Utilizacion-de-nejayote-para-la-produccion-de-xilanasas-y-feruloilesterasas-de-Aspergillus-niger-FP160-en-bioreactor

•

Outros

Estudiando Biologia

15/8/2022

¡Este material tiene más páginas!

Entonces, ¿te gustó este material?

Ayude a animar a otros estudiantes a mejorar el contenido

¿Te gustó este material? ¡Compartir! 🧡

Biología

322.799 Materiales compartidos

Descarga la aplicación para disfrutar aún más

Lea materiales sin conexión, sin usar Internet. Además de muchas otras características!

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

UTILIZACIÓN DE NEJAYOTE PARA LA PRODUCCIÓN DE
XILANASAS Y FERULOILESTERASAS DE Aspergillus niger FP160
EN BIOREACTOR

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICA DE ALIMENTOS

PRESENTA
EILEEN VITTORIA CANCHOLA CARRILLO

MÉXICO, CIUDAD DE MÉXICO AÑO 2019

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso

DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: JOSE GUILLERMO DE JESUS AGUILAR OSORIO
VOCAL: Profesor: FRANCISCO RUIZ TERAN
SECRETARIO: Profesor: ALEIDA MINA CETINA
1er. SUPLENTE: Profesor: GENARO JIMENEZ REYES
2° SUPLENTE: Profesor: FRANCISCO JAVIER DIAZ GARCIA

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA:
GRUPO DE FISIOLOGÍA DE HONGOS. DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y
BIOTECNOLOGÍA. FACULTAD DE QUÍMICA. CONJUNTO E. LABORATORIO
312.

ASESOR DEL TEMA:
Dr. José Guillermo de Jesús Aguilar Osorio

___________________________________
SUSTENTANTE:
Eileen Vittoria Canchola Carrillo

___________________________________

Tabla de Contenido
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................................. 5
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................... 5
1. – RESUMEN .......................................................................................................................................... 7
2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................... 8
3.- HIPÓTESIS ........................................................................................................................................... 9
4.- OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 10
4.1.- OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................ 10
4.2.- OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................................................................ 10
5.- ANTECEDENTES .............................................................................................................................. 11
5.1.- EL GÉNERO ASPERGILLUS .................................................................................................................. 11
5.1.1.- Aspergillus niger ....................................................................................................................... 13
5.2.- ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DE LA PARED CELULAR VEGETAL ....................................................... 15
5.2.1.- Xilano .......................................................................................................................................... 17
5.3.- ENZIMAS DEGRADADORAS DE LA PARED CELULAR VEGETAL ............................................................. 19
5.3.1.- Xilanasas ................................................................................................................................... 19
5.3.2.- Feruloilesterasas ...................................................................................................................... 23
5.3.3.- Aplicaciones industriales ......................................................................................................... 27
5.4.- EL MAÍZ Y EL PROCESO DE NIXTAMALIZACIÓN .................................................................................... 31
5.4.1.- Nejayote ..................................................................................................................................... 34
5.5.1.- FERMENTADOR DE TANQUE AGITADO. ............................................................................................. 38
6.- METODOLOGÍA ................................................................................................................................ 43
6.1.- MATERIAL BIOLÓGICO ......................................................................................................................... 43
6.1.1. Microorganismo .......................................................................................................................... 43
6.1.2. Nejayote ...................................................................................................................................... 43
6.2.- MÉTODOS ............................................................................................................................................ 44
6.2.1.- Preparación del inóculo de A. niger FP160 .......................................................................... 44
6.2.2.- Medios y condiciones de cultivo líquido ................................................................................ 44
6.2.3.- Análisis de la producción de xilanasas y feruloilesterasas. ............................................... 45
6.2.4- Determinación de la actividad enzimática por el método de DNS ..................................... 45
6.2.5- Actividad de feruloilesterasas en placa .................................................................................. 46
6.2.6- Tratamiento de semipurificación del filtrado enzimático crudo ........................................... 46
6.2.7- SDS-PAGE ................................................................................................................................. 47
6.2.8- Zimograma para xilanasas ....................................................................................................... 47
7.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................................... 48
7.1.- EFECTO DEL PH EN LA PRODUCCIÓN DE XILANASAS Y FERULOILESTERASAS ................................... 48
7.1.1. Fermentaciones en matraz a pH inicial 5 ............................................................................... 48
7.1.2. Fermentaciones en matraz a pH inicial 8 ............................................................................... 51
7.2.- EFECTO DE LA VELOCIDAD DE AGITACIÓN Y AIREACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE XILANASAS Y
FERULOILESTERASAS. .................................................................................................................................. 55
7.2.1. Fermentaciones en bioreactor a pH inicial 5 ......................................................................... 55
7.2.2. Fermentación en bioreactor a pH inicial 8 .............................................................................. 58
7.3. CARACTERIZACIÓN DE LOS FILTRADOS ENZIMÁTICOS ......................................................................... 61
5

8.- CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 64
9.- PERSPECTIVAS ................................................................................................................................65
REFERENCIAS ....................................................................................................................................... 66

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA 1. Composición aproximada del pericarpio crudo de maíz….………………............32
TABLA 2. Composición aproximada de los sólidos de nejayote……………………….……..35
TABLA 3. Comparativa de FA en pericarpio y nejayote en diferentes variedades de
maíz……………………………………………………..…………………………..……..………37
TABLA 4. Actividad enzimática máxima alcanzada por Aspergillus niger FP160 en las
diferentes condiciones de cultivo………..………………………………....……………………54

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructuras de reproducción asexual de Aspergillus sp. Copyright © 2013. Facultad
de Medicina .............................................................................................................................. 11
Figura 2. Ciclo de vida de Aspergillus niger. Modificado de
http://www.biologydiscussion.com/fungi/aspergillus-habitat-reproduction-and-
importance-ascomycotina/24000 ......................................................................................... 144
Figura 3. Estructura y composición de la pared celular vegetal (tomada de
http://www.biofuel.webgarden.com/sections/blog/pictures-for-lignocellulose) ............. 155
Figura 4. Representación esquemática de la estructura del xilano. (Ronald P De Vries and
Visser, 2001) ........................................................................................................................... 177
Figura 5. Estructura química del arabinoxilano. (Niño-Medina et. al. 2009) ........................... 188
Figura 6. Enzimas accesorias involucradas en la degradación de hemicelulosa. (Beg et. al,
2001) ......................................................................................................................................... 21
Figura 7. Representación de ácido ferúlico en la estructura de polisacáridos. El ácido
diferúlico está involucrado en el entrecruzamiento de polisacáridos de la pared celular.
................................................................................................................................................. 255
Figura 8. Modelo del papel que juega xlnR y CreA en la regulación de los genes que
codifican las enzimas degradadoras de hemicelulosa en A. niger. (Modificado de Vries y
Visser, 2001) ........................................................................................................................... 277
Figura 9. Principales estructuras del grano de máiz. Modificado de: Ocupational Safety and
Health Administration: OSHA Technical Manual, sección IV, capítulo 5.
https://www.osha.gov/dts/osta/otm/otm_iv/otm_iv_5.html ................................................. 31
Figura 10. Localización de la cocción alcalina (nixtamalización) y producción de nejayote en
el diagrama de procesamiento industrial del maíz. (Serna-Saldivar, 2010) ...................... 33
Figura 11. Diagrama de un Fermentador de tanque agitado. Industrial Microbiology: an
introduction. ............................................................................................................................. 40
6

Figura 12. Monitoreo del pH de la fermentación de Aspergillus niger FP160 en matraz a pH
inicial 5. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo,
1% salvado de trigo. 100% Medio Mínimo, 1% salvado de trigo. ................................. 48
Figura 13. Monitoreo de la actividad xilanolítica de fermentaciones de Aspergillus niger
FP160 en matraz a pH inicial 5. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo. 75% nejayote,
25% Medio Mínimo, 1% salvado de trigo. 100% Medio Mínimo, 1% salvado de trigo.
................................................................................................................................................... 49
Figura 14. Monitoreo de la producción de feruloilesterasa de Aspergillus niger FP160 en
matraz a pH inicial 5. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo. 75% nejayote, 25%
Medio Mínimo, 1% salvado de trigo. 100% Medio Mínimo, 1% salvado de trigo........ 50
Figura 15. Monitoreo del pH de las fermentaciones de Aspergillus niger FP160 en matraz a
pH inicial 8. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo,
1% salvado de trigo. 100% Medio Mínimo, 1% salvado de trigo. ................................. 51
Figura 16. Monitoreo de la producción de xilanasas de Aspergillus niger FP160 en matraz a
pH inicial 8. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo,
1% salvado de trigo. 100% Medio Mínimo, 1% salvado de trigo. ................................. 52
Figura 17. Monitoreo de la producción de feruloilesterasa de Aspergillus niger FP160 en
matraz a pH inicial 8. 75% nejayote, 25% Medio Mínimo. 75% nejayote, 25%
Medio Mínimo, 1% salvado de trigo. 100% Medio Mínimo, 1% salvado de trigo. ....... 53
Figura 18. Monitoreo del pH de la fermentación de Aspergillus niger FP160 en bioreactor de
tanque agitado, a pH inicial 5 y medio de cultivo con 75% nejayote, 25% Medio Mínimo y
1% salvado de trigo. 200 rpm, 1 vvm. 200 rpm, 0.5 vvm. 400 rpm, 1 vvm.
400 rpm, 0.5 vvm...................................................................................................................... 55
Figura 19. Monitoreo de la producción de xilanasas de Aspergillus niger FP160 en bioreactor
de tanque agitado, a pH inicial 5 y medio de cultivo con 75% nejayote, 25% Medio
Mínimo y 1% salvado de trigo. 200 rpm, 1 vvm. 200 rpm, 0.5 vvm. 400 rpm, 1
vvm. 400 rpm, 0.5 vvm. ..................................................................................................... 56
Figura 20. Monitoreo de la producción de feruloilesterasas de Aspergillus niger FP160 en
bioreactor de tanque agitado, a pH inicial 5 y medio de cultivo con 75% nejayote, 25%
Medio Mínimo y 1% salvado de trigo. 200 rpm, 1 vvm. 200 rpm, 0.5 vvm. 400
rpm, 1 vvm. 400 rpm, 0.5 vvm. ......................................................................................... 57
Figura 21. Perfil proteico de los filtrados enzimáticos de Aspergillus niger FP160. A: SDS-
PAGE. B: Zimograma de xilanasas. Carril I: Matraz 75% nejayote, 25% MM, pHi 5. Carril
II: Matraz 75% nejayote, 25% MM, 1% salvado de trigo, pHi 5. Carril III: Matraz 100% MM,
1% Salvado de trigo, pHi 5. Carril IV: Bioreactor 75% nejayote, 25% MM, 1% salvado de
trigo, pHi 5. Carril V: Marcador de peso molecular. Carril VI: Matraz 75% nejayote, 25%
MM, pHi 8. Carril VII: Matraz 75% nejayote, 25% MM, 1% salvado de trigo, pHi 8. Carril
VIII: Matraz 100% MM, 1% salvado de trigo, pHi 8. Carril IX: Bioreactor 75% nejayote,
25% MM, pHi 8. ......................................................................................................................... 61

1. – Resumen

En México, el maíz es consumido principalmente como tortillas, con un consumo
per capita promedio de 120 kg/año. La masa de maíz se elabora reproduciendo, en
una escala moderna e industrial, el antiguo arte azteca de cocinar y procesar el maíz
con cal mediante un proceso de lixiviación alcalina llamado nixtamalización. Dicho
proceso utiliza grandes cantidades de agua y produce un efluente altamente alcalino
rico en hidróxido de calcio, sólidos solubles e insolubles y pericarpio del maíz
conocido como nejayote. Este efluente causa graves problemas de contaminación
debido a su pH (10-14) y a la demanda bioquímica de oxígeno impartida por los
sólidos que contiene.
Aspergillus niger es uno de los microorganismos de mayor importancia en el campo
de la biotecnología; ha sido utilizado por décadas para producir enzimas
extracelulares de gran importancia industrial tales como xilanasas, celulasas,
proteasas y lipasas entre otras, así como compuestos como el ácido cítrico, todos
ellos con estatus GRAS.
Este trabajo se llevó a cabo conuna cepa autóctona aislada por nuestro grupo de
investigación e identificada como Aspergillus niger FP160. Con el fin de optimizar la
producción xilanasas y feruloilesterasas en fermentación sumergida utilizando
nejayote como fuente de carbono, se probaron condiciones de pH inicial de 5 y 8 en
matraz; así como la suplementación de dicho medio de cultivo con salvado de trigo.
Al determinarse la mejor condición para la producción de dichas enzimas (75%
nejayote, 25% Medio Mínimo y 1% salvado de trigo) se escaló la producción a
bioreactor de 1L de capacidad y se evaluó el efecto de la agitación y aireación en la
producción de xilanasas y feruloilesterasas; encontrándose que la condición de
mayor agitación y aireación evaluada (400 rpm y 1 vvm) favorece la producción de
dichas enzimas. Finalmente, se comparó el perfil proteico y zimográfico de las
xilanasas producidas en cada condición de pH inicial y de fuente de carbono.

2.- Planteamiento del Problema

El maíz es uno de los principales cultivos a nivel mundial y su consumo en México
es de suma relevancia a nivel económico y nutricional debido a que la tortilla
representa el 1% del PIB nacional y el segundo producto más importante en la
canasta básica de consumo (Secretaría de Economía, 2010). Dado que el proceso
de nixtamalización para la producción de tortilla genera un efluente altamente
contaminante, conocido como nejayote, rico en polisacáridos, particularmente,
arabininoxilano y xilano, provenientes del maíz, por lo que puede ser utilizado por
hongos del género Aspergillus para la producción de enzimas de interés industrial.
Actualmente, A. niger posee el estatus GRAS (Generally Regarded As Safe, por sus
siglas en inglés) y es ampliamente utilizado para la producción de enzimas a nivel
industrial, particularmente de xilanasas y celulasas (Bennet, 2010; Vries & Visser,
2001).

3.- Hipótesis

El nejayote es un desecho agroindustrial que contiene arabinoxilano y xilano,
reconocidos como inductores de xilanasas y ácido ferúlico reconocido como
inductor de feruloilesterasas; por lo que, Aspergillus niger será capaz de producir
xilanasas y feruloilesterasas utilizando nejayote como medio de cultivo.

4.- Objetivos

4.1.- Objetivo General
 Producción de xilanasas y feruloilesterasas de Aspergillus niger
FP160 utilizando nejayote como fuente de carbono.
4.2.- Objetivos Particulares
 Analizar la producción de xilanasas y feruloilesterasas de Aspergillus
niger FP160 en matraz, utilizando nejayote como fuente de carbono.
 Analizar el efecto de la suplementación de los medios de cultivo con
salvado de trigo.
 Determinar las condiciones de pH inicial y fuente de carbono más
favorables para la producción de xilanasas y feruloilesterasas y
utilizarlas para el escalamiento en bioreactor de 1L.
 Analizar la producción de xilanasas y feruloilesterasas de Aspergillus
niger FP160 en bioreactor de 1L utilizando diferentes condiciones de
agitación y aireación
 Analizar y comparar el perfil de proteínas y zimograma de xilanasas
de Aspergillus niger FP160.

5.- Antecedentes

5.1.- El género Aspergillus

El género Aspergillus es un grupo de hongos filamentosos con un gran número de
especies y que se reproduce únicamente de manera asexual. El primer registro de
este hongo puede encontrarse en el Nova Plantarum Genera de Micheli. En 1729,
al observar al microscopio la estructura que soporta las esporas, ésta le recordó al
dispositivo utilizado por el clero católico romano para rociar agua bendita durante la
liturgia, el asperges o aspergillum, del cual recibe su nombre. En 1926 una primera
clasificación de estos hongos fue propuesta describiendo 11 grupos dentro del
género; sin embargo, una reexaminación del género publicada en 1945, identifica
14 grupos distintos. Algunos de estos grupos conformados por hongos patógenos,
por ejemplo A. fumigatus, A. flavus y A. parasiticus; pero más importantes por su
aplicación industrial son algunos miembros del grupo de Aspergillus negros como
A. niger y A. tubingensis (Bennet, 2010; Vries & Visser, 2001).

La morfología del conidióforo, la estructura que soporta las esporas asexuales, es
la característica taxonómica más importante utilizada en la taxonomía de
12

Aspergillus. Las especies de Aspergillus son comunes y se encuentran ampliamente
distribuidas. Como estrategia nutricional, estos organismos secretan ácidos y
enzimas al ambiente que les rodea, degradando los polímeros en moléculas más
simples para después absorberlas; son organismos heterotróficos. Los Aspergillus
crecen abundantemente como saprófitos en vegetación en descomposición donde
se han encontrado en grandes cantidades; muchas de sus especies se han
adaptado para la degradación de polímeros vegetales complejos. Se encuentran
entre los grupos de hongos filamentosos más exitosos y cuyo papel tanto en los
ecosistemas naturales como en la economía humana posee gran importancia;
además de producir numerosas enzimas extracelulares y ácidos orgánicos de gran
utilidad, estos hongos producen metabolitos secundarios de importancia
biotecnológica. Debido a su prevalencia en el ambiente y su facilidad de cultivo, este
microorganismo se encuentra actualmente involucrado en procesos industriales que
incluyen la producción de enzimas, ácidos orgánicos de suma importancia como el
ácido cítrico y la producción de alimentos como la salsa de soya (Bennet, 2010;
Vries & Visser, 2001).
Además de las técnicas morfológicas tradicionalmente aplicadas, nuevas técnicas
bioquímicas y moleculares han sido utilizadas en la reclasificación de este grupo de
Aspergillus. Dichos análisis han resultado en la clara distinción de 8 grupos de
Aspergillus negros: A. niger, A. tubingensis, A. foetidus, A. carbonarius, A.
japonicus, A. aculeatus, A. heteromorphus y A. ellipticus. Los productos de varias
de estas especies han obtenido la distinción GRAS (Generally Regarded As Safe,
por sus siglas en inglés), lo que les permite ser utilizados para aplicaciones
alimentarias. Los Aspergillus negros tienen ciertas características que los hacen los
microorganismos ideales para aplicaciones industriales tales como buena
capacidad fermentativa y altos niveles de excreción de proteínas. En particular, una
amplia variedad de enzimas producidas por el género Aspergillus para la
degradación de polisacáridos de la pared celular vegetal son de suma importancia
para la industria alimentaria (De Vries & Visser 2001).

5.1.1.- Aspergillus niger

Aspergillus niger es uno de los microorganismos de mayor importancia en el campo
de la biotecnología. Ha sido utilizado por varias décadas para producir enzimas
extracelulares y ácido cítrico. De hecho, al ácido cítrico y a muchas enzimas de A.
niger se les ha otorgado el status GRAS por parte de la FDA (Food & Drug
Administration, por sus siglas en inglés) de Estados Unidos. Adicionalmente es
utilizado para biotransformaciones y tratamiento de desechos (Schuster et al. 2002).

A. niger es un hongo filamentoso del Phylum Ascomycota encontrado en el
ambiente de manera ubicua, crece aeróbicamente en materia orgánica en
descomposición y ha sido también implicado en infecciones oportunistas en
humanos. En la naturaleza, se encuentran en materia orgánica en descomposición
y como miembro regular de la microbiota del suelo, juega un papel significativo en
el ciclo del carbono. Aspergillus niger es capaz de crecer en amplio rango de
temperatura que va de 6-47°C con una temperatura óptima de crecimiento
relativamente alta de 35-37°C. La actividad acuosa límite parasu crecimiento es de
0.88, lo cual es relativamente alto comparado con otras especies de Aspergillus. A.
niger es capaz de crecer en un rango de pH extremadamente amplio: 1.4-9.8.
Dichas habilidades y la abundante producción de conidiosporas, las cuales se
distribuyen por vía aérea, aseguran la ubicuidad de la especie, teniendo una mayor
incidencia en climas cálidos y húmedos (Schuster et al. 2002; Baker 2006).
Este microorganismo saprófito posee una amplia variedad de enzimas hidrolíticas y
oxidativas involucradas en la descomposición de material lignocelulósico. Una gran
variedad de dichas enzimas son importantes a nivel biotecnológico. A. niger se
convirtió en un organismo utilizado industrialmente cuando se produjo por primera
vez en 1919 ácido cítrico por fermentación. El ácido cítrico es ampliamente utilizado
en una variedad de industrias y, por volumen de venta, excede enormemente a otros
metabolitos como el ácido glucurónico. El ácido cítrico es el acidulante principal en
14

la industria alimenticia y de bebidas. Es utilizado en productos como jugos, postres,
gelatinas, dulces y vino. En la industria farmacéutica el citrato ferroso es utilizado
como fuente de hierro y el ácido cítrico es utilizado en la industria alimentaria como
conservador en bebidas, mermeladas, conservas y otros; en los cosméticos se
utiliza como buffer, para ajustar pH y como antioxidante.

Figura 2. Ciclo de vida de Aspergillus niger. Modificado de
http://www.biologydiscussion.com/fungi/aspergillus-habitat-reproduction-and-importance-ascomycotina/24000

También tiene otras aplicaciones industriales que incluyen detergentes, curtido de
piel, galvanoplastia y otras aplicaciones en donde se requiere un agente
secuestrante con actividad en rangos de pH de neutral a bajo. Adicionalmente al
ácido cítrico, A. niger es una fuente rica de enzimas: pectinasas, proteasas y
amiloglucosidasas por nombrar algunas (Schuster et al. 2002; Baker 2006).
A. niger también es importante como microorganismo modelo para algunas áreas
de estudio que incluyen el estudio de la secreción de proteínas en eucariontes en
general, el efecto de factores ambientales en la supresión o inducción de la
exportación de enzimas degradadoras de biomasa, mecanismos moleculares
críticos en el desarrollo de procesos fermentativos y mecanismos involucrados en
el control de la morfología fúngica (Baker 2006)
15

5.2.- Estructura y composición de la pared celular vegetal

Los polisacáridos que constituyen la pared celular de las plantas son los
compuestos orgánicos más abundantes encontrados en la naturaleza; conforman
hasta el 90% de la pared celular vegetal y pueden dividirse en tres grandes grupos:
celulosa, hemicelulosa y lignina. La pared celular de las plantas es un material
complejo en el cual celulosa, hemicelulosa (principalmente xilano) y lignina se
encuentran estrechamente asociadas. En la madera, los principales constituyentes
se distribuyen de la siguiente manera: celulosa (35-50%), hemicelulosa (20-30%) –
grupo de carbohidratos complejos en el cual el xilano es el más abundante- y lignina
(20-30%) (Subramaniyan & Prema, 2002).

Figura 3. Estructura y composición de la pared celular vegetal (tomada de
http://www.biofuel.webgarden.com/sections/blog/pictures-for-lignocellulose)

http://www.biofuel.webgarden.com/sections/blog/pictures-for-lignocellulose
16

La celulosa representa el mayor constituyente de los polisacáridos de la pared
celular y consiste en cadenas lineales de D-glucopiranosa unidos mediante enlaces
β-1,4 condensados mediante puentes de hidrógeno formando estructuras cristalinas
llamadas microfibrillas. Estas microfibrillas consisten en hasta 250 cadenas de
glucosa unidas por hemicelulosa. Adicionalmente a esta estructura cristalina, la
celulosa contiene regiones no cristalinas (amorfas) dentro de las microfibrillas. La
cantidad relativa de celulosa cristalina y no cristalina varía dependiendo de su origen
y su principal función es la de proveer rigidez a la pared celular vegetal (Ronald P
De Vries and Visser 2001).

Por su parte, la hemicelulosa es un polisacárido más heterogéneo y la segunda
estructura orgánica más abundante en la pared celular vegetal. El polímero de
hemicelulosa de mayor abundancia en cereales y madera dura es el xilano. El xilano
consiste en un esqueleto de residuos de D-xilosa unidos mediante enlaces β-1,4 y
que pueden tener grupos sustituyentes como L-arabinosa, D-galactosa, acetilo,
feruloil, p-cumaroil y ácido glucurónico (Ronald P De Vries and Visser 2001). Dicho
heteropolisacárido contiene los grupos sustituyentes acetil, 4-O-metil-D-glucuronosil
y α-arabinofuranosil ligados al esqueleto de β-1,4-xilopiranosa y cuyas propiedades
enlazantes se encuentran mediadas por interacciones covalentes y no covalentes
con lignina, celulosa y otros polímeros. La lignina está unida al xilano mediante un
enlace éster a residuos de ácido 4-O-metilD-glucurónico (Puls, 1997).

Los polisacáridos hemicelulosa y pectina, así como el polímero aromático lignina,
interactúan con las fibrillas de celulosa creando una estructura rígida que fortalece
la pared celular vegetal. También forman entrecruzamientos covalentes, los cuales
se cree que están involucrados en limitar el crecimiento celular y reducir la
biodegradabilidad de la pared celular. Dos tipos de entrecruzamientos covalentes
han sido identificados entre los polisacáridos vegetales y la lignina; sin embargo, el
entrecruzamiento formado por ácido diferúlico es el más estudiado. Los puentes de
ácido diferúlico entre polisacáridos y lignina han sido identificados en muchas
plantas. El segundo tipo de entrecruzamiento es el enlace éster entre lignina y ácido
17

glucurónico unido a xilano, el cual ha sido identificado en madera de haya (Ronald
P De Vries and Visser 2001).

5.2.1.- Xilano

El xilano es el polisacárido complejo más abundante en la hemicelulosa cuya
estructura puede variar enormemente dependiendo de su origen, pero siempre
contiene un esqueleto de D-xilosa unido mediante enlaces β-1,4. La Figura 4 es una
representación esquemática del xilano, en la cual se enlistan las diferentes
estructuras que pueden estar unidas al esqueleto de xilosa, lo que resulta en una
gran variedad de estructuras de xilano encontradas en las plantas. A pesar de que
la mayor parte de los xilanos son estructuras ramificadas, algunos polisacáridos
lineales han podido ser aislados. El xilano de cereales contiene grandes cantidades
de L-arabinosa y por tanto se refiere a ellos como arabinoxilanos; mientras que al
xilano de maderas duras se le llama glucuronoxilano debido a las grandes
cantidades de ácido D-glucurónico unido a su esqueleto (Ronald P De Vries and
Visser 2001).

Figura 4. Representación esquemática de la estructura del xilano. (Ronald P De Vries and Visser, 2001)

Los arabinoxilanos son polisacáridos no amiláceos de la pared celular del
endospermo de los cereales; la arabinosa se conecta al esqueleto del xilano
mediante enlaces α-1,2 ó α-1,3 ya sea como un solo residuo o como una cadena
lateral corta. Estas cadenas laterales pueden contener además xilosa unida a
arabinosa mediante enlaces β-1,2, y galactosa, que puede estar unida a arabinosa
mediante enlaces β-1,5 ó a xilosa mediante enlaces β-1,4. El ácido glucurónico y su
18

4-O-metil éter se encuentran unidos al xilano mediante un enlace α-1,2; mientras
que los residuos aromáticos feruloil y p-cumaroil sólo han sido localizados, hasta el
momento, unidos al O-5 de residuos de arabinosa terminal. Los dehidrodímeros de
ácido ferúlico (estructuras de ácido diferúlico) pueden servir para entrecruzar los
polímeros de la pared celular y contribuir a la red de la pared celular (Niño-Medina
et al. 2009 , R P de Vries et al. 2000).

Figura 5. Estructura química del arabinoxilano.(Niño-Medina et. al. 2009)

Los compuestos aromáticos son considerados de suma importancia para la
estructura y función de la pared celular vegetal. El ácido ferúlico puede estar unido
tanto a la hemicelulosa como a la pectina y es capaz de entrecruzar dichos
polisacáridos el uno con el otro, así como también al polímero aromático lignina.
Esta estructura entrecruzada aumenta la rigidez de la pared celular. Un incremento
en los entrecruzamientos con ácido ferúlico durante el proceso de maduración
vegetal sugiere un papel del ácido ferúlico en la limitación del crecimiento celular y
en la prevención de biodegradabilidad de la planta debido al efecto antimicrobiano
de los compuestos aromáticos; lo que contribuye al mecanismo de defensa de la
planta contra microorganismo fitopatógenos (Ronald P De Vries and Visser 2001).

5.3.- Enzimas degradadoras de la pared celular vegetal

Para colonizar las plantas, los hongos han desarrollado estrategias para invadir el
tejido vegetal y optimizar tanto su crecimiento como su propagación. Estos hongos,
generalmente secretan un cóctel de enzimas hidrolíticas, incluyendo cutinasas,
celulasas, pectinasas y proteasas para penetrar al tejido vegetal. Después de la
entrada, una estrategia para colonizar una especie de planta es a menudo la
secreción de toxinas o compuestos semejantes a las hormonas de plantas que
manipulan la fisiología de ésta para el beneficio del patógeno. Esta interferencia
puede consistir simplemente en matar a las células vegetales con el fin de la
absorción de nutrientes (Knogge, 1996).
Las enzimas son biocatalizadores complejos de naturaleza proteica de gran
especificidad y eficiencia, que aceleran la velocidad con la que las reacciones se
llevan a cabo sin alterar el equilibrio y son responsables de las transformaciones
metabólicas de los seres vivos. Así mismo, son el foco de una intensa investigación
en todo el mundo, no sólo en la comunidad biológica, sino también con los procesos
de diseñadores/ ingenieros, ingenieros químicos e investigadores que trabajan en
otros campos científicos (Beg, et al, 2001).
Entre las enzimas que degradan polisacáridos de la pared celular de plantas de
mayor interés se encuentran las celulasas, pectinasas, xilanasas, entre otras. Así
como también las proteasas, lipasas y amilasas que tienen interés industrial.

5.3.1.- Xilanasas

La biodegradación del esqueleto de xilano depende de dos clases de enzimas.
Endoxilanasas (EC 3.2.1.8) que juegan un papel de suma importancia en la
degradación del xilano mediante la hidrólisis aleatoria del esqueleto de xilosa y la
liberación de xilooligosacáridos, los cuales serán hidrolizados posteriormente en
unidades de xilosa por la Exo- 1,4-β-xilosidasa (EC 3.2.1.37). Los grupos
sustituyentes presentes en el xilano son liberados por la α-L-arabinofurosidasa, α-
20

D-glucuronidasa, galactosidasa y acetil-xilanesterasa. Ambas clases de enzimas,
así como los genes que las codifican, han sido caracterizados en varios organismos,
varias endoxilanasas han sido identificadas en Aspergillus. Aunque la variación es
detectada en el peso molecular o el pH óptimo de degradación, la mayor diferencia
entre las enzimas es su punto isoeléctrico (PI) el cual va de 3.5 a 9. Las
endoxilanasas también difieren en cuanto a especificidad hacia el polímero de
xilano. Algunas enzimas cortan aleatoriamente entre los residuos de xilosa no
sustituidos, mientras que la actividad de otras endoxilanasas depende fuertemente
de los sustituyentes de los residuos de xilosa adyacentes a los residuos atacados
(Ronald P De Vries and Visser ,2001; Subramaniyan & Prema, 2002).

La Exo- 1,4-β-xilosidasa (EC 3.2.1.37) cataliza la hidrólisis de 1,4-β-D-xilo-
oligosacáridos removiendo residuos de D-xilosa sucesivos del extremo no reductor.
Las xilanasas reportadas que liberan xilosa durante la hidrólisis de xilano no tienen
ninguna actividad sobre xilobiosa, las cuales podrían ser fácilmente hidrolizadas por
β-xilosidasas. La hidrólisis total del glucoronoxilano natural, requiere esterasas que
remuevan la unión a ácidos acéticos y fenólicos. Las esterasas hidrolizan los
enlaces de la xilosa al ácido acético [acetil xilanesterasa (EC. 3.1.1.6)], de los
residuos de las cadenas laterales de arabinosa al ácido ferúlico [feruloilesterasas
EC. 3.1.1.73] y al ácido p-cumárico [p-cumaroilesterasa]. La ruptura de los grupos
de acetil, feruloil y p-cumaroil del xilano es muy útil en la remoción de lignina. Puede
contribuir a la solubilización de lignina hidrolizando los enlaces éster entre la lignina
y la hemicelulosa. Si se utilizan junto con otras xilanasas u otras enzimas
degradadoras de xilano en el bioblanqueo de pulpa, las esterasas pueden degradar
parcialmente y debilitar la estructura de la pared celular (Subramaniyan & Prema,
2002).

Figura 6. Enzimas accesorias involucradas en la degradación de hemicelulosa. (Beg et. al, 2001)

Recientemente ha ocurrido un incremento en la utilización de preparados
enzimáticos de xilanasas producidas por hongos teniendo un pH óptimo ≤ 5.5. El
pH óptimo para la hidrólisis de xilano es alrededor de pH=5 para la mayor parte de
las xilanasas fúngicas, aunque normalmente son estables a pH 3-8. La mayor parte
de los hongos produce xilanasas que toleran temperaturas inferiores a los 50°C. En
general, salvo raras excepciones, los hongos productores de xilanasas reportados
se cultivan a pH inicial menor a 7. En muchas de las aplicaciones industriales,
especialmente la industria papelera, el bajo pH requerido para el crecimiento óptimo
y la actividad xilanolítica requiere operaciones adicionales en las etapas
subsecuentes, lo que hace las xilanasas fúngicas menos apropiadas
(Subramaniyan & Prema, 2002).

Aunque se han reportado altas actividades xilanolíticas para muchos hongos,
debido a la presencia de cantidades considerables de actividad celulolítica dicho
preparado enzimático es poco apropiado para la industria papelera. En 1988 se
22

clasificaron las xilanasas microbianas en dos grupos de acuerdo a características
fisicoquímicas como masa molar y punto isoeléctrico (pI). Mientras que un grupo
consiste en enzimas de masa molar elevada con bajo pI, el otro es de baja masa
molar con elevado pI y sus excepciones. Posteriormente se encontró que la
clasificación anterior concuerda con la clasificación de las glucanasas que se basa
en análisis del cluster hidrofóbico y similitudes en cuanto a secuencia de
aminoácidos. Las endoxilanasas de elevada masa molar y pI bajo pertenecen a la
familia 10 de glucanasas, conocida anteriormente como familia “F”; mientras que las
enzimas de baja masa molar y elevado pI están clasificadas como familia 11 de las
glucanasas, anteriormente conocida como familia G (Wong, Tan, and Saddler
1988).

Tras series de estudios extensivos sobre las diferencias en las propiedades
catalíticas entre las familias de xilanasas se concluyó que las endoxilanasas de la
familia 10, en contraste con las de la familia 11, son capaces de atacar los enlaces
glucosídicos adyacentes a las ramificaciones y hacia el extremo no reductor.
Mientras que las endoxilanasas de la familia 10 requieren dos residuos de xilosa no
sustituidos entre ramificaciones, las endoxilanasas de la familia 11 requieren tres
residuos de xilosa no sustituidos consecutivos. Las endoxilanasas de la familia 10
poseen varias actividades catalíticas compatibles con las β-xilosidasas. Las
endoxilanasas de la familia 10 liberan los residuos de xilopiranosil terminales que
se encuentran unidos a residuos sustituidos, y además exhiben actividad aril-β-D-
xilosidasa (Bajpai, 2014).

En muchos de los reportes concernientes a las xilanasas se encuentra la existencia
de éstas enzimas de manera constitutiva. El xilano es un heteropolisacárido
comparativamente grande,el cual no puede entrar a la matriz celular a través de la
membrana celular. Los productos de la hidrólisis del xilano son moléculas de bajo
peso molecular como la xilosa, xilobiosa, xilotriosa y otros xilo-oligosacáridos. Estas
moléculas pueden penetrar fácilmente las células microbianas y sostener su
23

crecimiento actuando como fuente de carbono. Los productos de la hidrólisis del
xilano pueden estimular la producción de xilanasas por diferentes métodos. Al ser
la xilosa una molécula pequeña de pentosa, puede entrar en la célula fácilmente e
inducir la producción de xilanasas. Existen dos explicaciones plausibles para el rol
inductivo de moléculas más grandes. Una de ellas explica que los xilo-oligómeros
formados por la acción de las xilanasas sobre el xilano son directamente
transportados hacia la matriz celular donde son degradados por β-xilosidasas
intracelulares que liberan residuos de xilosa desde el extremo del oligómero. Lo
anterior es consistente con la existencia de β-xilosidasas en microorganismos de
manera universal. La otra posibilidad es que los oligómeros son hidrolizados en
monómeros durante su transportación al interior de la célula a través de la
membrana celular mediante la acción de transportadores hidrolíticos que poseen
proteínas con actividad exo β-1,4 como las β-xilosidasas. La idea anterior está
sustentada en reportes de β-xilosidasas con actividad transferasa. En ambos casos
las moléculas de xilosa resultantes derivan en una producción aumentada de
xilanasas. Si la glucosa, la fuente de carbono más efectiva, se encuentra presente
en el medio de cultivo, ocurre una represión de la síntesis de enzimas catabólicas
que puede ocurrir a nivel transcripcional o por exclusión del inductor de las enzimas.
En Aspergillus niger el gen xlnR controla la síntesis de las enzimas xilanolíticas y de
dos endoglucanasas (celulasas), lo que sugiere que existe un sistema regulatorio
en común para ambos sistemas enzimáticos (Subramaniyan & Prema, 2002)

5.3.2.- Feruloilesterasas

Las feruloilesterasas (FAEs) ó esterasas del ácido ferúlico [E.C. 3.1.1.73]
representan una subclase de hidrolasas de éster carboxílico; actúan en sinergia con
las xilanasas para hidrolizar el enlace éster que une al ácido ferúlico (FA) y diferúlico
(diFA) a la pared celular vegetal, liberando ácidos fenólicos como el ácido ferúlico
(FA) y el ácido p-cumárico y sus dímeros, encontrados naturalmente en
hemicelulosas y pectinas; en donde se encuentran principalmente como ésteres con
24

polisacáridos que contienen L-arabinofuranosa tales como L-arabino-D-xilanos y L-
arabinanos (Topakas, Vafiadi, and Christakopoulos 2007).

Los residuos de ácido ferúlico en la pared celular vegetal están unidos
principalmente al xilano y a la pectina y pueden entrecruzar los polímeros de la
pared celular, lo cual incrementa la rigidez, inhibe la elongación celular y reduce su
biodegradablidad por microorganismos (Ronald P De Vries and Visser 1999).

El ácido hidroxicinámico más abundante es el trans-FA, ácido (E)-4-hidroxi-3-
metoxicinámico; constituye aproximadamente el 0.66% (m/m, peso seco) en
salvado de trigo, 1.24% en trigo entero, 3.1% en salvado de maíz, 0.9% en la pared
celular del endospermo de arroz, 0.14% en granos de cebada, 0.32% en cebada
gastada, 2.2-3.8% en cáscara de avena y 1.4% en cáscara de cebada.Se encuentra
usualmente esterificado en la posición O-5 a cadenas laterales de α-L-
arabinofuranosil en arabinoxilanos, en la posición O-6 a residuos de β-D-
galactopiranosil en ramnogalacturonanos y en la posición O-4 a residuos de α-D-
xilopiranosil en xiloglucanos (Topakas, Vafiadi, and Christakopoulos 2007).

Diferentes especies de Aspergillus tales como Aspergillus flavipes y Aspergillus
niger fueron las productoras más activas de FAE en condiciones de cultivo
sumergido en presencia de fuentes de carbono derivadas de lignocelulosa, tales
como salvado de maíz y salvado de trigo (Johnson et al, 1989).

Figura 7. Representación de ácido ferúlico en la estructura de polisacáridos. El ácido diferúlico está
involucrado en el entrecruzamiento de polisacáridos de la pared celular.

La elección de un sustrato apropiado es de gran importancia para la producción
exitosa de esterasas. El sustrato no sólo sirve como fuente de carbono y energía,
sino que también provee los compuestos inductores necesarios para el
microorganismo. Monosacáridos y disacáridos como glucosa, xilosa, lactosa,
maltosa y xilitol generalmente no permiten la producción de FAE. Esto puede
deberse a los mecanismos de represión catabólica y/o de inducción, los cuales no
han sido completamente elucidados. Fuentes de carbono complejas que contienen
grandes cantidades de ácido ferúlico esterificado como el salvado de trigo, salvado
de maíz, malta gastada, remolacha y otros han sido empleados eficientemente para
la producción de FAE. Así mismo una variedad de sustratos naturales tales como
oligosacáridos ferulados y salvado de trigo desamilado han sido utilizados para la
detección de enzimas. En paralelo, esteres sintéticos de varios ácidos cinámicos
con cadenas cortas de alcoholes, tales como metil y etilferulatos, han sido
26

introducidos para la detección de FAEs (Topakas, Vafiadi, and Christakopoulos
2007).

La expresión del gen que codifica para la feruloilesterasa A (FAEA) de Aspergillus
niger depende de la D-xilosa (expresión mediada por XlnR, el activador
transcripcional xilanolítico) y de un segundo sistema que responde a compuestos
aromáticos con una estructura cíclica definida, tales como el ácido ferúlico y
vanillínico. Estudios conducidos por Vries y Visser (1999) de regulación del gen de
la feruloilesterasa en Aspergillus mostraron que la enzima es sintetizada de manera
separada en xilano y pectina. El gen que codifica para la feruloilesterasa A (faeA)
de Aspergillus niger ha sido clonado, y se ha estudiado la inducción de este gen a
nivel de proteína. Se detectó un alto nivel de actividad enzimática de FaeA en el
filtrado del cultivo cuando una mutante super productora fue cultivada en un medio
que contenía arabinoxilano de trigo. Bajos niveles de actividad de FaeA se
detectaron al cultivarla en pectina de remolacha. La adición de ácido ferúlico al
medio de cultivo que contenía xilano incrementó los niveles de actividad de FaeA
en los filtrados del cultivo. El gen que codifica la feruloilesterasa B (FAEB),
formando una proteína homodimérica con FAEA, fue amplificado del DNA genómico
de A. niger utilizando un primer “rio arriba” conservando la secuencia señal
requerida para la translocación del retículo endoplásmico, y un primer “rio abajo”
con un marcador de 6 codones de histidina para facilitar la separación por
cromatografía de afinidad (Faulds et al. 1997; Ronald P De Vries and Visser 1999;
Panda and Gowrishankar 2005).

En Aspergillus niger, dos sistemas regulatorios afectan la expresión de los genes
que codifican para enzimas involucradas en la degradación de los polímeros de la
pared celular vegetal. El regulador transcripcional de represión catabólica del
carbono, CreA, evita la transcripción de estos genes en presencia de sustratos que
son fácilmente metabolizables, tales como glucosa o fructosa y el activador
transcripcional xilanolítico, XlnR, es requerido para la expresión de todos los genes
codificantes de enzimas xilanolíticas, incluyendo faeA, y algunos genes de
27

celulasas, cuando A. niger es cultivado en xilosa o xilano. Por otro lado, se ha
observado la inducción en pectina y xilanos mejoran en presencia del ácido ferúlico
lo que sugiere que hay un sistema regulatorio más complejo (Ronald P De Vries and
Visser 1999).

Figura 8. Modelo del papel que juega xlnR y CreA en la regulación de los genes que codifican las enzimas
degradadoras de hemicelulosa en A. niger. (Modificadode Vries y Visser, 2001)

5.3.3.- Aplicaciones industriales

La aplicación más importante de las xilanasas es el preblanqueo y pulpeo de la
pulpa Kraft, dicho proceso en el cual se remueve la lignina residual de la pulpa de
Kraft, está física y químicamente restringido por la hemicelulosa y por lo cual ha
ganado importancia como alternativa a los compuestos químicos clorados tóxicos.
Los principales motivos para dicho desarrollo son las ventajas económicas y
ambientales que as xilanasas aportan a la planta de banqueo (Beg et al. 2001).

El proceso de pulpeo más común es el proceso Kraft o proceso del sulfato en el cual
la cocción de las virutas de madera se lleva a cabo en una solución de Na2S/NaOH
28

a aproximadamente 170°C durante 2 horas, resultando en la degradación y
solubilización de la lignina. La pulpa resultante tiene un característico color café, el
cual se debe principalmente a la presencia de lignina y derivados de lignina
residuales y cuya intensidad es función de la cantidad y estado químico de la lignina
residual, la cual es difícil de remover debido a las interacciones covalentes a las
fibras de celulosa y hemicelulosa. Para obtener una pulpa brillante toda la lignina
debe ser eliminada, para lo cual el pulpeo químico es más efectivo que el mecánico;
sin embargo, la lignina residual debe ser removida por un proceso de blanqueo.
Dicho proceso puede considerarse como un proceso de purificación que involucra
la destrucción, alteración o solubilización de la lignina, compuestos orgánicos
coloridos y otros residuos indeseables en las fibras. Estos químicos del blanqueo
ocasionan diversos problemas relacionados con los efluentes en la industria
papelera. Los subproductos de la utilización de estos químicos son sustancias
orgánicas cloradas, de las cuales muchas son tóxicas, mutagénicas, persistentes y
bioacumulables y ocasionan numerosas afectaciones en los sistemas biológicos
(Beg et al. 2001; Subramaniyan & Prema, 2002).

Convencionalmente, el cloro es utilizado en el proceso de blanqueo. A bajo pH la
principal reacción del cloro es de halogenación en lugar de oxidación y su principal
función es convertir la lignina residual en productos solubles en agua o álcali. Los
efluentes producidos durante todo el proceso, en especial después del tratamiento
con cloro y las primeras etapas de extracción, son los mayores contribuyentes a la
contaminación de las aguas de desecho de la industria papelera (Subramaniyan et
al, 2001).

Las alternativas disponibles incluyen deslignificación por oxigenación, cocción
extendida y sustitución del óxido de cloro por cloro, peróxido de hidrógeno y ozono;
sin embargo, estos métodos involucran la inversión de grandes capitales para
cambiar el proceso. El bioblanqueo en cambio, utiliza microorganismos y enzimas
para blanquear la pulpa. Se basa en la habilidad de algunos microorganismos de
29

despolimerizar la lignina directamente o en enzimas que ataquen la hemicelulosa y
por tanto favorezcan la subsecuente despolimerización de la lignina (Beg et al.
2001).

La principal enzima requerida para mejorar la deslignificación de la pulpa Kraft es la
endo-β-xilanasa, sin embargo, el enriquecimiento con otras enzimas como
mananasas, lipasas y α-galactosidasas han mostrado un aumento en el efecto del
tratamiento enzimático de la pupa Kraft. El mecanismo mediante el cual las
xilanasas facilitan e blanqueo de la pulpa no está del todo elucidado. La enzima no
blanquea la pulpa sino que cambia la estructura de la pulpa. Una hipótesis es que
despolimeriza la hemicelulosa precipitada en la superficie de la fibra; lo cual abre la
estructura de la pulpa permitiendo el acceso a los químicos del blanqueo. Sin
embargo, también es posible que las xilanasas liberen cromóforos asociados a los
carbohidratos. La ruptura del complejo carbohidrato-lignina para producir residuos
más pequeños de lignina, los cuales son más fáciles de remover, es también un
mecanismo posible del pretratamiento enzimático con lignina. Por tanto, el
pretratamiento enzimático de la pulpa Kraft parece ser el proceso más adecuado
para facilitar el blanqueo de la pulpa. Las xilanasas pueden reducir el requerimiento
de agentes oxidantes químicos en un 20-40% (Beg et al. 2001).

Recientemente ha surgido un interés considerable en las FAEs y su potencial
aplicación en la obtención de FA a partir de desechos agroindustriaes como los que
se producen en las industrias de la molienda, cervecera y azucarera. El FA puede
ser utilizado como antioxidante y se ha demostrado que posee cierta actividad hacia
el peroxinitrito y que oxida lipoproteínas de baja densidad (oxLDL) in vitro. El FA
también ha sido evaluado en sinaptosomas y cultivos neuronales expuestos al
“daño” de radicales peroxilo e hidroxilo mediante estrés oxidativo severo y podría
ser un candidato prometedor como antioxidante en desórdenes neurodegenerativos
como el Alzheimer (Topakas, Vafiadi, and Christakopoulos 2007).

Existe también un creciente interés en el uso potencial de FA como materia prima
para la bioconversión catalítica en otras moléculas de interés como estirenos,
polímeros, alquilbencenos epóxidos, derivados del ácido vainillínico, catecoles,
guayacol y vainillina. Éste último es una de las moléculas aromáticas
universalmente utilizada en las industrias, alimenticia, farmacéutica y cosmética.
Los ácidos ferúlico, sináptico, caféico y cumárico son ampliamente utilizados en la
industria alimenticia, bebidas y perfumería debido a sus propiedades antioxidantes
y como precursores de saborizantes. Sus ésteres están presentes en cereales,
desechos agroindustriales y biopulpa. Las feruloil y cinamoilesterasas de
Aspergillus niger, junto con pectinasas celulasas y xilanasas, pueden liberar tales
ácidos hidroxicinámicos a partir del salvado de trigo, salvado de arroz, bagazo de
caña. Bambú, remolacha etc. Dichas enzimas son producidas y utilizando
fermentaciones sumergidas o fermentaciones en estado sólido (Topakas, Vafiadi,
and Christakopoulos 2007; Panda and Gowrishankar 2005).

Las FAEs serían las enzimas a utilizar para la deslignificación biológica de plantas
no maderosas debido a que hidrolizan los puentes de ferulato que unen a la lignina
con los carbohidratos de la pared celular de diferentes monocotiledones y
dicotiledones. Empleado conjuntamente con xilanasas u otras enzimas
degradadoras de xilano en biopulpeo y bioblanqueo de pulpa, las esterasas pueden
quebrantar parcialmente y aflojar la estructura de la pared celular. El complejo
carbohidrato-lignina sería entonces más susceptible al ataque enzimático y sus
productos de degradación serían más solubles. La extractabilidad mejorada de la
lignina podría resultar en una reducción del consumo de cloro en las etapas
subsecuentes del blanqueo y mejoraría la brillantez de la pulpa (Topakas, Vafiadi,
and Christakopoulos 2007).

5.4.- El maíz y el proceso de Nixtamalización

El maíz ha sido la principal fuente de alimento en México, especialmente en el medio
rural, donde aproximadamente el 70% del total de calorías requerido y el 50% de
los requerimientos proteínicos provienen de este cereal. La tortilla representa en
promedio el 47% de la ingesta calórica y su procesamiento industrial el 1% del
producto interno bruto; así mismo la industria tortillera en México representa una
quinta parte de su mercado alimenticio total, con una producción anual estimada de
11 millones de toneladas y ventas por 4 billones de dólares (Gutiérrez-Uribe et al.
2010; Velasco-Martinez et al. 1997; Martínez-Bustos et al. 2001).

Figura 9. Principales estructuras del grano de máiz. Modificado de: Ocupational Safety and Health
Administration: OSHA Technical Manual, sección IV, capítulo 5.
https://www.osha.gov/dts/osta/otm/otm_iv/otm_iv_5.htmlLa estructura más externa del grano de maíz es el pericarpio, el cual representa 5-
6g/kg de peso seco del grano y aproximadamente 51g/kg de la fibra total del grano.
El arabinoxilano (59.06g/kg) y la xilosa (29.53g/kg) son los principales componentes
del pericarpio crudo (Martínez-Bustos et al. 2001).

https://www.osha.gov/dts/osta/otm/otm_iv/otm_iv_5.html
32

Tabla 1. Composición aproximada del pericarpio crudo de maíz.

CNT= Carbohidratos neutros totales. (Martínez-Bustos et al. 2001)

La masa de maíz se elabora reproduciendo, en una escala moderna e industrial, el
antiguo arte azteca de cocinar y procesar el maíz con cal mediante un proceso de
lixiviación alcalina llamado nixtamalización.

Del náhuatl “nixtli” (cenizas) y “tamalli” (masa), el proceso de la nixtamalización se
inicia con la adición de dos partes de solución de cal generalmente al 1% a una
porción de grano entero, el cual es cocinado durante 50 a 90 minutos a 80-100°C y
se deja remojando en el agua de cocción de 14-18 horas. Posteriormente, el grano
es lavado con grandes cantidades de agua, produciendo un grano suave y sin
cascarilla llamado nixtamal, donde la fracción acuosa es un subproducto llamado
nejayote (Velasco-Martinez et al. 1997; Paredes et. al. 2009).

Este proceso puede realizarse en lote o como un proceso continuo dependiendo del
equipo de producción y de los procesos implementados, y es altamente dependiente
de la variedad de maíz, temperatura, tiempo y concentración de álcali utilizado. Se
sabe que durante la nixtamalización ocurren muchos cambios físicos, químicos y
estructurales al interior de los granos de maíz grano (Rosentrater 2006; Velasco-
Martinez et al. 1997).

Componente Pericarpio crudo
Arabinosa (g/kg CNT) 2.47
Xilosa (g/kg CNT) 29.53
Galactosa (g/kg CNT) 0.45
Ácido D-glucurónico (g/kg) 2.46
Arabinoxilano (g/kg) 59.06
33

Figura 10. Localización de la cocción alcalina (nixtamalización) y producción de nejayote en el diagrama de
procesamiento industrial del maíz. (Serna-Saldivar, 2010)

Estos incluyen la solubilización y disolución de tejidos del pericarpio, especialmente
desde la capa del endocarpio (lo que facilita la remoción física del pericarpio durante
los subsecuentes procesos de agitación y lavado) hasta la capa de aleurona (la cual
permanece unida al endospermo), gelatinización parcial del almidón del
endospermo, desnaturalización parcial de las proteínas del endospermo y el
germen, hidratación del almidón y proteínas, y penetración y absorción del calcio al
interior de la matriz del germen y endospermo. Todos estos cambios derivan en
granos hinchados y suavizados que pueden ser fácilmente molidos durante el
34

proceso de elaboración de la masa de maíz. El grano cocido, conocido como
nixtamal, el cual contiene típicamente entre 35-70% de agua, es separado del agua
de remojo (nejayote), el cual se ha enriquecido con limo y pericarpio; lo cual abarca
alrededor del 7% del peso total del grano (Rosentrater 2006; Velasco-Martinez et
al. 1997).
De acuerdo con cifras de la Secretaría de Economía, para el año 2010 el consumo
anual de tortilla a nivel nacional alcanzó 6.9 millones de toneladas; de las cuales el
65% se elabora con masa de nixtamal y el 35% restante con harina de maíz
(Secretaría de Economía, 2010). A partir de estos datos se calcula que anualmente
se procesan 3.2 millones de toneladas de maíz mediante el proceso de
nixtamalización.

5.4.1.- Nejayote

La pérdida de sólidos en el agua residual, también llamada nejayote, oscila entre el
5.5 y 12.5%; aproximadamente el 50% de los sólidos de nejayote se encuentran en
suspensión y contienen aproximadamente 64% de polisacáridos no amiláceos, 20%
almidón y 1.4% de proteína. El otro 50% se compone de sólidos solubles que
consisten en proteínas, azúcares, vitaminas y fitoquímicos ricos en compuestos
fenólicos y carotenoides. La mayor parte de los sólidos insolubles provienen del
pericarpio y los solubles filtrables del endospermo y germen (Rojas-García et al.
2012; Gutiérrez-Uribe et al. 2010).

El nejayote tiene altas concentraciones de materia orgánica en suspensión y en
solución debido al uso de hidróxido de calcio en el proceso de nixtamalización, que
degrada y solubiliza componentes de la pared celular del maíz, facilitando la
remoción del pericarpio. El pH de dicho efluente es cercano al máximo de alcalinidad
(10 a 14). El nejayote contiene del 6 al 8% de sólidos del germen, lo que incluye
parte del pericarpio, endospermo, pequeñas porciones de germen y carotenoides
35

(pigmentos) responsables de su coloración amarillenta; sus sólidos son ricos en
fibra dietética (45.3%), calcio (5.7%) y ácido ferúlico (219 mg/100g sólidos de
nejayote) (Acosta-Estrada et al. 2014; Niño-Medina et al. 2009)
El ácido ferúlico (ácido 3-metoxi, 4-hidroxicinámico) es el compuesto fenólico más
comúnmente asociado con los granos de cereal. Se ha confirmado que los ácidos
ferúlicos se encuentran en su mayoría asociados a la pared celular mediante
enlaces éster y que es abundante en la aleurona y el pericarpio (Gutiérrez-Uribe et
al. 2010).

El nejayote más el agua de lavado exhaustivo (5 veces) presento altos valores de
xilosa (64.23g/kg de sólidos solubles) seguido de ácido glucurónico (8.60g/kg de
sólidos solubles) y galactosa (1.1g/kg de sólidos solubles). El análisis de los
polisacáridos de la pared celular de la fibra del maíz dieron D-xilosa (48-50g/kg), L-
arabinosa (33-35g/kg), galactosa (5-11g/kg) y ácido glucurónico (3-6g/kg). Un
reporte previo menciona que los polisacáridos solubilizados durante la cocción
alcalina fueron xilosa (60g/kg), arabinosa (34.4g/kg) y galactosa (5.6g/kg)
conteniendo también ácido glucurónico (Martínez-Bustos et al. 2001).
Adicionalmente el equipo de Niño-Medina analizó el nejayote utilizado en su estudio
encontrando lo siguiente:

Tabla 2. Composición aproximada de los sólidos de nejayote.
Componente g/ 100g de sólidos de nejayote
Arabinosa 32.0 + 0.80
Xilosa 49 + 1.90
Glucosa 5.10 + 0.40
Proteína 4.50 + 0.20
Ácido ferúlico 0.23 + 0.01 μg/mg
Ácido diferúlico 0.58 + 0.01 μg/mg
(Niño-Medina et al. 2009)

Dado que la pérdida de sólidos que ocurre durante la nixtamalización está
principalmente influenciada por diversos parámetros clave en el proceso que
incluyen la variedad de maíz, dureza del endospermo, calidad del grano, tipo y
concentración del álcali, tiempo y temperatura de cocción y remojo, fricción
producida durante el lavado y transporte, equipo y prácticas utilizadas durante el
proceso (Rosentrater, 2006); el tipo y cantidad de polisacáridos liberados durante la
nixtamalización es variable. Sin embargo, cabe resaltar que en todos los casos los
principales componentes del nejayote son arabinosa, xilosa, ácido ferúlico y ácido
glucurónico en proporciones variables.

Debido a los grandes volúmenes de agua utilizados durante la nixtamalización (3:1
proporción en peso de nejayote producido con respecto al grano procesado) se
estima que anualmente la cantidad de nejayote generada en México es de
aproximadamente 9.6 millones de m3 (Secretaría de Economía, 2010); además,
debido a su alta concentración de materia orgánica, el nejayote obtenido de los
molinos y fábricas de nixtamal se considera altamente nutritivo y además un
subproducto altamente contaminante debido a que su demanda bioquímica de
oxígeno (BOD por sus siglas en inglés) y la demanda química de oxígeno (COD por
sus siglas en inglés) son 2.69mg O2/L y 10,200-20,000 mg/L respectivamente.
Generalmente, los pequeños productores de tortilla descartan el efluente
directamente en el sistema de alcantarillas; mientras que los productores de harina
de maíz casi siempre tratan aeróbica o anaeróbicamente el nejayote para reducir la
BOD y COD (Velasco-Martinez et al. 1997; Gutiérrez-Uribeet al. 2010)

Recientemente se ha documentado la incidencia de compuestos antioxidantes y
carotenoides en el nejayote y la liberación de fitoquímicos asociados a la pared
celular vegetal debido al proceso de hidrólisis alcalina; el cual transforma la forma
conjugada del ácido ferúlico en su forma libre. Independientemente del tipo de
grano, el nejayote contiene al menos 150 veces más ácido ferúlico conjugado
comparado con el grano crudo y la masa. El ácido ferúlico es el principal compuesto
37

fenólico absorbido en el intestino delgado y entre los cereales de mayor importancia,
el maíz contiene la mayor cantidad de FA (176mg/100g de grano de maíz)
(Gutiérrez-Uribe et al. 2010).

TABLA 3. Concentración de FA* en pericarpio y nejayote en diferentes variedades
de Maíz.
Variedad Grano entero Nejayote
Libre Conjugado Libre Conjugado
Maíz blanco 0.490 ±
0.011
134.12 ±
1.151
99.10 ±
2.321
1349.0 ±
15.99
Maíz amarillo 0.568 ±
0.008
169.10 ±
10.41
96.74 ±
1.325
1993.2 ±
10.78
Maíz azul 1.206 ±
0.022
127.51 ±
19.14
89.95 ±
0.908
2756.3 ±
10.32
* Expresado en g/ 100g de muestra seca (Gutiérrez -Uribe, 2010).

Así mismo diferentes investigaciones previas han demostrado que el nejayote
contiene aproximadamente 125 veces más ácido ferúlico libre y 5 veces más ácido
ferúlico conjugado comparado con los granos sin procesar. El análisis del pericarpio
crudo y de los sólidos solubles del nejayote con agua de lavados mostraron una
disminución de ácidos fenólicos presentes inicialmente en el pericarpio crudo, tales
como ácido p-cumárico (de 17.07 a 0.10g/kg de pericarpio crudo), ácido ferúlico (de
11.13 a 0.81g/kg pericarpio crudo) y ácido diferúlico (de 9.21g/kg a niveles no
detectables) los cuales se expresaron como g de compuesto fenólico/ kg de
pericarpio crudo (Martínez-Bustos et al. 2001; Gutiérrez-Uribe, 2010; Acosta-
Estrada et al. 2014).

Muchas enfermedades crónicas están asociadas con el estrés oxidativo, el cual se
combina con la formación de radicales libres como aniones superóxido, radicales
hidroxilo y radicales óxido nítrico. Los ácidos fenólicos como el ácido ferúlico
exhiben una fuerte actividad antioxidante debido a que forman radicales fenoxi
estables que terminan las reacciones en cadena de los radicales libres (Bijalwan et
al. 2016).
38

Los sólidos de nejayote pueden ser utilizados como fuente importante de este
conocido compuesto nutracéutico. La recuperación de estos compuestos del
nejayote puede tener dos efectos benéficos: generar valiosos productos a partir de
grandes cantidades de afluentes consideradas contaminantes y el uso de estos
compuestos para la producción de antioxidantes y nutracéuticos con el potencial
para tratar el estrés oxidativo y enfermedades crónicas. Los beneficios potenciales
a la salud del ácido ferúlico han sido ampliamente demostrados y se atribuyen a la
actividad antioxidante, principalmente a la prevención de la oxidación de lípidos,
proteínas clave y daño neuronal. Adicionalmente, el ácido ferúlico protege a las
células de daño oxidativo (Gutiérrez-Uribe et al. 2010).

5.5.1.- Fermentador de tanque agitado.

En microbiología, el término fermentación se utiliza en dos contextos diferentes;
primeramente, el contexto metabólico en donde se refiere al proceso catabólico en
el cuál los compuestos orgánicos actúan como donadores y como aceptores de
electrones; y el contexto de la microbiología industrial, que se refiere al cultivo de
grandes cantidades de células bajo condiciones aerobias o anaerobias dentro de un
recipiente conocido como fermentador o bioreactor (Waites, 2001). La principal
función de un fermentador es la de proveer un ambiente propicio en el cual un
organismo puede producir de manera eficiente algún producto específico tales como
biomasa celular, un metabolito o un producto de bioconversión (Waites, 2001).
El desempeño de cualquier fermentador depende de muchos factores, sin embargo,
los parámetros físicos y químicos clave que deben ser controlados son velocidad de
agitación, transferencia de oxígeno, pH, temperatura y producción de espuma. Las
fermentaciones en laboratorio pueden ser realizadas en matraces que pueden ser
agitados para proveer la aireación necesaria; sin embargo, dado que son sellados
para evitar contaminación, el intercambio gaseoso es muy limitado (Waites, 2001).
39

La agitación en las fermentaciones de células suspendidas se realiza para mezclar
las tres fases dentro del fermentador. La fase líquida contiene nutrientes disueltos y
metabolitos, la fase gaseosa contiene predominantemente oxígeno y dióxido de
carbono, y la fase sólida está conformada por células y sustrato sólido que pudiera
estar presente. El mezclado debe producir condiciones homogéneas y promover la
transferencia de nutrientes, gases y calor. La transferencia de calor es necesaria
tanto para la esterilización como para mantener la temperatura de trabajo. Un
mezclado eficiente es particularmente importante para la transferencia de oxígeno
en las fermentaciones aeróbicas, ya que los microorganismos pueden asimilar el
oxígeno disuelto en la fase líquida. El mezclado y la dispersión de las burbujas de
aire se logran mediante la agitación mecánica; lo cual requiere una alimentación de
energía relativamente alto por unidad de volumen. La transferencia de la fase
gaseosa al líquido es incrementada mediante la agitación; ya que prolonga la
retención de burbujas de aire en suspensión, disminuye el tamaño de burbuja
aumentando el área de contacto para la transferencia de oxígeno, impide la
coalescencia de la burbuja y disminuye el grosor de la interfaz gas-líquido (Doran,
1995; Waites, 2001).
Los fermentadores de tanque agitado (STRs, stirred tank reactors por sus siglas en
inglés) tienen agitadores o propelas que se mueven mecánicamente dentro de un
recipiente cilíndrico con bafles. Los bafles usualmente son “platos” verticales planos
cuya anchura es aproximadamente una décima parte del diámetro del recipiente.
Normalmente, 4-6 bafles son dispuestos en las paredes internas del recipiente para
favorecer el mezclado y la transferencia de masa al incrementar la turbulencia,
previniendo la formación de un vórtice y eliminando los espacios muertos (Doran,
1995; Waites, 2001)

Figura 11. Diagrama de un Fermentador de tanque agitado. Industrial Microbiology: an introduction.

En fermentaciones aeróbicas las células toman el oxígeno del caldo de cultivo; por
lo tanto el oxígeno disuelto (OD) es un sustrato de suma importancia, pudiendo
llegar a ser el sustrato limitante dado que la solubilidad del oxígeno en agua es de
8 mg O2/L de agua a 25°C y 1 atmosfera de presión. A altas concentraciones
celulares, la tasa de consumo de oxígeno puede exceder la velocidad de suministro,
provocando limitaciones de oxígeno (Shuler, 2002).
41

La transferencia de oxígeno es compleja debido a que comprende el cambio de fase
de fase gaseosa a fase líquida, la cual está influenciada por diferentes factores
como: temperatura, presión, área de contacto de las burbujas de aire, composición
química del medio, el volumen de gas introducido por unidad de volumen del reactor
por unidad de tiempo (vvm) y velocidad de agitación (Waites, 2001).
El oxígeno es usualmente introducido en el medio de cultivo mediante inyección en
el fondo del tanque a través de un difusor. La tasa de transferencia de oxígeno de
la fase gaseosa a la fase líquida está dada por (Shuler, 2002):
OTR= kLa (C*- CL) donde
 kL es el coeficiente de transferencia de oxígeno (cm/h)
 a es el área en la interfase gas líquido (cm2/cm3)
 kLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxigeno (h-1)
 C* es concentración de OD saturado (mg/L)
 CL es la concentración de oxígeno disuelto en el medio de cultivo (mg/L)
 OTR es la velocidad de transferenciade oxígeno (mg/hL)

La mayoría de los cultivos celulares producen una variedad de agentes espumantes
y estabilizadores de espuma como proteínas, polisacáridos y ácidos grasos. La
formación de espuma en los birreactores es muy común, particularmente en
sistemas aeróbicos. La espuma causa una variedad de problemas operativos, de
manera que su control es de suma importancia en el diseño del fermentador. El
exceso de espuma desbordando el fermentador provee una ruta de entrada para
microorganismos contaminantes y causa el bloqueo de las líneas de salida de gas.
Tanto el líquido como las células atrapadas en la espuma representan una pérdida
de volumen en el bioreactor; las condiciones en la espuma pueden no ser favorables
para la actividad metabólica de los microorganismos (Doran, 1995).

La adición de agentes antiespumantes al medio es el método más común para
reducir la formación de espuma. Sin embargo, los agentes antiespumantes afectan
la química de la superficie de las burbujas y su tendencia a la coalescencia, además
de tener un efecto significativo sobre el kLa. La mayoría de los antiespumantes son
sustancias que disminuyen la tensión superficial; lo que reduce el diámetro
promedio de la burbuja, produciendo valores más altos de a. Con la mayoría de los
agentes antiespumantes a base de silicón, el descenso en el kL es generalmente
mayor que el incremento de a; de manera que, en general, el kLa se ve reducido. El
descenso en la tasa de transferencia de oxígeno puede ser de hasta un factor de
diez (Doran, 1995).

Adicionalmente pueden utilizarse rompedores mecánicos de espuma; sin embargo,
estos dispositivos requieren grandes cantidades de energía para operar en
fermentadores a escala comercial. Su capacidad para controlar la espuma es
limitada en cultivos con alta formación de espuma, de manera que en muchos casos
el uso de agentes antiespumantes es inevitable (Doran, 1995).

En la mayoría de las fermentaciones el pH puede variar sustancialmente. A menudo
la naturaleza de la fuente de nitrógeno puede ser importante. Si el amonio es la
única fuente de nitrógeno, los iones hidronio se liberan en el medio como
consecuencia de la utilización del amonio, resultando en un decremento del pH. Si
el nitrato es la única fuente de nitrógeno, los iones hidronio son removidos del medio
de cultivo para reducir el nitrato a amonio, resultando en un incremento del pH.
Además, el pH puede cambiar debido a la producción de ácidos orgánicos, a la
utilización de aminoácidos o a la producción de bases (Shuler, 2002).

6.- Metodología

6.1.- Material biológico

6.1.1. Microorganismo

Para el desarrollo de esta investigación se utilizó el hongo filamentoso Aspergillus
niger FP160, proveniente del cepario del grupo de Fungal Physiology (FP) de la
Facultad de Química, UNAM.
A. niger FP160 se recuperó y activó en una placa de agar Sabouraud depositando
3 cristales de sílica de la cepa resguardada, la cual se incubó a 37°C durante 96h.
Se tomó una asada del cultivo con un asa micológica estéril, que fue depositada al
centro de una placa con agar Sabouraud; a continuación, el inóculo fue extendido
en toda la placa utilizando un asa de Drigalsky. Las placas se incubaron a 37°C por
72 h. Aspergillus niger FP160 se manejó en una suspensión de esporas en solución
salina isotónica (0.9% p/v) con Tween 80 (0.005% v/v).

6.1.2. Nejayote

Procedencia: Molino de Nixtamal Los Angeles, Milpa Alta, D.F.
Se colectaron aproximadamente 18 litros de nejayote directamente de la tina de
remojo previo a las operaciones de lavado. Se transportó al laboratorio en garrafón
de plástico de 20 litros de capacidad y se mantuvo a 4°C hasta su utilización.
pH: 12.7
Arabinoxilano: 0.48 % m/v
Sólidos sedimentables: 3.39 mg/mL

6.2.- Métodos

6.2.1.- Preparación del inóculo de A. niger FP160

Se vertieron 10 mL de solución salina isotónica (0.9% p/v) con Tween 80 (0.005%
p/v) estéril en una de las cajas sembradas y se raspó suavemente su superficie con
un asa Drigalsky para recuperar las esporas. Una vez que éstas fueron liberadas,
la suspensión se transfirió con pipeta a un tubo para centrífuga con tapón. Para
lavar las esporas, se centrifugó la suspensión a 4500 rpm por 5 min y se desechó
el sobrenadante; a continuación, las esporas se resuspendieron hasta alcanzar un
volumen de 10 mL de solución salina con Tween; dicho lavado se realizó cuatro
veces más. Se determinó la concentración de esporas en la suspensión final (10
mL) mediante el método de conteo directo con la cámara de Neubauer.

6.2.2.- Medios y condiciones de cultivo líquido

Se realizaron fermentaciones en medio líquido en matraces de 500 mL con 100mL
de medio de cultivo, ajustándose el pH del medio a 5 y 8 con ácido sulfúrico;
llevándose a cabo en incubadora de agitación orbital a 300 rpm y 37°C durante 96
horas. La composición de los medios se describe a continuación:
 75% nejayote, 25% Medio Mínimo (MM, Apéndice)
 75% nejayote, 25% MM, 1% salvado de trigo
 100% MM, 1% salvado de trigo

Así mismo se realizaron fermentaciones en medio líquido en bioreactor de tanque
agitado de 1.2 litros de capacidad con 1L de medio de cultivo de composición 75%
nejayote, 25% MM y 1% salvado de trigo a pH inicial de 5; llevándose a cabo con
diferentes condiciones de agitación y aireación, a 37°C durante 96 horas. Las
condiciones de agitación y aireación se describen a continuación:
45

 400 rpm, 1 vvm
 400 rpm, 0.5 vvm
 200 rpm, 1 vvm
 200rpm, 0.5 vvm

6.2.3.- Análisis de la producción de xilanasas y feruloilesterasas.

Al término de la fermentación de A. niger FP160; el medio de cultivo se filtró al vacío
con papel filtro Whatman del No 1 obteniéndose el filtrado enzimático crudo, el cual
fue utilizado para la determinación de la actividad enzimática. Para determinar el
perfil de proteínas y el perfil zimográfico de las fermentaciones se realizó
adicionalmente un tratamiento de semipurificación del filtrado crudo.

6.2.4- Determinación de la actividad enzimática por el método de DNS

La actividad xilanolítica se determinó por la cuantificación de grupos reductores
liberados por la actividad enzimática por el Método de DNS (Miller, 1959). En tubos
de 16x150 mm se agregó 0.4 ml de buffer de acetatos (100 mM, pH 5) y 0.5 ml de
solución de xilano de Abedul al 1%; la reacción enzimática se inició agregando 0.1
mL del filtrado enzimático libre de células y se incubó durante 20 min a 50°C. La
reacción se detuvo adicionando 1 mL de Ácido 2,4-dinitrosalicílico (DNS) y se
determinan los azúcares reductores producidos por la degradación de xilano
relacionando la Absorbancia de las muestras a 575 nm con su concentración a partir
de una Curva Patrón de xilano de Abedul al 1% mediante la Ley de Lambert-Beer.
El blanco se preparó de la misma forma que la muestra pero agregando el filtrado
libre de células después de adicionar el DNS, de manera que la lectura de
carbohidratos reductores libres corresponden a los residuales del medio de cultivo.
La actividad enzimática se reportó como unidades de actividad enzimática (U), la
46

cual fue definida como la actividad catalítica responsable de la formación de un μmol
de xilosa por mililitro de filtrado enzimático a las condiciones de ensayo.

6.2.5- Actividad de feruloilesterasas en placa

La actividad de feruloilesterasas se determinó cualitativamente por la medición de
halos de degradación producidos por la actividad enzimática en un gel de etilferulato
al 0.1% de 1 mm de grosor; se formaron pozos de 7 mm de diámetro en los que se
colocaron 20 μL de filtrado enzimático libre de células; se incubó de 6 a 12 h a
temperatura ambiente, observándose la difusión y degradación del etilferulato;
finalmente se midieron los halos formados. La actividad enzimática se