La-hipoxia-como-factor-regulador-en-la-expresion-de-CYP2B6-en-celulas-de-meduloblastoma-humano--activacion-biologica-de-un-segmento-de-la-region-promotora-del-gen

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE 
MEXICO 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
IZTACALA 
 
 
“La hipoxia como factor regulador en la 
expresión de CYP2B6 en células de 
meduloblastoma humano: activación 
biológica de un segmento de la región 
promotora del gen” 
TESIS 
 
Que para obtener el título de 
Licenciado en Biología 
 
PRESENTA: 
Yazareth Julián Cruz Villegas 
 
 
Director de tesis: 
 Dr. Víctor Manuel Dávila Borja 
 
 
 
Los Reyes Iztacala, Edo. De México, 2017 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos: 
➢ A mi madre y a mi padre por el tiempo y su apoyo otorgado en la realización 
de esta tesis. 
➢ A todo el equipo de trabajo del Laboratorio de Oncología Experimental por la 
ayuda brindada en el presente trabajo. 
➢ Al Dr. Víctor Manuel Dávila-Borja por su amplio conocimiento y enseñanzas 
recibidas, al Dr. Jonathan Alcántar Fernández, al Dr. Jesús Valencia 
Cervantes, al Dr. Juan Miranda Ríos, al Dr. Sergio Juárez-Méndez, al Dr. 
Oscar Alberto Pérez González y a la Dr. Rosa Angélica Castillo-Rodríguez 
por su apoyo en el apartado experimental de la tesis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Oncología Experimental 
del Instituto Nacional de Pediatría, bajo la dirección del Dr. Víctor Manuel Dávila 
Borja. Con financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 
(CONACyT), número de proyecto 152919; y Recursos Fiscales de Presupuesto 
Federal para Investigación del Instituto Nacional de Pediatría con registro 39/2010 
y 70/2014. 
La asesoría en el manejo de técnicas de biología molecular utilizadas en el 
presente proyecto, fue proporcionada por el I.B. Jonathan Alcántar Fernández, de 
la Unidad de Genética de la Nutrición del Instituto de Investigaciones Biomédicas 
de la UNAM en el Instituto Nacional de Pediatría. 
A su vez se recibió un apoyo como becario por parte del proyecto CONACyT 
152919.
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE GENERAL 
Glosario ............................................................................................................................................... 6 
Resumen ........................................................................................................................................... 11 
Marco Teórico 
Meduloblastomas .......................................................................................................................... 15 
Hipoxia tumoral y el factor de inducción por hipoxia ..................................................................... 17 
Hipoxia y resistencia a fármacos en tumores ............................................................................... 19 
Enzimas del citocromo P450 ......................................................................................................... 21 
CYP en la terapia anticáncer ......................................................................................................... 22 
CYP2B6 ......................................................................................................................................... 23 
CYP e hipoxia ................................................................................................................................ 25 
Antecedentes..................................................................................................................................... 26 
Planteamiento del problema .............................................................................................................. 28 
Hipótesis ............................................................................................................................................ 28 
Objetivo general ................................................................................................................................ 29 
Objetivos particulares ........................................................................................................................ 29 
Materiales y Metodología 
Determinación in silico de elementos de respuesta a hipoxia (HRE) en la región promotora de 
CYP ........................................................................................................................................... 30 
Análisis de alineamiento de genes CYP por huella filogenética ................................................... 30 
Cultivo de células y establecimiento de las condiciones de hipoxia in vitro ................................. 30 
Extracción de proteína total y determinación de los niveles de la proteína CYP2B6 por Western 
blot ............................................................................................................................................. 31 
Identificación del segmento de la región promotora del gen CYP2B6 humano ........................... 32 
Extracción de ácidos nucleicos ..................................................................................................... 33 
Transcripción reversa y obtención de ADN de cadena complementaria (cDNA) ......................... 34 
Análisis de expresión de HIF-1α;21 .............................................................................................. 35 
Amplificación de la región promotora de CYP2B6 por PCR punto final ....................................... 35 
Purificación de productos de PCR ................................................................................................ 36 
Producción de bacterias químicamente competentes .................................................................. 37 
Clonación de la región promotora del gen CYP2B6 ..................................................................... 37 
Subclonación de la región promotora del gen CYP2B6 ................................................................ 39 
Secuenciación de la región promotora del CYP2B6 ..................................................................... 40 
Alineamiento de secuencias .......................................................................................................... 41 
Transfección y ensayo de la actividad de luciferasa ..................................................................... 41 
Análisis estadístico ........................................................................................................................ 43 
Resultados 
Predicción de elementos de respuesta a hipoxia en el gen CYP2B6 ........................................... 44 
Respuesta celular a hipoxia y su efecto en la expresión de CYP2B6 en células de 
meduloblastoma humano .......................................................................................................... 45 
Discusión ........................................................................................................................................... 61 
Conclusiones ..................................................................................................................................... 66 
Perspectivas ...................................................................................................................................... 66 
Referencias bibliográficas .................................................................................................................67 
Anexo ................................................................................................................................................ 75 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS 
Ilustración 1. Homología entre las subunidades HIF-1 α y β y su unión a HRE en el ADN. ............ 19 
 
Tabla 1. Predicción de elementos HRE de genes CYP en humanos. .............................................. 27 
 
Figura 1. Análisis de huella filogenética. ........................................................................................... 44 
Figura 2. Niveles de proteína de CA-IX en células Daoy a diferentes tiempos de exposición a 
hipoxia al 1% y 0.1%. ........................................................................................................................ 46 
Figura 3. Expresión del ARN mensajero de HIF-1α en células Daoy expuestas en hipoxia. ........... 47 
Figura 4. Niveles de proteína CYP2B6 en la línea celular de hepato carcinoma humano Hep G2. 49 
Figura 5. Expresión de CYP2B6 en células Daoy en condiciones de hipoxia al 1% y 0.1%. ........... 50 
Figura 6. Amplificación de la región promotra del gen CYP2B6 por PCR punto final. .................... 51 
Figura 7. Clonación y digestión del promotor del gen CYP2B6 en el vector pCR4TOPO................ 52 
Figura 8. Alineamiento de secuencias de la región promotora del gen CYP2B6. ............................ 57 
Figura 9. Electroferograma de la secuenciación del vector recombinante pCR4T-CYP2B6. ......... 58 
Figura 10. Digestión de la subclonación del promotor del gen CYP2B6 del vector pGL3-basic. ..... 59 
Figura 11. Actividad transcripcional del elemento potencializador de respuesta al fenobarbital 
(PBREM) de la región promotora del gen CYP2B6. ......................................................................... 60 
Figura 12. Actividad transcripcional de los elementos de respuesta a hipoxia (HRE) de la región 
promotora del gen CYP2B6. ............................................................................................................. 60 
 
Anexo 
Esquema 1. Estrategia experimental de la modulación de la expresión de CYP2B6 por hipoxia. ... 75 
Tabla 2. Secuencia del diseño de oligonucleótidos utilizados para la amplificación del ARN 
mensajero de HIF-1α y RPL4. ........................................................................................................... 75 
Tabla 3. Secuencia del diseño de dos pares de oligonucleótidos para la amplificación del segmento 
de la región promotora del gen CYP2B6. ......................................................................................... 76 
Figura 1.. Digestión enzimática del vector pGL3-Basic y del promotor del gen CYP2B6. ............... 76 
Esquema 2. Mapa circular del vector pCR®4-TOPO®. .................................................................... 77 
Esquema 3. Esquema ilustrativo de clonación del promotor del gen CYP2B6 en el vector 
pCR4TOPO…………………………………………………………………………………………………..78 
Figura 2. Clonación del segmento de la región promotora de CYPB6. ............................................ 78 
Esquema 4. Estrategia de la subclonación del promotor del gen CYP2B6 en el vector pGL3-
Basic…………………………………………………………………………………………………………..79 
Figura 3. Subclonación del promotor de CYP2B6 en el vector pGL3-basic……... …………………..80 
 
 
 
 
 
GLOSARIO 
 
Acetil-CoA acetil coenzima A 
ADN ácido desoxirribonucleico 
AQ4N diclorhidrato de banoxantrona 
ARNm ácido ribonucleico mensajero 
ARNt ácido ribonucleico de transferencia 
ATP adenosín trifosfato 
Bgl ll Bacillus globiggi, enzima de tipo dos 
bHLH dominio básico-hélice-asa-hélice 
BSA proteína albumina de suero bovino 
C/EBPα proteínas de unión a potenciador CCAAT 
CA-IX anhidrasa carbónica IX 
CAR receptor constitutivo de androstano 
CBP proteína de unión a CREB 
cDNA cadena complementaria 
ChIP inmunoprecipitación de la cromatina 
CO2 dióxido de carbono 
C-TAD dominio de Transactivación C (carboxilo)-terminal 
CYP citocromos P450 
CYP19A1 citocromo P450, familia 19, subfamilia A, miembro 1 
CYP1A2 citocromo P450, familia 1, subfamilia A, miembro 2 
CYP1B1 citocromo P450 familia 1, subfamilia B, miembro r 1 
CYP2A6 citocromo P450 familia 2, subfamilia A, miembro 6 
 
 
CYP2B6 citocromo P450 familia 2, subfamilia B, miembro 6 
CYP2C19 citocromo P450 familia 2, subfamilia C, miembro 19 
CYP2C29 citocromo P450 familia 2, subfamilia C, miembro 29 
CYP2C8 citocromo P450 familia 2, subfamilia C, miembro 8 
CYP2C9 citocromo P450 familia 2, subfamilia C, miembro 9 
CYP2D6 citocromo P450 familia 2, subfamilia D, miembro 6 
CYP2E1 citocromo P450 familia 2, subfamilia E, miembro 1 
CYP2J2 citocromo P450 familia 2, subfamilia J, miembro 2 
CYP2S1 citocromo P450 familia 2, subfamilia S, miembro 1 
CYP2U1 citocromo P450 familia 2, subfamilia U, miembro 1 
CYP2W1 citocromo P450 familia 2, subfamilia W, miembro 1 
CYP3A4 citocromo P450 familia 3, subfamilia A, miembro 4 
CYP3A5 citocromo P450 familia 3, subfamilia A, miembro 5 
CYP3A7 citocromo P450 familia 3, subfamilia A, miembro 7 
CYP4A11 citocromo P450 familia 4, subfamilia A miembro 11 
CYP4B1 citocromo P450 familia 4, subfamilia B, miembro 1 
CYP51 lanosterol 14α-demetilasa 
DR1 secuencia corta de repetición directa 
EDTA ácido etilendiaminotetraacético 
EET ácidos epoxieicosatetranoicos 
EGR1 receptor de respuesta de crecimiento temprana 
EMEM medio esencial mínimo de Eagle 
EMSA ensayo de cambio en la corrida electroforética 
Fe(III) óxido de hierro (III) o trióxido de dihierro 
(g) fuerza de centrifugación relativa 
 
 
(g/v) gramos entre volumen 
 
GLOBOCAN estimación de la incidencia, mortalidad y prevalencia del 
cáncer en todo el mundo 
H+ ion del hidrogeno 
HIF factor inducible por hipoxia 
Hind III Haemophilus influenzae, enzima de tipo dos 
HNF4α factor nuclear 4 alfa de hepatocito 
HRE elementos de respuesta a la hipoxia 
HUVEC células humanas endoteliales de la vena umbilical 
Jak-STAT transductores de la señal Janus-cinasas y activadores 
de la transcripción 
kb kilobases 
kDa kilo daltons 
LB Luria Bertani 
LDHA lactato deshidrogenasa A 
MAPK proteína quinasas activadas por mitógenos 
MCT-4 co-transportador monocarboxilato 4 
MDR1 gen de resistencia a multi-farmacos 1 
mg miligramos 
ml mililitros 
mM milimolar 
[M] concentración molar 
NADP nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxiada 
NADPH+ nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducida 
ng nanogramos 
 
 
nm nanómetros 
NOD dominio de oligomerización de nucleótido 
NR1 sitio de unión a receptor nuclear 1 
NR2 sitio de unión a receptor nuclear 2 
NR3 sitio de unión a receptor nuclear 3 
NR8 sitio de unión a receptor nuclear 8 
N-TAD dominio de Transactivación N (amina)-terminal 
O2 oxígeno molecular 
OAREKI elemento de respuesta al ácido okadaico 
ODD dominio de degradación dependiente de oxígeno 
p300 proteína de unión a la región temprana del adenovirus 
p53 proteína supresora de tumores 
PAS dominos Per-ARNT-Sim 
PB fenobarbital 
pb pares de bases 
PBREM módulo potenciador de respuesta a fenobarbital 
PCR reacción en cadena de la polimerasa 
PDH piruvato deshidrogenasa 
PDK piruvato deshidrogenasa quinasa 
P-gp glicoproteína de permeabilidad 
pH concentración de iones hidrógeno [H]+ 
PHD prolil-hidroxilasas 
PMSF fluoruro de fenilmetilsulfonilo 
PPAR receptores activados por el proliferador de peroxidasa 
PVDF fluoruro de polivinilideno 
 
 
pVHL von Hippel-Lindau 
PXR receptor de pregnano X 
RH sustrato orgánico 
RHO hidroxilación del sustrato orgánico 
RPL4 proteína ribosomal L4 
RXR receptorX de retinoide 
SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato 
sódico 
TAE tris, ácido acético, EDTA 
TBE tris, borato, EDTA 
TBS buffer tris salino 
TCA ciclo de los ácidos tricarboxilicos 
TSNC tumores del sistema nervioso central 
UTR región sin trasladar 
UV luz ultravioleta 
VEGF factor de crecimiento del endotelio vascular 
WNT Wingless 
μg microgramos 
μl microlitro 
μM micromol
11 
 
RESUMEN 
Antecedentes. El citocromo P450 (CYP) es una superfamilia de genes que 
codifican para un amplio grupo de hemoproteínas, que catalizan reacciones de 
óxido-reducción para la mayoría de los agentes químicos utilizados en la terapia 
anticáncer. La hipoxia y la activación del factor inducible por hipoxia (HIF) 
desempeñan un papel crítico en la resistencia a la terapia en los tumores sólidos; 
sin embargo, su contribución en modular la expresión de CYP y las consecuencias 
que esto podría tener en la resistencia a fármacos, no se entienden claramente. 
Recientemente, se ha descrito que in vitro la hipoxia aumenta la resistencia a la 
ciclofosfamida, ifosfamida y vincristina en células de meduloblastoma, lo que está 
relacionado con la modulación de la expresión de la proteína CYP2B6. El objetivo 
del presente trabajo fue evaluar el efecto de la hipoxia sobre la regulación de la 
expresión transcripcional de un segmento de la región promotora de CYP2B6 en un 
modelo in vitro en células de meduloblastoma humano. 
Métodos: cultivos celulares en monocapa de meduloblastoma (Daoy) se incubaron 
en normoxia (21%) e hipoxia (al 1% y 0.1% de oxígeno molecular) durante 4, 8 y 24 
horas. Los niveles de proteína CYP2B6 y ARNm de HIF-1α y se determinaron 
mediante Western blot y PCR de punto final, respectivamente; mientras que los 
niveles de proteína de la anhidrasa carbónica nueve (CA-IX) se consideraron como 
indicador de la activación de la vía HIF-1α. Se realizaron predicciones de la 
secuencia núcleo de elementos de respuesta a hipoxia 5'-RCGTG-3' (HRE) en la 
región no codificante -1880/+1 pb de CYP2B6, mediante alineaciones con 
CLUSTAL2W y el uso de la base de datos de JASPAR. La región promotora que 
contiene los dos elementos HRE río arriba del gen CYP2B6, se amplificó por PCR 
y se clonó a partir de ADN genómico, posteriormente se secuenció para su 
confirmación y se subclonó en un vector que lleva el gen reportero de la luciferasa, 
la respuesta a la hipoxia se analizó mediante la determinación de actividad de 
luciferasa por bioluminisencia. 
12 
 
Resultados: Los niveles de proteína de CYP2B6, aumentaron de manera 
significativa cuatro veces bajo la condición de hipoxia al 0.1% a 4 horas de 
tratamiento, en comparación con las condiciones de normoxia, por el contrario, no 
hubo ningún cambio en la expresión de CYP2B6 bajo hipoxia al 1% a las 4 horas, 
sin embargo, disminuye hacia las 24 horas en hipoxia al 0.1%, aunque no de manera 
significativa, y un 50% hacia las 24 horas en hipoxia al 1%. El PBREM del promotor 
clonado de CYP2B6 respondió a PB a una concentración de [100 μ M] durante 24 
horas. La actividad de luciferasa aumenta significativamente bajo hipoxia al 1% (1.3 
veces) y 0.1% (2.9 veces) a 4 horas en comparación con normoxia y disminuye a 
las 24 horas, resultado que se relaciona a lo observado con la expresión de la 
proteína de CYP2B6 en hipoxia al 1% y 0.1% a las 4 y 24 horas. 
Conclusiones: La hipoxia representa un factor que regula la expresión de CYP2B6 
en la línea celular de meduloblastoma humano (Daoy) y es dependiente del tiempo 
de exposición y la concentración de oxígeno, lo que tiene una relación con la 
actividad de luciferasa al evaluar dos elementos HRE presentes en la región 
promotora, lo que apoya la propuesta de una posible interacción de HIF-1α y los 
HRE identificados. Sin embargo, la hipoxia prolongada disminuye la expresión de 
CYP2B6, lo cual podría afectar la biodisponibilidad de algunos profármacos que 
necesiten ser activados por esta enzima en las células tumorales y que podría ser 
un factor determinante en los mecanismo de resistencia tumoral. 
Palabras clave: hipoxia celular, HIF-1, citocromo P450, CYP2B6. 
 
13 
 
ABSTRACT 
Background. Cytochrome P450 (CYP) is a huge family of genes that code for a 
wide group of hemo-thyolated enzymes, which catalyzes oxide-reduction reactions 
for most chemical agents used in the cancer therapy. Hypoxia and activation of the 
hypoxia inducible factors (HIFs) play a critical role in the drug resistance observed 
in solid tumors, however, their contribution CYP expression modulation and 
consequences in therapheutic failure are not clearly understood. Recently, it has 
been described that in vitro, hypoxia increases resistance to cyclophosphamide, 
ifosfamide and vincristine in meduloblastoma cells, which is related with the 
modulation of the CYP2B6 expression. The aim of the present work was to evaluate 
the effect of hypoxia on the regulation of transcriptional expression of a segment of 
the CYP2B6 promoter region in an in vitro model in human medulloblastoma cells. 
Methods: Monolayer medulloblastoma Daoy cell cultures were incubated in 
normoxia and hypoxia (1% and 0.1%) for 4, 8 and 24 h. Protein levels and mRNA of 
CYP2B6 and HIF-1 alpha were determined by Western blotting and RT-PCR 
respectively; whereas, carbonic anhydrase IX (CA-IX) protein levels were 
considered as indicator of the HIF-1 alpha pathway activation. Prediction of the 
hypoxia response element core 5´-RCGTG-3´ (HRE) was performed within the 
noncoding region -1880/+1 pb of CYP2B6, for alignments with CLUSTAL2W and 
JASPAR database. The promoter region containing the two HRE elements upstream 
of the CYP2B6 gene was amplified by PCR and cloned from genomic DNA, 
subsequently sequenced for confirmation and subcloned into a vector carrying the 
luciferase reporter gene, the response to hypoxia was analyzed by the determination 
of luciferase activity by bioluminescence. 
Results: Protein levels of CYP2B6 were significantly augmented four times in 
hypoxia 0.1% at 4 hours comparing to normoxia, in contrast, there was no change 
in CYP2B6 expression with 1% hypoxia at 4 hours, however, it decreased at 24 
hours in hypoxia to 0.1%, although not significantly, and a 50% at 24 hours in 1% 
hypoxia. The PBREM of promoter cloned CYP2B6 responds to PB at a concentration 
of [100 µM] for 24 hours. The luciferase activity increases significantly in both 
14 
 
hypoxia at 1% (1.3 fold) and 0.1% (2.9 fold) at 4 hours compared to normoxia and 
decreases at 24 hours, a result that is related to the observed with the expression of 
the protein of CYP2B6 in hypoxia 1% and 0.1% at 4 and 24 hours. 
Conclusions: Hypoxia regulates the expression of CYP2B6 protein in the Daoy 
medulloblastoma cell line and it is dependent of time of exposition and oxygen 
concentration, which has a relationship with luciferase activity when evaluating two 
HRE elements present in the promoter region. These results support the hypothesis 
of biological activity of the HRE in the CYP2B6 gene in response to hypoxia. 
prolonged hypoxia decreases the protein expression of CYP2B6, which could affect 
the bioavailability of cytotoxic compounds of some prodrugs that need to be activated 
by this enzyme in tumor cells and could be a factor associated with a mechanism of 
resistance. 
Key words: cell hypoxia, HIF-1, cytochrome P450, CYP2B6. 
 
15 
 
MARCO TEÓRICO 
Meduloblastomas 
Los tumores del sistema nervioso central (TSNC) constituyen el tipo de neoplasia 
sólida más común en la infancia, pues se presentan con frecuencias de entre el 20% 
al 25%, tan sólo antecedidas por las leucemias (Martínez et al., 2008). La incidencia 
promedio a nivel mundial es de 3.4 por cada 100, 000 habitantes, mientras que en 
países desarrollados es de 5.1/100, 000 y de 3/100, 000 en países en desarrollo(GLOBOCAN 2012). Datos proporcionados por “The Central Brain Tumor Registry” 
de los Estados Unidos de Norteamérica (2007-2011), establecen que la incidencia 
en niños de 0 a 14 años es de 5.3 casos por cada 100, 000 habitantes y es más alta 
en hombres que en mujeres, 5.4 y 5.1 por cada 100, 000 habitantes, 
respectivamente (Ostrom et al., 2015). Con respecto a México, en el año 1996 se 
reportó que los tumores del sistema nervioso central ocupaban el tercer lugar de 
todas las neoplasias malignas, con una incidencia anual de 2.5 casos por 100, 000 
habitantes menores de 15 años (Rivera L, 2002). Mientras que para el año 2012 se 
reportan incidencias de 2.3 en hombres y 2.0 en mujeres menores de 15 años 
(GLOBOCAN 2012); aunque no existe información precisa al respecto. 
Dentro de los TSNC, los meduloblastomas constituyen entre el 15% al 25% del total 
de estos tumores en la edad pediátrica (Chico-Ponce de León et al., 2007; Ostrom 
et al., 2014, Parkes et al., 2015). Por su origen, que se ha planteado sucede en 
etapas muy tempranas del desarrollo embrionario, se les considera tumores muy 
heterogéneos; y existen datos que reportan que el 75% de los meduloblastomas 
pediátricos surge en la vermis cerebelar, con proyección hacia el cuarto ventrículo 
(Louis et al., 2007). La mayor parte de la sintomatología, está relacionada con la 
obstrucción del líquido cerebroespinal y su acumulación en el cerebro, llamada 
hidrocefalia. Los niños con meduloblastoma generalmente se diagnostican entre 2 
y 3 meses después del inicio de los síntomas y comúnmente se presentan con 
dolores de cabeza, especialmente por las mañanas, náuseas y/ó vómitos, letargo, 
ataxia, incluyendo la inestabilidad del tronco (Ramaswamy et al., 2014). 
16 
 
En los últimos años se ha avanzado considerablemente en el tratamiento de estas 
neoplasias, que incluye procedimientos de cirugía, con la que se busca resecar la 
mayor cantidad del tejido tumoral, además de controlar el crecimiento o progresión 
con combinaciones de radioterapia cráneo-espinal y/o quimioterapia (Grill et al., 
2005; Hill et al., 2014). 
Esto ha repercutido en incrementar las tasas de sobrevida, que para algunas 
poblaciones se reportan en promedios de hasta un 80% (Kijima and Kanemura, 
2016), pero que en otras se ubica en o por debajo del 50%. No obstante, aún se 
reportan elevadas tasas de morbilidad y un porcentaje muy elevado de recaídas 
[95%] (Hill et al., 2014), además de efectos negativos en el desarrollo neuro-
cognitivo, disminuciones en el coeficiente intelectual, cambios en el 
comportamiento, alteraciones en el lenguaje y en funciones motoras que residen en 
el cerebelo, mayor riesgo de accidentes cerebro-vasculares y el desarrollo de 
neoplasias secundarias; que en conjunto o por separado afectan la calidad de vida 
(Cantelmi et al., 2008; Perkins et al 2013; Picard et al., 2012; Brandão et al., 2013, 
Desandes et al., 2014; Hill et al., 2014). 
El tratamiento del meduloblastoma en niños mayores de 3 años, depende de si el 
tumor es de riesgo medio o alto riesgo; en el caso de que el riesgo sea medio se 
consideran los criterios de si el tumor se ha removido completamente por cirugía o 
si queda una cantidad residual mínima, así como la presencia de metástasis. Para 
el caso de los de alto riesgo, se integran aspectos como si el tumor no pudo 
eliminarse y la presencia de metástasis en otras regiones del SNC, la médula 
espinal y otras partes del cuerpo (PDQ Pediatric Treatment Editorial Board. 
Childhood Central Nervous System Embryonal Tumors Treatment (PDQ®): Patient 
Version. 2016). 
Los efectos de la radioterapia en pacientes pediátricos menores de 3 años, impactan 
prinicipalmente en el desarrollo intelectual, por lo que en la mayoría de las veces se 
recurre a la quimioterapia (Brown et al., 2000). Los agentes quimioterapéuticos de 
mayor uso son el cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida y vincristina, 
17 
 
(http://reference.medscape.com/article/987886-treatment). Por lo que la resistencia 
a la quimioterapia tiene un papel relevante en la evolución clínica de estos tumores 
y es considerada una de las principales causas de falla terapéutica. 
Los mecanismos que definen la resistencia a fármacos en cualquier tumor, son 
complejos y multifactoriales. No obstante, algunos autores los ha clasificado en tres 
categorías: resistencia farmacocinética, resistencia tumoral intrínseca celular y el 
microambiente tumoral (Gottesman, 2002; Gatti y Zunino, 2005). Con relación a los 
últimos dos, se ha propuesto que una condición común en varios tipos de tumores 
sólidos, que se asocia con resistencia a fármacos, es la hipoxia; ésta se genera en 
los tumores mayores a 1 cm3 como producto de una elevada tasa de proliferación 
celular e incrementos en la masa tumoral, junto con una red vascular deficiente y 
cortes intermitentes o prolongados del flujo sanguíneo. 
Hipoxia tumoral y el factor de inducción por hipoxia 
El microambiente tumoral se encuentra influenciado por gradientes en la tasa de 
proliferación celular y por regiones de hipoxia y acidez, que afectan la respuesta del 
tumor a la quimioterapia (Tredan et al., 2007). La adaptación de las células 
tumorales a la hipoxia actúa como una fuerza de selección clonal que resulta en un 
fenotipo tumoral más agresivo y resistente a la terapia (Vaupel, 2004). El principal 
mediador molecular de esta adaptación es el factor inducible por hipoxia (HIF) que 
actúa como un factor de transcripción (Iyer et al., 1998). 
HIF es un heterodímero compuesto de una subunidad-β, que se expresa 
constitutivamente y una subunidad-α cuya expresión y actividad transcripcional es 
regulada por la concentración celular de oxígeno (O2) (Wang et al., 1995). En 
mamíferos se han identificado tres isoformas de HIF-α: HIF-1α, HIF-2α y HIF-3α, 
que comparten un alto grado de secuencia hómologa y su regulación proteolítica es 
similar. Sin embargo la expresión de HIF-2α en el tejido parece ser más restringida 
en comparación a HIF-1α, el cual es ampliamente expresado en los tejidos 
(Wiesener et al., 2003). Por otro lado, HIF-3α puede actuar como regulador negativo 
dominante de HIF-1α y viceversa (Makino et al., 2001). Recientemente también se 
18 
 
ha descrito por ensayos de microarreglos que bajo hipoxia, HIF-3α regula una 
batería de genes independientes de la regulación por HIF-1α, particularmente de 
aquellos que regulan el metabolismo de la glucosa, aminoácidos, la apoptosis, la 
proteolisis, la señalización de p53 y la de PPAR. HIF-3α aumenta la expresión de 
genes en la señalización Jak-STAT y del receptor NOD. Asimismo, sólo HIF-1α 
activa genes que están implicados en la señalización de VEGF, de la insulina y la 
vía de MAPK (Zhang et al., 2014). 
Estructuralmente, HIF posee en su extremo amino terminal un dominio básico-
hélice-asa-hélice (bHLH, por sus siglas en inglés), y dominos Per-ARNT-Sim (PAS) 
que participan en la heterodimerización y en la unión al ADN; mientras que en la 
región carboxilo terminal se ubican dos dominios de transactivación (N-TAD y C-
TAD) que interaccionan con coactivadores como CBP y p300 (Jiang et al., 1997; 
Pugh et al., 1997; Kallio et al., 1998). En condiciones de oxígeno normal (normoxia), 
la subunidad-HIF-1α está sujeta a la hidroxilación de dos residuos de prolina 402 y 
564, por acción de enzimas prolil-hidroxilasas PHD, PHD2 y PHD3, lo que se conoce 
como dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD) (Ivan et al., 2001; 
Jaakkola et al., 2001), esta modificación crea una interfase para la interacción con 
la proteína supresora de tumores von Hippel-Lindau (pVHL) que interactúa con 
HIF1-α y posteriormente el complejo HIF-1α/pVHL es reconocido por una ubiquitin 
ligasa E3, que cataliza la poliubiquitinación de HIF-1α y su subsecuente 
degradación vía proteasomal (Maxwell et al., 1999; Ohh et al., 2000; Kaelin y 
Ratcliffe, 2008). Por el contrario, en condicionesde hipoxia, la hidroxilación es 
limitada, lo cual tiene como consecuencia el aumento de los niveles de proteína HIF-
1α y su posterior translocación al núcleo, en donde dimeriza con la subunidad-β y 
recluta a co-activadores de la transcripción (Ilustración 1). El complejo 
transactivador de HIF-1α se une a una secuencia consenso en el ADN 
(5´RCGTG3´), denominada elemento de respuesta a hipoxia (HRE, por sus siglas 
en inglés) después de lo cual se activa la expresión de genes blanco (Semenza, 
2010). 
19 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ilustración 1. Homología entre las subunidades HIF-1 α y β y su unión a HRE en el ADN. 
 A) Homologías estructurales entre las subunidades HIF-1 α y β. Se muestran los sitios de 
dimerización, unión al ADN y los dominios hélice-asa-hélice (bHLH), PER-ARNT-SIM (PAS), dominio 
dependiente de O2 (ODD) y de transactivación (TAD). B) Unión del heterodímero HIF-1 α/β a los 
elementos de respuesta a hipoxia (HRE) en el ADN y reclutamiento de proteínas co-activadoras 
p300/CBP (Ke and Costa, 2006). 
 
Hipoxia y resistencia a fármacos en tumores 
Uno de los primeros mecanismos moleculares reportados sobre la contribución de 
la hipoxia a la resistencia a fármacos en tumores, es que HIF-1α es capaz de activar 
el gen de resistencia a multi-fármacos 1 (MDR1, por sus siglas en inglés) 
(Comerford et al., 2002). MDR1 codifica para la glicoproteína-P (P-gp), que reside 
en la membrana celular y que pertenece a una familia de transportadores 
dependientes de la unión a ATP (proteínas ABC). La glicoproteína-P puede 
disminuir la concentración intracelular de fármacos quimioterapéuticos, tales como 
alcaloides, antraciclinas y paclitaxel, al actuar como una bomba de flujo de salida 
(Gottesman et al., 2002). 
Ademas, HIF-1α regula una diversidad de vías metabólicas sobre-expresadas en 
cáncer, por ejemplo, el transporte de la glucosa, la glucólisis, la actividad 
mitocondrial y la regulación del pH intracelular y extracelular (Semenza, 2010). El 
rápido crecimiento y la proliferación de las células cancerígenas, demanda una gran 
20 
 
cantidad de nutrientes diferentes para producir ATP y mantener la estructura y 
función celular. En las células normales, la mayoría del ATP es derivado de la 
fosforilación oxidativa de la glucosa en la mitocondria, lo que requiere de una gran 
cantidad de moléculas de oxígeno como combustible. Debido a que el suministro de 
oxígeno en los tejidos depende de los vasos sanguíneos y otros factores como la 
difusión y perfusión, en algunas zonas de los tumores su biodisponibilidad es 
limitada. En algunos tumores, la glucosa es catalizada principalmente por la vía 
glucolítica sin entrar al ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA), mecanismo que se 
le conoce como efecto Warburg, ya que fue propuesto por Otto Warburg en el año 
1920 (Warburg, 1956). 
También se ha reportado que la expresión de la enzima piruvato deshidrogenasa 
quinasa 1 (PDK1) se incrementa en condiciones de hipoxia a través de la activación 
de HIF-1α. PDK1 fosforila a la piruvato deshidrogenasa (PDH) lo que conlleva a la 
inhibición de su actividad catalítica y, como resultado, el piruvato no es convertido 
a acetil coenzima A (acetil-CoA) que es la primera molécula en entrar al ciclo TCA. 
Por lo que el piruvato se acumula y es convertido a lactato por la enzima lactato 
deshidrogenasa A (LDHA) que también es inducida por hipoxia (Kim et al., 2006). A 
su vez, la elevada producción de lactato se relaciona con una excesiva acumulación 
de H+ dentro del citoplasma, lo que puede afectar la función celular y activar vías de 
muerte celular; para superar este cambio en el pH intracelular, las células 
cancerígenas en hipoxia sobre-expresan el co-transportador monocarboxilato 4 
(MCT-4), (Pinheiro et al., 2012) y el intercambiador de sodio-hidrógeno a la bomba 
de lactato y H+, respectivamente (Chiche et al., 2010). Por otro lado, la hipoxia 
induce a la anhidrasa carbónica IX (CA-IX), que contribuye al flujo de salida de H+ 
de las células cancerígenas. Como resultado, el microambiente intracelular se torna 
ligeramente más básico, lo cual promueve la proliferación; mientras que el espacio 
extracelular es más ácido, y favorece la invasión celular e influye en la citotoxicidad 
de fármacos antineoplásicos (Swietach et al., 2008). 
Adicionalmente, las moléculas que atraviesan la membrana celular a través de la 
difusión pasiva, lo hacen de forma más eficiente en la forma descargada; de esta 
21 
 
forma, fármacos de base débil, que tienen una constante de disociación de ácido de 
7.5 a 9.5 tales como doxorrubicina, mitoxantrona, vincristina y vinblastina, están 
protonados y muestran una disminución en la captación celular (Tannock y Rotin, 
1989). Por el contrario, fármacos débilmente ácidos como clorambucil o 
ciclofosfamida, se concentran en el espacio intracelular relativamente neutral 
(Gerweck et al., 2006). Además el microambiente ácido también puede inhibir el 
transporte activo de algunos compuestos como el metotrexato (Cowan y Tannock, 
2001). 
Enzimas del citocromo P450 
Los citocromos P450 (CYP) son una superfamilia de hemoproteínas que catalizan 
una amplia diversidad de reacciones enzimáticas de oxidación y reducción, teniendo 
como sustratos a componentes exógenos conocidos como xenobióticos, y varias 
moléculas endógenas, entre las que se encuentran hormonas esteroideas y el ácido 
araquidónico, entre muchas más (Ingelman-Sundberg, 2004). En humanos, existen 
57 genes CYP, organizados en 18 familias y 43 subfamilias (Nelson et al., 1996; 
Nelson et al., 2004; Nelson, 2005). Su distribución en el organismo es en el riñon, 
pulmón, piel, intestino, corteza adrenal, testículos, placenta entre otros; aunque 
particularmente se expresan en altas densidades en el hígado (Ding y Kaminsky, 
2003). En organismos eucariontes se ha detectado prácticamente en todas las 
membranas subcelulares (Stasiecki et al., 1980; Oesch 1985), siendo la membrana 
interna de la mitocondria y el retículo endoplásmico liso, los organelos celulares 
principales (Lee et al., 1981). En cuanto a sus mecanismos enzimáticos, las 
características principales de los CYP son: (1) unión del sustrato a la enzima, en 
ocasiones acompañada por un cambio en el estado spin del átomo de hierro, para 
producir un aducto enzima-sustrato, (2) reducción del citocromo P450 férrico por 
una reductasa asociada con un electrón derivado de NADPH, a citocromo 450 
ferroso, (3) unión de oxígeno molecular al grupo hemo ferroso para producir un 
complejo citocromo P450-dioxígeno, (4) una segunda reducción de un electrón y 
protonación para llegar al complejo Fe(III)-hidroperóxido, (5) la protonación y 
escisión heterolitica de la unión O-O y (6) la producción concurrente de una 
22 
 
molécula de agua para formar un intermediario reactivo fierro-oxo 7 (7) y finalmente, 
transferir un átomo de oxígeno del complejo fierro-oxo a la unión del sustrato para 
formar el producto oxigenado complejo. Finalmente, la disociación del producto 
completa el ciclo (Ortiz de Montellano, 2005). En resumen, el ciclo catalítico se lleva 
a cabo con un sistema de transporte de electrones y de oxígeno molecular, bajo la 
siguiente fórmula general: 
RH + NADPH + H+ + O2 ROH + NADP+ + H2O 
Cuando el sistema está completamente acoplado, opera con una eficiencia 
catalítica completa, de tal manera que los equivalentes redox y el oxígeno 
consumido están en relación estequiométrica con los productos oxidados 
(Narasimhulu, 2010). En las reacciones metabólicas de fármacos, los CYP se 
clasifican como enzimas de Fase I, por llevar a cabo reacciones de oxidación 
principalmente (Wolkers et al., 1998). En humanos, aproximadamente 15 CYP que 
se agrupan en las familias 1 a la 3, son responsables del metabolismo de la gran 
mayoría de los compuestos xenobióticos, que incluye a más del 90% de los 
fármacos (Shimada et al., 1994; Purnapatreet al., 2008). Entre estos CYP se 
incluyen; CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C8, CYP2C19, CYP2D6, 
CYP2E1 y CYP3A4 (Momose et al., 2002; Wienkers y Heath, 2005). 
CYP en la terapia anticáncer 
La importancia de los CYP en la terapia anticáncer, es que varias de sus isoformas, 
particularmente las que pertenecen a las familias CYP1, CYP2 y CYP3 como ya se 
mencionó, contribuyen de forma significativa en el metabolismo, ya sea por la 
activación o inactivación, de una gran variedad de fármacos antineoplásicos. 
Adicionalmente, algunas de estas enzimas se encuentran sobreexpresadas en 
varios tipos de tumores como los de mama, colon, pulmón, esófago, ovario y 
sarcomas de tejido blando (McFadyen et al., 2004), aspecto por el cual también se 
les reconoce como factores determinantes en la resistencia tumoral a fármacos. Los 
patrones de expresión de CYP en tumores difieren significativamente de los que se 
presentan en hígado y otros tejidos normales y algunas isoformas son consideradas 
23 
 
como de expresión tumor-específica, entre las que se encuentran CYP1B1, 
CYP2A6, CYP3A5, CYP3A7, CYP4B1, CYP19A1, CYP2J2, CYP2S1, CYP2U1, 
CYP2W1 y CYP51 (Spivack et al., 2003; McFadyen et al., 2004; Karglen, 2007; 
Chen et al., 2009). 
Sobre las implicaciones que la expresión de estas enzimas tiene en la biología de 
los tumores se conoce muy poco y solo algunas asociaciones se han establecido, 
por ejemplo, con estudios realizados in vivo e in vitro se ha demostrado que la 
expresión de la isoforma CYP2J2, que metaboliza al ácido araquidónico y produce 
ácidos epoxieicosatetranoicos (EET por sus siglas en inglés; son importantes 
mediadores de procesos angiogénicos), se relaciona con mayor proliferación celular 
en tumores (Chen et al., 2009). Situación similar se ha observado con CYP1B1, 
enzima que metaboliza al 17-beta estradiol a 4-hidroxiestradiol, cuya expresión 
elevada caracteriza a tumores de próstata, mama, y útero (Rodríguez et al., 2010). 
En general, se considera que una expresión elevada de CYP en las células 
tumorales podría formar parte de las estrategias adaptativas que estas células 
tienen para favorecer su supervivencia (Smalley et al., 2005), condición que la 
industria farmacéutica aprovecha para utilizarlos como blanco terapéutico para el 
diseño y desarrollo de fármacos antineoplásicos de nueva generación (Patterson et 
al., 2003; McFadyen et al., 2004; Karlgren, 2007). Sin embargo, la gran mayoría de 
los fármacos utilizados en la quimioterapia actual, también son metabolizados por 
CYP en los tumores (McFadyen et al., 2004). 
CYP2B6 
CYP2B6 es una enzima inducible que se expresa principalmente en el hígado, 
ocupando entre el 2% al 10% del total del contenido de los CYP hepáticos (Hanna 
et al., 2000); aunque también se ha detectado en varios tejidos como el cerebro, 
riñón, intestino, endometrio, macrófagos, alveolos bronquiales, linfocitos de sangre 
periférica y en la piel (Gervot et al., 1999; Janmohamed et al., 2001; Ding y Kamiski, 
2003). Además, CYP2B6 está involucrada en la activación e inactivación metabólica 
de una variedad de sustratos endógenos y un amplio número de fármacos como el 
24 
 
bupropion (antidepresivo), efavirenz (antiretroviral), ifosfamida, nicotina, verapamil, 
diazepam, neverapina, artemisinin, propofol (anestésico), ciclofosfamida y 
tamoxifeno. (Chang et al., 1993; Nakayama et al., 1993; Ono et al., 1996; Code et 
al., 1997; Faucette et al., 2000; Oda et al., 2001). 
La regulación de la expresión de CYP2B6 sucede principalmente a nivel 
transcripcional, lo que depende en gran parte de compuestos inductores que activan 
a receptores nucleares, tales como el receptor constitutivo de androstano (CAR) y/o 
por el receptor de pregnano X (PXR). Estos a su vez se unen a un módulo enhancer 
de respuesta a fenobarbital (PBREM) que se localiza en -2 kb río arriba del inicio de 
la transcripción y que contiene dos motivos NR1 y NR2 dentro de su secuencia; 
siendo el motivo NR1 escencial para su activación. Adicionalmente, también hay 
evidencia de elementos localizados a -8.5 kb río arriba, conteniendo a varios 
motivos de unión a receptores nucleares, entre ellos los motivos NR3 y NR8, que 
tienen capacidad de unirse a los receptores CAR y PXR, en donde NR8 incluye 
dentro de su secuencia a NR3 y un sitio adyacente con secuencia AGGTCC. A su 
vez, en NR8 se pueden unir los heterodímeros PXR/RXRα y CAR/RXRα por lo que 
se piensa que estos elementos son módulos funcionales de respuesta distal que 
potencian la expresión de CYP2B6 (Wang et al., 2003). 
Por otra parte, se ha observado que la vía de señalización WNT/β-catenina también 
está involucrada en la inducción de la expresión de CYP2B6 y otros CYP, al 
interactuar con los receptores CAR y PXR. En contraste, esta misma vía limita la 
expresión de otros genes, tales como CYP1A, CYP2C8, CYP3A4 y CYP4A11 por 
interactuar con PPARα (Thomas et al., 2015). Otros reportes indican que el promotor 
de CYP2B6 está regulado principalmente por dos secuencias: la distal PBREM (-2 
k.b) y la proximal OAREKI, -270 pb, la cual consiste en una secuencia de 52 pb, que 
se dividen en tres motivos (DR1, E-box y CACCC) y que se activa con tratamiento 
con ácido okadoico. También existen dos motivos conocidos como CA2 y CA3 que 
localizan río abajo del sitio PBREM y un motivo CA1, localizado cerca de OAREKI; 
estos motivos son esenciales para que interactúe el receptor de respuesta de 
crecimiento temprana 1 (EGR1) y active el promotor dentro del segmento -1.8 k.b 
25 
 
de CYP2B6. Aunado a esto se ha descrito un mecanismo de looping entre el 
PBREM junto con el OAREKI, por lo que EGR1 permite a CAR interactuar con HNF4α 
para interactuar con DR1 y así activar sinérgicamente el promotor de CYP2B6, 
(Inoue y Negishi, 2009). Por otro lado, también se ha demostrado que CAR requiere 
de la cooperatividad de dos factores de transcripción, HNF4α y C/EBPα, a través de 
secuencias de reconocimiento en su región regulatoria 5´, los tres factores cooperan 
uno con el otro: CAR con C/EBPα, CAR con HNF4α, y C/EBPα con HNF4α, lo que 
nos ofrece un panorama de cómo CYP2B6 se regula transcripcionalmente y cómo 
estos factores interactúan entres sí (Benet et al., 2010). 
CYP e hipoxia 
Se ha reportado que en pacientes con enfermedades cardiorrespiratorias e 
insuficiencias pulmonares crónicas, se presentaban complicaciones relacionadas 
con la toxicidad producida por la teofilina, un alcaloide utilizado en su tratamiento; 
estudios posteriores demostraron que estas personas tenían problemas en la 
eliminación del compuesto debidos a la presencia de hipoxemia que es la 
disminución a nivel sistémico de la presión parcial de oxígeno en sangre arterial 
(Piafsky, 1977). Adicionalmente, en otro estudio se mostró que en conejos 
expuestos a una concentración de 10% de oxígeno durante 24 horas, mostraban 
una reducción en la eliminación de la teofilina, lo que permitió suponer que las 
enzimas encargadas del metabolismo del compuesto estaban siendo afectadas por 
las bajas concentraciones de O2 (Kurdi et al., 1999). En humanos, en 
concentraciones terapéuticas, la biotransformación de la teofilina es catalizada 
principalmente por CYP1A2 y CYP2D6; estudios posteriores demostraron que en 
animales y cultivos primarios de hepatocitos sometidos a condiciones de hipoxia, se 
producía la inhibición de la expresión de las isoformas CYP1A1 y CYP1A2; 
sugiriendo que la baja concentración de oxígeno podría tener un papel relevante en 
la modulación de la expresión y mecanismos enzimáticos de los CYP (Fradette et 
al., 2002). En otro estudio, por ejemplo, se ha descrito que las isoformas CYP2C8 y 
CYP2C9 incrementan significativamente sus niveles de ARN mensajero (ARNm) y 
proteína en cultivos de células endoteliales humanas sometidas a condiciones de 
26 
 
hipoxia al 1% de O2; lo que también se ha observado con la homóloga CYP2C29 
(Michielset al., 2000). Además, in vivo en conejos, se ha reportado que la hipoxia 
aumentó la expresión de CYP3A6; lo que estuvo asociado con una mayor expresión 
y transcripción nuclear de HIF-1α (Fradette y du Souich, 2003). 
Antecedentes 
Con relación a los mecanismos por los cuales el O2 podría modular la expresión de 
CYP, se cuenta con muy poca información. Al respecto, mediante estudios in silico 
hemos demostrado que al menos 40 de los 57 genes CYP humanos podrían ser 
regulados transcripcionalmente por la activación de la vía HIF-1α (datos no 
publicados), ya que en ellos se identificaron secuencias HRE (5´-ACGTG-3´) con 
alta probabilidad de función biológica (Tabla 1). A la fecha existe un único 
antecedente en el que se ha caracterizado experimentalmente la funcionalidad de 
elementos HRE en la región promotora del gen cyp2s1 de ratón, en donde además 
se demuestra la inducción transcripcional de la enzima en condiciones de hipoxia 
(Rivera et al., 2007). 
En experimentos con células de meduloblastoma (Daoy) en condiciones de hipoxia 
al 1% y 0.1% de O2, se ha observado la modulación a nivel de ARNm y proteína de 
CYP2B6, lo que posiblemente podría estar asociado con resistencia a 
ciclofosfamida, ifosfamida y vincristina. En los mismos experimentos, otras 
isoformas como CYP3A4 y CYP3A5 no mostraron cambios significativos en su 
expresión, no obstante que en los genes de ambas enzimas se identificaron también 
elementos HRE (Tabla1), lo que sugiere que la regulación transcripcional de CYP 
promovida por la hipoxia y la posible activación de HIF-1α, es diferencial y 
dependerá de varios otros factores, entre ellos la posición de los elementos HRE y 
la intervención de otros factores de transcripción. Por otra parte, análisis de huella 
filogenética realizados con CYP2B6, muestran que existen tres regiones HRE 
conservadas en genes ortólogos entre otras especies, como Gorilla gorilla y Macaca 
fascicularis, por lo que es necesario aportar información que demuestre que la 
inducción de CYP2B6 en condiciones de hipoxia, se debe directamente a la 
activación de HIF-1α. 
27 
 
 
Tabla 1. Predicción de elementos HRE de genes CYP en humanos. 
Las secuencias de los genes CYP fueron obtenidas de The National Center for Biotechnology Information de los Estados 
Unidos (www.ncbi.nlm.nih.gov). La predicción de elementos HRE se realizó con el programa JASPAR database 
(http://jaspar.genereg.net), utilizando la matriz HIF para vertebrados, considerando un escore de predicción del 95 % como 
probabilidad de funcionalidad (Datos no publicados: Valencia-Cervantes J et al.,). 
CYP Predicción 
Secuencia 
HRE 
Localización Score Score 
Relativo 
CYP Predicción 
Secuencia 
HRE 
Localización Score Score 
Relativo 
1A1 GTACGTGG -3026/-3019 9.82 0.96 GTACGTGG -258/-251 9.82 0.96 
1A2 CGACGTGC -140/-133 10.44 0.98 4Z1 GGACGTGG -2359/-2352 9.95 0.96 
2A7 GTACGTGG -2816/-2809 9.82 0.96 GTACGTGG -3485/-3478 9.82 0.96 
 GGACGTGT -1483/-1476 9.59 0.95 5A1 GGACGTGT -2228/-2221 9.59 0.95 
2A13 GGACGTGG -2366/-2359 9.95 0.96 7A1 GTACGTGG -3272/-3265 9.82 0.96 
 GGACGTGA -3060/-3053 9.81 0.96 8A1 GGACGTGA -186/-179 9.81 0.96 
2B6 GCACGTGA -972/-965 9.60 0.95 GTACGTGA -2966/-2959 9.69 0.95 
2C9 GTACGTGG -2958/-2951 9.82 0.96 GGACGTGT -199/-192 9.59 0.95 
2C18 GTACGTGA -2447/-2440 9.69 0.95 8B1 GTACGTGA -677/-670 9.69 0.95 
 GGACGTGT -245/-238 9.59 0.95 GGACGTGT -1045/-1038 9.59 0.95 
2C19 GGACGTGT -1186/-1179 9.59 0.95 11A1 GGACGTGT -882/-975 9.59 0.95 
 GGACGTGA -3333/-3326 9.81 0.96 11B1 GGACGTGA -1922/-1915 9.81 0.96 
2E1 GTACGTGG -789/-782 9.82 0.96 GTACGTGA -3391/-3384 9.69 0.95 
 GGACGTGT -1518/-1511 9.59 0.95 11B2 GGACGTGT -1263/-1256 9.59 0.95 
2F1 GGACGTGA -2081/-2074 9.81 0.96 20A1 GTACGTGG -770/-763 9.82 0.96 
 CCACGTGC -2174/-2167 10.23 0.97 GGACGTGT -2582/-2575 9.59 0.95 
2J2 GGACGTGT -3381/-3374 9.59 0.95 GGACGTGT -1150/-1143 9.59 0.95 
2R1 GGACGTGG -626/-619 9.95 0.96 21A2 GGACGTGT -2787/-2780 9.59 0.95 
2S1 CCACGTGC -1450/-1443 10.23 0.97 GTACGTGC -3384/-3377 11.07 0.99 
 GTACGTGG -2566/-2559 9.82 0.96 24A1 GGACGTGA -215/-208 9.81 0.96 
3A4 GGACGTGT -3215/-3208 9.59 0.95 GGACGTGG -1273/-1266 9.95 0.96 
 GGACGTGT -3496/-3489 9.59 0.95 GGACGTGG -289/-282 9.95 0.96 
3A5 GGACGTGT -3293/-3293 9.59 0.95 26A1 GGACGTGA -1813/-1806 9.81 0.96 
3A43 GTACGTGA -3021/-3014 9.69 0.95 GGACGTGC -2518/-2511 11.19 0.99 
4A11 GGACGTGA -1902/-1895 9.81 0.96 26C1 GGACGTGT -3163/-3156 9.59 0.95 
 GGACGTGC -382/-375 11.19 0.99 27A1 GTACGTGG -2030/-2023 9.82 0.96 
4A22 ACACGTGC -1664/-1657 10.18 0.97 27B1 ATACGTGC -1315/-1308 10.27 0.97 
 GGACGTGT -1842/-1835 9.59 0.95 27C1 GTACGTGC -2003/-1996 11.07 0.99 
4B1 GGACGTGC -1204/-1197 11.19 0.99 GGACGTGA -480/-473 9.81 0.96 
4F2 GTACGTGG -1260/-1253 9.82 0.96 46A1 GTACGTGA -1298/-1291 9.69 0.95 
4F8 GTACGTGC -399/-392 11.07 0.99 GTACGTGA -1363/-1356 9.69 0.95 
 GGACGTGT -1160/-1153 9.59 0.95 GGACGTGG -2218/-2211 9.95 0.96 
4F12 GTACGTGA -2382/-2375 9.69 0.95 51A1 GTACGTGA -3490/-3483 9.69 0.95 
 GGACGTGA -2593/-2586 9.81 0.96 
 
28 
 
 
Planteamiento del problema 
CYP2B6 contribuye de manera importante en el metabolismo de diversos fármacos 
antineoplásicos, tales como la ciclofosfamida, vincristina, ifosfamida y tamoxifeno. 
Un estudio previo realizado en el laboratorio de Oncología Experimental del Instituto 
Nacional de Pediatría, demostró que en condiciones de hipoxia al 1% y 0.1%, los 
niveles de ARNm y proteína de CYP2B6 se modulan y que esto podría impactar en 
la resistencia al efecto citotóxico producido por estos fármacos en células de 
meduloblastoma. Sin embargo, no se cuenta con información sobre la modulación 
de la expresión de CYP2B6 por HIF-1α y si podría con ello también interferir en el 
efecto terapéutico de estos fármacos. La identificación de elementos HRE en el gen 
de CYP2B6 y estudios filogenéticos sugieren que HIF-1α podría contribuir de 
manera directa en regular la expresión de la enzima; sin embargo se requiere de 
datos experimentales que apoyen esta propuesta. Lo anterior resulta necesario, 
desde el punto de vista en que podría considerarse a CYP2B6 como blanco 
potencial terapéutico para el uso de pro-fármacos antineoplásicos que sean 
activados por esta enzima en condiciones de hipoxia en los tumores, como ya se ha 
demostrado con el fármaco AQ4N (McErlane et al., 2005). 
 
Hipótesis 
Sí la hipoxia puede modular la expresión de la proteína de algunas isoenzimas del 
citocromo P450, mediante la activación del factor de transcripción HIF-1α a través 
de su unión a elementos de respuesta a hipoxia (HRE) en las regiones promotoras 
de sus genes blanco tal como la anhidrasa carbonica IX (CA-IX), entonces es 
posible que la hipoxia module la expresión de la proteína CYP2B6 a través de la vía 
de HIF-1α. 
 
29 
 
 
 
 
OBJETIVO GENERAL 
Evaluar el efecto de la hipoxia sobre la regulación de la expresión transcripcional de 
un segmento de la región promotora de CYP2B6 en un modelo in vitro en células 
de meduloblastoma humano. 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
1. Identificación de elementos de respuesta a hipoxia en un segmento de -2000 pb 
en la región no codificante del gen CYP2B6. 
2. Analizar la respuesta celular a hipoxia por la expresión de anhidrasa carbónica IX 
y los niveles de ARN mensajero de HIF-1α. 
3. Determinar el efecto de la hipoxia sobre los niveles de proteína de CYP2B6. 
4. Analizar la activación transcripcional del gen CYP2B6 por hipoxia. 
 
30 
 
MATERIALES Y METODOLOGÍA 
Determinación in silico de elementos de respuesta a hipoxia (HRE) en la región 
promotora de CYP 
La secuencia del gen CYP2B6 (Reference Sequence: NG_007929.1) fue obtenida 
de la base de datos GenBank (National Center for Biotechnology Information de los 
Estados Unidos). El análisis fue realizado mediante el software JASPAR Database, 
con matriz de HIF-1α: ARNT y secuencia de HRE consenso, resaltada en negritas 
(5´-CACGTC-3´)en la especie Homo sapiens, limitándose la búsqueda a -2000 
kilobases (k.b.) río arriba y +18 del inicio de la transcripción. Como parte del análisis, 
se incluyo una prueba positiva para el gen CA-IX, del que experimentalmente ya se 
ha reportado la identificación de secuencias HRE; considerando puntajes de 0 a 12, 
y como probable funcionalidad con puntaje ≥ 9.0 y con exactitud del 95 %. 
Análisis de alineamiento de genes CYP por huella filogenética 
El análisis de huella filogenética se realizó mediante el software rVista2.0, con el 
alineamiento múltiple de las secuencias de regiones promotoras de CYP en 
diferentes especies obtenidas de la base de datos GenBank (National Center for 
Biotechnology Information de los Estados Unidos) con el programa CLUSTAL2W. 
Cultivo de células y establecimiento de las condiciones de hipoxia in vitro 
Células de meduloblastoma (Daoy ATCC® HTB-186™) y células de 
hepatocarcinoma célular (HepG2 ATCC® HB-8065™) se sembraron en botellas T 
de 75 cm.2 (Greiner bio-one®, #658170) y fueron mantenidas con medio de cultivo 
Eagle's Minimum Essential Medium y 2 mM L-Glutamina (EMEM ATCC®, #30-
2003), suplementado con 10 % de suero fetal bovino inactivado (Gibco®, #1354979, 
Biowest®, #501520), 10,000 U de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Gibco®, 
#10378-016); incubándose en una atmósfera húmeda, controlada con 5% de 
dióxido de carbono (CO2) y un 95% flujo de aire, a 37°C. Estas condiciones se 
mantuvieron en los controles experimentales para normoxia, mientras que para las 
condiciones de hipoxia al 1% y 0.1% de oxígeno, los cultivos fueron colocados en 
31 
 
una cámara de control de atmósfera interna (Bactrox®, ShelLab@, USA) y el oxígeno 
fue desplazado con nitrógeno de grado médico en fujo constante. 
Extracción de proteína total y determinación de los niveles de la proteína 
CYP2B6 por Western blot 
Células Daoy y HepG2 (P-6) se sembraron en botellas T de 75 cm2, bajo normoxia 
y al alcanzar el 80% de confluencia fueron despegadas con tripsina-EDTA 0.05% 
(GIBCO, #15400-054) y la viabilidad celular fue determinada por el método de azul 
de tripano (Sigma®, #H7901). Posteriormente se sembraron aproximadamente 
200,000 células en cajas de Petri de 60 x15mm2 (Corning®, #430166) y fueron 
distribuidas para tratamientos con hipoxia al 1% y 0.1% en distintos tiempos, 4h, 8h 
y 24h; manteniendo controles respectivos en normoxia. Al finalizar los tratamientos, 
los cultivos celulares fueron procesados para la extracción de proteína total, la cual 
se obtuvo al homogeneizar las células en amortiguador TRIS-HCl 50 mM (pH 8.0), 
NaCl 150 mM, 1.0% IGEPAL® CA-630, deoxicolato de sodio (0.5% p/v) y SDS 
(0.1% p/v) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 100 mM, el cual es un inhibidor 
de proteasas de serina. Después de lo cual, las muestras fueron centrifugadas a 
9,223 g durante 30 minutos a 4°C, para obtener fracciones de proteína total y se 
almacenaron a -20°C, hasta su posterior uso. 
Las determinaciones de proteína total se realizaron mediante el método 
colorimétrico de Bradford (Bradford, 1976), empleando una curva de referencia a 
partir de cantidades conocidas de una solución stock de albúmina de suero bovino 
(1mg/ml); expresando los valores de concentración en microgramos por microlitro 
(μg/μl). Posteriormente se utilizaron entre 20 a 50 μg de proteína total, para realizar 
electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE), al término de lo cual 
se realizaron transferencias electroforéticas a membranas de fluoruro de 
polivinilideno (PVDF, Millipore) por el método en semi-seco. 
Para revelar las bandas correspondientes a las proteínas de interés, las membranas 
fueron bloqueadas con leche en polvo descremada y baja en grasa (Svelty, Nestlé) 
al 5% (g/v) en TBS-Tween 0.1% (v/v) durante una hora, seguido de una incubación 
32 
 
durante toda la noche con el anticuerpo primario Anti-Cytochrome P450 2B6 
(Abcam®, #EPR9985(B)), en dilución 1:1000 y la inmuno-detección se realizó con el 
anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa goat anti-rabbit IgG-HRP (Santa 
Cruz Biotechnology, #sc-2004) en dilución 1:2000. La señal se detectó mediante un 
kit de quimioluminiscencia ImmobilonTM Western HRP substrate (Millipore, USA) 
en una dilución 1:1 (v/v), utlizando como sustrato al luminol y procesando las 
imágenes por medio de ChemiDoc™ XRS+ system (Bio-Rad), con el programa 
Chemi Hi resolution. Los niveles de proteína se cuantificaron por análisis 
densitométrico de imagen con el programa Image Lab (versión 4.1) y los valores de 
densidad óptica relativa se utilizaron para observar las diferencias en la cantidad de 
cada muestra, utilizando como control de carga a la -actina, utilizando un 
anticuerpo específico en dilución 1:5000 (GeneTex, #GT5412) y para el segundo 
anticuerpo HRP anti-mouse en una dilución 1:2000 (Invitrogen, #626520). Como 
control de respuesta a la hipoxia, se determinaron los niveles de proteína de 
anhidrasa carbónica nueve CA IX, con un anticuerpo primario en dilución 1:1000 
(Santa Cruz Biotechnology, #sc-365900) y un anticuerpo secundario HRP-anti 
mouse en dilución 1:2000. 
Identificación del segmento de la región promotora del gen CYP2B6 humano 
La secuencia del gen CYP2B6 humano se obtuvo de la base de datos del National 
Center for Biotechnology Information de los Estados Unidos 
(www.ncbi.nlm.nih.gov), en el apartado de secuencia de nucleótidos (Reference 
Sequence: NG_007929.1) y se consultaron los programas Ensemble Genome 
Browser (www.ensembl.org/) y UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/), 
a partir de lo que se identificaron elementos regulatorios entre los que se incluyó el 
inicio de la transcripción, el codón de inicio y la región sin traducir cinco prima ó 
untranslated region (UTR) 5´, limitándose a -2 k.b. río arriba de la 5´ UTR y + 30 del 
inicio de la transcripción. 
A partir de dicha secuencia se diseñaron dos pares de oligonucleótidos 
determinados para generar un amplicón de 1907 pares de bases (bp) que incluyera 
el segmento -1889/+18 de CYP2B6. Con la finalidad de integrar sitios de 
33 
 
reconocimiento de corte para enzimas de restricción y brindar estabilidad en los 
extremos 5´y 3´ para la subsecuente clonación en un vector reportero del gen de la 
luciferasa, se diseñó un segundo par de oligonucleótidos con sitios de 
reconocimiento de restricción Bgl II y Hind III respectivamente, subrayando la 
secuencia de reconocimiento de corte, que genera un amplicon de 1888 pb 
correspondiente a la región -1880/+8 pb del gen CYP2B6, en la cual se encuentran 
las dos secuencias consenso de elementos de respuesta a hipoxia (HRE), 
denominados HRE2 en -1327/-1323 pb y HRE1 en -636/-631 pb, identificados en el 
análisis in silico y que se presentaron con un score de probabilidad funcional del 
0.95, y en el que también se encuentra un elemento conservado de respuesta al 
fentobarbital (PBREM) en -1714/-1696 pb. 
Extracción de ácidos nucleicos 
La extracción de ADN genómico y ARN total a partir de células Daoy (P-6), se realizó 
por el método de Trizol, el cual es una solución monofásica de fenol, isotiocianato 
de guanidina, y otros componentes diseñados para aislar ARN total, así como ADN 
y proteínas, a partir de muestras de células y tejidos de origen humano, animal, 
vegetal, levadura, o de origen bacteriano. Las células Daoy fueron cultivadas en 
cajas Petri de 60 X100 mm2 y una vez que tuvieron una confluencia del 80% fueron 
procesadas para la extracción del ADN, adicionando 1ml de Trizol e incubando a 
temperatura ambiente por 5 minutos. Se les adicionó 200 µL de cloroformo, se 
agitaron vigorosamente por 30 segundos y se incubó a temperatura ambiente por 3 
minutos, después de lo cual se centrifugó a 12,000 g por 15 minutos a 4°C. La fase 
acuosa fue separada y a la restante se le adicionó acetato de sodio C2H3NAO2 (3M 
pH 5.5) en un volumen 1/10 con respecto al volumen inicialy posteriormente se le 
añadieron 300 µL de etanol absoluto y se incubó a -20°C por 15 minutos, se 
centrifugó a 2000 g por 7 minutos a 4°C y el sobrenadante fue removido y se 
añadieron 700 μl de citrato de sodio Na3C6H5O7 [0.1M] y se incubó a temperatura 
ambiente por 15 minutos, se centrifugó a 2000 g por 5 minutos a 4°C y se descartó 
el sobrenadante. El procedimiento del lavado con citrato de sodio se repitió una vez 
más, posteriormente se añadió 1.4 ml de etanol al 75 % y se incubó a temperatura 
34 
 
ambiente por 15 minutos, se centrifugó a 2000 g por 5 minutos a 4 °C, se descartó 
el sobrenadante y el pellet que contenía el ADN se dejó secar por 10 minutos y se 
resuspendió en 100 µL de agua ultra pura libre de RNAsas y DNAsas y mantuvo 
a -70°C hasta su posterior uso. 
En cuanto a la extracción del ARN total, las células Daoy se cultivaron en cajas Petri 
de 100 x 20 mm2 (Corning, #430167), en condición de normoxia e hipoxia al 1% y 
0.1% a 4 h y 24 h, después de alcanzar el 80% de confluencia se extrajó el ARN 
total por el método de Trizol conforme la descripción anterior. La fase acuosa fue 
separada y colocada en un tubo nuevo y se le adicionaron 500 µL de isopropanol, 
se incubó a temperatura ambiente por 10 minutos y se centrifugó a 12,000 g por 10 
minutos a 4°C; el pellet que se obtuvo fue resuspendido en un 1 ml de etanol al 75% 
(v/v, agua libre de nucleasas), después de los cual se agitó vigorosamente por 1 
minuto y se centrifugó a 7,500 g por 5 minutos a 4°C. Finalmente, se dejó secar el 
pellet de ARN por 10 minutos y se resuspendió en 25 µL de agua ultra pura libre de 
nucleasas. La integridad del ADN genómico y el ARN total se verificaron a partir de 
electroforesis en geles de agarosa al 1% (g/v), en el caso de ARN al observar la 
presencia de subunidades ribosomales 28s y 18s; mientras que la concentración y 
pureza se obtuvieron espectrofotométricamente de los valores de absorbancia a 
260 nm y los cocientes de 260/280 y 280/230. 
Transcripción reversa y obtención de ADN de cadena complementaria (cDNA) 
Posterior a la extracción de ARN total, se procedió a la obtención de cDNA en un 
volumen final de 20 µL con agua ultra pura libre de nucleasas, conteniendo 5 µg de 
ARN total, DNasa I (1 U/µL), Buffer DNasa 1X (20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 2 mM 
MgCl2, 50 mM KCl), con incubación a 37°C por 30 minutos, se añadió 1 µL de EDTA 
a 65°C por 10 minutos. Posteriormente, se añadió 1µL de primer (50 μM oligo dT20) 
y 1 µL de buffer de alineamiento, con incubación a 65°C por 10 minutos, 
posteriormente se añadió 10 µL de 2X First-Strand Reaction Mix (10 mM MgCl2 y 1 
mM de cada dNTP) y 2 µL de SuperScript™ III/RNaseOUT™ Enzyme Mix 
(Invitrogen, #18080-400), con incubación a 50°C por 50 minutos y 85°C por 5 
minutos para inactivar la reacción. 
35 
 
Análisis de expresión de HIF-1α 
Se partió de alícuotas de 25 ng de cDNA para analizar los niveles de ARNm de HIF-
1α (Ver cuadro más adelante), utilizando oligonucleótidos específicos en reacciones 
de PCR en un volumen final de 10 µL, la Kappa DNA polimerasa (5 U/µL), dNTPs y 
MgCl2 (en una concentration final de 1.5 mM), 10 µM de cada oligonucleótido 
Forward HIF-1α y oligonucleótido Reverse HIF-1α, y una concentración de 25 ng de 
cDNA, las condiciones fueron: desnaturalización inicial a 95°C por 3 minutos 
seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95°C por 5 segundos, alineamiento a 
60°C por 15 segundos, extensión a 72°C por 10 segundos y una extensión final a 
72°C por 15 minutos. Como control de expresión se analizaron los niveles de ARNm 
del gen RPL4 (ver cuadro 2)., utilizando 10 µM de oligonucleótidos, la Kappa DNA 
polimerasa (5 U/µL), dNTPs y MgCl2 (en una concentration final de 1.5 mM) en las 
siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95°C por 3 minutos seguida de 
35 ciclos de desnaturalización a 95°C por 5 segundos, alineamiento a 60°C por 15 
segundos, extensión a 72°C por 10 segundos y una extensión final a 72°C por 15 
minutos. Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 1% (g/v) 
compuesto de Buffer de Tris, Borato y EDTA (TBE) 1X, teñidos con Syber Gold 2X, 
estos se visualizaron mediante un transluminador de luz ultravioleta (UV), utilizando 
un marcador de peso molecular de 50 pb y (Invitrogen, #10416-014), 100 pb 
(Invitrogen, #15628-019), para RPL4 que genera un amplicón de 250 pb y de HIF-
1α que genera un amplicon de 80 pb. Los oligonucleótidos utilizados en esta 
sección, fueron amablemente propocionados por el Dr. Sergio Juárez Méndez, del 
Laboratorio de Oncología Experimental del Instituto Nacional de Pediatría. 
Amplificación de la región promotora de CYP2B6 por PCR punto final 
Mediante el primer par de oligonucleótidos diseñados Forward 1 (F1) y Reverse 1 
(R1) se amplificó la región promotora de CYP2B6 por PCR punto final, con un 
volumen final de 25 μl por reacción, conteniendo 2.5 Unidades de Pfx50™ DNA 
Polymerase (Invitrogen, #12355-012), amortiguador Pfx50™ DNA Polymerase (20 
mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% (v/v) de glicerol, 
MgSO4 2mM, dNTP´s 0.35 mM, oligonucleótidos CYP2B6 FW1 y CYP2B6 RV1 en 
36 
 
una concentración de 0.3 μM, con 100 ng de templado de ADN genómico. Las 
condiciones de amplificación para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 
desnaturalización inicial a 94°C por 2 minutos, seguida de 35 ciclos de 
desnaturalización a 94°C por 15 segundos, alineamiento a 52°C por 30 segundos, 
extensión a 68°C por 2 minutos y una extensión final a 68°C por 5 minutos. Los 
productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 1% (g/v) en amortiguador 
Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA (TAE) y fueron teñidos con bromuro de 
etidio (0.005% v/v), utilizando como amortiguador de carga blue/orange 1X 
(Invitrogen, #G190A) y un marcador de peso molecular de 100 pb; estos se 
visualizaron mediante un transluminador de luz ultravioleta (UV). 
Posteriormente se utilizaron los oligonucleótidos modificados CYP2B6 FW2 y 
CYP2B6 RV2 (ver cuadro 3), se amplificó el mismo segmento que correspode a la 
región promotora de CYP2B6, utilizando como templado el producto de la reacción 
de PCR antes descrito. Los componentes de la reacción de PCR fueron las mismas 
a las descritas en el párrafo anterior. Las condiciones de amplificación para la PCR 
anidada fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 94°C por 2 minutos., 
seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 15 segundos, alineamiento a 
55°C por 30 segundos, extensión a 68°C por 2 minutos y extensión final a 68°C por 
5 minutos, posteriormente los productos de PCR también se resolvieron en geles 
de agarosa al 1%. 
Purificación de productos de PCR 
Una vez amplificada la región promotora del gen CYP2B6 por medio de la PCR 
anidada, se realizó la purificación de los productos de PCR mediante el kit QIAquick 
Gel Extraction (QIAGEN, #28606), cortando el fragmento de la banda de ADN del 
gel de agarosa y colocándolo en un tubo nuevo, posteriormente se añadieron 3 
volumenes del amortiguador (QG) tiocianato de guanidina (GuSCN) 5.5 M, Tris HCl 
20 mM (pH 6.6), seguida de una incubación a 52°C para disolver la agarosa; el 
producto fue precipitado por la adición de un volumen de isopropanol grado biología 
molecular (SIGMA) y la mezcla fue centrifugada a 17,900 g a través de una columna 
con membrana de sílice. Posteriormente el producto se lavó con 750 μl del 
37 
 
amortiguador PE (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, en 80% de etanol) centrifugando a 
17,900 g, nuevamente se centrifugó para descartar el etanol restante; para diluir el 
ADN, se adicionaron 20 µL de agua ultrapura (atemperada a 70°C), se depositó 
directo al centro de la membrana de la columna y se dejó reposar por 2 minutos a 
temperaµtura ambiente, se centrifugó a 17,900 g por 1 minuto, se adicionaron 15 
µL de agua ultra pura sin reposar y se centrifugó a 17,900 g por 1 minuto, el producto 
eluidose depositó en un tubo nuevo y se almacenó a -20°C. 
Producción de bacterias químicamente competentes 
Se inocularon 5 ml de medio LB líquido con 10 μl de bacterias E.coli TOP 10 
incubando a 90 g a 37°C por 16 horas; al día siguiente por duplicado se inocularon 
25 ml de medio LB líquido suplementado con 500 μl de MgCl2 1 M más 2.5 ml del 
medio LB con las bacterias E.coli TOP 10 e incubándose a 37°C a 90 g hasta 
alcanzar una densidad óptica entre 0.4 a 0.6 calibrada a 600 nm y añadiendo a la 
lectura un control blanco conteniendo solo el medio LB sin bacterias. Después se 
dividió en cuatro porciones de 12.5 ml en cada tubo falcon de 15 ml, se centrifugó a 
2,500 g, por 20 minutos a 4°C, por cada tubo se descartó el sobrenadante y la 
biomasa bacteriana se resuspendió en 2.5 ml de solución en frío de 50 mM de CaCl2 
y se incubó por 45 minutos en hielo, el pellet se resuspendió y las bacterias fueron 
colectadas por centrifugación a 2,500 g, por 5 minutos a 4°C; posteriormente se 
descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 500 μl de solución en frío de 
CaCl2 y la concentración celular obtenida fue de 5X109 unidades formadoras de 
colonias (UFC)/mL, se alicuotaron 100 µL en tubos eppendorf de 1.5 ml en hielo y 
se almacenaron hasta su posterior uso a -70°C (Sambrook et al., 1989). 
Clonación de la región promotora del gen CYP2B6 
El producto de la PCR anidada fue sometido a una reacción de poliadenilación en 
los extremos 3´ de la secuencia forward y 3´ de la secuencia reverse, bajo las 
siguientes condiciones: 5 unidades de GoTaq® DNA Polymerase, amortiguador 
GoTaq® DNA Polymerase, Cloruro de Magnesio 1.5 mM y desoxiadenosina 
trifosfato (dATP) 0.2 mM y 150 ng del producto de PCR; en un volumen final de 10 
38 
 
µL y las reacciones se incubaron a 70°C durante 15 minutos. Para el procedimiento 
de clonación, se utilizaron 45 ng del producto de PCR poliadelinado y el vector 
pCR™4-TOPO® (Invitrogen, #45-0030), a una concentración de 10 ng/μl de 
plásmido de ADN en un volumen final de 6 μl, con: 50% glicerol, 50 mM Tris-HCl, 
pH 7.4, 1 mM EDTA, 2 mM de DTT, 0.1% Triton X-100, 100 μg/ml de BSA, 30 μM 
rojo fenol, 200 mM de NaCl y 10 mM de MgCl2. 
Para la transformación de bacterias competentes se utilizaron 6 µL de la reacción 
de poliadenilación por 50 µL de bacterias E.coli TOP 10, para esto, la mezlca se 
colocó en hielo durante 15 minutos y en seguida se incubaron a 42 °C durante 45 
segundos; para generar un choque térmico e inmediatamente se colocaron en hielo 
por 10 minutos, al final de lo cual y a temperatura ambiente, se adicionaron 150 µL 
de medio S.O.C (2% Triptona, 0.5% de extracto de levadura,10 mM de NaCl, 2.5 
mM de KCl,10 mM de MgCl2,10 mM de MgSO4 y 20 mM de glucosa). Las 
reacciones, se incubaron durante 1 hora a 37°C con 100 g y se sembraron 100 µL 
de la reacción de transformación en cajas Petri con medio LB/agar y 50 mg de 
ampicilina, mateniendose a 37°C durante toda una noche; al día siguiente, se 
seleccionaron las colonias transformadas y se cultivaron con 5 ml de medio LB 
líquido y 50 mg de Ampicilina con 100 g a 37°C durante 16 horas. 
Posteriormente, las bacterias fueron procesadas para la extracción del plásmido de 
ADN mediante el kit comercial QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, #27106) siguiendo 
las instrucciones establecidas para ello. El plásmido liberado se purificó mediante 
una columna con membrana de sílice, se lavó con amortiguador PE (Tris-HCl 10 
mM, pH 7.5, en 80% de etanol) y se conservó en agua ultra pura libre de DNAsas y 
RNAsas. Posteriormente se confirmó la inserción correcta del promotor, mediante 
un proceso de doble digestión enzimática con BgI II y Hind III (Promega) a una 
concentración final de 5 unidades por cada enzima, amortiguador “C” (Tris-HCl 10 
mM, MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, pH 7.9 a 37 °C) y BSA 0.25 mg/ml 
(Promega, #R3060; con 1 μg del producto purificado. 
 
39 
 
Subclonación de la región promotora del gen CYP2B6 
Para la generación de un plásmido recombinante unido al gen reportero de 
luciferasa, se realizó la subclonación del inserto del promotor de CYP2B6 clonado 
del vector pCR™4-TOPO®, el vector pGL3-basic® (Promega, # E175). Ambos 
vectores fueron sometidos a un proceso de doble digestión enzimática por 
separado, empleando la enzima BgI II y Hind III a una concentración final de 5 
unidades, amortiguador “C” (Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 
mM, pH 7.9 a 37 °C) 1X y BSA (0.25 mg/ml) (Promega), con 3 μg del plásmido 
purificado del vector pCR™4-TOPO®; además se realizó una reacción 
independiente con 3 μg del vector pGL3-basic®, las reacciones se llevaron a un 
volumen final de 20 µL con agua ultra pura libre de DNAsas y RNAsas. Después 
ambas reacciones se incubaron a 37°C por 3 horas, después de lo cual fueron 
inactivadas por calor a 65°C durante 15 minutos. La presencia de los fragmentos 
esperados se corroboró en un gel de agarosa al 1% (g/v), en el caso del vector 
pCR™4-TOPO® sólo se purificó el amplicón que corresponde al promotor de 
CYP2B6 y también el vector linearizado pGL3-basic® mediante el kit QIAquick Gel 
Extraction (QIAGEN) en el procedimiento anteriormente citado. Las muestras fueron 
almacenadas a -20°C. 
Para el proceso de ligación, se realizó un tratamiento de desfosforilación con 20 y 
50 ng del vector pGL3-basic® más 10 unidades de fosfatasa alcalina (Tris-HCl 25 
mM, MgCl2 1 mM, ZnCl2 0.1 mM, glicerol 50 % (w/v), pH 7.6 (4°C) y amortiguador 
de desfosforilación (Tris-HCl 50 mM y 100 µM de EDTA (pH 8.5), incubando a 37 
°C por una hora; posteriormente las reacciones fueron inactivadas por calor a 65°C 
durante 10 minutos, y se realizaron otras reacciones sin tratamiento de 
desfosforilación con 20 y 50 ng del vector pGL3-basic®. Todas las reacciones se 
realizaron de manera independiente, esto con el fin de observar en qué tratamiento 
se obtenía el mayor número de colonias. 
Posteriormente, se realizó la ligación del inserto digerido y purificado del promotor 
CYP2B6 al vector digerido purificado y linearizado pGL3-basic®, mediante el uso de 
5 Unidades de la enzima T4 DNA Ligasa (Thermo Scientific, #EL0012), 
40 
 
amortiguador de Ligasa (Tris-HCl 400 mM, MgCl2 100 mM, DTT 100 mM y de 5mM 
ATP (pH 7.8); utilizando una relación molar 1:3 de vector:inserto, es decir 20 ng y 
50 ng del vector pGL3-basic® digerido con y sin tratamiento de fosfatasa alcalina, y 
60 ng ó 150 ng del inserto del promotor de CYP2B6 digerido. A su vez se utilizaron 
como controles negativos que nos indicaran si el vector pGL3-basic® se estuviera 
recircularizando, se utilizaron 50 ng del vector más fosfatasa alcalina y con Ligasa 
T4 y otra reacción independiente sin ligasa T4; las reacciones se llevaron a un 
volumen final de 20 µL con agua ultra pura libre de DNAsas y RNAsas, se incubaron 
a temperatura ambiente toda la noche. 
A continuación se realizó la transformación, empleando una estirpe bacteriana E.coli 
TOP 10 químicamente competentes, con base al protocolo descrito anteriormente. 
Se sembraron en cajas petri con medio LB/agar y 50 mg de Ampicilina a 37°C toda 
una noche, posteriormente se tomaron 4 colonias por cada tratamiento, estas fueron 
cultivadas en 5 ml de medio LB líquido y 50 mg de ampicilina a 37°C a 100 g durante 
16 horas, después las bacterias fueron procesadas para la extracción del plásmido 
de ADN genómico mediante el kit comercial QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN), 
siguiendo las instrucciones establecidas. Las muestras fueron resuspendidas en 50 
µL con agua ultra pura libre de DNAsas y RNAsas. Posteriormente la clonación se 
confirmó por doble digestión enzimática con BgI II y Hind III a una concentración 
final de 5 unidades, amortiguador “C” 1X (Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 50 
mM, DTT 1 mM, pH 7.9 a 37 °C) 1X y 0.25 mg/ml de BSA (Promega), con 1 μg del 
plásmido purificado del vector de cada tratamiento, estos fueron visualizados 
mediante