica in vivo.
37
El estudio de las celulasas ha progresado considerablemente en
la presente decada. Han sido aplicadas técnicas de DNArecombi­
nante y estudios quimicos y estructurales sobre estas protei­
nas, lograndose una mayor comprensión sobre este tema (Woody
Garcia-Capaya,1990; Claeyssens y Tomme,1989).
8.8. PURIFICACION DE LAS CELULASAS EXTRACELULARES­
Existe cuantiosa información en cuanto a los métodos de purifi­
cación utilizados para la separación de las enzimas celuloli­
ticas, tales comofiltraciones moleculares sobre Sephadex, Ul­
trogel, Sephacryl, cromatografias de intercambio iónico sobre
DEAE Sepharosa, DEAESephadex, DEAE, CM-Sephadex, y cromato­
grafía de afinidad sobre avicel, celulosa amorfa, ConA-Sepha­
rose (Enari et al.,1987; Sharrock,1988; Yoshida,et al.1989;
Khandre et al.,1989; Schmidet al.1990).
Los métodos de purificación a aplicar se encuentran baJo un
continuo desarrollo, intentandose lograr nuevos métodos sensi­
tivos de detección.
Existen dificultades en la purificación producto de la simili­
tud de las propiedades fisicoquimicas de las proteinas extrace­
lulares producidas por los hongos como se demuestra en los ge­
les de electroforesis en combinación con inmunodifusión. La si­
militud en este tipo de caracteristicas hace en muchoscasos
que sea insuficiente la separación por métodos basados en el
tamaño molecular y las propiedades iónicas (Sprey et al.,
1983).
Ciertos estudios han demostrado que las condiciones de cultivo
para la producción de celulasas afectan la cantidad y calidad
de proteinas no-celulósicas liberadas al nmdio, las cuales
interactúan con las enzimasceluloliticas.
Las enzimasceluloliticas obtenidas a partir de distintos di­
seños de purificación han mostrado diferencias en sus propieda­
des enzimaticas. Existe evidencia en cuanto a que el pH y aún
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la temperatura utilizadas en los ensayos pueden causar desinte­
gración de las enzimas en fragmentos inactivos. Durante la pu­
rificación y almacenamientode estas preparaciones puede exis­
tir una modificación espontánea en su Pm, punto isoeléctrico,
actividad especifica, asi comoproteólisis (Enari et al,1987).
Para obtener enzimas al estado puro que mantengan su forma
original debe trabadarse con preparaciones frescas y el número
de P3505 en la PurificaCiOn deben ser el minimo. Desde este
punto de vista los métodos de afinidad especifica son los pre­
feridos (Nummiet al.,1983; Tilbeurgh et al.,1984).
9. XILANASAS.
9.1.GENERALIDADES.
El término hemicelulosa incluye la porción fácilmente hidro­
lizable de la pared celular en contraste con la celulosa que es
más resistente (Pouls et al.,1989). Básicamente, las hemice­
lulosas tienen la propiedad de ser solubles en alcalis dilui­
dos. Ellas se clasifican usualmente de acuerdo a los azúcares
residuales presentes en xilanos, mananos, arabinanos y galac­
tanos. La mayoria de las hemicelulosas no ocurren como homopo­
lisacáridos sino comoheteropolisacáridos, conteniendo diferen­
tes tipos de azúcares en la cadena principal o en las cadenas
laterales. Ellos pueden ser D-xilosa, L-arabinosa, D-manosa,
D-glucosa, D-galactosa, D-ácido glucurónico, D-4-O-acido metil­
glucurónico, D-ácido galacaturónico, grupos O-acetil o feruloil
y ésteres coumaril unidos via L-arabinosa residuales a la ca­
dena principal. Las hemicelulasas, un extenso grupo de enzimas
(Dekker y Richard, 1976), debe ser discutido con referencia a
sus sustratos. Dentro de las hemicelulosas el mas abundante es
el xilano, constituyendo más del 35 x del peso seco total de
las plantas superiores (Busche et al.,1983). La descomposición
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microbiana del xilano ha despertado interés por la posible uti­
lización de su biomasa como recurso natural. Las xilanasas
constituyen el grupo enzimático más estudiado entre las hemice­
lulasas.
Las D-xilanasas, similares a las celulasas, se componende tres
grupos de enzimas: endo-l,4-B-D—xilanasa (1,4-B-D-xilano xila­
nohidrolasa), exoxilanasa y B-D-xiloxidasa (1,4-B-D-xylan xilo­
hidrolasa), aunque no se sabe claramente si la exosnzima es una
entidad separada de la B-D-xiloxidasa, las cuales en muchos
casos han mostrado estar formadas por distintas isoenzimas (Tan
et al.,1985; Tsao et al.,1987; Huanget al.1991).
La cadena principal es hidrolizada por las endoxilanasas, y
los xilooligosacaridos formados son hidrolizados a xilosa por
B-xiloxidasa. Un sistema xilanolitico completo requiere igual­
mente de las enzimas responsables de la hidrólisis de los gru­
pos sustituyentes diferentes a la xilosa (Biely et al.,1986;
Huanget al.,1991).
La producción de xilanasas por distintos microorganismos in­
cluye hongos, levaduras y bacterias. Comúnmentese observa que
los microorganismos secretan al medio de cultivo varias clases
de xilanasas con diferentes'propiedades. Son productores de di­
chas actividades distintas especies de Aspergillus, Bacillus,
Cflostridium, Streptomyces, Sporotrichum, Sblerotium, Ihlaromy­
ces y Trichoderma, en los cuales la multiplicidad de las xila­
nasas ha sido extensivamente estudiada. Se ha investigado tam­
bién la hidrólisis de diferentes sustratos lignocelulósicos por
parte de ellos (Poutanen et al.,1987; Wonget al.,1988; Khandke
et al.,1989; Huanget al.,1991).
Al igual que las enzimas celuloliticas, las xilanoliticas de
TTIchodsnmaspp. son inducibles. Un estudio en la variación en
s1 patrón de producción de enzimas extracelulares por una efi­
ciente cepa degradadora de lignocelulosa, Zïkoningii G-39, en
respuesta a varios compuestos inductores, mostró que la celu­
losa microcristalina, avicel, induce la sintesis de una xila­
nasa de bajo peso molecular en adición a las enzimas celu­
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1011ticas, y no asi inductores solubles comocelooligosacaridos
y soforosa (Biely,1985; Wanget al.,1988; Huanget al.,1991).
Los D-xilanos se encuentran en la mayoria de las plantas de la
tierra y ellos son los principales componentesde las paredes
celulares primarias de monocotiledóneas. Desde que es sabido
que numerosos microorganismos patógenos a tales plantas, son
productores de dichas enzimas, es de interes el investigar el
papel que desepeña en la patogénesis la degradacion de estos
polisacaridos. Para el estudio de los efectos de estas enzimas
sobre las paredes celulares de las plantas y la evaluación de
su posible rol en la patogénesis, se necesitan preparaciones
enzimáticas puras. Tales preparaciones servirian igualmente
comouna poderosa herramienta para la elucidación de