tesis-n3777-LavistaLlanos

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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. 
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Tesis Doctoral
Control de la respuestaControl de la respuesta
transcripcional a hipoxia entranscripcional a hipoxia en
Drosophila melanogaster, por lasDrosophila melanogaster, por las
proteínas de la familia bHLH-PAS:proteínas de la familia bHLH-PAS:
Similar y TangoSimilar y Tango
Lavista Llanos, Sofía
2004
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor de la
Universidad de Buenos Aires en Ciencias Químicas de la
Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
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Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by
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Cita tipo APA:
Lavista Llanos, Sofía. (2004). Control de la respuesta transcripcional a hipoxia en Drosophila
melanogaster, por las proteínas de la familia bHLH-PAS: Similar y Tango. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3777_LavistaLlanos
Cita tipo Chicago:
Lavista Llanos, Sofía. "Control de la respuesta transcripcional a hipoxia en Drosophila
melanogaster, por las proteínas de la familia bHLH-PAS: Similar y Tango". Tesis de Doctor.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2004.
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3777_LavistaLlanos
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3777_LavistaLlanos
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3777_LavistaLlanos
mailto:digital@bl.fcen.uba.ar
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.
Universidad de Buenos Aires
Facultad de ciencias Exactas y Naturales
Control dela Respuesta Transcripcional a Hipoxiaen Drosophila
melanogaster, por las proteínas de la familia bHLH-PAS:
Similar y Tango
Autor: Lic. Sofía Lavista Llanos
Director: Dr. Pablo Wappner
Lugar de Trabajo: Fundación Instituto Leloir
¡‘377 vr;
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la
Universidad de Buenos Aires
Año 2004
A Santi y Catalina, que está en camino.
A la memoria de mi abuelo, el Dr. Héctor Ángel Lavista Llanos.
Agradecimientos
A Pablo Wappnerque me dio la posibilidad de trabajar en su laboratorio, de viajar y desarrollar este
trabajo de tesis con amplia libertad.
A los compañeros de laboratorio y a los amigos: Silvia, Mariana, Dani, Lachi, Andrés, Maxi, Juan,
Fede, Nuria, Ceci, Lucía, Tini, Martin, Cafle, Ale, Gabi, Diani, Flei, Belén, Santi, Caro, Paz, Jimena,
Estéban, Carmen y Marta.
A Fernanda Ceriani por su apoyo e interés en todo momento.
A todos los compañeros de la FIL que me ayudaron en algún momento con el trabajo. A Cristian,
Walter, Sergio, Hugoy Pancho por la buena disposición a solucionar problemas.
A Georgina, Cristina, Mónica, Dora y Juan por su colaboración y a Sole, Ceciy Juan M.por las
horas de biblioteca compartidas.
Al Consejo directivo de la Fundación Instituto Leloirpor permitirme desarrollar este trabajo en el
Instituto.
A la Universidad de Buenos Aires, al Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Técnicas y a
la Fundación Instituto Leloir por su apoyo económico.
Control de Ia Respuesta Transcripcional a Hipoxia en Drosophi/a
melanogaster, por las proteínas de Ia familia bHLH-PAS: Similar y Tango.
En mamíferos, se ha demostrado que el factor de transcripción hetero-dimérico bHLH-PAS - Hypoxia
Inducible Factor (HIF) —es un regulador clave de la respuesta a hipoxia induciendo la expresión de
genes regulada por oxígeno. En esta tesis demostramos la existencia de un sistema homólogo en
Drosophila, y caracterizamos su actividad ¡n vivo durante el desarrollo. Usando reporteros
transcripcionales en moscas transgénicas mostramos que la actividad transcripcional inducible por
hipoxia aumenta a lo largo del desarrollo resultando máxima hacia el final de la embriogénesis.
Mostramos que los diferentes tipos celulares tienen distintos niveles de sensibilidad a hipoxia y que las
células traqueales son más sensibles respondiendo a hipoxia suaves. Mostramos que las proteínas
bHLH-PAS Similar (Sima) y Tango funcionan como los homólogos de HIF-a y [3respectivamente, y
demostramos un modo conservado de regulación por oxígeno para Sima. La proteína Sima se indujo en
hipoxia, mientras el nivel de su ARN mensajero no varió con la concentración de oxígeno. En
experimentos de un pulso de expresión ectópica de Sima seguidos de una curva de tiempo vimos que
Sima se estabiliza en hipoxia y que su degradación depende de oxígeno. La expresión ectópica
continua de Sima superó su tasa de degradación pennitiéndonos estudiar el control de su localización
subcelular. Sima es mayormente citoplasmática en nonnoxia y la proteína transloca al núcleo
únicamente en hipoxia, revelando una segunda etapa de activación regulada por oxígeno. Describimos
que la localización subcelular de Sima se encuentra modulada por parámetros del desarrollo.
Caracterizamos el mecanismo que gobierna la localización subcelular dependiente de oxígeno de Sima.
Mostramos que Sima entra y sale continuamente del núcleo al citoplasma y caracterizamos la
exportación nuclear de Sima, cuyo mecanismo involucra al receptor de exportación nuclear CRM­
l/Embargoed y es dependiente de oxígeno. Mostramos que el factor supresor de tumores de Von
Híppel Líndau (VHL) modula la exportación nuclear de Sima, la cual requiere la hidroxilación de un
residuo de prolina específico (Pro850). Proponemos que la localización núcleo-citoplasmática de
HIFa/Sima resulta de un equilibrio dinámico entre la importación y la exportación nuclear, siendo este
último un proceso modulado por oxígeno.
Palabras clave: hipoxia, HIF-l, Drosophila melanogaster, Sima, exportación nuclear
Transcriptional Response to Hypoxia in Drosophi/a melanogaster, controlled
by the bHLH-PAS proteins: Similar y Tango.
In mammalian systems, the heterodimeric bHLH-PAS transcn'ption factor - Hypoxia Inducible Factor
(HIF) - has emerged as the key regulator of responses to hypoxia. ln this thesis we define a
homologous system in Drosophila, and characterise its activity in vivo during development. Using
transcriptional reporters in transgenic developing flies we show that hypoxia inducible activity rises to
peak levels in late embryogenesis, and is most pronounced in tracheal cells. We show that the bHLH­
PAS protein Similar (Sima) and Tango function as HIP-0L and B homologues respectively, and
demonstrate a conserved mode of regulation for Sima by oxygen. Sima protein, but not its mRNA, was
upregulated in hypoxia. Time course experiments following pulsed ectopic expression demonstrath
that Sima is degraded in normoxia. Continuous ectopic expression over-rode Sima degradation which
remained cytoplasmic in nonnoxia, and translocated to the nucleus only in hypoxia, revealing a second
oxygen regulated activation step. We also show that Sima shuttles continuously between the nucleus
and the cytoplasm. We characterized nuclear export of Sima which occurs through a mechanism that
involves the nuclear export receptor CRMl/Embargoed and is oxygen-dependent. The Von Hippel
Lína'au (VHL) tumor suppressor factor modulates nuclear export of Sima, which requires
hydroxylation of a specific prolyl residue (ProSSO).We propose that HIFa/Sima nucleo-cytoplasmic
localization is the result of a dynamic equilibrium between nuclear import and nuclear export, being
the latter process modulated by oxygen tension.
Key words: hypoxia, HIP-l , Drosophila melanogaster,Sima, nuclear export
Resumen
En mamíferos, se ha demostrado que el factor de transcripción hetero-dimérico bHLH-PAS - Hypoxia
Inducible Factor (HIP) -—es un regulador clave de la respuesta a hipoxia induciendo la expresión de
genes regulada por oxígeno. En esta tesis demostramos la existencia de un sistema homólogo en
Drosophila, y caracterizamos su actividad in vivo durante el desarrollo. Usando reporteros
transcripcionales en moscas transgénicas mostramos que la actividad transcripcional inducible por
hipoxia aumenta a lo largo del desarrollo resultando máxima hacia el final de la embriogénesis.
Mostramos que los diferentes tipos celulares tienen distintos niveles de sensibilidad a hipoxia y que las
células traqueales son más sensibles respondiendo a hipoxia suaves. Mostramos que las proteínas
bHLH-PAS Similar (Sima) y Tango funcionan como los homólogos de HIF-a y [3respectivamente, y
demostramos un modo conservado de regulación por oxígeno para Sima. La proteína Sima se indujo en
hipoxia, mientras el nivel de su ARN mensajero no varió con la concentración de oxígeno. En
experimentos de un pulso de expresión ectópica de Sima seguidos de una curva de tiempo vimos que
Sima se estabiliza en hipoxia y que su degradación depende de oxígeno. La expresión ectópica
continua de Sima superó su tasa de degradación permitiéndonos estudiar el control de su localización
subcelular. Sima es mayormente citoplasmática en nonnoxia y la proteína transloca al núcleo
únicamente en hipoxia, revelando una segunda etapa de activación regulada por oxígeno. Describimos
que la localización subcelular de Sima se encuentra modulada por parámetros del desarrollo.
Caracterizamos el mecanismo que gobierna la localización subcelular dependiente de oxígeno de Sima.
Mostramos que Sima entra y sale continuamente del núcleo al citoplasma y caracterizamos la
exportación nuclear de Sima, cuyo mecanismo involucra al receptor de exportación nuclear CRM­
l/Embargoed y es dependiente de oxígeno. Mostramos que el factor supresor de tumores de Von
Híppel Lindau (VHL) modula la exportación nuclear de Sima, la cual requiere la hidroxilación de un
residuo de prolina específico (Pro850). Proponemos que la localización núcleo-citoplasmática de
HlFaJSima resulta de un equilibrio dinámico entre la importación y la exportación nuclear, siendo este
último un proceso modulado por oxígeno.
Palabras clave: hipoxia, HIF-l, Drosophila melanogaster, Sima, exportación nuclear
Abstract
In mammalian systems, the heterodimeric bHLH-PAS transcription factor - Hypoxia Inducible Factor
(HIF) - has emerged as the key regulator of responses to hypoxia. In this thesis we define a
homologous system in Drosophíla, and characterise its activity in vivo during development. Using
transcriptional reporters in transgenic developing flies we show that hypoxia inducible activity rises to
peak levels in late embryogenesis, and is most pronounced in tracheal cells. We show that the bHLI-l­
PAS protein Similar (Sima) and Tango function as HIP-a and [3 homologues respectively, and
demonstrate a conserved mode of regulation for Sima by oxygen. Sima protein, but not its mRNA, was
upregulated in hypoxia. Time course experiments following pulsed ectopic expression demonstrated
that Sima is degraded in normoxia. Continuous ectopic expression over-rode Sima degradation which
remained cytoplasmic in norrnoxia, and translocated to the nucleus only in hypoxia, revealing a second
oxygen regulated activation step. We also show that Sima shuttles continuously between the nucleus
and the cytoplasm. We characten'zed nuclear export of Sima which occurs through a mechanism that
involves the nuclear export receptor CRMl/Embargoed and is oxygen-dependent. The Von Hippel
Lindau (VHL) tumor suppressor factor modulates nuclear export of Sima, which requires
hydroxylation of a specific prolyl residue (Pr0850). We propose that I-llFa/Sima nucleo-cytoplasmic
localization is the result of a dynamic equilibrium between nuclear import and nuclear export, being
the latter process modulated by oxygen tension.
Key words: hypoxia, HIF-l , Drosophila melanogaster, Sima, nuclear export
2-OG
Adh
AhR
Alda
ARNT
Bal
BCIP
bHLl-l
BMAL
BSA
Btl
CBP
CPRG
CRE
CREB
CRM-l
Cul-l
Cul-2
DAB
DEPC
DFO
DIG
DIG-AP
DMSO
dNup
D'I'T
Dys
Abreviaturas
2-oxoglutarato
ácido desoxirribonucleico
Alcohol dehydrogenase
Aryl hydrocarbon Receptor
Aldolasa
ácido ribonucleico
AhR Nuclear Translocator
Balanceador
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate
basic Helix Loop Helix
Brain-Muscle-ARNT-Like-protein
Bovine Serum Albumin
Breathless
CREB-Binding Protein
Chloro Phenol Red- B -D—Galactopyranoside
Cyclic AMP Response Element
Cyclic AMP Response Element-Binding protein
Chromosome Region Maintenance l
Cullin l
Cullin 2
diaminobenzidine
di-etílpirocarbonato
Desfen'ioxamine
Digoxigenin
Digoxigenin-Alkaline Phosphatase
Dimethyl Sulfoxide
Drosophila Nucleoporin
Dithiothreitol
Dysfusion
ECL
EDTA
EGF
egl-9
Emb
EMS
En
Epo
FGF
FGFR
FIH
GFP
Glob
Glut-l
HERG
HIF-l
HRE
HRP
Hsp
ImpL3
IPAS
th-A
LMB
LOV
MAP
MAPK
Mbo
deh-A
Mt2
Electro-generated ChemiLuminescence
ethylenediaminetetraacetic
Endothelial Growth Factor
egg laying-9
Embargoed
etíl-metano sulfonato
Engrailed
Erythropoietin
Fibroblast Growth Factor
Fíbroblast Growth Factor Receptor
Factor Inhibiting HIF
Green Fluorescent Protein
Globin
Glucose transporter 1
Human Ether-a-go-go Related Gene
Hypoxia Inducible Factor l
Hypoxia Response Element
horseradish peroxidase
Heat shock
Heat shock protein
Ecdysolne-inducible gene L3
Inhibitory PAS domain protein
Inverted Repeat
Lactate dehydrogenase-A
Leptomicína-B
Light-Oxygen-Voltage
Mitogen-Activated Protein
Mitogen-Activated Protein Kinase
Members only
murine Lactate dehydrogenase-A
Methyltransferase 2
4-Nitrol Blue Tetrazolium chloride
NES
NLS
NOS
ODDD
PAGE
PAS
PBS
PC-ZOS
PCR
PDGF
PDH
Pfk
ng
PH
PMSF
PR-l l S
PR- l 9S
PT
Ptc
PTEN
PTW
PVDF
pVHL
PYP
RanGAP
RanGDP
RanGEF
RanGTP
be
Ref-l
ry
Nuclear Export Sequence
Nuclear Localization Signal
Nitric Oxide Synthase
Oxygen Dependent Degradation Domain
Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
Period-ARNT-Single minded
Phosphate Buffer Solution
Partícula Catalítica 208
Polymerase Chain Reaction
Platelet-Derived Growth Factor
PH Domain-containing Human protein
Pen'od
Phospho-fructo kinase
Phospho-glicerate kinase
Prolil-4-Hidroxilasa
Phenyl- Methyl - Sulphonyl Fluoride
Partícula Regulatoria llS
Partícula Regulatoria 19S
PBS-Tn'tón
Patched
Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome lO
PBS-Tween
Polyvínylidene Difluoride
proteína Von Hippel-Lindau
Photoactive Yellow Protein
Ran GTPase activating protein
Ran small GTPase guanosine diphosphate-bound
Ran GTPase exchange factor
Ran small GTPase guanosine triphosphate-bound
RING box protein
Redox effector factor-l
rosy
VCB
VEGF
VHL
Wg
X-Gal
B-gal
Skpl - Cdc53/Cullin l - F-box protein
Standard Deviation
Sodium Dodecyl Sulfate
Single minded
Similar
Spineless
Standard Saline Citrate
Small Ubíquitin-related Modifier
trans-activation domain
Tris-Buffered Saline Tween-ZO
Transforming growth factor
Tango
Trachealess
unidades arbitrarias
Gal4-Upstream Activatíng Sequence
ubiquitina
ubiquitin-conjugating enzyme 9
ultravioleta
Von hippel-Lindau - Elongina B/C
Vascular Endothelial Growth Factor
von Hi'ppel-Lindau
white
Wingless
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactopyranoside
beta galactosidasa
Índice
I. INTRODUCCIÓN
1.1 El oxígeno como regulador dela expresión génica
l.l.l El sistema HIF de
1.1 Inducción transcripcional en respuesta a hipoxia
1.2 Un factor de unión a ADN regulado por oxígeno
1.4 Expresión y función de HIF-l in vivo
l.l.
1.1.
1.1.1.3 El clonado de las subunidades a y [3de HlF-l
1.1.
l.l. 1.5 Genes regulados por oxígeno
1.1.1.5 (ii) Genes blanco de HlF-l involucrados en biología vascular
1.1.2Regulación de HIF-l por oxígeno
1.1.2.1 Estabilidad de la subunidad HIF-la
1
2
4
4
6
7
9
ll
1.1.1.5 (i) Genes blanco de HlF-l involucrados en el metabolismo de la glucosa ................................. .. ll
ll
1.1.1.5 (iii) Genes blanco de HIF-l involucrados en el metabolismo del grupo hemo .......................... .. 12
14
14
1.1.2.1 (i) Un dominio de Degradación Dependiente de Oxígeno en la subunidad -a .......................... .. 15
1.1.2.1 (ii) Degradación de HIP-la por el Sistema Ubiquitina-Proteasoma ......................................... .. 16
l.l.2.l (iii) La ubiquitinación de HIF-a depende del gen supresor de tumores de von Hippel-Lindau 20
1.1.2.1 (iv) Un sistema de sensado de oxígeno: la hidroxilación de HlF-a en prolinas regula su
73
78
ubiquitinación y degradación
1.1.2.2 Regulación de la actividad transcripcional de HIF-l
1.1.2.2 (i) Un dominio de activación transcripcional en la región carboxilo-terminal de la proteina HIF­
la
1.1.2.2 (ii) Co-activadores transcripcionales de HIF-l
1.1.2.2 (iii) Un segundo sistema de sensado de oxígeno: la hidroxilación de HIF-la en una asparagina
7
78
29
1.2.4 Métodos Genéticos
Ill. OBJETIVO GENERAL
3.1 Objetivos F‘ r "'
regula su actividad transcripcional 9
1.1.2.2 (iv) Regulación redox y fosforilación de HIF-l n 33
1.1.2.3 Localización subcelular de las proteínas HIP-1a y ARNT 34
1.2 Drasophila melanogasler como sistema mndeln 36
1.2.1 Ciclo de vida de Drosophíla melanogaster 37
1.2.1.1 Desarrollo embrionario 3°
1.2.2 El sistema traqueal de Drosophila melanogaster 44
1.2.2.1 Desarrollo del sistema traqueal de Drosophila 45
1.2.3 El sistema ¡raqueal de los insectos responde a hipnxia 48
50
1.2.4.1 Mutaciones, Inserciones, Deleciones cromosómicas y prueba de r Sl
1.2.4.2 Cromosomas Balanceadores 52
1.2.4.3 Líneas transgénicas y mapeo cromosómico S4
1.2.4.4 El sistema de expresión Gal4/UAS S4
1.2.5 Evidencias de la respuesta a hipoxia en Drosophila melanogaster S7
II. HIPÓTESIS DE TRABAJO 58
59
<0
593. l .1 Monitorear la expresión génica sensible a oxigeno, en un sistema in vivo
3.1.2 Identificar a los genes involucrados en la cascada de transducción de la señal hipóxica ....................... ..59
3.1.3 Determinar mecanismos celulares de regulación del sistema dl-IIFpor oxígeno 59
IV. MATERIALES Y MÉTODQS 60
4.1 Construcciones de ADN 60
4.2 Generación de moscas transgénicas y expresión transciente de genes en embriones ...............................60
4.3 Mantenimiento de moscas y cruzamjentos 6'
4.4 Líneas de moscas utilizadas 67
4.4.1 Reporteros tran“ n'r ' ' 62
4.4.2 Líneas de sobre-expresión bajo el control de secuencias UAS 62
4.4.3 Líneas que dirigen la expresión de Gal4 bajo el control de promotores endógenos ............................... ..63
4.4.4 Otras líneas: mutantes, deleciones e inserciones de elementos-P 63
4.5 Mapeo de líneas transgénicas 63
4.6 Construcción de líneas por recombinación L “ a l“
4.7 Recolección sincronizada de embriones, larvas y tratamientos de hipoxia y calor ...................................69
4.8 Ensayo de actividad B o ' ‘ " 6°
4.9 Cuantificación de proteínas 70
4.10 Tinción de embriones con x-Gal 70
4.11 Inmunohistoquímica de embriones 70
4.12 Inyección de ARN de interferencia (ARNí) 72
4.13 Western blot y RNA slot hlnt 72
4.14 Hibridización in situ de ARN mensajero 74
v. RESULTADQS, , _ 76
5.1 Conservación de la respuesta transcripcional a hipoxia en Drosophila melanogaster ..............................76
5.1.1 Caracterización fisiológica de la respuesta transcripcional a hipoxia 83
5.1.1.1 La actividad transcripcional es proporcional a los niveles de oxígeno ........................................... ..84
5.1.1.2 El sistema traqueal de la mosca responde a hipoxia 86
5.1.1.3 La respuesta transcripcional a hipoxia en tejidos extra L 1 ‘ 91
5.1.1.4 La respuesta transcripcional a hipoxia es autónoma de célula 93
5.1.1.5 La respuesta transcripcional a hipoxia está regulada a lo largo del desarrollo embrionario ........... ..94
5.1.1.6 El gen reportero de hipoxia responde a otros " ' 97
5.1.2 Los homólogos de HIP-la y HIP-IB en Drosophila melanogaster 99
5.1.2.1 El factor de transcripción dHIF pertenece a la familia bHLH-PAS 99
5. l .2.3 Las proteínas Sima y Tango median la respuesta a hipoxia en Drosophila melanogaster ............ .. 106
5.1.2.3 (i) La proteína Sima es funcional sobre los sitios HRE, en embriones de Drosophila ............. .. 106
5.1.2.3 (ii) Sima es el homólogo de HlF-la en D. r ' " 109
5.1.2.3 (iii) Tango es el homólogo de HIF-lB en Drosophila melanogaster ....................................... .. 110
5.1.2.4 La expresión de Sima se encuentra regulada por oxígeno en embriones de Drosophila .............. .. 113
5.1.2.5 La proteína Sima es degradada en presencia de oxígeno 116
5.2 Control de la localización subcelular de Sima, un segundo mecanismo dependiente de oxígeno..........118
5.2.1 Sima se localiza en el núcleo en respuesta a hipoxia y en el citoplasma en normoxía ......................... .. l 18
5.2.2 La localización subcelular de Sima está regulada por parámetros del desarrollo ................................. .. l22
5.2.3 La localización subcelular de Sima depende también de otros " ‘ 125
5.2.4 La localización subcelular de Sima no depende de la subunidad Tgo 127
5.2.5 Tgo recapitula la localización subcelular de Sima l29
5.2.6 Sima entra y sale al núcleo continuamente l3l
5.2.6.] Sima es activamente exponada del núcleo al citoplasma por el receptor de exportación Emb/CRMI
131
5.2.7 dVHL regula la localización subcelular de Sima 135
5.2.7.1 dVHL es necesario para la localización de Sima en el citoplasma en normoxia ........................... .. 135
5.2.7.2 La sobre-expresión de thl aumenta la localización citoplasmática de Sima ................................ l37
5.2.7.3 El efecto de la sobre-expresión de dVHL sobre la localización subcelular de Sima es sensible al
mrígpnn 139
5.2.7.4 La localización subcelular de Sima por sobre-expresión de thl es sensible al calor .................... 140
5.2.7.5 Cul-2 también regula la localización subcelular de Sima 141
5.2.8 El efecto de la sobre-expresión de thl sobre la localización subcelular de Sima depende de CRM] .. 143
5.2.8.1 La sobre-expresión de dVHL no afecta la localización subcelular de Sima en ausencia del
exportador embargoed 143
5.2.8.2 La LMB inhibe el aumento de la localización citoplasmática de Sima inducida por la sobre­
expresíón de dVI-lL. 145
5.2.9 Aspectos adicionales de regulación del sistema Sima. 147
VI. DISCUSIÓN ' 151
6.1 El sistema dHif modularía la respuesta fisiológica a parámetros ambientales .......................................151
6.2 El sistema Sima/Tgo regula la expresión de genes en hipoxia, durante el desarrollo de Drasaphíla..... 152
6.3 Restricción espacio-temporal de la inducción del sistema Sima/Tgo en embriones de Drosophila ....... 153
6.4 Un sistema conservaldo de respuesta a'hipnvia 155
6.5 La localización subcelular de Sima resulta de un equilibrio entre la importación y exportación nuclear.
6.6 La exportación nuclear de Sima es un paso dependiente de oxígeno y se encuentra regulada por
parámetros del desarrnlln 159
6.7 El sistema prolil hidroxilasa/dVHL promueve la exportación de Sima 160
6.8 Relación entre la degradación de HIF-a/Sima y la localización subcelular ............................................161
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 163
l. Introducción
Hoy en día, existe preocupación acerca de las consecuencias ambientales que trae aparejada la
actividad humana sobre la tierra. Sin embargo, en el pasado otros organismos causaron cambios en el
medio ambiente que resultaron revolucionarios, aunque de un modo gradual y mucho más lento. El
ejemplo más claro lo constituye la composición atmosférica de la tierra. Varias líneas de evidencias
geológicas y geoquímicas indican que el nivel de oxígeno atmosférico era extremadamente bajo hace
unos 2450 millones de años y alcanzó niveles considerableshace aproximadamente 2220 millones de
años (Bekker y col., 2004). Así, la atmósfera se transformó de una mezcla de gas prácticamente sin
oxígeno molecular a estar constituida por un 21% de oxígeno del total, en la actualidad.
La molécula de oxígeno es extremadamente reactiva, por lo que resultó tóxica para muchos
organismos. El oxígeno molecular puede interactuar con la mayoría de los constituyentes de la célula y,
en particular, la reacción de oxidación puede interferir con la actividad catalítica de diversas enzimas.
De hecho, en la actualidad, el oxígeno resulta tóxico para muchas bacterias anaerobias y algunos
tejidos de organismos complejos. La mayoría de los organismos aerobios ha evolucionado mecanismos
de detoxificación del oxígeno que protegen a las proteínas de su alta reactividad.
Esta alta reactividad otorga a la molécula de oxígeno la capacidad de funcionar como fuente de energía
química y no resulta sorprendente que haya sido explotada por los organismos a lo largo de Ia
evolución. La disponibilidad de oxígeno atmosférico permitió el desarrollo de bacterias que basan la
producción de ATP en un metabolismo aerobio, utilizando la gran cantidad de energía liberada en la
oxidación de carbohidratos y otras moléculas hasta su conversión en CO; y HZO.Hoy en día las células
eucariotas basan su producción energética mayoritariamente en un metabolismo aerobio, por lo que
presentan un requerimiento constante y absoluto de oxígeno. De este modo, con excepción de aquellos
estrictamente anaerobios, todos los organismos dependen del oxígeno para sobrevivir.
La aparición de organismos multicelulares complejos durante la evolución se acompañó del desarrollo
de sistemas y mecanismos que aseguran una adecuada oxigenación celular dentro de los tejidos. En
estas especies, evolucionaron órganos y tejidos altamente complejos que se especializaron en los
procesos de captura, transporte y distribución del oxígeno a cada célula en el organismo.
Llamativamente, el principal regulador funcional de la homeostasis del oxígeno en los tejidos es la
propia presión parcial de oxígeno. Una regulación autónoma del oxígeno, en lugar de un programa
codificado genéticamente durante el desarrollo, resulta ventajosa ya que provee un alto nivel de
plasticidad a la función de estos órganos. Esta autonomía permite que las células y los tejidos
desprovistos de suficiente oxígeno respondan en forma independiente, mediante mecanismos celulares
intrínsecos, lo que resulta crucial para la normal fisiología tisular. Esta autonomía tisular en la
homeostasis del oxígeno juega un rol preponderante en procesos fisiológicos que resultan médicamente
importantes como, por ejemplo, la neo-vascularización de los tejidos en zonas desprovistas de oxígeno.
Este proceso, llamado angiogénesis, es una etapa clave en el crecimiento y la metástasis tumoral y
constituye el principal mecanismo compensatorio en las patologías isquémicas del sistema circulatorio,
siendo determinante en la pato-fisiología de condiciones clínicas como la isquemia, el cáncer y el
infarto de miocardio (Semenza, 2000).
La identificación del/os sensor/es de oxígeno en los tejidos y la comprensión de los mecanismos de
transducción de la señal hipóxica en la célula fue durante mucho tiempo uno de los objetivos más
importantes entre los investigadores del área y en la última década se han generado importantes
avances en el entendimiento del mecanismo molecular que subyace a la respuesta celular a la
disponibilidad de oxígeno.
1.1 El oxígeno como regulador de la expresión génica
Una clásica respuesta de las células deprivadas de oxígeno fue descripta por primera vez por Louis
Pasteur (1822-1895) en levaduras. El llamado efecto Pasteur consiste en un aumento substancia] del
consumo de carbohidratos que ocurre en compensación de su ineficiente utilización bajo condiciones
anaerobias. Cuando no disponen de oxígeno como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria,
las células abandonan la fosforilación oxidativa y se basan solamente en Ia glucólisis para la
producción de energía. El cambio a un metabolismo anaerobio está regulado por la acción de
metabolitos de la vía energética sobre las enzimas glucolíticas involucradas. Concomitantemente, las
células hipóxicas sensan disminuciones en el nivel de oxígeno antes de que los reservorios de
metabolitos sean depletados y responden con un mecanismo auto-regulado de austeridad en el
consumo de energía, prescindiendo de funciones celulares no esenciales (Hochachka y col., 1996). La
hipoxia no solamente funciona como señal de conservación energética para la célula sino que, además,
dirige la expresión de un grupo selecto de genes que incluye isofonnas específicas de enzimas
glucolíticas y transportadores de glucosa que son funcionales a bajas concentraciones de oxígeno
(Semenza y col., 1994).
Para la mayoría de los organismos la disponibilidad de oxígeno afecta los niveles intracelulares y
frecuentemente la actividad de un gran número de proteínas. Esta respuesta involucra un complejo
programa bioquímico y genético que incluye la expresión diferencial de un considerable número de
genes (Bunn y Poyton, 1996; Hochachka y col., 1996). Dentro de los genes regulados por oxígeno
existen aquellos que se transcriben eficientemente en condiciones aerobias (genes aeróbicos) y otros
que lo hacen en hipoxia (genes hipóxicas). En Saccharomyces cereviciae se ha descripto que el grupo
hemo libre funciona como barómetro interno de la tensión de oxígeno modulando la actividad de
factores de transcripción que regulan Ia expresión de genes de respuesta a oxígeno (Hodge y Cumsky,
1989; Kwast y col., 1999). Dentro de los factores de transcripción afectados por el hemo se encuentran
activadores transcripcionales de genes aeróbicos así como represores transcripcionales de la mayoría
de los genes de respuesta a hipoxia. Por otro lado, en la bacten'a Rhízobíum meIIilotí la concentración
de oxígeno es sensada por una hemoproteína con actividad kinasa, cuya auto-fosforilación en ausencia
de oxígeno provoca la fosforilación de un factor de transcripción que induce genes de respuesta a
hipoxia (Lois y col., 1993; Monson y col., 1992).
Al igual que para otros estímulos fisiológicos, la falta de oxígeno provoca respuestas agudas y otras de
carácter crónico. Las respuestas agudas ocurren en una escala temporal de segundos a minutos e
involucran modificaciones post-traduccionales de proteínas y otras macromoléculas a corto plazo, a
través de reacciones de óxido-reducción, fosforilación, etc. A largo plazo, respuestas más lentas (de
minutos a horas) representan cambios en la expresión génica que resultan en modificaciones crónicas
dentro del organismo. En general, para la mayoría de los organismos la expresión génica diferencial en
respuesta a oxígeno involucra tanto, genes que inducidos por hipoxia aseguran un óptimo grado de
oxigenación o intervienen en procesos metabólicos dependientes de oxígeno, como genes cuya función
tiende a minimizar la toxicidad causada por el oxígeno.
Existen respuestas a la falta de oxígeno que son autónomas de célula, lo que indica que cada célula
tiene su propio sistema de sensado de oxígeno. Un ejemplo de esto es la inducción transcripcional de
genes que codifican para transportadores de glucosa y enzimas glucolíticas funcionales en hipoxia, lo
cual facilita la producción de ATP en condiciones de bajo oxígeno (Semenza, 1998). Por otro lado,
existen respuestas que están mediadas por sensores centrales que monitorean los niveles globales de
oxígeno en el cuerpo y alteran su distribución en todo el sistema. Por ejemplo, existen
quimiorreceptores en células especializadas del cuerpo carotídeo y del cuerpo neuro-epitelial que
sensan la concentración de oxígeno de la sangre y en las vías respiratorias, respectivamente. Estas
células son rápidamente despolarizadas como resultado de la inhibición de canales de potasio
dependientes de oxígeno, activandocircuitos neuronales que propagan señales dopaminérgicas al
cerebro. Con una cinética más lenta, en el cuerpo carotídeo se induce la tirosina hidroxilasa (Czyzyk­
Krzeska y col., 1994) que provoca un aumento de dopamina, lo cual conduce a un aumento de las
frecuencias cardiaca y respiratoria que resultan en la saturación de oxígeno en sangre. Otro ejemplo
son las células del hígado en desarrollo y del riñón adulto que regulan la capacidad de transporte de
oxígeno en la sangre, secretando la hormona glicoproteica eritropoyetina (Epo), que estimula la
producción de glóbulos rojos y de hemoglobina (Goldberg y col., 1988). La extremada especialización
anatómica de los órganos implicados en la homeostasis del oxígeno requiere una compleja expresión
diferencial de genes que, a su vez, se encuentra finamente regulada.
1.1.1 El sistema HIFde mamíferos
1.1.1.1Inducción transcripcional en respuesta a hipoxia
El principal regulador fisiológico de la disponibilidad de oxígeno en mamíferos es el factor de
crecimiento primario de las células progenitoras de eritrocitos, la Eritropoyetina. La hipoxia tisular, ya
sea provocada por cambios en la tensión de oxigeno atmosférico o por alteraciones de la capacidad de
transporte y/o afinidad de la sangre al oxígeno, es el principal estímulo para la producción de Epo
(Goldberg y col., 1988). En mamíferos, el riñón es el principal sitio de síntesis de Epo en adultos pero,
sin embargo, no se dispone de líneas celulares derivadas de riñón en las que la expresión de Epo resulte
regulada por la tensión de oxígeno.
Una línea celular de hepatoblastoma humana Hep3B ha sido extensamente utilizada para estudiar la
regulación transcripcional del gen epo por oxígeno. En estas células la tasa de transcripción de epo
resultó más de lO veces aumentada por incubación de las células a 1% de 02 (Goldberg y col., 1991;
Imagawa y col., 1991). A su vez, la expresión de Epo se indujo por metales divalentes como el cobalto
(Cop) y por el producto metabólico del actinomiceto Streptomyces pílosus, deferroxamina-B (DFO),
un poderoso quelante de hierro (Wang y Semenza, 19933). Por el contrario, la inducción del gen epo
por hipoxia resultó bloqueada por monóxido de carbono (CO) y por óxido nítrico (NO) (Goldberg y
co]., 1988; Huang y col., 1999), donde tanto el CO como el NO unen átomos de hiero dentro de grupos
hemo (Watts y col., 2003). En conjunto, estos datos sugieren la participación de átomos de hierro o de
un grupo hemo en el proceso de sensado y/o de transducción de la señal hipóxica.
Un estudio del mecanismo molecular de la activación transcripcional del gen epo por hipoxia en
ratones transgénicos y en células Hep3B identificó la presencia de elementos enhancers sensibles a
oxígeno en el gen de la En'lropoyetina (Beck y col., 1991; Blanchard y col., 1992). Estas secuencias de
ADN resultaron capaces de dirigir la expresión de genes reporteros heterólogos, mostrando un aumento
dramático de su expresión a 1% de oxígeno (Blanchard y col., 1992). La identificación de un sitio
hipersensible a DNAsa l en la región 3’ flanqueante del gen epo llevó a la caracterización de una
secuencia funcionalmente tripartita, de aproximadamente 50 pares de bases, responsable de la
inducción de este gen (Semenza y col., l99lb; Semenza y Wang, 1992) (figura l A). Estudios de
4
mutagénesis revelaron dos sitios absolutamente necesarios para la inducción en respuesta a hipoxia
(sitios BSl y B82) y un sitio adicional (sitio BS3) de amplificación de la respuesta, definiendo así un
elemento de respuesta a hipoxia: flypoxic Besponse Element (HRE) (figura 1 A). El elemento HRE se
ha descripto en la región regulatoria de diversos genes que responden a oxígeno (Maxwell y col., 1993)
(figura 1 B).
humano
—-—-——-—-c—c—-IG—C-G———-—T—-ocr-T-GG murino
B
oen enhancer - HRE
ldh-A
epo
vegf
glut-1
fgk
Figura 1: EI ‘ de ‘ a hipoxia (HRE)en genes humanos
(A) La secuencia tripartita de 50 nucleótidos del enhancer inducíble por hipoxia del gen de Ia Eritropoyetina
(epo) humana se muestra con los sitios involucrados en su inducción por hipoxia destacados: de unión a HIF-1
(BS1) y a otros factores de transcripción (BSZ y BS3). Debajo, la secuencia homóloga del enhancer epo murino
se indica con los residuos conservados marcados por guiones. Se destaca la unión de HIF-1 al sitio BS1
dependiente de hipoxia (Semenza y Wang, 1992). (B) El sitio de unión de HlF-1 (resaltado en gris) comparte la
secuencia 5’-(A/G)CGTG-3’con los enhancers de los genes: lactato deshidrogenasa-A (ldh-A), epo, factor de
crecimiento endotelio-vascular (vegf), transportador de glucosa (glut-1) y fosfoglicerato kínasa (pgk). Los
elementos HRE contienen una secuencia adicional ubicada 8-9 nucleótidos, río abajo o rio arriba, que constituye
una inversión imperfecta repetida del sitio de unión HIF-1 (subrayada) (Firth y col., 1995; Kimura y coI., 2001).
1.1.1.2 Un factor de unión a ADNregulado por oxígeno
Analizando la actividad de unión al ADN presente en células incubadas en hipoxia se identificó el
factor responsable de la inducibilidad dependiente de secuencias HRE, en ensayos de movilidad
retardada en geles. Varios factores presentes en células Hep3B interactuaron con oligonucleótidos
específicos de la secuencia HRE del enhancer del gen epo, uno de los cuales se encontró presente
únicamente en células mantenidas en hipoxia (Semenza y Wang, 1992). Esta actividad nuclear
regulada por oxígeno fue designada flypoxía Inducible Eaclor o Factor Inducible por Hipoxia-l (HIF­
l). La secuencia de ADN específica para la unión de HlF-l dentro del enhancer del gen epo se limitó a
los nucleótidos 5’-TACGTGCT-3’ correspondiente al sitio BS] del enhancer de epo (figura l A)
(Semenza y Wang, 1992).
La presencia de HIF-l se reportó en una variedad de líneas celulares cultivadas en condiciones de
hipoxia. Aún células que no producen Epo mostraron la presencia de este factor nuclear regulado por
oxígeno (Wang y Semenza, l993b), evidenciando por primera vez que HIF-l no solo activa la
expresión del gen epo sino que forma parte de un sistema de sensado de oxígeno y transducción de la
señal hipóxica, más amplio (Maxwell y col., 1993). En estas células se describió la inducción
transcripcional de una batería de genes endógenos involucrados en procesos como la angiogénesis y la
glucólisis (Firth y col., 1994; Semenza y col., 1994) y la región HRE correspondiente al gen epo
funcionó como inductor transcripcional de genes reporteros en hipoxia (Maxwell y col., 1993; Wang y
Semenza, l993b). Además de los experimentos en células mencionados, la actividad de unión a ADN
de HIF-l fue detectada en extractos nucleares de células provenientes de ratones anémicos tratados con
fenil-hidrazina (Semenza y col., l99la), confirmando que los cultivos celulares reflejan lo que sucede
in vivo.
Estos resultados demostraron la existencia de una vía de señalización hipóxica común a todos los tipos
celulares y sugirieron un rol central del factor de unión a ADN HlF-l en la regulación transcripcional
de la expresión de genes que responden a hipoxia.
1.1.1.3 El clonado de las subunidades a.y Bde HIF-1
La proteína de unión a HRE fue purificada por cromatografia de afinidad a la secuencia enhancer de
epo. Resultó ser un hetero-dimero compuesto por una subunidad a de 120 kDa y una subunidad [3de
91-94 kDa (Wang y Semenza, 1995). Estas subunidades fueron secuenciadas y la comparación de sus
secuencias con bases de datos identificó a la subunidad HlF-la como una nueva proteína de 826
aminoácidos mientras la subunidad HlF-IB resultó idéntica al factor de hetero-dimerización del
receptor de dioxinas en mamíferos, AryI-Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) (figura
2) (Wang y col., 19953).
El análisis de la secuencia de HlF-la reveló que pertenece a la misma clase de proteínas que ARNT,
conteniendo un dominio básico de unión a ADN seguido de un dominio hélice-vuelta-hélice (bHLH) y
un dominio llamado PAS (figura2), acrónimo de los primeros tres integrantes de esta familia:
Eeriod/ARNT/Single minded, Period y Single minded de Drosophila melanogaster (Huang y col.,
1993; Nambu y co]., 1991). El dominio bHLH está presente en un considerable número de factores de
transcripción (figura 2) y media tanto la unión al ADN como la homo- o la hetero-dimerización. El
dominio PAS contiene dos unidades de homología interna, PAS-A y PAS-B, y está implicado en
interacciones proteína-proteina (Huang y col., 1993; Lindebro y col., 1995). Los dominios bHLH y
PAS comprenden la mitad amino-tenninal de las proteínas HlF-la y [3 y son requeridos
respectivamente para la unión al ADN y para la dimerización de ambas subunidades. La región
carboxi-terminal de cada subunidad es requerida para la función de activación transcripcional (Jiang y
col., 1996; Reisz-Porszasz y col., 1994) (figura 2).
bHLH PAS
dimerización dimerización
unión al ADN
y 1 transactivación
l I - - Respuestaxenobiótica
Subunidad de heterodimerización
fi Respuestaa tupoxra
Respuesta a hipoxia
represión
O Q i‘tQOVUOQOQQOÍ
I ... I , .v .yIcore-32144.39;ImH Neurogénesisammm:
figura adaptada de Kewley RJ, WhitelawMLy Chapman-Smith A. Int J Biochem Cell Biol 2004, 36(2)
Figura 2: Proteinas de la familia bHLH-PASen mamíferos
La estructura básica de los factores de transcripción bHLH-PASse encuentra muy conservada: el dominio básico
(b) de unión al ADN y de dimerización (HLH) se encuentran en el extremo amino-terminal de las proteinas. Los
dominios PAS (A y B) otorgan especificidad por Ia subunidad de dimerización a cada factor de transcripción: AhR
y HIF-u (HIF-1a, HiF-2 a y HIF-3 a) hetero-dimerizan con la subunidad común ARNT (1 y 2) y presentan dominios
de trans-activación, responsables de la inducción de genes en respuesta a dioxinas e hipoxia, respectivamente. La
proteina IPAS contiene los dominios bHLH y PAS pudiendo heterodimerizar con ARNT y carece del dominio de
transactivación, funcionando como un dominante negativo de HIF-a. El dominio de represión en SIM (1 y 2) inhibe
la expresión de genes implicados en neurogénesis y la proteína BMAL (1 y 2) regula la expresión de genes
involucrados en los ritmos circadianos.
1.1.1.4 Expresión y función de HIF-1in vivo
Se ha propuesto un papel general de HlF-l en la coordinación de las respuestas fisiológicas que medían
la adaptación a la falta de oxígeno. La expresión de los genes hif-Ia y hif-1fl(arnt) fue analizada in
vivo y mostró ser ubicua tanto en ratón, como en rata y en humanos (Wiener y col., 1996), habiéndose
detectado el ARN mensajero de ambas subunidades en: cerebro, corazón, riñón, hígado, páncreas,
músculo esquelético y bazo. Además, la secuencia de HIF-la se encontró representada en bibliotecas
de ADN copia de hueso, cerebro fetal y adulto, linfocitos, islotes pancreáticos, placenta y útero
(Wiener y col., 1996).
Más tarde otros dos miembros de esta familia fueron descn'ptos: HIP-2a (Ema y col., 1997; Flamme y
col., 1997; Tian y col., 1997) y HIP-3a (Gu y col., 1998). A diferencia de HIP-la, estos dos miembros
de la familia mostraron un patrón de expresión tisular mucho más restringido. La comparación
funcional in vitro entre HIF-la y HIP-2a reveló muchas similitudes en cuanto a su organización
genómica, su estructura proteica y regulación por hipoxia (Wiesener y col., 1998). Además, se
demostró la hetero-dimerización de HlF-Za con la proteína ARNT, y el reconocimiento y unión a sitios
HRE resultó funcional en la transactivación de genes reporteros (O'Rourke y col., 1999).
La existencia de los tres HlFs cuya expresión está parcialmente solapada sugiere que su función podría
ser redundante. Sin embargo, ratones knock-out para los genes HIP-lor. o HIP-2a resultaron letales
durante el desarrollo. Los ratones knock-out para HIP-la mueren alrededor de la mitad del período de
gestación, mostrando malformaciones cardiovasculares y defectos en el tubo neural (Iyer y col., 1998;
Kotch y co]., 1999; Ryan y col., 1998). Estos experimentos demostraron, además, que HlF-la es
requerido no solo para la respuesta a hipoxia sino también para la supervivencia de las células
mesenquimáticas del embrión en desarrollo (Kotch y col., 1999). Ratones con una única copia del alelo
mutante HIF-la se desarrollan normalmente pero muestran defectos en la respuesta fisiológica a
tratamientos crónicos de hipoxia, como reducción de la policitemia, hipertrofia del ventrículo derecho,
hipertensión pulmonar y re-modelamiento de la vasculatura pulmonar (Yu y col., 1999). Las respuestas
electrofisiológicas a hipoxia también se encuentran alteradas en estos ratones heterocigotas (Shimoda y
col., 2001) y los cuerpos carotídeos aislados de estos ratones muestran defectos en la actividad neural
luego de expuestos a hipoxia (Kline y col., 2002). Finalmente, a pesar de que la respuesta ventilatoria a
hipoxia aguda resultó normal en ratones heterocigotas para HlF-la, la adaptación ventilatoria a hipoxia
crónica fue defectuosa (Kline y col., 2002). Estos resultados demuestran claramente que HIP-l juega
un papel central en la adaptación a hipoxia, tanto a un nivel celular como a nivel sistémico.
Estudios de la expresión de HIF-l en ratones sanos revelaron que además de participar en la respuesta
a hipoxia su función puede abarcar procesos adicionales. La subunídad HIF-la se encontró expresada
en diversos tejidos en normoxia, involucrando diferentes tipos celulares (Stroka y col., 2001),
sugiriendo que factores adicionales, como factores de crecimiento, regulan su expresión. Por ejemplo,
se ha demostrado la interacción de HIF-l con el componente del reloj Perl (Chilov y col., 2001) por lo
que la expresión de HlF-la en cerebros de ratón en normoxia podría estar involucrada en la regulación
del n'tmo circadiano (Hogenesch y col., 2000). Otro ejemplo lo constituye una isofonna de HIF-la
cuya expresión deriva de una variante de procesamiento del transcripto primario que involucra al
promotor y al primer exón. Esta isofonna se expresa en espermátidas post-meióticas en testículos de
ratón (Marti y col., 2002), y en linfocitos-T activos (Lukashev y col., 2001). La función de esta
isofonna alternativa de HIF-la no ha sido completamente determinada y tendrá que ser dilucidada en
estudios futuros.
Una nueva proteína PAS inhibitoria (lPAS) fue descripta como variante de procesamiento del ARN
mensajero de HIP-3a (Makino y col., 2002). La proteína [PAS no contiene dominio de trans­
activación (figura 2) por lo que resulta un antagonista natural de las proteínas HlF (Makino y col.,
2001). Existen altos niveles de expresión de IPAS en el epitelio de la córnea, un órgano donde la
angiogénesis dependiente de HlF se encuentra inhibida a pesar de la hipoxia fisiológica que existe en
este tejido.
Se han reportado otros tres potenciales antagonistas naturales de HIF-l: aHIF, un ARN antisentido
complementario a la región 3’ no traducida de HlF-la (Thrash-Bingham y Tartof, 1999); HIFaZ, una
isofonna de HIFOLinducible por zinc, que no contiene al exón 12 (Chun y col., 2001); y una isoforma
dominante negativa de HIP-la que no contiene los exones ll y 12 (Chun y col., 2002). La relevancia
fisiológica de estos transcriptos aún no ha sido definida.
1.1.1.5Genes regulados por oxígeno
HIF-l actúa como un regulador maestro de la expresión génica modulada por oxígeno y hasta el
momento, se conocen aproximadamente dos docenas de genes-blanco de este factor de transcripción.
Sin embargo, experimentos de micro-arreglos en células que sobre-expresan constitutivamente HIP-la
revelaron la existencia de muchos otros genes inducidos por HIF-l (Wykoff y col., 2000b). En la tabla
l se listan algunos de los procesos que involucran la expresión génica regulada por oxígeno.
1.1.1.5 (i) Genes blanco de HlF-1involucrados en el metabolismo de la glucosa
El metabolismo anaerobio de la glucosa proporciona la fuente principal de generación de ATP de la
célula bajo condiciones limitantes de oxígeno (efectoPasteur) (Seagroves y col., 2001). Muchos genes
involucrados en la captura de Ia glucosa y en el proceso de glucólisis se han identificado como blancos
de HIF-l (Wenger, 2000), por ejemplo la lactado deshidrogenasa A (LDH-A), y consistente con ello
estos genes presentan elementos HRE en su región promotora. Como resultado de la glucólisis
anaerobia se produce un incremento en la producción de ácido láctico, que lleva a la acidificación del
medio. Aún con altos niveles de glucosa, el pH ácido potencialmente limita el metabolismo anaerobio
privando a la célula del proceso de glucólisis como fuente de ATP. Isoforrnas de la anhidrasa­
carbónica inducible por hipoxia (Wykoff y col., 2000a) evitan la acidificación en la célula, regulando
el pH por conversión de protones y bicarbonato a CO2, que es captado por los eritrocitos y
transportado hasta el pulmón.
1.1.1.5 (ii)Genes blanco de HlF-1involucrados en biología vascular
Se ha determinado que la hipoxia local en los tejidos es el mayor estímulo del proceso de angiogénesis
en los mamíferos (Maxwell y Ratcliffe, 2002). En respuesta a hipoxia, las células secretan factores de
crecimiento específicos, como el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF), cuya acción
sobre las células endoteliales estimula su proliferación y migración determinando la formación de un
nuevo capilar sanguíneo que provee una cuota extra de oxígeno al tejido (Shweiki y col., 1992). En
hipoxia, los niveles de VEGF se encuentran aumentados de lO a 15 veces como resultado de su
inducción transcripcional dependiente de HlF-l y de la estabilización del ARN mensajero (Levy y col.,
1995). De este modo, la expresión de VEGF promueve la remodelación vascular en respuesta a bajas
concentraciones de oxígeno en los tejidos y tiende a revertir la situación de hipoxia.
La oxigenación de los tejidos se encuentra determinada por la densidad vascular y por el flujo
ll
sanguíneo local, que a su vez se encuentra estrechamente regulado. Las enzimas óxido nítrico sintetasa
y hemo-oxidasa-l, cuyos genes son regulados por HIF-l (Hu y col., 1998; Lee y col., 1997; Melillo y
col., 1997; Palmer y col., 1998) catalizan respectivamente la producción de óxido nítrico y monóxido
de carbono y junto a las proteínas endotelina-l y adrenomedulina, también reguladas por HlF-l (Hu,
Discher y col. 1998) modulan el tono vascular. De esta forma HlF-l media el proceso de angiogénesis
regulando tanto la formación de los capilares sanguíneos como su posterior homeostasis.
1.1.1.5 (iii)Genes blanco de HIF-1involucrados en el metabolismo del grupo hemo
La eritropoyesis es un proceso que se induce en respuesta a hipoxia, incrementando la capacidad de la
sangre de transportar oxígeno, compensando la hipoxia tisular. El hierro es frecuentemente un factor
limitante en el proceso de eritropoyesis y se requiere para Ia síntesis del grupo hemo. Varios de los
genes involucrados en el transporte del hierro al tejido eritroide y en su asociación a grupos hemo, tales
como el gen de la Fern'tina, el de la Transferrina y el de su receptor, son genes blanco de HIF-l (Lok y
Ponka, 1999; Mukhopadhyay y col., 2000; Tacchini y col., 1999). De este modo, en hipoxia se
encuentra favorecido el suplemento de hierro a los eritrocitos permitiendo el incremento de los
glóbulos rojos.
Tabla 1. Algunos procesos involucrados en la expresión génica regulada por oxigeno
Proceso Referencia Gen regulado por oxigeno Expresión
Eritropoyesis (Goldberg y ooI.. 1991) eritropoyetína T
Glucólisis (Firth y co|., 1994) Iactado deshidrogenasa-A T
(Semenza y ool.. 1994) fosfoglicerato kinasa-1 T
(Semenza y ool., 1996) aldo/asa A y C T
(Ebert y ooI., 1996) fosfofructo kinasa L y C T
piruvato kinasa M T
eno/asa A T
Gluconeogénesis (Kietzmann y col., 1993) fosfofenolpiruvatocarboxi-kinasa i
Transporte de glucosa (Ebert y co|.. 1995) tranSportador de glucosa 1 T
(O'Rourke y col, 1996) transportador de glucosa 3 T
transportadorde glucosa 2 l
Sintesis de cateoolaminas (Czyzyk-Krzeska Beresh, 1996) tirosina hidroxilasa T
Transporte e hierro (Rolfs y ool., 1997) transfern'na T
Factores de crecimiento (Kourembanas y ool., 1997) factor endotelio vascular (vegf) T
(Shweiki y col, 1992) factor de transformación ,6 (tgf-m T
factor derivado de plaquetas (pdgf) T
factor de crecimientode Ia placenta l
Sintesis de óxido nítrico (McQuiIIany ooI., 1994) oxido nítrico síntetasa ¡nducible T
(Melilloy col., 1995) oxido nítrico sitnetasa endotelial l
Vasomotores endotelina-1 T
Metabolismo de fosfatos (O'Rourke y col, 1996) adenilato kinasa-3 T
Metabolismo del hemo (Lee y col, 1997) oxigenasa del hemo 1 T
Las evidencias de un mecanismo común de inducción de los genes listados provienen de su similitudfuncional en
Ia respuesta (por ejemplo: inducción por hipoxia. por iones Coz‘ o quelantes de hierro). por la definición de sitios
de unión de HlF-1 funcionalmente críticos en sus secuencias regulatorias y por la regulación alterada en células
mutantes que no producen HlF-1. Las flechas indican aumento (T)o disminución (i) de la expresión en hipoxia.
1.1.2 Regulación de HIF-1por oxigeno
Una vez determinada la identidad del factor responsable de la inducción génica dependiente de oxígeno
los estudios se centraron en entender los mecanismos celulares que median la regulación de HlF-l por
oxigeno.
En primer lugar se estudió la expresión de los genes hif-l ay arnt a nivel transcripcional. El ARN
mensajero de HlF-la resultó inducido en cerebro, riñón y pulmón de ratón dentro de los 30 a 60
minutos de exposición a hipoxia, sin reportar cambios en otros tejidos dentro del mismo animal. Luego
de 4 horas de tratamiento continuo en hipoxia, los niveles de ARN mensajero retomaron a valores
basales (Wenger y col., 1996), indicando una inducción transciente de Ia expresión del ARN mensajero
de HIP-la por hipoxia. La subunidad B, por su parte, no mostró cambios en la expresión del ARN
mensajero por exposición a hipoxia. Aunque estos resultados sugieren que HlF-l es en parte regulado a
nivel transcripcional y/o de estabilidad de ARN mensajero, los genes hijïla y arnt fueron clonados
independientemente de bibliotecas de ADN copia de células no hipóxicas, encontrándose altos niveles
de los transcriptos de ambos genes en presencia de oxígeno. Esto sugiere que ni la transcripción ni la
estabilidad del ARN mensajero de hif-Ia o híf-Ifi representan etapas principales en la regulación por
oxigeno.
1.1.2.1 Estabilidad de la subunidad HIP-1a.
Experimentos de Western BIot en células de mamífero determinaron que HIF-la es virtualmente
indetectable en células mantenidas en nonnoxia y los niveles de proteína aumentan dramáticamente
tras pocas horas de incubación en hipoxia (Wang y col., l995a). La cinética de acumulación de la
proteína HlF-10Lresultó paralela a la inducción de la actividad de unión al ADN previamente descripta
para HIF-l. Un análisis similar en células HeLa mostró que tanto la actividad de unión al ADN de
HIF-l como el nivel de la proteína HIF-la aumentaron exponencialmente con la disminución de la
concentración de oxígeno, registrándose la respuesta más dramática a concentraciones aproximadas a
0,5 % de 02.
Experimentos de pulso y caza en presencia de cicloheximida indicaron una vida media de HIF-l a larga
(de horas) en células mantenidas en hipoxia, en contraste con la rápida desaparición de la proteína (5
minutos) en células re-oxigenadas a 21% 02 (Wang y col., l995a). Esta disminución en los niveles de
la proteína fue dependiente de la integridad celular e independiente del tratamiento con cicloheximida
14
(Huang y col., 1996; Wang y col., l995a). Estos datos sugirieron un mecanismo independiente de los
procesos de transcripción y de traducción y permitieron postular la existencia de una regulación post­
traduccional de HIF-la que provoca cambios en la estabilidad de la proteína en respuesta a hipoxia.
La subunidad HIP-IB no mostró cambios significativos en sus niveles de expresión luego de la
exposicióna hipoxia (Wang y col., l995a), sugiriendo que la subunidad [3no se encuentra regulada por
oxígeno. Sin embargo, la expresión de genes endógenos y de elementos reporteros mostró un
comportamiento refractario a la hipoxia en células deficientes para HlF-lB/ARNT (Wood y col.,
1996), confirmando la importancia de la subunidad [3en la conformación y funcionalidad del factor de
transcripción HlF-l.
Estos datos indican que Ia acumulación de la subunidad-a es un pre-requisito para la activación del
factor de transcripción HlF-l y sugirieron que su regulación por oxígeno radica principalmente en
modificaciones post-traduccionales que llevan a la estabilización de dicha subunidad.
1.1.2.1 (i) Un dominio de Degradación Dependiente de Oxígeno en la subunidad -a
Un estudio de estructura/función de las proteinas HlF-la y HIF-IB demostró que existen secuencias
dentro de HIP-la, y no de HIF-lB/ARNT, responsables de su regulación por oxígeno. Este análisis
definió dos dominios regulatorios dentro de Ia porción C-tenninal de HIP-la, comprendidos entre los
aminoácidos 530-652 y 652-826. Estas secuencias de HIF-o. fueron capaces de conferir su actividad
regulada por oxígeno a quimeras fusionadas al dominio de unión al ADN de factores de transcripción
heterólogos (Pugh y col., 1997). Al igual que para HIF-l, la activación transcripcional de estas
quimeras respondió a iones cobalto o a DFO, y no a inhibidores mitocondriales. En particular, la
inducibilidad por hipoxia del dominio 530-652 se correlacionó con un aumento en los niveles de la
proteína de fusión, indicando un efecto del oxígeno sobre la estabilidad proteica (Pugh y col., 1997).
Más adelante se vio que las secuencias capaces de conferir regulacion se extienden desde el
aminoácido 400 al 603. La deleción de este dominio en la proteína entera lo identificó como el
responsable de la degradación de HIF-la en normoxia. Se definió así el dominio de degradación
dependiente de oxígeno Qxygenerendent Qegradation domain (ODD) acotado entre los aminoácidos
401-603 que gobierna parte de Ia regulación por oxígeno de HlF-la mediando su degradación en
normoxia (figura 3) (Huang y col., 1998). El dominio ODD confirió su actividad dependiente de
oxígeno en fusiones con el factor de transcripción de levaduras Gal4 (Huang y col., 1998),
demostrando la existencia de un mecanismo de regulación celular intrínseco que opera sobre este
15
dominio en respuesta a hipoxia.
17___ 71 87 296 401 603 786___826
foz/ N O2
Estabilización
Hif-1aIB
loz l
Transactivación
figura modificada de Huang L. E. y cal., Prac. Natl. Acad. Sci., 1998 95: 7987-7992
rADHif-1a l y
Figura 3: Estructura de HIF-1a
HlF-1a se expresa constitutivamente y el dominio de degradación dependiente de oxigeno (ODD) dentro de la
proteina gobierna su degradación en normoxia; en ausencia de oxígeno HIF-1a se estabiliza y sus dominios de
dimerización (HLH y PAS) le permiten heterodimerizar con HIF-1B y unirse al ADN por el dominio básico (b). El
dominio de transactivación (TAD)gobierna la inducción de genes de respuesta a hipoxia. Los números indican el
primer y último residuo aminoacídico de cada dominio dentro de la proteína. Las flechas indican alto (T) o bajo (i)
oxígeno.
1.1.2.1 (ii)Degradación de HlF-1a por el Sistema Ubiquitina-Proteasoma
La degradación de proteínas dentro de la célula es un proceso altamente regulado que se encuentra
involucrado en numerosas funciones biológicas. Las células eucariotas dependen principalmente de los
sistemas lisosomal y del proteasoma para la degradación intracelular de proteínas. Para analizar el
posible rol de estas Víasde degradación proteica sobre la vida media de HIF-loc se estudió el efecto de
inhibidores específicos de ambas vías proteolíticas sobre la estabilidad de la subunidad-a. La
inhibición con lactacistina o MG-132 en normoxia provocó la estabilización de la proteína HIF-la
(Lee y col., 2004; Salceda y Caro, 1997), demostrando que la degradación de la subunidad-oc ocurre en
el proteasoma en presencia de oxígeno (cuadro 1).
Generalmente, las proteínas destinadas a la degradación proteasomal son previamente ubiquitinadas, en
16
un proceso altamente regulado y específico que involucra una cascada enzimática (cuadro 2). Células
293 co-transfectadas con vectores expresando HIF-la y ubiquitina fusionada a hemaglutinina (HA­
ubiquitina), incubadas en presencia de un inhibidor del proteasoma, produjeron una especie de HIP-lor.
altamente ubiquitinada (Huang y col., 1998). Esto demostró que en presencia de oxígeno la subunidad­
a es modificada por la cascada enzimática de ubiquitinación, dirigiendo a HIF-la hacia su degradación
en el proteasoma de 268.
Cuadr91:E uema l rotas m 2
proteínas débilmente
. asociadas
Partícula regulatoria
pR_1gs factores auxiliares (enzimas de
ubiquitinación / chaperonas)
subunidades-Bi
. induciblesPartícula catalitica
PC-2OS
Partículas regulatorias
alternativas PR-1 1S
El proteasoma es una estructura modular: una o dos particulas regulatorias (PR-195) se unen
a la superficie externa de una estructura central o partícula catalítica (PC-203). La PC está
compuesta de cuatro anillos heptaméricos: dos anillos-a idénticos (a7) en los extremos y dos
anillos-Bidénticos (37) internos. Cada anillo está compuesto de siete subunidades homólogas
diferentes. Algunas de las subunidades-B contienen un sitio de actividad proteasa hacia el
interior de la estructura proteolitica tipo barril. Existen subunidades-[3 inducibles (BI) (por
ejemplo, por interferón-y)que pueden intercambiarse con tres de las subunidades homólogas
alterando la especificidad proteolítica del proteasoma. La PR está compuesta por dos sub­
complejos (tapa y base) que a su vez están compuestos por ocho subunidades. cada uno. La
base contiene las 6 ATP-asas proteasomales y se une al anillo-a de la PC. La tapa puede
disociarse del proteasoma, resultando en un complejo base-PC trunco. La proteina an10
puede interactuar con la tapa y con la base. estabilizando la unión entre ambas. Numerosas
proteinas asociadas y factores auxiliares. como chaperonas y componenetes de la maquinaria
de ubiquitinación, pueden interactuar con PR. Complejos regulatorios alternativos (PR-118)
también pueden unirse a la superficie del anillo-a.
figura adaptada de Glíckmany Ciechanover, Physialagical Reviews82: 373-428, 2002
Quadro 2: Vía de con'u a ión de ubi i ina o eólisi en l ro soma 2 S
(2) Reconocimiento
del sustrato
. +ATP
(1) Activación de la
ubiquitina
(3) Ligación de
ubiquitina
(múltiples ciclos)
compleio
(n)
(5) Reciclado de
ubiquitina
(4) Degradación en
6 elproteasoma
impune (3a23aa)
La conjugación del péptido ubiquitina (Ub) a las proteinas sustratos procede en un
mecanismo en cascada de tres pasos. (1) inicialmente. la ubiquitina es activada por la
enzima activadora de ubiquitina E1 y la reacción, dependiente de ATP, genera un
intermediario tiol ester E1-S-'Ub de alta energia. Una de varias enzimas conjugadoras de
ubiquitina E2 transfiere la ubiquitina activada desde la E1, via un intermediario tiol ester E2­
S'vUb de alta energía, al sustrato unido especificamente a un miembro de la familia de E3
Iigasas de ubiquitina (2). Existen diferentes clases de enzimas E3 (ver Cuadro 3). las cuales
catalizan el último paso en el proceso de conjugación: la unión covalente de la ubiquitina al
sustrato (3). En general la ubiquitina se transfiere a un grupo e-NHz de un residuo lisina
interno del sustrato generando una unión iso-peptidica covalente. La adición sucesiva de
formas activadas de ubiquitina al residuo lisina interno, sobre la molécula de ubiquitina
previamente conjugada, sintetiza una cadena de poli-ubiquitina.Esta cadena es reconocida
por el complejo del proteasoma 268 llevando a la degradación proteolitica del sustrato
ubiquitinado (4), con la liberación de pequeños péptidos. De este modo. las enzimas E3
juegan un rol clave en la cascada proteolltica mediada por ubiquitina puesto que sirven de
factor de reconocimiento especificoal sistema. La molécula de ubiquitina es reciclada por la
actividad de enzimas que de-ubiquitinan al sustrato (5).
figura adaptada de Glickmany Ciechanaver, Physíolagical Reviews82: 373-428,2002
1.1.2.1 (iii)La ubiquitinación de HIF-adepende del gen supresor de tumores de von Hippel­
Lindau
La herencia de un alelo mutante del gen supresor de tumores de von HippeI-Lindau (VHL) lleva a un
síndrome de cáncer familiar heredable autosómico dominante, que predispone a los individuos
afectados a una variedad de tumores. Los tumores más frecuentes son angiomas de retina,
hemangioblastomas del sistema nervioso central, carcinoma renal y feocromocitomas, entre otros.
Todos ellos son tumores típicamente muy vascularizados y en ocasiones se encuentran asociados a una
sobre-producción de glóbulos rojos. Se encontró que estas características están asociadas a la
producción excesiva de péptidos angiogénicos como VEGF, y a la expresión ectópica de Epo por parte
de las células tumorales (Sato y col., 1994; Wizigmann-Voos y col., 1995). La inducción ectópica de
genes de respuesta a hipoxia en células mutantes para vhl sugirió que la proteína pVHL podría
participar en el camino de señalización de la hipoxia.
En líneas celulares de carcinoma renal (RCC4 y 786-0) que son deficientes para pVHL (vhïl') se
reportó la expresión constitutiva de once genes que normalmente son inducidos en hipoxia (Maxwell y
col., 1999). Coincidentemente, un gen reportero controlado por la secuencia HRE también mostró una
expresión constitutiva e independiente de los niveles de oxígeno. La transfección estable del gen
salvaje vhl en las células RCC4 o 786-0 restituyó la expresión regulada por oxígeno de los genes de
respuesta a hipoxia (Maxwell y col., 1999), demostrando la participación de la proteína pVHL en la
regulación de la expresión de genes implicados en la respuesta celular a hipoxia (Ohh y Kaelin, 1999).
Consistente con lo anterior, las células RCC4 carentes de th mostraron una expresión constitutiva del
complejo HIF-l en normoxia aunque los niveles de ARN mensajero de las subunidades HIF-la y
[3fueron normales en estas células. Sin embargo, HlF-la mostró una vida media en normoxia muy
incrementada (60 minutos), explicando la acumulación anormal de la proteína en estas células
(Maxwell y col., 1999). Los niveles elevados de HIP-1a fueron restituidos a niveles normales y
dependientes de hipoxia luego de la transfectar las células RCC4 con th y la vida media de HIF­
la retornó a sus valores normales (menos de 5 minutos) en presencia de cicloheximida. Estos datos
involucraron a la proteína pVHL en la regulación de HlF-l y en particular, sugirieron la participación
de pVHL en la degradación de su subunidad-a.
Asimismo, experimentos de inmuno-precipitación demostraron la interacción fisica entre las proteínas
pVHL y HIP-1a en células tratadas con inhibidores del proteasoma (Maxwell y col., 1999) y esta
introducción resultó ser dependiente de hierro e inhibida en células tratadas con DFO o cobalto.
Se han descripto varias proteínas celulares que interactúan con la proteína pVHL, incluyendo las
20
Elonguínas B y C (Kibel y col., 1995), Culina 2 (Cul-2) (Ohh y Kaelin, 1999) y bel (Kamura y col.,
1999). La formación de complejos estables con Elonguina-B, Elonguina-C, bel y Cul-2 se asocia a la
capacidad de pVHL de regular la inducción de genes de respuesta a hipoxia, incluyendo la expresión
de VEGF (Gnarra y col., 1996; Iliopoulos y col., 1996; Sicmeister y col., 1996), factores mitogénícos
(PDGF-b, TGF-a y TGF-B) (Ananth y col., 1999; Iliopoulos y col., 1996; Knebelmann y col., 1998) y
proteínas involucradas en el metabolismo celular (Glut-l) (Iliopoulos y col., 1996).
La semejanza estructural y funcional de la proteína Cul-2 con el componente Cdc53/Cul-l del
complejo E3 ubiquitina-ligasa SCF (cuadro 3) y la participación de la proteína bel tanto en el
complejo SCF como en el complejo de pVHL, sugirieron una homología en la arquitectura de ambos
complejos proteicos. Posteriormente, ensayos bioquímicos demostraron que la proteína pVHL está
asociada a una actividad de ubiquitina-ligasa que depende de la región de unión a Elonguina-BC y a
Cul-Z. Esta actividad fue específicamente bloqueada por péptidos sintéticos correspondientes a un
motivo BC-box presente en pVHL, que desestabilizan al complejo pVHL/Elonguina-BC/Cul-Z
(Lisztwan y co]., 1999). Tomados en conjunto, estos datos extendieron la analogía estructural
propuesta entre los complejos SCF y el complejo pentamérico VCB (compuesto por pVHL,
elonguinas-BC, bel y CulZ) (cuadro 3) a un nivel funcional, donde la proteína pVHL funciona como
la subunidad de reconocimiento del substrato de un complejo E3 ubiquitina-ligasa. De este modo,
quedó establecido que el complejo VCB que incluye a la proteína pVHL cataliLa la ubiquitinación de
HIP-la (Cockman y col., 2000).
Cuadro 3: Com le os SCF VCB ubi uitina ll asa
BW yf
Complejo VCBÜ
Etapas clave en ia vía de poli-ubiquitinaciónde proteínas sustrato por los complejos E3
ubiquitina-Iigasa SCF y VCB. La ubiquitina (Ub) unida a la enzima activadora de ubiquitina
E1 es transferida a la enzima conjugadora de ubiquitina E2 que interactúa con los
complejos E3 ubiquitina-"gasa SCF (Skp1, Cdc53/Culina 1, F-box y be1) y VCB (Eiongina­
B, Elongina-C, Culina 2, pVHLy be1) que catalizan la transferencia de la ubiquitina de ia
E2 a un residuo lisina interno de las proteinas blanco. La especificidad del sustrato está
dada por ias proteínas F-box en los complejos SCF y por pVHL en el complejo VCB. La
proteina pVHLinteractúa con el complejo por su dominio a y reconoce especificamente a
HIF-a a través de su dominio B. La formación de una cadena de poli-ubiqtuitina sobre la
proteina sustrato/HlF-a la marca para su degradación en el proteasoma 268.
figura adaptada de Wappnery Ratchffe, Genetic Models in Cardiarespiratory Biology 2001, 156
22
1.1.2.1 (iv) Un sistema de sensado de oxígeno: la hidroxilación de HlF-aen prolinas regula su
ubiquitinación y degradación
Se demostró que el dominio ODD de la subunídad HlF-la interacciona fisicamente con pVHL de
manera oxígeno y hierro dependiente y media la degradación proteasomal de HIP-la en nonnoxia
(Huang y col., 1998). Sugestivamente, las proteínas pVHL y HIF-la no ínteraccíonaron en ensayos en
los que HIF-la fue generado por traducción in vitro en lisados de germen de trigo o como proteína
recombinante expresada en E. coli. HIP-1a sintetizado in vitro adquirió la capacidad de interactuar con
pVHL cuando fue preincubado con extractos celulares humanos, de ratón o Xenopus (Ivan M, 2001;
Jaakkola P, 2001), sugiriendo la existencia de factores presentes en células de vertebrados capaces de
modificar a HIP-la en presencia de hierro y oxígeno (Ivan M, 2001; Jaakkola P, 2001). Las prolil-4
hidroxilasas (PH) son enzimas cuya función requiere Fe(ll) y oxígeno para catalizar la hidroxilación
post-traduccional de prolinas. Esto sugirió que la modificación de HlF-la por oxígeno podría consistir
en la hidroxilación de un residuo prolina.
El estudio detallado de los dominios de HIF-la que interaccionan físicamente con pVHL demostró que
una mutación en la prolina 564 de HlF-la, altamente conservada, evitaba la interacción con pVHL
(Ivan M, 2001; Jaakkola P, 2001). Además, un análisis por espectroscopia de masa de péptidos
sintéticos, en comparación con péptidos de la proteína HlF-la recombinante pre-tratados con extracto
de células de mamíferos, indicó la oxidación del residuo prolina 564. De acuerdo con esto, un péptido
sintético conteniendo un residuo trans-4-hidroxiprolina (la más común de las oxidaciones de prolina)
en la posición 564 bloqueó la interacción HIF-la/pVHL, sin requerir un tratamiento previo con
extractos celulares (Jaakkola P, 2001). Estos datos demostraron inequívocamente que la modificación
post-traduccional dependiente de oxígeno de HIF-la consiste en la hidroxilación de la prolina 564
presente en el dominio ODD. Ensayos de co-inmunoprecipitaciónin vivo confirmaron que la
hidroxilación de la prolina 564 de HlF-la es el regulador primario de la unión con pVHL.
‘02) es tambiénPosteriormente, se encontró que la hidroxilación de un segundo residuo prolina (Pro
importante para el reconocimiento de HIP-la por pVHL (Masson y col., 2001). Todavía restaba
identificar a la enzima responsable de la hidroxilación de HlF-la. Las únicas enzimas con actividad
prolil-4-hidroxílasa (PH) previamente caracterizadas en mamíferos eran las que catalizan la
hidroxilación en prolinas de la molécula de pro-colágeno, la cual ocurre a lo largo de la via secretoria.
Las PHs involucradas en este proceso pertenecen a la superfamilia de las dioxigenasas dependientes de
2-oxoglutarato, anticipando que las PHs modificadoras de I-llF-la podrían también pertenecer a esta
familia. Las PHs están compuestas por dos subunídades a y dos B donde la actividad hidroxilasa reside
23
en la subunidad-a (Kivirikko y Myllyharju, 1998). Existían varias evidencias para suponer que las PHs
modificadoras de HIF-la eran diferentes de las PHs del colágeno. En primer lugar, el residuo de
prolina modificado en la molécula de colágeno difiere en su entorno de la secuencia relevante que
contiene a las prolinas modificadas en HIP-la (Ivan M, 2001; Jaakkola P, 2001; Yu y col., 2001).
Además, las PHs modificadoras del colágeno residen en el retículo endoplasmático, a diferencia de la
localización citoplasmática o nuclear esperable para la actividad hidroxilasa sobre HlF-la. De acuerdo
con ello, isoformas recombinantes de las enzimas modificadoras de colágeno no reportaron actividad
sobre el sustrato HIF-la (Jaakkola P, 2001), descartándolas definitivamente como las prolil­
hidroxilasas modificadoras de HIF-l.
Las PHs que modifican a HIP-let fueron finalmente identificadas por estudios genéticos en
Caenorhabditis elegans (C. elegans) (Bruick y McKnight, 2001; Epstein y col., 200]). Basados en la
predicción de que estas PHs dependientes de 2-oxoglutarato y oxígeno poseen un motivo barril B se
identificó el gen egI-9 en C. elegans, de función hasta ese momento desconocida. Mutantes de C.
elegans para egI-9 mostraron altos niveles de CeHIF-la en norrnoxia y pérdida de la inducción por
hipoxia. En experimentos in vitro se observó que la proteína recombinante EGL-9 promovía alguna
modificación en CeHlF-l que permitía la interacción con CeVHL en forma dependiente de 2­
oxoglutarato, hierro y oxígeno, e inhibible por cobalto. Finalmente, se demostró que la interacción
fisica entre CeHlF-l y CeVHL depende de la hidroxilación de un residuo de prolina crítico. La
mutación específica de este residuo previno la formación de una 4-hidroxiprolina analizada en un
péptido sintético, y también la interacción de CeVHL con la proteína CeHlF-l recombinante pre­
incubada con EGL-9. Estos resultados demostraron que EGL-9, la prolil-4-hidroxilasa de HIF-l en C.
elegans (Mole y col., 2003), tiene una función crítica en la regulación de la subunidad HlF-a. Estudios
estructurales definieron un centro de coordinación de átomos de hierro no-hémico dentro de estas
dioxigenasas caracterizado por el motivo HXD/E...H (Schofield y Zhang, 1999) que concuerda con el
absoluto requerimiento de Fe(II) como cofactor que presentan las PHs. De acuerdo con lo predicho,
estas enzimas utilizan 2-oxoglutarato y oxígeno molecular como co-sustratos para su actividad
hidroxilasa, generando como productos de la reacción a una prolina hidroxilada, succinato, agua y C02
(figura 4). La marcada supresión de la hidroxilación de HlF-l en hipoxia sugiere que las PHs de HlF
son verdaderamente sensores celulares de oxígeno.
24
His 313
PDH
H2 / N + 2-OG / N
HQOIIhh" mm Í + 02 In,“ \\\\\N——l/
“2°/Í\Éra ” ' ¡ANTEN
fl Asp315 VLL‘N
His 374
HIF Pro 402 / 564
succinato
C02
figura adaptada de Bruick KR.Genes and Develpment 2003, 17(21)
Figura 4: Modificación del é tido HIF-a or la roliI-4-hidroxilasa de HIF.
La enzima PDH hidroxila a HIF-1a en los residuos Pro 402 y Pro 564. EI sitio activo contiene Fe(l|) coordinado
por Ia triada His-XAsp...His. La enzima une 2-oxogiutarato (2-OG), el polipéptido HlF-a como sustrato y 02,
catalizando la hidroxilación de HlF-a y de 2-OG. En el curso de Ia reacción el oxígeno molecular es consumido y
el 2-OG hidroxilado sufre una decarboxilación, dando como productos succinato y dióxido de carbono (C02). Los
números de los residuos corresponden a las proteínas HlF-1a y PDH2. humanas.
25
En humanos se identificaron tres prolil-hidroxilasas específicas para HlF-la, por homología de
secuencias con el gen egI-9 de C. elegans, designadas PDH (PH domain-containing protein) l, 2 y 3,
cuya expresión resultó ubicua. lncubando PDHl, PDH2 o PDH3 producidas en forma recombinante
con un péptido sintético que incluye a los residuos relevantes de prolina se demostró la función
hidroxilasa de las diferentes PDHs sobre l-IIF-la. Las tres isofonnas resultaron activas sobre la
subunidad a, hidroxilando a la prolina crítica contenida en la secuencia conservada LXXLAB
reconocida por pVHL, permitiendo su interacción en ensayos de co-inmunoprecípitación (Mole y col.,
2002). Confirmando estos resultados, la sobre-expresión de HlF-la en células 293 provocó la
inducción constitutiva de un gen reportero en nonnoxia que resultó atenuada por la co-expresión de
PDH], sin modificar su expresión a 0.5% de 02. Esto indica que la actividad prolil-4-hidroxilasa
dependiente de oxígeno de PDHl sobre Ia proteína HlF-la es un paso limitante en la degradación de
HIF y propone a las PDHs como reguladores integrales de Ia vía de respuesta hipoxia. Finalmente,
puesto que la subunidad HIP-la no sufrió hidroxilación a bajas concentraciones de oxígeno,
permitiendo la acumulación de HlF-l (Epstein y col., 2001; Jewell y col., 2001), las PDHs pueden
considerarse sensores moleculares de oxígeno dentro de la célula (figura 5).
Proteasoma 268
figura adaptada de Yuan Y,Hílliard G, Ferguson Ty Míllhorn DE. J Biol Chem 2003, 278 (18)
Figura 5: Modelodel sensado de oxígeno
Las hidroxilasas específicas de HIF utilizan hierro (Feh) como cofactor. En presencia de oxigeno (02), las
hidroxilasas catalizan la hidroxilación de dos prolinas en HIF-a (se esquematiza la prolina 564). La P564
hidroxilada interactúa específicamente con Ia proteína pVHLy una vez ubiquitinado. HIF-a es degradado en el
proteasoma de 268. (Ia ubiquitina se esquematíza oUL)
27
1.1.2.2 Regulación de la actividad transcripcional de HlF-1
El bloqueo de Ia ubiquítinación y/o degradación proteasómíca de la subunidad HlF-la en nonnoxia no
resultó en un factor de transcripción HlF-l completamente activo (Kallio y col., 1999; Salceda y Caro,
1997). Esto indica que la mera estabilización de la subunidad HIF-l-a endógena no es suficiente para
la activación transcripcional de HlF-l, en condiciones de norrnoxia. Por otro lado, aunque la sobre­
expresión de la subunidad HIF-la resultó suficiente para la inducción de genes reporteros en nonnoxia
(indicando la presencia intracelular de concentraciones saturantes de la subunidad-B) la hipoxia mostró
un efecto sinérgico sobre esta inducción transcripcional (Kallio y col., 1999). Todo esto indica la
existencia de eventos adicionales a la estabilización que son necesarios para una máxima actividad
transcripcional del hetero-dímero HlF-loJB en hipoxia.
1.1.2.2(i) Un dominio de activación transcripcional en la región carboino-terminal de la
proteína HIF-1a
Originalmente se demostró que la deleción de la región carboxilo-terrninal de la proteína HlF-la no
afecta su dimerización con la subunidad HIP-IB ni la unión al ADN, aunque disminuye la
transactivación de genes reporteros basados en secuencias regulatorias del gen epo (Jiang y col., 1996),
indicando que la actividad transcripcional de HIP-la reside en la porción carboxilo-terminal de la
proteína. Para identificar los aminoácidos dentro de esta región que median la actividad transcripcional,
se construyeron plásmidos que expresan