Produccion-e-identificacion-de-xilanasas-de-Aspergillus-flavus-en-salvado-de-trigo

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
PRODUCCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE XILANASAS DE ASPERGILLUS 
FLAVUS EN SALVADO DE TRIGO 
 
 
TESIS 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
PRESENTA 
CLARA LUZ MARCELÍN LEYVA 
 
 
 
 
MÉXICO, CDMX JUNIO, 2017 
! !
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
! 3!
JURADO ASIGNADO 
 
 
Presidente José Guillermo de Jesús Aguilar Osorio 
 
Vocal Aurora Irma Ortegón Ávila 
 
Secretario Gloria Díaz Ruiz 
 
1er. Suplente Norma Angélica Castellanos Chávez 
 
2do. Suplente Aleida Mina Cetina 
 
 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA 
Grupo de Fisiología de Hongos Filamentosos del Departamento de Alimentos y 
Biotecnología. 
Laboratorio 312, Edificio de Alimentos y Biotecnología, Conjunto E, Facultad de 
Química, UNAM 
 
ASESOR DEL TEMA 
Dr. Guillermo Aguilar Osorio _________________________ 
 
SUSTENTANTE 
Clara Luz Marcelín Leyva _________________________ 
 
 
 
 
 
 
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A mis papás y hermana, 
a los que estuvieron antes 
y a los que vienen después 
 
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AGRADECIMIENTOS 
Mamá, por no dejarme perder nunca, ni siquiera contra mí misma; por ver, recordarme 
y alimentar mi luz . Papá por la paciencia y el esfuerzo para hacer de mí la mejor en lo 
que sea que decida, por mi libro de “Los cazadores de microbios” en 2006. A los dos 
por el apoyo incondicional de siempre. 
Fer, por ser mi compañera y amiga desde 1998, por los fines de semana en el 
laboratorio y ser la mejor ayudante para las soluciones 1M. 
Doctor Guillermo por la oportunidad de trabajar, aprender y crecer en el laboratorio. Por 
la paciencia y la comprensión. 
Sergio, que después de un semestre de convivir 24/7 se convirtió en mi mejor amigo, 
mejor compañero y mejor público de innumerables tonterías. Allan: sin ti nunca lo 
hubiera logrado (o tal vez si, pero más lento), gracias por la ayuda y las hamburguesas 
que compartimos contra tu voluntad. Los quiero a los dos. 
Pancho que con sarcasmo y humor me regresó muchas veces al camino de la tesis y la 
titulación, y me hizo a comprender que la perfección no debe llevarte a la 
procastinación. 
Dinath, la mejor compañera, amiga y equipo por 6 semestres en la universidad y que 
con un poco de suerte será para toda la vida. El ejemplo para toda la generación. 
Pau, la mejor socia, excelente persona, la muestra de que con las personas menos 
esperadas se pueden lograr cosas maravillosas y que con amor y dedicación llegas 
lejos. Gracias por las porras y acompañarme en el camino. De aquí pa’lante. 
Mario. Por el tiempo y la dedicación. 
Alfonso, my dear shrink, who help me to understand and embrace my own madness. 
Emil, mon Petit Prince. Gemeinsam werden wir die Welt essen. 
Calú, si se pudo... 
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La presente investigación fue realizada con recursos del Programa de Apoyo a 
Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la UNAM. Proyecto: 
“Identificación de enzimas degradadoras de polisacáridos producidas por cepas 
autóctonas del grupo flavi durante su crecimiento en sustratos complejos”, clave 
IN219813. 
Agradezco a la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) la 
beca recibida. 
! 9!
ÍNDICE 
 
 Página 
Lista de figuras 6 
Lista de tablas 8 
Lista de abreviaturas 8 
1. Introducción 9 
2. Antecedentes 
 2.1 Hongos filamentosos 11 
 2.1.1 Aspergillus 12 
 2.1.1.1 Aspergillus flavus 12 
 2.2 Componentes de la pared celular de plantas 13 
 2.2.1 Lignocelulosa 14 
 2.2.2 Celulosa 14 
 2.2.3 Hemicelulosa y xilano 15 
 2.3 Enzimas degradadoras de pared celular 16 
 2.3.1 Xilanasas 17 
 2.4 Sustratos complejos 18 
 2.5 Regulación génica: represión e inducción 19 
3. Planteamiento del problema 21 
4. Hipótesis 21 
5. Objetivos 21 
6. Estrategia experimental 24 
7. Metodología 
 7.1 Microorganismos 
 7.1.1 Acondicionamiento de la cepa de A. flavus (CECT-2687), 
cosecha y conteo de esporas 
25 
 7.2 Medios de cultivo: Condiciones de cultivo en medio líquido 26 
7.2.1 Muestreo 26 
 7.3 Determinación de proteína: Método de Bradford 27 
 7.4 Determinación de actividad enzimática: actividad xilanolítica 27 
! 10!
 7.5 Liofilización de los filtrados libres de células 28 
 7.6 Análisis electroforético 
 7.6.1 Electroforesis SDS-PAGE 28 
 7.6.2 Determinación de peso molecular aproximado de las 
proteínas separadas por electroforesis 
29 
 7.6.3 Zimogramas 29 
8. Resultados y discusión 
 8.1 Efecto del pH inicial y tipo de sustrato sobre el crecimiento de A. 
flavus y la producción de xilanasas. 
30 
 8.2 Efecto de los azucares simples sobre la inducción y/o represión 
de las xilanasas en cultivos de A. flavus (CECT-2687) con salvado de 
trigo. 
38 
9. Conclusiones 50 
10. Perspectivas 51 
11. Bibliografía 52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
! 11!
Lista de Figuras 
 
Figura 
 
Página 
1 Ciclo de vida y estructura de A. nidulans. 11 
2 Representación esquemática comparativa de la morfología entre dos 
géneros de Aspergillus. 
12 
 
3 (A) Fotografía de una colonia de A. flavus en agar Sabouraud a 72 
horas de incubación. (B) Crecimiento de A. flavus en maíz (Texas A&M 
University). 
13 
4 Estructura y composición de lignocelulosa a partir de residuo de materia 
orgánica 
14 
5 Estructura y composición de celulosa a partir de la pared celular 
vegetal. 
15 
6 Representación esquemática de xilanopiranosas. 16 
7 Acción del complejo enzimático de la degradación de una cadena de 
xilano. 
17 
8 Representación esquemática del blanqueamiento de “pasta” de celulosa 
con xilanasas en la fabricación de papel. 
18 
9 Estructura de un grano de trigo. 19 
10 Variación en la producción-consumo de azúcares (A y C) y producción 
de xilanansas (B y D) por A. flavus cepa CECT-2687, pH inicial 5, 
creciendo en sustratos solubles (A y B) y sustratos complejos (C y D). 
32 
11 Variación en la producción-consumo de azúcares (A y C) y producción 
de xilanansas (B y D) por A. flavus cepa NRRL-6541, pH inicial 5, 
34 
! 12!
creciendo en sustratos solubles (A y B) y sustratos complejos (C y D). 
12 Variación en la producción-consumo de azúcares (A y C) y producción 
de xilanansas (B y D) por A. flavus cepa CECT-2687, pH inicial 7.5, 
creciendo en sustratos solubles (A y B) y sustratos complejos (C y D). 
35 
13 Variación en la producción-consumo de azúcares (A y C) y producción 
de xilanansas (B y D) por A. flavus cepa NRRL-6541, pH inicial 7.5, 
creciendo en sustratos solubles (A y B) y sustratos complejos (C y D). 
36 
14 Gel SDS-PAGE, perfil protéico de muestras de la cepa 2687, en 
condiciones de pH 5 (carriles 1 al 6) y pH 7.5 (carriles 7 al 12) con 
fuentes de carbono simples y complejas: glucosa (carriles 1 y 7), xilosa 
(carriles 2 y 8), ácido galacturónico (carriles 3 y 9), xilano (carriles 4 y 
10), salvado de trigo (carriles 5 y 11), olote de maíz (carriles 6 y 12). 
37 
15 Variación en la concentración de azúcares reductores en la 
fermentación de matraces con adiciones de glucosa (A) y xilosa (B) 
durante 96 h. 
40 
16 Variación en la concentración de azúcares reductoresen la 
fermentación de matraces con sacarosa en combinación con un azúcar 
simple durante 96 h. 
42 
17 Variación en la actividad enzimática específica en fermentaciones con 
adiciones de glucosa (A) y xilosa (B) durante 96 h. 
45 
18 (A) Gel SDS-PAGE al 12% de acrilamida para la determinación del peso 
molecular de proteínas. (B) Zimograma para la determinación de la 
actividad xilanolítica en los filtrados enzimáticos: carril 1, salvado; carril 
2, salvado+glucosa t0; carril 3, salvado+glucosa t24; carril 4, 
salvado+glucosa t24, 48 y 72; carril 5, sacarosa+glucosa; carril 6, 
salvado+xilosa t0; carril 7, salvado+xilosa t24; carril 8, salvado+xilosa 
t24, 48 y 72; carril 9, sacarosa+xilosa. 
48 
! 13!
 
Lista de Tablas 
 
 
 
Lista de Abreviaturas 
 
°C Grado Celsius mL Mililitros 
% m/v Porcentaje masa/volumen µL Microlitros 
% v/v Porcentaje volumen/volumen mm Milímetros 
CECT 
Colección Española de Cultivos 
Tipo MM Medio mínimo 
Cm Centímetros mM Concentración micromolar 
DNS Ácido 3, 5-dinitrosalicílico mmol Milimoles 
kDa Kilodaltones nm Nanómetros 
M Concentración molar NRRL 
Northern Regional Research 
Lab 
mbar Milibares pH Potencial de hidrógeno 
min Minutos rpm Revoluciones por minuto 
 
 
19 Superposición del gel SDS-PAGE y el zimograma. 49 
Tabla Página 
1 Composición porcentual de sales en medio mínimo. 26 
2 Composición de los matraces. 26 
3 Reactivos empleados para medir actividad xilanolítica. 28 
! 14!
1. Introducción 
 
El género Aspergillus lo conforman más de 300 especies distribuidas en todo el 
mundo. Algunas de estas especies son pátogenos de humanos y animales, otras son 
mohos saprofíticos que pueden encontrarse en ambientes extremos u oligotrópicos 
(Frisvad y Larsen, 2016). 
 
Estas especies secretan diversas enzimas degradadoras que les permiten obtener el 
carbono y la energía necesarios para su ciclo celular a partir de polímeros como xilano, 
pectinas, poligalacturonanos, entre otros (Bennet, 2010). Así, especies del género 
Aspergillus son ampliamente utilizadas en diversos procesos industriales para elaborar 
productos como ácidos orgánicos, enzimas, antibióticos y alimentos fermentados de 
varios tipos, por ejemplo para la obtención de ácido cítrico, celulasas, penicilina y salsa 
de soya, respectivamente. Estos últimos productos están clasificados como GRAS 
(Generally Regarded As Safe, por sus siglas en inglés), por lo que su aplicación en la 
industria farmacéutica y de alimentos es posible (Villena y Gutiérrez-Correa, 2003). 
 
El xilano es un polímero muy abundante en la naturaleza y para su degradación se 
requiere de la acción de un sistema enzimático, compuesto principalmente por 
xilanasas y los productos de la hidrólisis son azúcares más simples como la xilosa. 
Algunos ejemplos de estas enzimas producidas por hongos y bacterias son la β-1,4-
endoxilanasa y β-xilosidasa. También se consideran en este grupo la α-L-
arabinofuranosidasa, α-glucoronidasa, acetilxilanoesterasa y feruloilesterasa (Amaike, 
2011). Las aplicaciones industriales y comerciales de las xilanasas incluyen el 
tratamiento de desechos agroindustriales, la clarificación de jugos, la extracción de 
café, aceites esenciales y almidón, el mejoramiento de productos de la industria 
panificadora, el pretratamiento de forrajes para ganado, la producción de 
biocombustibles y blanqueamiento de pulpa para papel (De Alencar et al., 2013). 
 
Sin embargo, algunas cepas de Aspergillus, además de generar enzimas de 
importancia económica, producen metabolitos secundarios tóxicos. Tal es el caso de 
! 15!
Aspergillus flavus, un microorganismo conocido especialmente por su capacidad para 
producir diversas micotoxinas de tipo aflatoxinas. Este hongo saprófito es capaz de 
infectar plantas en desarrollo, cultivos de algodón, aguacate, cereales (maíz y trigo), 
etc., provocando pérdidas económicas importantes (se estima que las pérdidas anuales 
por contaminación de alimentos con aflatoxinas en los EEUU ascienden a 270 millones 
de dólares) (Georgianna y Payne, 2009), además de que representa serios problemas 
de salud debido al carácter carcinogénico y teratogénico de estos metabolitos. Así, más 
de 100 países en todo el mundo has establecido límites muy rigurosos en el contenido 
de aflatoxinas en alimentos y materias primas (Amaike, 2011). 
 
El presente trabajo de investigación busca evaluar la producción de enzimas 
xilanolíticas por la cepa toxigénica del hongo A. flavus CECT-2687, con la finalidad de 
comprender y establecer la forma en la que estas enzimas participan en los proceso de 
colonización de plantas como el maíz. Así, se determinarán las condiciones más 
adecuadas de cultivo para cepas de A. flavus que permitan la producción de enzimas, 
además de que se espera que con el uso de sustratos complejos ricos en polímeros de 
xilano, se observe la actividad enzimática que permita establecer la relación entre la 
presencia y variedad enzimática con el potencial degradativo y de virulencia de la cepa 
de estudio. 
 
 
! 16!
2. Antecedentes 
 
2.1 Hongos filamentosos 
Los hongos filamentosos son microorganismos eucariontes, heterótrofos, aerobios y 
morfológicamente complejos. La mayoría de estos crece entre 0 y 55 °C, con una 
temperatura óptima entre 20 y 30 °C (Bonifaz, 2009), y presentan diferentes formas de 
crecimiento a lo largo de su ciclo de vida, comenzando con una estructura básica 
vegetativa llamada espora. Por otra parte, la mayoría de los hongos son organismos 
multicelulares y forman una red de filamentos llamada hifa, compuesta por células 
tubulares septadas (Figura 1). La hifa, que es la parte del hongo en la que se lleva a 
cabo el intercambio de sustancias con el ambiente, crece y se ramifica formando 
masas de hifas (micelio). Dependiendo de las condiciones de crecimiento, algunas 
especies de hongos filamentosos pueden crecer como células independientes o como 
micelio. A partir de este último, las ramas de hifas pueden alcanzar el aire por encima 
de la superficie, y después de un periodo vegetativo, el crecimiento continúa con la 
reproducción que se lleva a cabo por medio de la formación de esporas asexuales, es 
decir, que su formación no implica la fusión de los gametos o meiosis, en un área 
llamada conidio (Smith, 1994). A menudo las hifas están pigmentadas de color negro, 
verde, azul, rojo, amarillo o marrón. Los conidios dan al micelio el aspecto polvoriento y 
facilitan la dispersión del hongo a nuevos hábitats. 
 
Figura 1. Ciclo de vida y estructura de Aspergillus nidulans (Adaptado de google.com, búsqueda 
“Aspergillus life cycle”). 
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Los hongos se alimentan mediante la secreción de enzimas extracelulares para digerir 
materiales orgánicos complejos, tales como polisacáridos o proteínas, convirtiéndolos 
en azúcares, péptidos, aminoácidos, y así sucesivamente, asimilados como fuentes de 
carbono y energía (Madigan et. al., 2012). 
 
2.1.1 Aspergillus 
El género Aspergillus fue descrito por primera vez por P. Micheli en 1729 (Amaike, 
2011). Este grupo de saprófitos ascomicetos está compuesto por más de 300 especies 
que incluyen a las especies A. niger, A. flavus y A. fumigatus (Figura 2), por mencionar 
tres de las más importantes. Estos hongos crecen por medio de la extensión de hifas 
que se ramifican sub-apicalmente para formar el micelio, indispensable para cubrir 
superficies y maximizar la eficiencia en la obtención de nutrimentos (Culleton et al., 
2013). 
 
Figura 2. Representación esquemática comparativa de la morfología entre dos géneros de Aspergillus 
(flavus y fumigatus) (Adaptado de telmeds.org). 
 
Una de las principales características macroscópicas para la identificación de los 
grupos de Aspergillus es el color ya que poseen distintos tonos de verde, pardo, 
amarillo, blanco, gris y negro (Carrillo, 2003). En agricultura, algunas especies de 
Aspergillus son un serio problema debido a suparticipación en el deterioro de cultivos y 
granos de almacenamiento, actuando como patógeno oportunista (Bennett, 2010). 
 
2.1.1.1 Aspergillus flavus 
Aspergillus flavus es una especie saprófita de colonias color verde oliva con 
micelio blanco, de textura lanosa y aterciopelada (Figura 3). Esta especie es un 
patógeno oportunista que infecta diferentes cultivos agrícolas como maíz, algodón, 
! 18!
cacahuate, nuez y jitomate. Como contaminante de granos almacenados, A. flavus, 
produce aflatoxinas que son compuestos naturales tóxicos y hepatocarcinogénicos que 
disminuyen el valor nutritivo de los cultivos (Figura 4) y representan un gran riesgo para 
la salud humana y del ganado (Mellon y Cotty, 2004). 
A 
 
B 
 
Figura 3. (A) Fotografía de una colonia de A. flavus en agar Sabouraud a 72 horas de incubación. (B) 
Crecimiento de A. flavus en maíz (Texas A&M University, 2016). 
 
El descubrimiento de las aflatoxinas en la década de 1960 generó una conciencia sobre 
la amenaza que este hongo representaba en la alimentación. Las aflatoxinas son aún 
reconocidas como las micotoxinas más importantes, afortunadamente son de 
distribución quimiotaxonómica restringida, es decir que, sólo son sintetizadas por 
algunas especies de Aspergillus, siendo A. flavus el principal productor (Rodríguez et 
al., 2007; Bennett, 2010). 
 
2.2 Componentes de la pared celular de plantas 
Generalmente, la materia orgánica que sirve como sustrato para el crecimiento de 
las cepas de A. flavus se compone de moléculas complejas. Estas moléculas son 
degradadas por una mezcla enzimática secretada, además de que la acción de este 
complejo enzimático también desempeña un papel muy importante en el proceso 
fitopatogénico del hongo. Los principales polisacáridos estructurales de la pared celular 
de vegetales son celulosa, hemicelulosa y pectina. 
 
 
! 19!
2.2.1 Lignocelulosa 
La lignocelulosa es el componente principal de las plantas y del material vegetal en 
descomposición, además de ser la fuente más abundante de biomasa para la 
producción de biocombustibles como el etanol (Tuomela et al., 2000). Está compuesta 
por tres polímeros orgánicos diferentes: hemicelulosa, celulosa y lignina. Como se 
observa en la Figura 4, la lignina protege las fibras de celulosa y hemicelulosa con un 
arreglo irregular de polímeros de fenilpropano que resiste la degradación química o 
enzimática. Así, el uso de materiales lignocelulósicos se ve obstaculizado por la lignina, 
la cual limita la accesibilidad de las enzimas para la hidrólisis de la celulosa y la 
hemicelulosa. 
 
Figura 4. Composición de la lignocelulosa vegetal (Adaptado de Kobayashi y Fukuoka, 2013). 
 
 2.2.2 Celulosa 
La celulosa es el polisacárido más abundante y principal fuente de azúcares 
utilizables en la naturaleza. Está constituida generalmente por 300-1700 unidades de 
glucosa, pero puede llegar hasta las 10,000 en algunos tejidos vegetales. Estas 
unidades están unidas por enlaces glicosídicos β-1,4 (Figura 5). La unión de cientos de 
unidades de este polímero forma las cadenas llamadas microfibras, las cuales se 
agrupan para formar las fibras elementales que forman la celulosa. Dependiendo del 
arreglo de las mismas, las fibras de celulosa presentan regiones denominadas 
cristalinas (arreglo ordenado de las fibras) y amorfas (arreglo desordenado de las 
fibras); estas últimas son las regiones más susceptibles a la hidrólisis enzimática 
(Cullen y Kersten, 1992; Pérez, et al., 2002). La hidrólisis completa de la celulosa nativa 
requiere la acción conjunta de múltiples enzimas con distintas especificidades de 
sustrato. 
! 20!
 
Figura 5. Estructura y composición de la celulosa de la pared celular vegetal. 
 
 2.2.3 Hemicelulosa y xilano 
La hemicelulosa es el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza y 
que está asociado a las fibras de celulosa y de lignina (Collins et al., 2005). La 
hemicelulosa puede llegar a representar hasta el 35% del peso seco de las plantas 
superiores, y su función principal es aglutinar las fibras cristalinas de celulosa, dando 
consistencia a la pared celular (Paz-Lago y Hernández, 2000). Por lo general, la 
hemicelulosa se clasifica de acuerdo al azúcar residual más abundante en el polímero, 
siendo el xilano el principal (Figura 6). El xilano está compuesto por unidades lineales 
de β-xilanopiranosil unidos por enlaces β1-4 xilosídicos. Las unidades de xilosa (entre 
150 y 200) que constituyen el polímero presentan ramificaciones que consisten de 
unidades de otros azúcares como la manosa, arabinosa, galactosa, glucosa y ácidos 
glucorónicos (Arce, 2012). 
 
! 21!
 
Figura 6. Representación esquemática de xilanopiranosas unidas por enlaces β-1,4 para formar una 
cadena de xilano (Robledo, et. al., 2009). 
 
Aproximadamente una de cada diez moléculas de xilosa en la cadena tiene una 
sustitución en el carbono 2, en la que se une un residuo de ácido 4-O-metil-α-D- 
glucurónico por medio de un enlace α-1,2. Cerca del 70% de las xilosas están 
acetiladas en el C2, C3 o ambos. La presencia de los grupos acetilo favorece la 
solubilidad parcial del xilano en agua. Además, una proporción de las unidades de 
arabinosa de las cadenas laterales de los xilanos está esterificada con ácidos p-
cumárico y ferúlico, y le permite establecer enlaces con las cadenas de lignina 
(Khandeparkar y Bhosle, 2006). 
 
2.3 Enzimas degradadoras de pared celular (EDPC) 
Las cepas de A. flavus producen grandes cantidades de enzimas como amilasas, 
pectinasas, celulasas, proteasas y xilanasas (Figura 7), las cuales le permiten penetrar 
e invadir fácilmente los cultivos en los que crece. La habilidad para producir esta 
variedad de enzimas útiles para degradar compuestos orgánicos complejos, hace a la 
especie A. flavus un organismo muy versátil y de posible aplicación biotecnológica en 
diferentes procesos que involucren la transformación de polímeros vegetales en 
azúcares fermentables o biocombustibles. 
! 22!
 
Figura 7. Acción del complejo enzimático en la degradación de una cadena de xilano (Avinews, 2014). 
 
2.3.1 Xilanasas 
La biodegradación del esqueleto de xilano depende de diferentes enzimas llamadas 
xilanasas. Se ha descrito que estas son producidas por hongos, bacterias, levaduras, 
algas marinas, insectos, semillas, etc. y se pueden clasificar como: 
• endo-β-D-xilanasa: hidroliza principalmente cadenas de xilano liberando 
oligosacáridos más pequeños. 
• β-xilosidasas: degrada los fragmentos de xilano a xilosa. 
• α−glucoronidasa: remueve cadenas laterales de ácido D-glucurónico. 
• Arabinofuranosidasa: remueve cadenas laterales de L-arabinosa. 
La acción cooperativa de las endoxilanasas favorece la hidrólisis de los enlaces β-1,4 
internos del xilano para generar olígomeros (dímeros y monómeros de xilosa). Cabe 
destacar que las endoxilanasas no hidrolizan el xilano de forma aleatoria, como sucede 
durante en la hidrólisis de la celulosa por las endoglucanasas, sino en sitios específicos 
donde existen ramificaciones ó ciertos azúcares. Los olígomeros ramificados y dímeros 
generados por la acción de las endoxilanasas son rápidamente hidrolizados a su vez 
por otras enzimas como las xilosidasas, acetil esterasas, glucoronidasas, 
arabinofuranosidasas, galactosidasas, entre otras, para liberar azúcares como la xilosa, 
ácido glucorónico, arabinosa y galactosa, respectivamente (Arce, 2012). 
! 23!
 
Las aplicaciones industriales de las enzimas xilanolíticas son variadas y de gran 
importancia. Por ejemplo, y como se ilustra en la Figura 8, las xilanasas libres de 
celulasa permiten el bioblanqueamiento del papel y la pulpa, reduciendo la cantidad de 
químicos blanqueadores como el cloro (Bennett, 2010). Otra importante aplicación la 
encontramos en la industria de la panificación, ya que estas enzimas solubilizan la 
fracción de arabinoxilano en la masa, permitiendo el aumento de volumen delpan, 
mejorando así la calidad de la masa (Bhat, 2000; De Vries y Visser, 2001). 
 
Figura 8. Representación esquemática del bio-blanqueamiento de “pasta” de celulosa con xilanasas 
en la fabricación de papel. (Luengo y Bañares, 2010). 
 
2.4 Sustratos complejos: 
Los residuos orgánicos industriales que no han sufrido modificaciones o 
alteraciones en su estructura se denominan sustratos complejos. Ejemplos de éstos 
son la cáscara de diferentes frutas, el salvado de granos como el trigo o el mijo y olote 
de maíz, entre otros. Los hongos filamentosos, como A. flavus, pueden utilizar estos 
sustratos como nutrientes por lo que la evaluación detallada de la capacidad y el 
potencial que tienen estos organismos para degradarlos, además conocer el tipo de 
enzimas que producen, resulta un área de investigación importante (Castañeda, 2013). 
El salvado es uno de los principales subproductos que se obtiene a partir de la 
molienda del grano de trigo (Triticum vulgare, Figura 9). Este subproducto proviene de 
las cinco capas externas del grano: una primera capa exterior envuelta o cutícula, la 
segunda o epicarpio, la tercera o endocarpio, la cuarta capa denominada testa y la 
quinta, denominada aleurona. 
! 24!
 
Figura 9. Estructura de un grano de trigo (Asociación Española de Fabricantes de Cereales, 2009, 
adaptación). 
 
Los principales constituyentes del salvado de trigo son polisacáridos no amiláceos 
(arabinoxilanos), almidón (10-20%), proteínas (15-22%) y lignina (4 a 8%) (Zhang, 
2011). Su producción llega a ser de hasta 11 millones de toneladas por año en Estados 
Unidos (Perlack, et al, 2005) y de 170 millones de toneladas a nivel mundial (Sánchez, 
2009). En México la cantidad anual de esquilmos provenientes del trigo es de alrededor 
de 4,500,000 toneladas (Muñoz, 2012). Por su alto contenido de nutrientes, así como 
su estructura física, el salvado de trigo representa un medio de cultivo ideal para el 
crecimiento de A. flavus (López et al, 2004). 
 
2.5 Regulación génica: represión e inducción 
Algunas proteínas (enzimas) y moléculas de RNA se necesitan, en las células en 
general, en concentraciones constantes. Estas moléculas son constitutivas y su 
expresión es independiente de las condiciones de crecimiento. Por otra parte, 
numerosas macromoléculas son sintetizadas hasta que las condiciones del medio lo 
requieran (no constitutivas). Por ejemplo, en algunas bacterias, las enzimas 
degradadoras de lactosa se sintetizan únicamente si en el medio hay lactosa 
disponible. Dado que en el genoma de los microorganismos se codifican genes para 
ambos tipos de moléculas, el proceso de regulación de la expresión de estos genes es 
crítico en términos de optimización de energía y recursos metabólicos (Madigan et. al., 
2012). 
! 25!
A menudo, las enzimas que catalizan la síntesis de un producto específico no se 
producen si el compuesto se encuentra presente en el medio en una concentración 
suficiente para la célula. Este proceso se denomina represión enzimática y un ejemplo 
de este fenómeno es la represión por carbono en el género Aspergillus. Los hongos de 
este género, como muchos otros microorganismos, ajustan su catabolismo del carbono 
a las condiciones predominantes en que se encuentren; los carbohidratos fácilmente 
metabolizables reprimen la síntesis de enzimas relacionadas con el catabolismo de 
fuentes alternativas de carbono (Ruijter y Visser, 1997). Así, esta represión conlleva a 
dos beneficios fisiológicos: el primero resulta en la utilización más favorable de las 
fuentes de carbono; el segundo, se limita la síntesis innecesaria de elementos para 
metabolizar otras fuentes cuando no se requieren. A pesar de que la represión puede 
ser producida por varias fuentes de carbono, la glucosa es probablemente la más 
represiva y aquella con la cual se han conducido la mayoría de los experimentos 
acerca de la represión por carbono; se ha demostrado que en presencia de glucosa los 
microorganismos suelen reprimir un gran número de genes y por lo tanto la síntesis de 
múltiples enzimas (Pradal, 2012). 
 
Los genes que pueden ser regulados por represión por carbono en Aspergillus se 
dividen en tres grupos: 
• El primer grupo son los genes que codifican para proteínas que metabolizan fuentes 
de carbono de difícil asimilación, es decir, dichas enzimas permiten la degradación 
de fuentes poliméricas de carbono para poder entrar a la vía glucolítica, como 
hexosas fosfato, y ser metabolizadas del mismo modo que la glucosa (la mayoría de 
estos sistemas enzimáticos están involucrados en la degradación de polisacáridos 
como la celulosa, la pectina, el xilano y el arabano) (Ruijter y Visser, 1997). 
• El segundo grupo corresponde a los genes que codifican para enzimas de los ciclos 
de la gluconeogénesis y del glioxalato. Los genes fbp1 y pck1 codifican para las dos 
enzimas exclusivas de la gluconeogénesis: la fructosabisfosfatasa (FBP1) y la 
PEPcarboxicinasa (PCK1). Estas enzimas no participan en la glucólisis y por tanto 
marcan pasos irreversibles de la gluconeogénesis; la represión de estos genes en 
! 26!
presencia de glucosa evita que la gluconeogénesis y la glucólisis ocurran de forma 
simultánea. 
• El tercer grupo de genes sujetos a represión por carbono se relaciona con el 
metabolismo secundario. El sistema que mejor lo ejemplifica es la producción de 
penicilina por A. nidulans. A pesar de que la razón fisiológica por al cual la represión 
por carbono es capaz de influir en la producción del antibiótico aún no es clara, se 
ha comprobado que la regulación sucede a nivel transcripcional (Ruijter y Visser, 
1997). 
 
Por otra parte, en la inducción enzimática se favorece la síntesis de ciertas enzimas por 
la presencia de un sustrato específico en el medio. Mientras que la represión influye 
directamente a nivel anabólico, la inducción afecta la producción de enzimas 
degradativas, es decir, a nivel catabólico. Una enzima inducible es aquella que 
normalmente se encuentra ausente en la célula o presente sólo en niveles muy bajos, 
pero es sintetizada en cantidades considerables en respuesta a un inductor, es decir, 
una enzima no constitutiva (Madigan et. al., 2012). 
 
El catabolismo de los distintos compuestos utilizados como fuente de energía en 
Aspergillus, además de verse regulado por la represión por carbono, es controlado por 
sistemas específicos de inducción (Dzikowska, et al., 2002). Este fenómeno también 
puede llevarse a cabo por la acción de proteínas reguladoras de los genes que 
codifican para enzimas degradadoras, principalmente de la pared celular, o bien de 
otras fuentes de carbono difícilmente asimilables. Los genes inducibles se encuentran 
altamente regulados y son capaces de activarse de forma rápida y específica en 
respuesta a los estímulos y, además, una vez que el estímulo es removido o se agota, 
regresan rápidamente a su estado basal (Weake y Workman, 2010). 
 
Para el caso específico de las enzimas degradadoras de xilano, se ha reportado que en 
A. niger, el gen regulador del tipo dedos de zinc (zinc fingers) xlnR se une al DNA y 
actúa como el activador de la transcripción requerido para la inducción de genes que 
codifican para enzimas de la vía xilanolítica (Lockington, et al., 2002; De Vries, 2003). 
! 27!
Trabajos previos sobre algunas especies del género Aspergillus (A. nidulans, A. niger y 
A. tubigensis) han demostrado la presencia del gen implicado en la regulación de la 
expresión genética de xilanasas. Finalmente se ha establecido que la regulación 
genética de xilanasas está conservada en las tres especies antes mencionadas y se 
intuye que también debe estarlo en el resto de los hongos con funciones xilanolíticas, 
por ejemplo A. flavus. Existe mucha información generada respecto a las fuentes de 
carbono capaces de inducir estas enzimas. En muchas de las fuentes consultadas se 
concluye que tanto el xilanocomo la D-xilosa, son fuertes inductores de la expresión de 
xilanasas (Hrmová, 1991; Lockington, et al., 2002; De Vries, 2003). En cuanto a otros 
carbohidratos, se han realizado experimentos para la expresión de xilanasas 
empleando L-arabinosa y homodisacáridos de xilosa (xilobiosas), encontrando niveles 
de actividad particularmente altos en aquéllos con uniones β-1,2; y, por supuesto, con 
fuentes de carbono complejas, como partes de plantas y desechos agroindustriales que 
en realidad generan diferentes familias de enzimas degradadoras de pared celular 
(Pradal, 2012). 
 
 
! 28!
3. Planteamiento del problema 
Diversos estudios han demostrado la relación entre la presencia y la variedad 
enzimática con el potencial degradativo de sustratos complejos y de virulencia de 
cepas del género Aspergillus (Cleveland y Cotty, 1991). Sin embargo, la forma en que 
estas enzimas participan en los procesos de colonización de plantas como el maíz, 
trigo y algodón es todavía ambiguo (Woloshuk et al., 1997). Así, el presente trabajo 
pretende evaluar la producción de enzimas xilanolíticas por A. flavus (cepa CECT-
2687) en un medio de fermentación líquido enriquecido con salvado de trigo (sustrato 
complejo) y la identificación de los perfiles enzimáticos mediante análisis 
electroforéticos y zimográficos. 
 
4. Hipótesis 
El hongo A. flavus es capaz de crecer en sustratos complejos y producir enzimas, 
por ejemplo xilanasas, que degraden los componentes del medio como el xilano. 
 
5. Objetivos 
5.1 Objetivo general 
Identificar las enzimas xilanolíticas producidas por A. flavus cepa CECT-2687 bajo 
diferentes condiciones de cultivo. 
 
5.2 Objetivos particulares 
• Evaluar el efecto del salvado de trigo sobre la producción de xilanasas en A. 
flavus cepa CECT-2687. 
• Analizar el efecto de la adición de azúcares simples (glucosa y xilosa) sobre la 
inducción o represión catabólica (enzimas xilanolíticas) a diferentes tiempos de 
fermentación. 
 
! 29!
6. Estrategia experimental 
 
Adición de 1mL de 
xilosa 
(100mg/mL)
Adición de 1mL de 
glucosa 
(100mg/mL)
Adición de 
5mL de 
glucosa 
(100mg/mL)
Medición de azúcares 
reductores y actividad 
xilanolítica
Acondicionamiento de 
la cepa Aspergillus 
flavus (CECT-2687) 
en agar Sabouraud
37ºC/72h
Resiembra en agar 
Sabouraud para la 
producción de 
esporas
Cosecha y 
conteo de 
esporas
37ºC/72h
Suspensión de 
esporas
Fase 2: Medios de cultivo
Fase 3: Inoculación e incubación 
Fase 4: Toma de muestra y adición de azúcares simples
Preparación de 
matraces con medio 
de cultivo 
100mL de medio mínimo con salvado de trigo (1%) 
100mL de medio mínimo 
con sacarosa
Glucosa
Xilosa
Matraces para 
fermentación
Esterilización
125ºC/20minInoculación de los matraces (1 al 9) 
con suspensión de esporas 
37ºC/96h/300rpm
Adición de 
5mL de 
xilosa 
(100mg/mL)
0h 24h 48h 72h 96h
Adición de 5mL de 
glucosa (100mg/mL)
Adición de 5mL de 
xilosa (100mg/mL)
Adición de 1mL 
de glucosa 
(100mg/mL)
Adición de 1mL 
de xilosa 
(100mg/mL)
Adición de 1mL de 
glucosa 
(100mg/mL)
Adición de 1mL 
de xilosa 
(100mg/mL)
Muestras t0 Muestras t24 Muestras t48 Muestras t72 Muestras t96
Fase 5: Análisis de muestras Fase 6: Análisis electroforético
Liofilización de 
los filtrados 
enzimáticos
Gel SDS-PAGE
Zimograma
1 2 3 4 5 6 7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Fase 1: Microorganismos
! 30!
7. Metodología 
 
7.1 Microorganismos 
7.1.1 Acondicionamiento de la cepa de A. flavus (CECT-2687), 
cosecha y conteo de esporas 
El acondicionamiento del organismo fúngico se realizó a partir perlas de sílice 
con esporas desecadas las cuales fueron depositadas sobre cajas de Petri con agar 
Sabouraud, y se incubaron a 37 ºC durante 72 horas. Una vez detectado crecimiento, 
se resembraron por picadura cajas de Petri frescas con agar Sabouraud y se incubaron 
bajo las mismas condiciones. 
La cosecha de las esporas viables se realizó sobre solución salina isotónica (0.9% m/v) 
con Tween 80 (0.005% m/v). En primer lugar se vertieron 10 mL de la solución salina 
estéril en cada una de las cajas y se desprendieron las esporas con ayuda de un asa 
Drigalsky. Posteriormente se transfirió la suspensión en tubos para centrífuga de 15 mL 
y se realizaron una serie de lavados (seis) en la centrífuga a 1500 rpm durante 6min 
con solución salina limpia. A continuación se determinó la concentración de esporas en 
la suspensión final mediante el método de conteo directo en cámara de Neubauer. Para 
ello se realizó una dilución 1:200 de la suspensión previamente homogenizada y se 
tomó una alícuota de 20 µL de la dilución la cual fue colocada en el centro de la 
cámara. Las esporas contenidas en los cuadrantes 1 y 3 de la cámara fueron 
cuantificadas en el microscopio con el objetivo de 40×. La concentración final de 
esporas (9.14×108 esporas/mL de suspensión) se determinó mediante la siguiente 
ecuación: 
no.!!de!esporas
mL!suspensión = X!esporas!contadas (4)(2500) 
dónde X es el promedio de esporas, 4 es el número de cuadrantes en la cámara y 2500 
es el factor de corrección estandarizado de la cámara. 
 
 
! 31!
7.2 Medios de cultivo: Condiciones de cultivo en medio líquido 
Se prepararon 9 matraces Erlenmeyer de 500 mL con 100 mL de medio mínimo 
(MM) (Tabla 1) y 1% m/v de la fuente de carbono seleccionada. Se inocularon con 110 
µL de la suspensión de esporas para tener concentración final de 1×106 esporas/mL de 
medio. Los matraces fueron incubados a 37 °C por 96 horas en un agitador orbital a 
300 rpm para favorecer la aireación y homogenización del cultivo. Posteriormente, y 
como se indica en la Tabla 2 y en la fase 2 del esquema de la estrategia experimental, 
se añadieron 5 mL del azúcar de prueba a los matraces de adición única (t0 y t24) o 1 
mL a los matraces de triple adición (t24, t48, t72), a los diferentes tiempos de la 
fermentación. 
Tabla 1. Composición del medio mínimo (Pontecorvo, 1953). 
Sal Concentración (g/L) 
NaNO3 6.0 
KH2PO4 1.5 
KCl 0.5 
MgSO4-7H2O 0.5 
Fuente de carbono 10.0 
 
 
Tabla 2. Composición de los matraces. 
Matraz Fuente de carbono (1% m/v) Carbohidrato Tiempo de adición (h) 
1 
MM + salvado de trigo 
- - 
2 
glucosa 
0 
3 24 
4 24, 48, 72 
5 
xilosa 
0 
6 24 
7 24, 48, 72 
8 MM sacarosa y glucosa 0 
9 MM sacarosa y xilosa 0 
 
 7.2.1 Muestreo 
Para cada matraz, se tomaron alícuotas de 6 mL del medio de fermentación 
cada 24 horas bajo condiciones de esterilidad. Posteriormente, se determinó el pH de 
! 32!
cada muestra, se filtraron en equipo Millipore con algodón y las soluciones resultantes 
se almacenaron a 4 ºC. En el caso de los matraces enriquecidos con los carbohidratos, 
se tomaron muestras antes y después de la adición. Al término de la fermentación (96 
horas) se almacenaron a 4 ºC los 50 mL restantes de cada matraz, también filtrados en 
equipo Millipore con algodón para utilizarlos en el análisis electroforético 
posteriormente. 
 
7.3 Determinación de proteína: método de Bradford 
Se preparó una solución stock de albúmina (0.1 mg/mL) para realizar la curva de 
calibración con un rango de concentración de 0 a 0.7 mg de proteína/mL. Para 
determinar la concentración de proteína en las muestras problema, se añadieron 0.1 
mL de muestra en cada pozo y se adicionaron 0.2 mL de reactivo de Bradford en 
microplacas de 96 pozos. Después de 5 min de reacción, se midió absorbancia en un 
lector de microplacas a 595 nm. 
 
7.4 Determinación de actividad enzimática: actividad xilanolítica 
La actividad xilanolítica de las enzimas producidas por A. flavus bajo las 
diferentes condiciones de estudio, se determinó a partir de las muestras colectadas en 
el inciso 7.2.1. Para ello, en primer lugar se realizó la cuantificación de grupos 
reductores liberados por la acción de las enzimas en un sustrato complejo (xilanode 
abedul) y empleando una curva de calibración de xilosa. Para cada muestra problema 
(100 µL), se añadieron en tubos de ensayo de 16×150 mm los reactivos indicados en la 
Tabla 3. Una vez adicionado el filtrado al medio de reacción, se incubaron 
inmediatamente los tubos durante 20 min a 50 °C. La reacción se detuvo al agregar 1.0 
mL de ácido 3, 5-dinitrosalicílico (DNS). Posteriormente, los tubos de reacción se 
sometieron a ebullición en baño María durante 5min y se agregaron 5.0 mL de agua 
destilada. El blanco de reacción se trató bajo las mismas condiciones de análisis con la 
adición del filtrado después de detener la reacción con DNS. La absorbancia de las 
reacciones se determinó en un lector de microplacas a una longitud de onda de 575 
nm. 
 
! 33!
Tabla 3. Reactivos empleados para medir actividad xilanolítica. 
Reactivo Concentración Cantidad 
xilano de abedul 1% 0.5mL 
buffer de acetatos (pH 5.0) 100mM 0.4mL 
filtrado enzimático variable 0.1mL 
 
La actividad exoxilanolítica se expresó en unidades enzimáticas (U), definidas como la 
cantidad de enzima (xilanasas) que produce un µmol de xilosa en las condiciones del 
ensayo. 
 
7.5 Liofilización de los filtrados libres de células 
Los 50 mL restantes de filtrados libres de células se congelaron por 96 horas a 
−10 °C y posteriormente se sometieron a un proceso de liofilización a 110×10−3 mbar y 
−50 °C por 24 horas. Las muestras liofilizadas fueron resuspendidas en 1 mL de buffer 
de corrida compuesto por 0.025 M de trizma base, 0.192 M glicina y 0.1% SDS, 
ajustado a pH 8.3. 
 
7.6 Análisis electroforético 
 
7.6.1 Electroforesis SDS-PAGE 
Las pruebas electroforéticas se realizaron sobre geles de poliacrilamida de 8×8 
cm con SDS, en condiciones desnaturalizantes con un marcador de peso molecular de 
alto rango (6.5 – 200 kDa) en el primer carril. El volumen de las muestras analizadas 
fue variable ya que dependió de la concentración de proteína previamente cuantificada. 
El buffer de tratamiento desnaturalizante (SDS 4%, glicerol 20%, 2-β-mercaptoetanol 
10%, buffer Tris-HCl 125 mM ajustado a pH 6.8 y azul de bromofenol 0.005%) utilizado 
fue equivalente a la tercera parte de muestra. El gel separador se preparó al 12% de 
acrilamida y la electroforesis se realizó con un voltaje constante (30 voltios/gel), por 1 
hora y a través de una unidad de geles verticales de 1.0 mm Mini-PROTEAN Tetra Cell. 
Por cada gel para determinar proteína se corrió un gel análogo para generar el 
zimograma correspondiente. 
 
! 34!
7.6.2 Determinación de peso molecular aproximado de las proteínas 
separadas por electroforesis 
Los geles obtenidos fueron teñidos con una solución de azul de Coomassie R-
250 (0.025%), metanol (40% v/v) y ácido acético (7% v/v), durante una hora con 
agitación suave (40 rpm). Posteriormente fueron lavados con una solución de ácido 
acético (10% v/v) y se capturó la imagen con un sistema de documentación de geles 
Gel Doc XR. Una vez revelados los geles, tomando como referencia el marcador de 
peso molecular, se determinó el peso de las proteínas separadas en la electroforesis 
de acuerdo a las indicaciones del fabricante. 
 
7.6.3 Zimogramas 
Para la elaboración de los zimogramas, en primer lugar, se incubaron los geles 
de poliacrilamida después de la electroforesis en buffer de renaturalización (Tris-HCl 
10 mM ajustado a pH 7.5) a 37 ºC durante una hora, y a continuación se incubaron 
en buffer de acetatos (100 mM ajustado a pH 5.0) a 37 ºC durante 30 minutos. Bajo 
las mismas condiciones de temperatura y pH, se realizó el cambio de solución a 
buffer de acetatos con xilano de abedul al 1% durante 30 minutos. Posteriormente 
los geles se lavaron con agua destilada para retirar residuos de sustrato y se 
incubaron en 40 mL de etanol (96%) durante 15 minutos a temperatura ambiente y 
con agitación de 70 rpm. Para rehidratar los geles se retiró el exceso de etanol y se 
incubaron en las mismas condiciones de temperatura y agitación pero en agua 
destilada durante 15 minutos. Finalmente, para revelar la actividad xilanolítica, los 
geles se tiñeron con una solución de rojo Congo al 0.1% durante 15 minutos en las 
mismas condiciones de agitación y temperatura. Para visualizar las bandas donde 
se llevó a cabo la hidrólisis enzimática, se realizaron lavados con NaCl (1 M) y se 
capturaron las imágenes con un escáner de cama plana. 
! 35!
8. Resultados y discusión 
 
8.1 Efecto del pH inicial y tipo de sustrato sobre el crecimiento de A. flavus 
y la producción de xilanasas. 
 
Las cepas de A. flavus CECT-2687 (toxigénica) y NRRL-6541 (no toxigénica) 
fueron fermentadas bajo condiciones de pH inicial de 5 y 7.5. La elección de estos 
valores se fundamentó en el estudio realizado por Bhatt y colaboradores (2012) en 
donde demostraron que a pH 5 se induce la producción de enzimas, y a 7.5 se 
favorece la colonización e infección de los cultivos de importancia económica. 
 
En todos los cultivos de ambas cepas y bajo todas las condiciones experimentales, se 
observó una variación en el valor de pH después de 96 h de fermentación. Se ha 
establecido que cuando el microorganismo metaboliza los diferentes sustratos, se 
liberan compuestos como azúcares reductores, ácidos orgánicos y CO2 al medio, 
provocando un descenso del pH; por otra parte, cuando el valor del pH se incrementa, 
se ha asociado al efecto de las proteasas excretadas por el hongo una vez que los 
carbohidratos del medio han sido agotados, y a la lisis de las células en la que también 
se liberan ese tipo de enzimas. 
 
Para la cepa CECT-2687 fermentada a pH inicial de 5 y con sustratos solubles 
(glucosa, xilosa y ácido galacturónico), el agotamiento de los nutrientes, observado 
como una disminución en la concentración de los azúcares reductores, se debe a la 
alta biodisponibilidad del azúcar como fuente de carbono para ser metabolizada (Figura 
10-A); por esta razón, en ninguno de los casos se registró actividad xilanolítica, ya que 
la presencia de azúcares simples ejerce un efecto represor sobre la expresión de los 
genes que codifican estas enzimas (Figura 10-B). 
 
Los resultados obtenidos para las fermentaciones de la misma cepa pero en los medios 
enriquecidos con los sustratos complejos (xilano, salvado de trigo y olote de maíz) se 
ilustran en las Figuras 10-C y 10-D. En todos los casos, la concentración de azúcares 
! 36!
reductores en los cultivos cuya fuente de carbono fue xilano o salvado de trigo, 
incrementó drásticamente en las primeras 24 h de la fermentación, y posteriormente 
disminuyó; en el caso de los cultivos adicionados con olote de maíz, la concentración 
de estos azúcares no presentó variaciones significativas. Por otra parte, la actividad 
xilanolítica se mantuvo elevada durante prácticamente todo el periodo de fermentación 
(Figura 10-D). Este conjunto de resultados coinciden con los reportados por 
Gnanasoundari y colaboradores (2007), quienes determinaron el efecto sobre la 
producción de xilanasas por A. flavus a partir de diferentes desechos agroindustriales 
como bagazo de caña, fibra de piña y salvado de trigo, siendo este último sustrato el 
adecuado para la producción de enzimas xilanolíticas, ya que contiene una mayor 
concentración de xilano y celulosa en comparación con los otros (Gnanasoundari et al., 
2007). Cabe mencionar que el incremento en la concentración de los azúcares 
reductores se debe principalmente a la acción de la endo-β−1,4-D-xilanasa y la β-
xilosidasa, enzimas que degradan los sustratos a su unidad fundamental, xilosa. 
! 37!
 
 
Figura 10. Variación en la producción-consumo de azúcares (A y C) y producción de xilanansas (B y D) por A. flavus cepa CECT-2687, pH inicial 5, 
creciendo en sustratos solubles (A y B) y sustratos complejos (C y D). 
0 20 40 60 80
0.70
0.75
0.80
0.85
0.90
0.95
tiempo (h)
A
zú
ca
re
s 
re
du
ct
or
es
 (m
g/
m
L)
Xilano
Salvado de trigoOlote de maíz
0 20 40 60 80
0
5
10
15
tiempo (h)
A
zú
ca
re
s 
re
du
ct
or
es
 (
m
g/
m
L) Glucosa
Xilosa
Ácido galacturónico
0 20 40 60 80
0
20
40
60
80
tiempo (h)
A
ct
iv
id
ad
 x
ila
n
ol
ít
ic
a 
(U
/m
L)
Xilano
Salvado de trigo
Olote de maíz
0 20 40 60 80
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
tiempo (h)
A
ct
iv
id
ad
 x
ila
n
ol
ít
ic
a 
(U
/m
L)
Glucosa
Xilosa
Ácido galacturónico
C
B
A
D
! 38!
 
En el caso de los cultivos de la cepa 2687 fermentada bajo condiciones de pH inicial 
7.5, y la cepa 6541 a pH incial de 5 y 7.5, todos adicionados con sustratos solubles, se 
observó el mismo comportamiento en la concentración de los azúcares reductores y 
actividad xilanolítica (Figuras 11-A y B, 12-A y B y 13-A y B). Con base en estos 
resultados preliminares, se concluye que en las condiciones probadas, las xilanasas no 
son enzimas constitutivas de A. flavus CECT-2687. 
 
Por otra parte, cuando la cepa 6541 fue fermentada bajo condiciones de pH inicial de 5, 
y ambas cepas a pH inicial de 7.5, la concentración de azúcares reductores en los 
medios adicionados con salvado de trigo y olote de maíz se mantuvo constante, 
mientras que los adicionados con xilano disminuyó a pesar de que se registró un 
aumento en la actividad enzimática (Figura 11-C, 12-C y 13-C). Estos resultados están 
en armonía con el trabajo realizado por Pradal en 2012, en donde se evaluó la 
producción exo-pectinasas y xilanasas usando como sustratos polímeros puros 
(pectina cítrica y xilano de abedul) y sustratos complejos (olote de maíz, salvado de 
trigo y cáscara de limón). En este trabajo se demostró que la actividad enzimática, y 
por tanto la expresión de los genes implicados en ello, es altamente dependiente del 
valor de pH inicial de la fermentación, y se encontró que a pH 8.0 se favorece dicha 
expresión. 
 
! 39!
 
 
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
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!
!
!
!
!
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!
!
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Figura 11. Variación en la producción-consumo de azúcares (A y C) y producción de xilanansas (B y D) por A. flavus cepa NRRL-6541, pH inicial 
5, creciendo en sustratos solubles (A y B) y sustratos complejos (C y D).! !
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Figura 12. Variación en la producción-consumo de azúcares (A y C) y producción de xilanansas (B y D) por A. flavus cepa CECT-2687, pH inicial 
7.5, creciendo en sustratos solubles (A y B) y sustratos complejos (C y D). 
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Figura 13. Variación en la producción-consumo de azúcares (A y C) y producción de xilanansas (B y D) por A. flavus cepa NRRL-6541, pH inicial 
7.5, creciendo en sustratos solubles (A y B) y sustratos complejos (C y D). 
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Glucosa
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Por otro lado, con la finalidad de establecer la diferencia entre los perfiles proteicos de 
los cultivos anteriores, se realizaron los geles SDS-PAGE de cada uno medios 
siguiendo la metodología descrita en el inciso 7.6.1. Como se observa en la Figura 14, 
la cepa 2687 produjo una mayor cantidad de proteínas bajo las condiciones de 
fermentación con el pH inicial de 5 (carriles 1 al 6) en comparación con los fermentados 
a pH inicial de 7.5 (carriles 7 al 12). De todas estas, las fermentaciones adicionadas 
con salvado de trigo (carril 5) y xilano (carril 10) fueron las que presentaron en mayor 
número y concentración de bandas proteicas. 
 
El comportamiento general de las dos cepas [(toxigénica y no toxigénica (datos no 
mostrados)] respecto al sustrato añadido fue similar: (1) el consumo de fuentes de 
carbono solubles sin actividad xilanolítica y (2) la degradación de fuentes complejas 
con incremento de actividad xilanolítica durante el tiempo de fermentación. Con base 
en lo anterior, se decidió utilizar únicamente a la cepa CECT-2687 para los siguientes 
experimentos, además las condiciones de fermentación de pH inicial de 5 y la adición 
de salvado de trigo como fuente de carbono. 
 
 
Figura 14. Gel SDS-PAGE, perfil proteico de los cultivos de la cepa 2687 en condiciones de pH inicial de 
5 (carriles 1 al 6) y 7.5 (carriles 7 al 12), con fuentes de carbono simples [glucosa (carriles 1 y 7), xilosa 
(carriles 2 y 8) y ácido galacturónico (carriles 3 y 9)] y complejas [xilano (carriles 4 y 10), salvado de trigo 
(carriles 5 y 11) y olote de maíz (carriles 6 y 12)]. 
 
! 43!
Para determinar el efecto de los azúcares simples sobre la represión o inducción 
en la producción de enzimas xilanolíticas en la cepa A. flavus (CECT-2687), se 
diseñaron una serie de experimentos en donde se adicionó glucosa y/o xilosa a 
diferentes tiempos durante la fermentación del microorganismos en medio sumergido 
con salvado de trigo. Como se puede observar en la Figura 15, el hongo fue capaz de 
metabolizar eficientemente, independiente del tiempo de adición, a la glucosa (hexosa) 
y la xilosa (pentosa), además de que el consumo de estos azúcares es inmediato y no 
interfiere con la utilización de la fuente de carbono presente en el medio. 
 
En el caso de la fermentación que contenía únicamente salvado, la concentración de 
azúcares reductores se mantuvo constante (alrededor de 1.0 mg/mL) durante las 96 h 
de análisis. Por otra parte, la concentración de estos azúcares en los matraces con 
adición única de glucosa al tiempo “t0”, aumentó al momento de la adición (Figura 15-
A, línea roja), luego se consumió la cantidad añadida en las primeras 24 h de 
fermentación, y finalmente se mantuvo constante (aproximadamente 1.0 mg/mL) 
durante el resto de la fermentación. En el caso de la adición de xilosa (Figura 15-B, 
línea roja), a t0 se consumió la cantidad añadida en las primeras 48 horas y luego se 
mantuvo constante por el resto de la fermentación. 
 
En los experimentos con adición única al tiempo t24, se observó la activación del 
metabolismo del microorganismo mediante la producción de azúcares reductores a 
partir de la degradación del salvado en las primeras 24 h de fermentación, mismos que 
son necesarios para el crecimiento del hongo (Figuras 15 A y B, línea verde). Cuando 
se realizó la adición, se consumió la cantidad añadida de los azúcares (glucosa o 
xilosa) entre las 24 y 48 h de fermentación y posteriormente la concentración se 
mantuvo constante (aproximadamente 1.0 mg/mL) durante restode la fermentación. 
 
En el último experimento se realizaron tres adiciones del azúcar (glucosa o xilosa) 
durante la incubación a los t24, 48 y 72 (Figuras 15 A y B, línea morada). Las primeras 
24 h de fermentación fueron similares a las de la adición única al t24, en donde se 
produjo una cantidad mínima de azucares reductores. Después de la primera adición al 
! 44!
t24, el azúcar añadido se consumió durante las siguientes 24 h hasta llegar a la 
concentración de 1.0 mg/mL. De igual forma, tras realizar la segunda y tercera adición 
a los t48 y t72, respectivamente, se consumió la cantidad agregada de los azucares en 
las siguientes 24 h hasta llegar a la concentración de 1.0 mg/mL. La única diferencia 
entre las adiciones de los azucares glucosa y xilosa se presentó entre las 24 y 48 h de 
fermentación, en donde en el caso de la glucosa, se observó una producción continua 
de azucares a partir del medio (salvado de trigo) en una proporción parecida a la de las 
primeras 24 h de fermentación. Este comportamiento ha sido descrito también para las 
pectinasas de Aspergillus flavipes (Aguilar y Huitrón, 1987). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
! 45!
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Variación en la concentración de azúcares reductores durante las 96h de fermentación en los 
ensayos de adición de glucosa (A) y xilosa (B). 
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Salvado+xil t0
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A
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! 46!
En el experimento de adición de sacarosa, que tenía como objetivo evaluar la posible 
producción de una invertasa para sacarosa, se observa que en las primeras 24 h de 
fermentación hay un incremento significativo en la concentración de azúcares 
reductores (Figura 16), el cual se atribuye a que el microorganismos comienza a 
degradar la sacarosa del medio por efecto de la producción de la enzima invertasa de 
hidrólisis extracelular de sacarosa (Guimaraes et al., 2009). Cuando se adiciona 
sacarosa+glucosa (Figura 16, línea roja) y sacarosa+xilosa (Figura 16, línea verde), se 
observa también un incremento de los azucares reductores en las primeras 24 h y 
posteriormente disminuye la concentración éstos hasta un nivel ligeramente más bajo 
que el inicial. Cabe mencionar que para esos análisis no re realizó una medición 
cuantitativa de la biomasa generada en cada uno de los matraces debido a la presencia 
de salvado de trigo en los medios de fermentación. Sin embargo, no se observó la 
aparición significativa de biomasa en los cultivos. 
 
! 47!
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16. Variación en la concentración de los azúcares reductores en los fermentados con sacarosa en combinación con azúcares simples 
durante 96h
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Salvado
Sacarosa+glc
Sacarosa+xil
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Los resultados de la actividad xilanolítica de los distintos fermentados ensayados se 
ilustran en la Figura 17. De manera general, se logó cuantificar dicha actividad en 7 de 
los 9 experimentos, siendo los matraces con sacarosa en combinación con el azúcar 
simple (glucosa o xilosa), los únicos que no mostraron actividad enzimática. 
 
En la Figura 17-A, se presentan los resultados de las fermentaciones con adiciones de 
glucosa comparados contra la fermentación que contenía únicamente el medio mínimo 
con salvado de trigo. 
Se observa que la fermentación en el medio sin la adición del azúcar (Figura 17-A, 
línea azul), el valor máximo de actividad, en el tiempo t24, tiene un valor aproximado de 
1600 U/mg proteína; posteriormente, entre las 24 y 72 h, la actividad disminuye 
ligeramente (200 unidades) y mantiene en un valor constante; finalmente, en las 
últimas 24 h de incubación, la actividad desciende hasta los 500 U/mg proteína. 
 
En el caso de la fermentación en el medio de salvado de trigo con la adición única de 
glucosa al t0 (Figura 17-A, línea roja), se observa que la actividad de xilanasas es 
menor a 250 U/mg proteína durante las primeras 24 horas de la fermentación. Cuando 
comparamos este resultado con el obtenido en experimento de azúcares reductores 
(Figura 15-A, línea roja), podemos deducir que este valor tan bajo de actividad se debió 
a la adición de glucosa que, como se menciona en los antecedentes, funciona como 
represor sobre la producción de enzimas degradadoras de carbohidratos complejos. 
Posteriormente, entre las 24 y 48 h de fermentación, se observó un incremento en la 
actividad hasta 1500 U/mg proteína. Luego, en las 48 h restantes de fermentación, la 
actividad enzimática disminuye aproximadamente 500 unidades. Cabe destacar que 
estos resultados están en armonía con los observados en la Figura 15, en donde se 
correlaciona la disminución de actividad específica con el valor constante en la 
concentración de azúcares reductores de las 48 a las 96 h de fermentación. 
 
Para la fermentación con adición única al t24, Figura 17-A línea verde, se observa un 
máximo en la actividad xilanolítica en las 24 horas, las restantes 72 horas de 
fermentación la actividad disminuye como en el caso de la fermentación con adición 
! 49!
única de glucosa al t0. Este comportamiento se puede atribuir a dos fenómenos: los 
cambios en el pH influyen en la baja estabilidad de las enzimas y por lo tanto se 
disminuye su actividad, o a la presencia de proteasas que hidrolizan las enzimas 
xilanolíticas. 
 
La fermentación con adiciones sucesivas de glucosa (Figura 17-A, línea morada) 
presenta un comportamiento similar al de la fermentación sin adiciones, con valores de 
actividad más bajos de las 0 a las 72 horas, en donde se iguala la actividad enzimática, 
y disminuye las últimas 24 horas a un valor cerca de 1000 U/mg proteína. 
 
El efecto de represión e inducción se aprecia con mayor claridad en las fermentaciones 
con adición de xilosa donde, en comparación con el caso de salvado sin adiciones, la 
adición única al t0 y las sucesivas en t24, 48 y 72 horas, reprimen la actividad 
xilanolítica, mientras que la adición al t24 la induce. 
! 50!
 
Figura 17. Variación en la actividad enzimática específica en las fermentaciones con adiciones de 
glucosa (A) y xilosa (B) durante 96 h. 
 
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Salvado
Salvado+xilosa t0
Salvado+xilosa t24
Salvado+xilosa t24,48,72
Sacarosa+xil
A
B
! 51!
En la Figura 18-A se ilustra mediante el gel SDS-PAGE presencia de las proteínas 
contenidas en las muestras de filtrados enzimáticos. Exceptuando a los carriles 5 y 9 
que corresponden a las muestras con sacarosa, condición en la que se produjo una 
cantidad muy baja de proteína no detectable por los métodos empleados, los demás 
carriles presentaron múltiples bandas con diferentes pesos moleculares, además de 
algunas bandas que están presentes en todas las muestras, como la bandas con peso 
molecular entre 20 y 24 kDa. Es importante mencionar que para la elaboración de este 
análisis electroforético, se midió la cantidad de proteína presente en los filtrados 
enzimáticos para eliminar el efecto del crecimiento del microorganismo, e incubar la 
misma cantidadde proteína en cada uno de los pozos y evaluar la producción de 
xilanasas. 
 
De manera complementaria, en el zimograma de la Figura 18-B se observa la actividad 
xilanolítica pero solo por algunas de las proteínas producidas en los fermentados. De 
forma similar a lo observado en el gel SDS-PAGE, en todos los carriles excepto el 5 y 
el 9, se observó actividad xilanolítica, sobre todo en las bandas proteicas entre los 20 y 
24 kDa (carriles 1-4 y 6-8), 200 kDa (carriles 1, 6 y 7) y 6.5 kDa (carriles 3 y 8). Por otra 
parte, la actividad del carril 3 (salvado + glucosa t24), fue equivalente al de la 
fermentación control (carril 1), con la principal diferencia de que la enzima de 
aproximadamente 6.5 kDa se produjo en mayor cantidad. En este sentido, podemos 
deducir que la glucosa no tuvo efecto sobre la expresión enzimática y esto pudo 
deberse a que probablemente para el tiempo en el que se realizó la adición del azúcar, 
el microorganismo ya había producido el complejo enzimático necesario para el 
metabolismo del salvado de trigo. Por otra parte, los carriles 2 (salvado + glucosa t0) y 
4 (salvado + glucosa t24,48,72) presentaron el mismo perfil de actividad enzimática. 
Este perfil también presentó similitudes con el carril 1 (salvado), en donde se observó la 
represión de las enzimas de peso molecular mayor a 20 kDa. La producción de enzima 
con actividad xilanolìtica con peso molecular de aproximadamente 6.5 kDa nos permite 
deducir que la adición inicial y las adiciones sucesivas de glucosa reprimen 
parcialmente la expresión del sistema xilanolítico de A. flavus. En el caso de los carriles 
6 y 7 (salvado + xilosa t0 y salvado + xilosa t24) también presentaron similitud con en 
! 52!
carril 1 en cuanto a la producción de enzimas entre 20 y 24 y 200 kDa. En el caso 
específico del carril 6, este fenómeno se puede atribuir a la adición de xilosa al tiempo 
inicial de fermentación. Finalmente, el carril 8 (salvado + xilosa t24,48,72) mostró 
actividad enzimática en las bandas proteicas de entre 6.5, 20 y 24 kDa. Cabe 
mencionar que las enzimas que fueron menos sensibles al efecto de represión por los 
azúcares simples fueron las que se encuentran entre los 20 y 24 kDa, mientras que las 
enzimas que fueron más susceptibles (inducibles) fueron las de un peso molecular de 
aproximadamente 130 kDa. Es probable que estas enzimas sean las β-xilosidadsa, ya 
que se han reportado que tienen un peso molecular en el mismo rango. 
 
Con la finalidad de poder hacer una comparación mas ilustrativa del gel SDS-PAGE y 
el zimograma, se realizó la superposición de ambas figuras (Figura 19). 
 
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Figura 18. (A) Gel SDS-PAGE al 12% de acrilamida para la determinación del peso molecular de 
proteínas. (B) Zimograma para la determinación de la actividad xilanolítica en los filtrados enzimáticos: 
carril 1, salvado; carril 2, salvado+glucosa t0; carril 3, salvado+glucosa t24; carril 4, salvado+glucosa t24, 
48 y 72; carril 5, sacarosa+glucosa; carril 6, salvado+xilosa t0; carril 7, salvado+xilosa t24; carril 8, 
salvado+xilosa t24, 48 y 72; carril 9, sacarosa+xilosa t24,48,72, carril 9: Sacarosa+xilosa. �
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Figura 19. Superposición digital del gel SDS-PAGE y el zimograma
! 55!
 
9. Conclusiones 
 
• Se demostró que la cepa CECT-2687 de A. flavus tiene la capacidad de utilizar 
todas las fuentes de carbono empleadas en este trabajo. 
 
• La producción de los sistemas enzimáticos varía de acuerdo con las condiciones 
iniciales de la fermentación y está estrechamente relacionada con el pH inicial y la 
naturaleza y concentración de la fuente de carbono. 
 
• Utilizando el método de fermentación sumergida y bajo las condiciones de 
temperatura, pH, agitación y tiempo de fermentación probadas, la cepa CECT-2687 
de A. flavus fue capaz de producir enzimas xilanolíticas a partir de salvado de trigo, 
olote de maíz y xilano de abedul. 
 
• Los resultados del SDS-PAGE y zimografía permitieron identificar tres grupos de 
enzimas con actividad xilanolítica con pesos moleculares aproximados de 6.5, 20-24 
y 130 kDa. 
 
• Bajo las condiciones experimentales de este trabajo no fue posible identificar 
xilanasas constitutivas producidas por la cepa CECT-2687 de A. flavus, debido a 
que en las fuentes de carbono como la sacarosa y otros azúcares simples, el 
microorganismo no produjo enzimas con actividad xilanolítica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
! 56!
10. Perspectivas 
 
• Realizar los mismos experimentos bajo la modalidad de fermentación en estado 
sólido, con la finalidad de determinar la eficiencia en la producción de las enzimas 
con actividad xilanolítica, además de evaluar el comportamiento del microorganismo 
en condiciones más cercanas a su hábitat natural (limitada disponibilidad de agua). 
 
• Realizar los cultivos en bioreactores para evaluar factores como el efecto del flujo 
de aire y agitación con sustratos complejo. 
 
• Utilizar otros medio de cultivo complejos para las fermentaciones como los salvados 
de mijo y avena. 
 
• Evaluar el efecto de la sacarosa o fructosa en combinación con salvado de trigo, 
sobre la inducción o represión de la actividad enzimática. 
 
• Realizar los experimentos con la cepa no toxigénica, A. flavus NRRL-6541. 
 
! 57!
11. Bibliografía 
 
1. Aguilar, G., Huitrón, C. (1987). Stimulation of the production of extracelular 
pectinolitic activities of Aspergillus sp. By galacturonic acid and glucose adition. Enzyme 
Microbiology. Techol. 9:690-696. 
2. De Alencar Guimaraes, N. C., Sorgatto, M., Peixoto-Nogueira, S. de C., Betini, J. 
H. A., Zanoelo, F. F., Marques, M. R., … Giannesi, G. C. (2013). Bioprocess and 
biotecnology: effect of xylanase from Aspergillus niger and Aspergillus flavus on pulp 
biobleaching and enzyme production using agroindustrial residues as substract. 
SpringerPlus, 2, 380. 
3. Amaike, S., Keller, N. (2011). Aspergillus flavus. Annual Review of 
Phytopathology. 49:107–33. 
4. Arce, O. (2012). Producción de extractos enzimáticos a partir de Fomes sp. 
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5. Bennett, J. W., (2010). An Overview of the Genus Aspergillus. En: Machida, M. y 
Gomi, K. (eds). Aspergillus: Molecular Biology and Genomics. Norfolk: Caister 
Academic Press. pp. 1-17. 
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