tesis-n6966-Schiappacasse

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Universidad de Buenos Aires 
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 
Departamento de Química Biológica 
 
 
“Mecanismos involucrados en 
la resistencia celular a la acción de eritropoyetina” 
 
Tesis presentada para optar al título de 
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica 
 
 
Autora: Lic. Agustina Schiappacasse 
 
 
Directora: Dra. Daniela Cecilia Vittori 
Consejero de Estudios: Dr. Mario Galigniana 
 
 
Laboratorio de Fisiología Celular de la Eritropoyetina 
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2020 
 
 
 
 
 
Agradecimientos 
 
A mi mamá, Nélida, quien me ama y es mi apoyo y sostén en todos los momentos difíciles. 
Ella siempre me incentivó a hacer lo que me gusta. Su fuerza y perseverancia son un gran 
ejemplo. A mi abuela, quien siempre estuvo con un dulce para alegrarme y mimarme. A mí 
familia por todo el cariño que me dan. 
 
A la Dra. Vittori y la Dra. Nesse por esta oportunidad de continuar con mi carrera. 
 
A Maru por ayudarme en el día a día en laboratorio. A Romi, una amiga inesperada, quien 
siempre me incentivó a mejorar. A ambas gracias por la ayuda, cariño y buen clima de 
trabajo durante todos estos años. 
 
A Luciana, Yamila, Agustina, Nadia y Magali. Mis amigas que siempre me prestaron un 
hombro, aconsejaron y alegraron. 
 
A todos los docentes y no docentes que de una u otra forma colaboraron con este trabajo. 
 
Gracias a todos los que confiaron en mí. 
 
 
 
 Resumen 
 
 
Mecanismos involucrados en la resistencia celular 
a la acción de eritropoyetina 
 
La eritropoyetina (Epo) es una glicoproteína perteneciente a la familia de las citoquinas 
producida por los riñones en el individuo adulto. Su principal acción es inducir proliferación, 
supervivencia y diferenciación de los progenitores eritroides. La anemia, uno de los signos que 
más contribuye al deterioro de la calidad de vida de los pacientes con insuficiencia renal, es 
principalmente atribuida a la disminución del aporte de Epo debido a la reducción de la masa 
funcional del riñón. La purificación y clonación de esta citoquina permitió la generación de 
eritropoyetina recombinante (rHuEpo) usándose, en un principio, para contrarrestar la anemia 
de la enfermedad renal crónica, dado que el tratamiento permitía disminuir la frecuencia de 
transfusiones, reducir la mortalidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Luego se 
expandió el uso de la rHuEpo al tratamiento de la anemia asociada a distintas patologías 
crónicas. 
A partir del hallazgo de la expresión del receptor de Epo (EpoR) en tejidos no hematopoyéticos 
y la habilidad protectora de rHuEpo frente a respuestas inflamatorias o estímulos apoptóticos 
se amplió la posibilidad de su espectro terapéutico. Sin embargo, esta acción no eritropoyética 
necesita dosis más elevadas que las utilizadas para el tratamiento de la anemia. Diversos 
ensayos han vinculado el uso de altas dosis de Epo con distintos efectos negativos, como 
estados protrombóticos o problemas cardíacos. 
A pesar del éxito del uso de la rHuEpo y sus derivados en diversas patologías, un porcentaje de 
pacientes no responde al tratamiento. Las dosis de la hormona requeridas para un tratamiento 
efectivo, así como la sensibilidad de los pacientes a la droga, varían ampliamente. No sólo se 
han descripto efectos negativos debido a las dosis elevadas, sino también resistencia al 
tratamiento con la hormona en pacientes que reciben dosis elevadas de rHuEpo pero no 
pueden alcanzar los niveles adecuados de hemoglobinemia. Teniendo esto en cuenta, el 
objetivo de esta Tesis Doctoral es ampliar el conocimiento acerca de mecanismos que pueden 
estar involucrados en la inhibición de los efectos biológicos de Epo. Durante el desarrollo del 
plan de trabajo se utilizaron líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide en 
ensayos realizados para investigar el efecto de altas concentraciones de Epo sobre la 
funcionalidad de la citoquina. Por otro lado, se evaluó la acción de Epo en condiciones 
inflamatorias o en presencia de posibles “toxinas” que suelen acumularse en la insuficiencia 
renal crónica y/o en enfermedad cardiovascular. 
Resultados previos del laboratorio mostraron que la Epo protege a células K562 diferenciadas 
al linaje eritroide de la apoptosis inducida por la citoquina proinflamatoria TNF-. En este 
trabajo se observó que este efecto protector de Epo desaparece al aumentar su concentración. 
La falta de cambios en la expresión del EpoR nos llevó a estudiar mecanismos involucrados con 
el cierre de la señal. Se sabe que la unión de Epo a su receptor ocasiona la internalización del 
mismo, la cual es mediada por el proteasoma. El uso del inhibidor de proteasoma MG132, 
permitió recuperar la actividad antiapoptótica de la Epo, sugiriendo que el uso de altas 
 Resumen 
 
 
concentraciones de Epo afectaría la internalización del EpoR, llevando a la pérdida de función 
observada. 
En los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal se detecta un aumento del 
aminoácido no esencial homocisteína (Hcy) en sangre (hiperhomocisteinemia, HHcy). Además, 
se ha reportado que la HHcy puede originar un aumento intracelular de la concentración de S-
adenosilhomocisteína (SAH), potente inhibidor competitivo de la mayoría de las enzimas 
metiltransferasas. En estadios crónicos, esta patología se asocia también a procesos 
inflamatorios. La acumulación de Hcy y adenosina (Ado) produce un desfasaje del ciclo de la 
metionina que lleva a la hipometilación de ADN. La importancia biológica de los niveles 
aumentados de SAH se registra principalmente en su rol en la regulación génica y en la 
transducción de señales. Para evaluar el efecto debido a la presencia de los dos compuestos y 
su relación con la función de Epo, células K562, en distintos estadios de diferenciación 
eritroide, fueron incubadas con Hcy y Ado, agregando a los cultivos TNF- para simular 
condiciones inflamatorias. La presencia de Hcy-Ado aumentó la apoptosis celular, 
incrementando la actividad de caspasa 3, e indujo resistencia a la acción antiapoptótica de Epo 
frente al TNF-. Se demostró que la despolarización de la membrana mitocondrial, provocada 
por la presencia de Hcy-Ado-TNF-, está involucrada en el mecanismo de resistencia 
observada en estos tratamientos. 
La homocisteína tiolactona (HTL) es un derivado reactivo de la Hcy y puede unirse de forma 
covalente a los grupos ε-amino de los residuos lisina de las proteínas, en una reacción llamada 
N-homocisteinilación. Aquí, se demostró que la Epo puede ser N-homocisteinilada (HTLEpo). 
Se observó disminución de la proliferación y aumento de la apoptosis de las células UT-7, 
dependientes de Epo, al ser tratadas con la hormona previamente incubada con HTL. 
Mediante diversos estudios estructurales se demostró que la molécula de Epo sufre 
modificaciones por N-homocisteinilación. La Epo N-homocisteinilada muestra un aumento en 
las estructuras de hoja- en detrimento de -hélice. Este aumento de hojas- repetitivas se 
relaciona con la formación de oligómeros, con menor movilidad electroforética. El aumento 
del radio de la proteína N-homocistenilada, determinado por la técnica de dispersión de luz 
dinámica, apoya la hipótesis de la formación de oligómeros solubles. Estos cambios 
estructurales en la molécula perturbarían la adaptación espacial requerida para una 
interacción ligando-receptor eficiente y, por lo tanto, se produciría la alteración de las 
funciones proliferativa y antiapoptóticas de Epo. 
Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral intentan ampliar los conocimientos 
referentes a posibles mecanismos involucrados en la resistencia al tratamiento con Epo en 
varias patologías. En modelos celulares, observamos en presencia de altas concentraciones de 
Epo, una alteración de su funcionalidad, relacionada con un aumento de la velocidad de 
silenciamiento del receptor, vinculamos un posibleefecto entre el aumento de la 
concentración de Hcy y Ado con la resistencia a la activación celular por Epo y describimos por 
primera vez la modificación estructural ocasionada por N-homocisteinilación de la Epo que 
conduce a alteraciones funcionales. 
 Resumen 
 
 
 
Palabras claves: Eritropoyetina – Homocisteína – Adenosina – Homocisteína tiolactona – N-
homocisteinilación – Apoptosis – Células eritroleucémicas – Resistencia a la eritropoyetina 
 Abstract 
 
 
Mechanisms involved in cellular resistance to the action of erythropoietin 
 
Erythropoietin (Epo) is a glycoprotein belonging to the cytokine family which is produced in 
adult kidneys. Its main actions are to induce proliferation, survival and differentiation of 
erythroid progenitors. Anemia, caused by low levels of Epo in the bloodstream due to a 
reduced functional renal mass, is one of the main conditions that affect the life quality of 
dialysis patients. Epo purification and cloning allowed the development of recombinant human 
erythropoietin (rHuEpo) which was used at first to overcome anemia of chronic renal disease 
and helped to improve the patients’ quality of life by reducing the frequency of transfusions 
and mortality rate. Later on, rHuEpo treatment was made extensive to anemia associated with 
other chronic pathologies. 
After expression of the erythropoietin receptor (EpoR) was found in non-hematopoietic 
tissues, along with the discovery of the protective ability of rHuEpo against inflammatory 
responses or apoptotic stimuli, the therapeutic spectrum of the cytokine was extended. 
However, this non-erythropoietic action requires much higher Epo doses than those used for 
the treatment of anemia. In this line, several clinical trials have linked the use of high doses of 
Epo with adverse effects such as prothrombotic states or heart disorders. 
Despite the successful use of rHuEpo and its derivatives in different pathologies, a percentage 
of patients fail to respond to treatment. The doses of the hormone required for effective 
treatment, as well as the patients’ sensitivity to Epo, are widely variable. Apart from reports of 
adverse effects, resistance to treatment has also been demonstrated in patients who receive 
high Epo doses but still cannot achieve adequate hemoglobin levels. Taking the above into 
account, the aim of this Doctoral Thesis is to increase the current knowledge about the 
mechanisms that would inhibit the biological effects of Epo. In order to achieve this, several 
cell lines capable of erythroid differentiation have been used to investigate the effect of high 
concentrations of Epo on its functions. On the other hand, the action of Epo has been 
evaluated in the presence of diverse compounds which tend to accumulate in chronic kidney 
disease, as well as under inflammatory conditions. 
Previous results from our group have shown that Epo protects differentiated K562 erythroid 
cells from the apoptotic effect of the proinflammatory cytokine TNF-. In the present work, 
this protective action was not observed when high Epo concentrations were used. As no 
changes on EpoR expression were detected, the mechanisms involved in Epo signal 
downregulation were studied. It is known that the interaction of Epo with its receptor induces 
the proteasome-mediated internalization of the complex. The antiapoptotic effect of Epo was 
restored when the proteasome inhibitor MG132 was used. This suggests that high 
concentrations of Epo may affect EpoR internalization, causing the loss of Epo antiapoptotic 
effect. 
On the other hand, increased serum levels of the nonessential amino acid homocysteine (Hcy) 
have been detected in End-Stage Renal Disease patients. This condition, known as 
 Abstract 
 
 
hyperhomocysteinemia (HHcy), may cause an increase in the intracellular concentration of S-
adenosylhomocysteine (SAH), a potent inhibitor of transmethylation reactions. In chronic 
stages, it is associated with inflammatory processes. The accumulation of Hcy and adenosine 
(Ado) exerts a disruptive effect in the methionine cycle, leading to DNA hypomethylation. The 
biological importance of elevated levels of SAH is mainly related to the deregulation of gene 
expression and cell signaling. To evaluate the effect of Hcy and Ado on Epo function, 
differentiated and non-differentiated K562 cells were grown in the presence of both 
compounds, along with TNF-α, to mimic an inflammatory condition. Apoptosis and caspase 3 
activity were increased leading to resistance to the protective effect of Epo against the action 
of TNF-α. Mitochondrial depolarization, observed when Hcy and Ado were present, could 
explain this resistance. 
Homocysteine thiolactone (HTL), a highly reactive Hcy derivative, reacts with the ε-amino 
groups of lysine residues in a reaction called protein N-homocysteinylation. In this work, it was 
shown for the first time that Epo can be N-homocysteinylated (HTLEpo). Decreased 
proliferation and increased apoptosis were observed in cultures of the Epo-dependent UT-7 
cell line developed in the presence of HTLEpo. To elucidate whether this loss of Epo function 
could be due to molecular alteration, structural modifications of Epo treated with HTL were 
studied by different assays. The N-homocysteinylated Epo showed a secondary structure 
switch from α-helix to β-sheet. This enrichment in -sheet structures was related to the 
formation of soluble oligomers with lower electrophoretic mobility. This hypothesis was 
further supported by an increase in the radius of the modified protein, as determined by 
Dynamic Light Scattering analysis. These structural changes might interfere with the 
conformational adaptations necessary for an efficient ligand-receptor interaction, thus 
affecting the proliferative and antiapoptotic functions of Epo. 
The results presented in this Doctoral Thesis are directed to increase the knowledge regarding 
different mechanisms possibly involved in the resistance to Epo treatment. In cell-based assays 
where high Epo concentrations were used, we demonstrated that the alteration of Epo effects 
could be related to an increased rate of EpoR inactivation. We also found an association 
between the accumulation of Hcy and Ado and the loss of biological activity of Epo, and for the 
first time we described structural modifications of the Epo molecule caused by N-
homocysteinylation that lead to functional loss. 
 
Keywords: Erythropoietin – Homocysteine – Adenosine – Homocysteine thiolactone – 
N-homocysteinylation – Apoptosis – Erythroleukemia cells – Resistance to erythropoietin 
 
Difusión de resultados 
Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral dieron origen a las siguientes presentaciones 
en congresos y fueron publicados en una revista científica de difusión internacional. 
 
Publicaciones científicas con referato: 
• Modification of erythropoietin structure by N-homocysteinylation affects its 
antiapoptotic and proliferative functions. SCHIAPPACASSE A, Maltaneri RE, Chamorro ME, 
Nesse AB, Vittori DC. The FEBS Journal 285:3801-3814, 2018. doi: 10.1111/febs.14632 
 
Presentaciones en reuniones científicas: 
 La combinación de homocisteína y adenosina induce resistencia a la 
eritropoyetina en células eritroleucémicas humanas. SCHIAPPACASSE A, Maltaneri RE, 
Chamorro ME, Nesse AB, Vittori DC. 2º JORNADAS INFIBIOC 2019. “Avances en la 
Investigación Científica y su impacto en la Salud”. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 27 y 
28 noviembre de 2019. 
 
 Effect of high doses of erythropoietin on its antiapoptotic function on 
differentiated erythroid cells. SCHIAPPACASSE A, Maltaneri RE, Chamorro ME, Nesse AB, 
Vittori DC. Reunión Anual de Sociedades de Biociencia SAIC, SAFE, SAB, SAP 2019. LXIV 
Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigaciones Clínicas. Mar del Plata, 
provincia de Buenos Aires, 13 al 16 noviembre de 2019. Resumen publicado en Revista 
Medicina79(IV), 2019. 
 
 Involvement of homocysteine and adenosine in erythropoietin resistance in 
human erythroleukemia cells. SCHIAPPACASSE A, Chamorro ME, Maltaneri RE, Nesse AB, 
Vittori DC. Reunión Conjunta SAIC, SAI, SAFIS 2018. LXIII Reunión Anual de la Sociedad 
Argentina de Investigaciones Clínicas. Mar del Plata, provincia de Buenos Aires, 14 al 17 
noviembre de 2018. Resumen publicado en Revista Medicina 78(III):252, 2018. 
 
 The presence of homocysteine and adenosine exacerbated the TNF-α cytotoxicity 
in human erythroleukemia cells. SCHIAPPACASSE A, Mataneri RE, Nesse AB, Vittori DC. 
Reunión Conjunta de Sociedades de Biociencias. LXII Reunión Anual de la Sociedad 
Argentina de Investigaciones Clínicas. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 13 al 17 
noviembre de 2017. Resumen publicado en Revista Medicina 77(I):287, 2017. 
 
 N-Homocysteinylation alters erythropoietin functions. SCHIAPPACASSE A, Maltaneri 
RE, Chamorro ME, Wetzler D, Nesse AB, Vittori DC. LXI Reunión Anual de la Sociedad Argentina 
de Investigación Clínica (SAIC). Mar del Plata, Pcia. de Buenos Aires, 16 al 19 Noviembre 2016. 
Resumen publicado en Revista Medicina 76(I):289, 2016. 
Abreviaturas 
 ACD anemia of chronic disease, anemia de enfermedades crónicas 
 ADN ácido desoxirribonucleico 
 ADNc ADN complementario 
 Ado adenosina 
 ANOVA Analysis of Variance, análisis de la varianza 
 ANS ácido 8-anilo 1-naftalenesulfónico 
 ARN ácido ribonucleico 
 ARNm ARN mensajero 
 cR receptor -common (CD131) 
 BPW buffer PermWarsh (BD) 
 cFlip cellular FLICE inhibitory protein, inhibidor celular proteico de FLICE 
 CIEF isoelectroenfoque capilar 
 DAF 2,7 diaminofluoreno 
 DC dicroismo circular 
 DLS dispersión de luz dinámica 
 DMEM Dulbecco’s Minimun Essential Mediun, medio de cultivo 
 DMSO dimetilsulfóxido 
 dNTPs desoxinucleótidos trifosfatados 
 DTT 1,4-ditiotreitol 
 ECZ electroforesis capilar de zona 
 Epo eritropoyetina 
 EpoR receptor de eritropoyetina (monómero) 
 ESAs erythropoiesis-stimulating agents, agentes estimuladores de la 
eritropoyesis 
 ESRD End Stage Renal Disease, enfermedad renal en etapa terminal 
 FITC isotiocianato de fluoresceína, fluoróforo 
 GAPDH gliceraldehído-3-P-deshidrogenasa 
 GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, factor estimulante 
de colonias de granulocitos y macrófagos 
 Hb hemoglobina 
 Hcy homocisteína 
 He hemina 
 HHcy hiperhomocisteinemia 
 HTL homocisteína tiolactona 
 HTLEpo eritropoyetina N-homocisteinilada 
 IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, medio de cultivo 
 JAK2 Janus Kinase 2 
 Met metionina 
 MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol 
 PAGE Poliacrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en geles de 
poliacrilamida 
 PBS Phosphate-Buffered Saline, buffer fosfato salino 
 PFA paraformaldehído 
 PI3K Phosphatidil Inositol 3 kinase, fosfatidil inositol 3 quinasa 
 PTP1B Protein Tyrosin Phosphatase 1 B, proteína tirosina fosfatasa 1 B 
 rHuEpo eritropoyetina recombinante humana 
 RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction 
 SAH S-adenosilhomocisteína 
 SAM S-adenosilmetionina 
 SDS Sodium Dodecylsulphate, dodecilsulfato de sodio 
 SDS-PAGE SDS - Poliacrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en geles de 
poliacrilamida con SDS. 
Abreviaturas 
 SEM Standard Error of the Mean, error estándar de la media 
 SFB suero fetal bovino 
 TAE buffer Tris-Acético-EDTA 
 Taq polimera enzima polimerasa obtenida de Thermophilus aquaticus 
 TBS TRIS-Buffered Saline, buffer Tris salino 
 TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina 
 ThT tioflavina T 
 TNF- Tumor Necrosis Factor-, factor de necrosis tumoral- 
Índice 
Introducción 1-20 
I. Eritropoyetina 1 
Estructura de la eritropoyetina 1 
Sitios de síntesis de la eritropoyetina 3 
Regulación de la expresión de la eritropoyetina 3 
Receptores y vías de señalización de la eritropoyetina 4 
 Receptor de eritropoyetina 4 
 Vías de señalización 7 
 PI3K/AKT 7 
 MAPKs 8 
 Factores de transcripción STAT 8 
 Terminación de la señalización iniciada por eritropoyetina 8 
Actividad biológica de la eritropoyetina 10 
 En células eritroides 10 
 Apoptosis en el control de la eritropoyesis 10 
 Eritropoyetina en tejidos no hematopoyéticos 12 
Usos clínicos de la eritropoyetina humana recombinante 13 
Resistencia a la eritropoyetina 14 
II. Hipermocisteinemia: Homocisteína y homocisteína tiolactona 15 
Homocisteína 15 
Hiperhomocisteinemia 16 
Homocisteína tiolactona 17 
Adenosina 18 
 
Hipótesis y Objetivos 21-22 
Hipótesis 21 
Objetivo general 21 
Objetivos específicos 21 
 
Materiales y métodos 23-41 
I. Equipos, software y reactivos 23 
I.1 Equipos 23 
I.2 Servicios 23 
I.3 Software 23 
I.4 Reactivos y anticuerpos 24 
I.5 Calidad del agua 25 
I.6 Esterilización de materiales y soluciones 25 
I.7 Descarte de residuos peligrosos y patogénicos 25 
II. Cultivos celulares 25 
Índice 
II.1 Cultivos de líneas celulares 25 
 Células UT-7 25 
 Células K562 26 
 Células EA.hy926 26 
II.2 Criopreservación de líneas celulares 26 
 II.2.1 Congelamiento de células 26 
 II.2.2 Descongelamiento de células 26 
III. Protocolos 27 
III.1 Diferenciación celular 27 
 III.1.1 Preparación de la solución de hemina 27 
 III.1.2 Evaluación de la diferenciación celular. Reacción con 2,7-diaminofluoreno 27 
III.2 Estudios de proliferación y viabilidad celular 28 
 III.2.1 Recuento en cámara de Neubauer con azul Tripán 28 
 III.2.2 Ensayo de MTT 28 
III.3 Apoptosis celular 29 
 III.3.1 Marcación de núcleos apotóticos con colorante Hoechst 33258 29 
 III.3.2 Traslocación de fosfatidilserina 29 
 III.3.3 Antígeno intracelular (caspasa 3) 29 
 III.3.4 Despolarización de la membrana mitocondrial 30 
III.4 Electroforesis, tinción de plata y Western blotting 30 
 III.4.1 Extracción de proteínas 30 
 III.4.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas (PAGE) 
 y desnaturaizantes (SDS-PAGE) 30 
 III.4.3 Revelado por tinción de plata 31 
 III.4.4 Electrotransferencia de proteínas 32 
 III.4.5 Western blotting 32 
III.5 Cuantificación de RNA mensajero 32 
 III.5.1 Extracción y purificación de ARNm 32 
 III.5.2 Pasaje a ADN complementario 33 
 III.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR) 33 
 RT-PCR de punto final 33 
 Electroforesis en gel de agarosa y revelado 34 
 RT-PCR en tiempo real (real-time RT-PCR) 34 
III.6 Determinación de la masa molecular de la eritropoyetina por MALDI-TOF MS 35 
III.7 N-homocisteinilación de la eritropoyetina 37 
 III.7.1 Reacción de Ellman 37 
 III.7.2 Análisis por Espectrometría de Masa 37 
 Análisis de datos de MS 38 
 III.7.3 Electroforesis capilar de zona e isoelectroenfoque capilar 38 
 Electroforesis capilar de zona (ECZ) 38 
 Isoelectroenfoque por electroforesis capilar (CIEF) 39 
Índice 
 III.7.4 Dicroismo circular (CD) 39 
 III.7.5 Ensayo de rojo Congo 39 
 III.7.6 Estudio de emisión de fluorescencia 40 
 Fluorescencia intrínseca 40 
 ANS 40 
 Tioflavina T (ThT) 40 
 III.7.7 Ensayo de dispersión de luz dinámica (DLS) 41 
III.8 Análisis estadístico 41 
 
Resultados y discusión 42-92 
Capítulo I. Estudio del efecto de la N-homocisteinilación en la función y 
 estructura de la eritropoyetina 42-62 
I.1 N-homocisteinilación de la eritropoyetina recombinante humana 42 
 I.1.1 Determinación de grupos sulfhidrilos libres 42 
 I.1.2 Análisis por espectrometría de masa 44 
I.2 Efecto de la N-homocisteinilación de la eritropoyetina en sus funciones 
 proliferativa y antiapoptótica 44 
 I.2.1 Proliferación celular 44 
 I.2.2 Efecto antiapoptótico 48 
I.3 Análisis estructural de la eritropoyetina luego de N-homocisteinilación 48 
 I.3.1 Movilidad electroforética de la eritropoyetina N-homocisteinilada 48 
 Electroforesis capilar de zona e isoelectroenfoque 48 
 Electroforesis en geles de poliacrilamidaen condiciones nativas 
 y desnaturalizantes 50 
 I.3.2 Análisis de dicroísmo circular UV-cercano y UV-lejano de la eritropoyetina 
 N-homocisteinilada 52 
 I.3.3 Ensayo de rojo Congo y estudio de emisión de fluorescencia intrínseca, ANS 
 y tioflavina T 54 
 Fluorescencia intrínseca 54 
 Ensayo de ANS 54 
 Ensayo de rojo Congo y tioflavina T 55 
 I.3.4 Dispersión de luz dinámica 56 
I.4 Conclusiones 58 
Discusión Capítulo I 59 
Capítulo II. Participación de homocisteína y adenosina en la resistencia 
 al tratamiento con eritropoyetina 63-78 
II.1 Efecto de homocisteína, homocisteína tiolactina y adenosina 
 en la actividad metabólica de células eritroides 63 
II.2 Efecto de homocisteína y adenosina en condiciones proinflamatorias 
 sobre la viabilidad de células eritroleucémicas 65 
Índice 
 II.2.1 Actividad metabólica y apoptosis en células K562 indiferenciadas 65 
 II.2.2 Efecto sobre la diferenciación, metabolismo celular y apoptosis 
 de células K562 diferenciadas 66 
II.3 Mecanismos involucrados en la apoptosis celular mediada por homocisteína 
 y adenosina en condiciones proinflamatorias 69 
 II.3.1 Células K562 indiferenciadas 69 
 II.3.2 Células K562 diferenciadas 71 
II.4 Conclusiones 73 
Discusión capítulo II 75 
Capítulo III. Efectos celulares diferenciales en tratamientos 
 con bajas y altas concentraciones de eritropoyetina 79-92 
III.1 Efecto de altas concentraciones de eritropoyetina sobre la migración 
 de células endoteliales 79 
III.2 Efecto de altas concentraciones de eritropoyetina sobre líneas celulares 
 con capacidad de diferenciación eritroide 80 
 III.2.1 Efecto de altas concentraciones de eritropoyetina sobre la actividad 
 celular de la línea UT-7 81 
 III.2.2 Efecto de altas concentraciones de eritropoyetina sobre la actividad 
 celular de la línea K562 82 
 III.2.3 Investigación de las causas por las que se modifica la acción 
 de eritropoyetina a diferentes concentraciones 82 
 Expresión del receptor de eritropoyetina 82 
 Expresión de Bcl-xL 84 
 Ciclo de activación celular 85 
 Actividad del proteasoma 86 
III.3 Conclusiones 87 
Discusión Capítulo III 89 
 
Consideraciones finales 93-95 
 
Referencias 96-107 
 
 
 
 
 
 
Introducción 
Introducción 
1 
 
I. Eritropoyetina 
 
En 1906, Carnot y Deflandre observaron un aumento en el número de glóbulos rojos en 
conejos luego de inyectarles suero de animales anémicos y propusieron la existencia de un 
factor humoral responsable de la producción de los mismos. Bonsdorff y Jalavisto, en 1948, 
denominaron a este factor humoral eritropoyetina, haciendo hincapié en la capacidad de 
producción de eritrocitos. 
La primera purificación de eritropoyetina (Epo) a partir de orina de pacientes se realizó en 
1977 (Miyake et al., 1977) permitiendo, luego, la clonación del gen EPO (Jacobs et al., 1985; Lin 
et al., 1985). Esto inició una era de investigación sobre la biología y fisiología de la Epo, 
permitiendo la generación de eritropoyetina recombinante humana y su uso para tratar 
diversos tipos de anemia. 
 
Estructura de la eritropoyetina 
La eritropoyetina humana es una glicoproteína ácida perteneciente a la familia de las 
citoquinas entre las que se encuentran interleuquinas 2-7, prolactina y los llamados “Factores 
estimulantes de colonias” G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), M-CSF (macrophage 
colony-stimulating factor) y GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor). 
Existe una sola copia del gen de la Epo humana ubicado en el brazo largo del cromosoma 7 
(7q11-22). El transcripto consiste en cinco exones y cuatro intrones, codificando para una 
proteína precursora de 193 aminoácidos. 
El péptido sufre el clivaje de la secuencia secretoria N-terminal, compuesta de 27 aminoácidos, 
y de la Arg166 en su extremo carboxilo terminal, dando como resultado una proteína madura 
de 165 aminoácidos, con dos puentes disulfuro entre Cys7-Cys161 y Cys29-Cys33 (Wang et al., 
1985) (Figura A). 
La Epo presenta tres N-glicosilaciones en las Asn24, Asn38 y Asn83 y una O-glicosilación en 
Ser126. La masa molecular del péptido maduro se calcula en 18 kDa, mientras que el de la 
glicoproteína completa asciende a 30 kDa. 
Estudios de la estructura secundaria de la Epo mediante dicroísmo circular estiman un 50 % de 
presencia de estructuras α-hélice (Lai et al., 1986), presentando un arreglo espacial de cuatro 
ubicadas de a pares de forma antiparalelas. Esta conformación es similar a lo que se observa 
para otros factores de crecimiento hematopoyéticos (Figura B). 
Introducción 
2 
 
 
Figura A. Estructura primaria de la eritropoyetina humana. Se observan las N-glicosilaciones 
(CH)n en los residuos Asn24, Asn38 y Asn83 y la O-glicosilación, (CH)o, en el residuo Ser126. La 
Arg166 es clivada antes de que la eritropoyetina sea liberada a circulación. Imagen obtenida de 
Ng et al., 2003. 
 
Figura B. Estructura secundaria de la eritropoyetina humana. Se observan los pares de -
hélice antiparalelas. También, las glicosilaciones que ocurren postraduccionalmente. Las 
estructuras más ramificadas corresponden a las N-glicosilaciones de los residuos Asn24, Asn38 
y Asn83. Mientras que la estructura más pequeña corresponde a la O-glicosilación en el 
residuo Ser126. El código de formas y colores ejemplifica la composición de las glicosilaciones. 
Imagen adaptada de Wu et al., 2006. 
 
La conservación de los sitios de glicosilación en Epo en distintos animales sugiere la 
importancia de los mismos, que se encuentran relacionados con la biosíntesis, estructura 
terciaria y actividad biológica de la molécula. 
Introducción 
3 
 
La función de la O-glicosilación todavía no fue definida, mientras que para los motivos N-
glicosilados se determinaron tres unidades funcionales con roles específicos (Ng et al., 2003): 
 El núcleo principal está formado por glucosamina y manosa y ayuda a mantener la 
estructura del polipéptido. 
 La porción ramificada presenta ramificaciones de glucosamina, confiere estabilidad a 
la Epo en circulación y el grado de ramificación correlaciona positivamente con la 
actividad biológica in vivo de la Epo. 
 El componente terminal contiene ácido siálico, unidades repetidas de poli-N-
acetillactosamina y galactosa, interviene en la capacidad de Epo de unirse a su 
receptor e interaccionar con otras moléculas y correlaciona directamente con la 
actividad in vivo de Epo. 
La eritropoyetina recombinante humana (rHuEpo) presenta la misma estructura primaria y 
sitios de glicosilación que la endógena. Sin embargo, los diferentes tipos de rHuEpo presentan, 
entre ellos, distinto grado de glicosilación, lo que conduce a diferencias farmacocinéticas y 
farmacodinámicas. 
 
Sitios de síntesis de eritropoyetina 
Durante el estadio fetal, la Epo es producida por los hepatocitos. Inmediatamente después del 
parto, el riñón se convierte en el principal órgano productor de Epo. Los mecanismos 
involucrados en este switch todavía son desconocidos. 
A partir de ensayos de hibridación in situ y con ratones transgénicos se determinó que las 
células productoras de la Epo circulante son las células tipo fibroblastos peritubulares de la 
corteza renal. En el hígado, segundo órgano productor de Epo en los adultos, se determinaron, 
mediante inmunomcarcación, dos poblaciones celulares como lugares de síntesis de Epo: los 
hepatocitos y células de Ito (Maxwel et al., 1997). Además, se han detectado niveles de ARN 
mensajero (ARNm) de Epo en pulmón, bazo, cerebro y testículos. La producción de Epo en 
estos dos últimos órganos parece estar separada de la Epo sistémica mediante las barreras 
hematoencefálica y hematotesticular, respectivamente, sugiriendo una acción de tipo 
paracrina para la Epo sintetizada en estas locaciones independiente a la eritropoyesis (Lappin,2003). 
 
Regulación de la expresión de eritropoyetina 
La regulación de la expresión de Epo es a nivel del ARNm. El gen de Epo en el riñón presenta en 
su región 5’ una secuencia regulatoria denominada elemento de respuesta a hipoxia (hypoxia 
response element, HRE) a la cual se pueden unir los factores de transcripción inducibles por 
hipoxia (HIF). Los factores HIF son heterodímeros que incrementan la transcripción de varios 
genes al unirse al ADN en regiones consenso 5´-RCGTG-3’. Estos factores están constituidos 
por dos subunidades llamadas HIF- y HIF-. Debido a que la expresión del HIF- es 
constitutiva, la actividad del HIF puede ser regulada exclusivamente por la expresión del HIF-. 
El HIF- tiene un dominio de degradación altamente sensible al oxígeno que regula su 
Introducción 
4 
 
estabilidad. Se ha postulado al factor de transcripción HIF-2 (HIF-2α + HIF-1β) como el principal 
inductor de Epo (Haase, 2010; Jelkmann, 2013). 
En normoxia, la proteína HIF-2α es rápidamente degradada por el proteasoma tras su unión 
con la proteína von Hippel-Lindau (pVHL). Esta unión se debe a que HIF-2α es hidroxilada en 
dos residuos prolina (Pro405 y Pro531) mediante una hidroxilasa dependiente de hierro y 
oxígeno. 
En hipoxia, HIF-2α no puede ser hidroxilada, trasloca al núcleo donde dimeriza con HIF-1β y 
reclutan al coactivador p300. Este complejo se une a la secuencia regulatoria HRE y estimulan 
la transcripción del gen de Epo (Jelkmann, 2013) (Figura C). 
 
 
Figura C. Regulación del gen de la eritropoyetina. Modificado de Maltaneri, 2018. 
 
En la región 5’ del gen de Epo se encuentran, también, regiones inhibidoras correspondientes a 
los sitios de unión para GATA-2 y NF-B. La actividad de ambos factores se ve aumentada en 
presencia de las citoquinas interleuquina (IL)-1β y TNF- (Tumor Necrosis Factor-), lo que 
explicaría la presencia de anemia en pacientes con enfermedades asociadas a inflamación 
crónica (La Ferla et al., 2002). 
 
Receptores y vías de señalización de la eritropoyetina 
Receptor de eritropoyetina 
El receptor de Epo (EpoR) pertenece a la superfamilia de los receptores de citoquinas al igual 
que los receptores de otros factores de crecimiento hematopoyético como hormona de 
crecimiento, prolactina, trombopoyetina, GM-CSF y varias interleuquinas. El EpoR humano 
Introducción 
5 
 
completo, que consta de 508 aminoácidos, posee un peso molecular aproximado de 55-56 
kDa. En la Figura D pueden identificarse los siguientes dominios que conforman al EpoR (Farrel 
y Lee, 2004): 
 Dominio extracelular: conformado por 226 aminoácidos con dos pares de cisteínas 
conservados y el motivo WSXWS (Trp–Ser-X–Trp–Ser) conservado cerca de la 
membrana celular. Este fragmento es importante para la unión de Epo y la 
internalización de EpoR. 
 Dominio transmembrana: formado por 23 aminoácidos. 
 Dominio intracelular: conformado por 235 aminoácidos y carente de actividad 
catalítica. Presenta tres motivos altamente conservados Box 1, Box 2 y la región entre 
ellos, involucrados en la asociación de EpoR con la quinasa JAK2. 
 
 
Figura D. Estructura del receptor de eritropoyetina. El EpoR presenta diversas regiones 
conservadas en sus distintos dominios. En la región extracelular se encuentra la secuencia 
WSXWS involucrada en la unión del ligando e internalización del receptor. En la región 
intracelular se encuentran las regiones Box 1 (residuos 257-264), Box 2 (residuos 303-309) y el 
residuo Tyr343, involucrados en la iniciación de la cascada de señalización. Esto lleva a la 
fosforilación de 8 tirosinas, marcadas en la imagen, que sirven como sitios de anclaje para 
otras proteínas. En la región distal del dominio intracelular se encuentra una región regulatoria 
negativa. La activación de las fosfatasas SHP (Src-homology phosphatase) 1 y 2 es un ejemplo 
de mecanismo de regulación negativo. Adaptada de Dame, 2003. 
 
La unión de Epo con su receptor ocurre en una región hidrofóbica (Phe93, Met150 y Phe205) 
considerada como “epitope funcional”. La dimerización de dos subunidades EpoR provoca 
Introducción 
6 
 
cambios conformacionales del dominio extracelular que llevan al acercamiento de las quinasas 
JAK2 asociadas a cada uno. Este acercamiento provoca su transfosforilación en los residuos 
Tyr1007, perteneciente al loop de activación de JAK2 y su consecuente activación 
(Constantinescu et al., 1999). 
En condiciones normales, la concentración de Epo en sangre es de aproximadamente 5 pM y 
puede aumentar hasta 100 veces en situaciones de hipoxia detectadas por el riñón (Brines y 
Cerami, 2008). La Epo se une al homodímero de EpoR expresado en la membrana de los 
progenitores eritroides con una afinidad de 100 pM. En tejidos bajo situaciones de hipoxia o 
estrés metabólico pueden detectarse concentraciones locales de Epo mayores a la de la 
sangre. 
Brines y colaboradores (2004) mostraron que la actividad protectora de la citoquina en tejidos 
no eritropoyéticos es mediada por un receptor conformado por EpoR y β-common (βcR), este 
último, integrante de los receptores GM-CSF y de las interleuquinas 3 y 5 (Figura E). 
La afinidad de Epo por este receptor alternativo es menor (1-20 pM) que la de la citoquina por 
el homodímero EpoR2, por lo que resulta necesario administrar mayores dosis de Epo para 
lograr el efecto citoprotector. Esta diferencia farmacológica reduce la posibilidad de la Epo de 
origen renal de desencadenar los efectos citoprotectores locales observados en tejidos no 
hematopoyéticos (Brines y Cerami, 2005). 
 
 
Figura E. Receptores clásico y alternativo de eritropoyetina. (A) Epo ejerce su efecto 
eritropoyetico mediante un receptor homodimérico. Constituido por dos subunidades EpoR 
estabilizadas por un mecanismo de cierre de leucinas. (B) En algunos tejidos, la actividad 
protectora de Epo se encuentra mediada por el heteroreceptor constituido por subunidades 
EpoR y cR (CD131). cR se presenta como un dímero antiparalelo. Sendas subunidades de 
EpoR se asocian con cada cR mediante una unión de cisteína. Imagen adaptada de Brines y 
Cerami, 2008. 
 
 
 
 
Introducción 
7 
 
Vías de señalización 
La interacción entre Epo y su receptor genera cambios conformacionales que llevan a la 
transfosforilación de la quinasa JAK2 (Witthuhn et al., 1993). Al activarse, esta quinasa fosforila 
8 residuos lisina en la región citoplasmática del EpoR (Frank, 2002), convirtiéndolas en sitios de 
reclutamiento para varias proteínas que contienen el dominio SH2 (Src homology-2) las que, 
luego, inician diversos caminos de señalización (Figura F). 
 
 
Figura F. Vías de señalización de la eritropoyetina. La unión de Epo con su receptor induce la 
activación de la quinasa JAK2, la cual fosforila al receptor en 8 residuos lisina. Éstas funcionan 
como sitios de anclaje para proteínas, como las STAT (STAT1, 3 y 5), MAPKs (RAS/RAF/ERK) y 
PI3K/AKT, que desencadenan diversas vías de señalización, las cuales favorecen la expresión de 
genes antiapoptóticos (Bcl-xL), inhiben genes proapoptóticos (BIM, TRAIL) y favorecen la 
proliferación y diferenciación de los progenitores eritroides. Adaptado de Chateauvieux et al., 
2011. 
 
PI3K/AKT 
Una de las vías de señalización de EpoR involucra a las quinasas fosfatidil inositol 3 (PI3K) y 
AKT. PI3K presenta una subunidad catalítica p100 y una subunidad regulatoria p85, la cual se 
une directamente a EpoR mediante su Tyr479 (Gobert et al., 1995). La activación de PI3K lleva 
a la fosforilación de AKT, activando diversas proteínas involucradas en la regulación de la 
eritropoyesis. Un ejemplo es la fosforilación S310 del factor de transcripción GATA-1, que no 
Introducción 
8 
 
solo regula genes específicos eritroides sino que también aumenta la transcripción del gen 
antiapoptótico Bcl-xL. La fosforilación de FOXO3A (forkhead box O3A) mediada por AKT lleva a 
la inhibición de la transcripción de sus genes blanco como los delinhibidor de ciclo celular 
p27Kip1 y de la quinasa dependiente de ciclinas (CDK). Otros genes blanco de FOXO3A son los 
factores proapotóticos BIM (de la familia de Bcl2) y TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing 
ligand). AKT también fosforila a mTOR (mammalian target of rapamycin) que interacciona con 
FOXO3A para controlar la producción y maduración de células eritroides (Zhang et al., 2014). 
MAPKs 
La proteína adaptadora Grb2 lleva a la activación de las quinasas Ras y Raf, las que finalmente 
activan la vía de MAP quinasas. Raf1 está involucrada en la actividad proliferativa y 
antiapoptótica de Epo, ya que inhibe la actividad de caspasa 3. La activación de MAPKs es 
necesaria para la diferenciación eritroide modulada por Epo (Nagata et al., 1998). 
Factores de transcripción STAT 
Los factores de transcripción STAT (signal transducer and activator of transcription) se unen a 
las tirosinas fosforiladas de EpoR donde son fosforilados por JAK2. Esto posibilita su 
dimerización y activación de su función como factores de transcripción. Epo activa los factores 
STAT1, STAT3 y STAT5a/b (Kirito et al., 1998). La vía clásica de Epo en células eritroides es 
JAK2/STAT5, involucrada en la capacidad antiapoptótica ya que aumenta la expresión del gen 
de Bcl-xL (Socolovsky et al., 2001). 
Terminación de la señalización iniciada por eritropoyetina 
La activación del EpoR debida a la unión de su ligando lleva a ubiquitinación, internalización y 
degradación. Se ha reportado que la unión con su ligando induce cambios conformacionales en 
el EpoR suficientes para promover su internalización. La duración y magnitud de la acción de 
Epo está mediada por esta endocitosis. También, las tirosinas fosforiladas debido a la 
activación de JAK2, sirven como sitios de unión de distintas fosfatasas que intervienen en la 
finalización de la señal (Figura G). 
Se ha demostrado la participación de las fosfatasas SHP-1 y SHP-2 (Src-homology phosphatase) 
en la finalización de la señal de EpoR (Klingmüller et al., 1995). A su vez, trabajos de nuestro 
laboratorio (Callero et al., 2007 y Chamorro et al., 2015) mostraron la participación de la 
proteína tirosina fosfatasa 1B (PTP1B) en la terminación de la señal de Epo en células 
eritroides. 
Otro grupo de proteínas importantes en la regulación de la señal de citoquinas son los 
supresores de señal de citoquinas (SOCS, suppressor of cytokine signaling proteins). SOCS 1 y 3 
son inducidas por Epo y pueden unirse al EpoR una vez activado. Ambas pueden inhibir la 
acción de JAK2 y poseen una región, SOCS box, que sirve como sitio de unión para el sistema 
de ubiquitina-transferasa necesario para la internalización del EpoR activado (Yoshimura et al., 
2005). 
La ubiquitinación contribuye al control del proceso por el cual las proteínas sufren 
degradación, internalización y direccionamiento de las proteínas internalizadas hacia 
Introducción 
9 
 
endosomas y lisosomas. La poliubiquitinación del EpoR, que ocurre rápidamente al unirse la 
Epo, es probablemente responsable de la proteólisis de los receptores por los proteasomas 
que remueven una parte significativa del dominio intracelular. Después de la internalización, 
ambos componentes del complejo, Epo y EpoR son degradados por los lisosomas, aunque 
algunos EpoR son reciclados nuevamente hacia la membrana (Walrafen et al., 2005). En este 
contexto, ya se había reportado que el proteasoma controla el proceso de downregulation del 
EpoR en células estimuladas por Epo mediante inhibición del reemplazo en la superficie celular 
de los EpoR internalizados (Verdier et al., 2000). 
En el tráfico que sufre el EpoR durante el complejo proceso de su regulación negativa se ha 
descripto la participación de varios reguladores. La ubiquitina ligasa -TRC se une al dominio 
DSG del EpoR modulando los niveles de expresión del receptor, NOSIP/p33RUL es otra 
ubiquitina ligasa activada por Epo que interactúa con el EpoR y p85- parece estar involucrada 
en la desaparición del EpoR de la membrana inducida por Epo (Wojchowski et al., 2010). 
Estos parámetros cumplen un rol fundamental en la respuesta celular a señales extracelulares 
y su desregulación ha sido asociada a patologías humanas, como el cáncer. 
 
 
Figura G. Terminación de la señal de eritropoyetina. JAK2 es regulada negativamente por las 
proteínas tirosinas fosfatasas CD45 y PTP1B. La fosfatasa SHP-1 se une a la Y429 y a la Y431 del 
EpoR. La activación de STAT por Epo lleva a la transcripción de genes que codifican para las 
proteínas CIS y SOCS. CIS y SOCS3 compiten con STAT-5 por la unión a la Y401, SOCS1 y SOCS3 
se unen al loop de activación de JAK2. SOC3 al unirse al EpoR, favorece la ubiquitinación, 
Introducción 
10 
 
internalización y degradación por proteasoma. En el gráfico STAT simboliza STAT1, STAT3 y 
STAT5. También se indica la regulación de PI3K por SHIP. Las P y líneas verdes representan 
eventos de fosforilación. Las líneas rojas indican desfosforilaciones. 
 
Actividad biológica de la eritropoyetina 
En células eritroides 
En la médula ósea de los adultos, la Epo actúa sinérgicamente con otros factores de 
crecimiento (stem cell factor SCF, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-9 e insulin-like growth factor IGF-1) 
para favorecer la maduración de los progenitores eritroides. Los primeros progenitores 
comprometidos con el linaje eritroide son las células BFU-E (burst-forming unit-erythroid), 
quienes presentan una alta capacidad proliferativa y pocos receptores para Epo. Los siguientes 
estadios madurativos son las células CFU-E (colony-forming unit-erythroid) y proeritroblastos, 
donde se da el pico de expresión del EpoR (Figura H). En estos estadios, Epo actúa como un 
factor de supervivencia favoreciendo la proliferación y evitando la apoptosis de los precursores 
eritroides (Elliot y Sinclair, 2012). 
 
 
Figura H. Función eritropoyética de la eritropoyetina. En la médula ósea, la expresión del 
EpoR alcanza su máxima expresión en los precursores eritroides BFU-E, CFU-E y 
proeritroblastos. Estos últimos estadios presentan una dependencia de Epo vinculada con su 
acción proliferativa y antiapotótica. Imagen adaptada de Elliot y Sinclair, 2012. 
 
Apoptosis en el control de la eritropoyesis 
La apoptosis ocurre de forma normal durante el desarrollo y envejecimiento y como 
mecanismo de homeostasis para mantener el número de células en los tejidos (Elmore, 2007). 
Es un mecanismo genéticamente controlado y dependiente de energía. Las células apotóticas 
se pueden detectar por cambios morfológicos, tales como contracción celular, cambios en la 
membrana plasmática que llevan a la formación de cuerpos apoptóticos, condensación y 
fragmentación del núcleo celular. Estas células son fagocitadas por macrófagos evitando la 
liberación de citoquinas porinflamatorias. 
La apoptosis es controlada por un balance entre factores proapotóticos y antiapoptóticos 
mediado por señales externas (Kumar y Cakouros, 2004). En algunos casos, las células tienen 
Introducción 
11 
 
un programa apoptótico por default que debe ser bloqueado por la señal de un factor de 
crecimiento u hormona, como es el caso de la Epo y los progenitores eritroides (Testa, 2004). 
Como se mencionó anteriormente, se sabe que la eritropoyesis es un proceso complejo de 
varios pasos que abarca la diferenciación de las células madre hemopoyéticas hasta los 
eritrocitos maduros. Una homeostasis normal del sistema eritropoyético requiere un equilibrio 
apropiado entre la tasa de producción de células eritroides y la destrucción de glóbulos rojos. 
Es conocido que el mecanismo apoptótico juega un papel relevante en el control de la 
eritropoyesis en condiciones fisiológicas y patológicas. Diversas caspasas son fisiológicamente 
activadas durante la diferenciación eritroide y son funcionalmente necesarias para la 
maduración eritroide (Testa, 2004). Los estudios sobre la eritropoyesis normal han indicado 
claramenteque los precursores eritroides inmaduros son sensibles al desencadenamiento 
apoptótico mediado por la activación de las vías apoptóticas intrínsecas y extrínsecas (Figura 
I). Estos mecanismos apoptóticos se exacerban con frecuencia en algunas afecciones 
patológicas, asociadas con el desarrollo de anemia. 
 
 
Figura I. Vías extrínseca e intrínseca de la apoptosis. La vía extrínseca se activa por la unión 
de factores de muerte (FasL, TNF-) a su receptor. Diversas proteínas se asocian al receptor 
activado formando el complejo DISC (death-inducing signalling complex). DISC se forma por la 
asociación homóloga entre los dominios de muerte de Fas y FADD (azul) y entre el dominio de 
muerte efector (death-effector domain, DED) de FADD y procaspasa 8. Luego de la formación 
del complejo se produce el clivaje y activación de la caspasa 8. En la vía intrínseca, agentes 
citotóxicos o privación de citoquinas activan a las proteínas BH3-only que directamente (o 
Introducción 
12 
 
indirectamente al antagonizar con Bcl-2) inducen la oligomerización de Bax-Bak lo que lleva a 
la liberación de citocromo c de la mitocondria. El citocromo c se une a la Apaf-1 formando el 
apoptosoma y activando a la caspasa 9. Tanto la caspasa 8 como la caspasa 9 activan a la 
caspasa 3, la cual cliva los sustratos necesarios para llevar a cabo la apoptosis. Adaptada de 
Nagata, 2018. 
 
Eritropoyetina en tejidos no hematopoyéticos 
Como se mencionó anteriormente, la función fisiológica primaria de la Epo es estimular la 
producción de células progenitoras eritroides para proporcionar un suministro adecuado de 
glóbulos rojos y, por lo tanto, de oxígeno a los tejidos. Sin embargo, existen evidencias 
revelando roles menos estudiados de la señalización Epo/EpoR más allá del sistema 
eritropoyético. Estos hallazgos surgieron a partir del descubrimiento del EpoR en distintos 
tejidos incluyendo cerebro, células endoteliales, retina, células progenitoras de músculo, 
pulmón, corazón, hígado, miocardio, adipocitos, macrófagos y páncreas (Brines et al., 2004; 
Noguchi et al., 2008; Choi et al., 2010; Teng et al., 2011). 
Dentro de las acciones no eritropoyéticas se encuentra, por ejemplo, la angiogénesis 
estimulada por Epo en células endoteliales. Se demostró que la Epo ayuda a mantener el tono 
vascular al aumentar la producción de óxido nítrico endotelial mediante la modulación de la 
expresión de la óxido nítrico sintetasa endotelial (eNOS) (Beleslin-Cokic et al., 2004 y Beleslin-
Cokic et al., 2011). También se observó en modelos con ratas que la Epo favorece la 
angiogénesis ya que actúa sobre los progenitores endoteliales favoreciendo su migración y 
neovascularización (Westenbrink et al., 2007; Cakiroglu et al., 2016). 
Epo también proporciona neuroprotección durante el estrés isquémico/hipóxico a través de la 
producción de Epo inducida por estrés y la expresión de EpoR en el cerebro para ejercer los 
efectos antiapoptótico y antiinflamatorio. En un estudio preclínico realizado en ratones, la 
Epo previno la apoptosis celular causada por hipoxia frente a una herida isquémica o 
inflamación (Thériault et al., 2016). La falta de EpoR en ratones durante la embriogénesis 
provoca una reducción en el número de células progenitoras neurales y apoptosis en el 
sistema nervioso (Yu et al., 2002; Alnaeeli et al., 2012). Los estudios en animales y humanos 
mostraron que la Epo tiene un impacto en la diferenciación de las células neuronales y es 
esencial para el desarrollo neurológico normal (Rangarajan y Juul, 2014; Zhu et al., 2009). Se 
ha demostrado que la rHuEpo tiene un efecto terapéutico en los lactantes con parálisis 
cerebral durante la rehabilitación activa (Ohls et al., 2014). 
El estrés oxidativo, definido como un estado patológico caracterizado por una mayor 
producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o una menor capacidad para desintoxicar 
ROS, juega un papel causal en la lesión de tejidos en muchas afecciones, incluidas 
enfermedades cardiovasculares, trastornos neurológicos, cánceres y envejecimiento. Ha sido 
reportado que Epo reduce el daño por estrés oxidativo en enfermedades cardíacas 
proporcionando protección cardiovascular (Li et al., 2006). La Epo también tiene efecto 
antioxidante en las células sanguíneas talasémicas (Amer et al., 2006). En pacientes con 
insuficiencia renal en etapa terminal sometidos a diálisis peritoneal ambulatoria continua, el 
Introducción 
13 
 
tratamiento con Epo redujo significativamente la producción de ROS en leucocitos 
polimorfonucleares, lo que puede contribuir al efecto antiinflamatorio (Shurtz-Swirski et al., 
2002). 
Los datos publicados, también confirman el estrecho vínculo entre la señalización Epo/EpoR y 
el metabolismo energético y la homeostasis. La administración de Epo protege a los ratones 
de la obesidad inducida por la dieta, promueve el gasto de energía, reduce la acumulación de 
masa grasa y mejora la intolerancia a la glucosa y la resistencia a la insulina (Hojman et al., 
2009; Katz et al., 2010). 
Aunque estos hallazgos resaltan el posible potencial terapéutico de la Epo en enfermedades 
no hematopoyéticas, todavía queda un largo camino por recorrer antes de que el tratamiento 
con rHuEpo sea implementado en ensayos clínicos para algunas de estas enfermedades. Varios 
de los resultados comentados más arriba han sido obtenidos en ensayos in vitro o realizados 
en animales, sin embargo, los ensayos clínicos en humanos presentan resultados aún poco 
concluyentes. Se requieren más estudios para descubrir el real potencial de acción de Epo en 
los tejidos no hematopoyéticos. 
 
Usos clínicos de la eritropoyetina humana recombinante 
La anemia en las enfermedades renales es un proceso multifactorial. La principal causa es una 
disminución en la producción de la citoquina por parte del riñón. Por eso el uso de la rHuEpo y 
compuestos derivados capaces de estimular la eritropoyesis (erythropoiesis-stimulating 
agents, ESAs) se convirtió en el principal tratamiento contra la anemia asociada a la 
insuficiencia renal crónica. Los ESAs significaron para los pacientes en diálisis dejar de recibir 
transfusiones para poder combatir la anemia mejorando notablemente su calidad de vida 
(Hung et al., 2014). Sin embargo, su uso clínico es complejo dado su inicio de acción retardado 
(2-6 semanas) y la variabilidad de respuestas farmacológicas (Brier y Gaweda, 2011). De hecho, 
las dosis de ESA necesarias para lograr una concentración específica de hemoglobina (Hb) 
puede fluctuar con las circunstancias del paciente, como la ocurrencia de infecciones, 
enfermedades y hospitalizaciones, así como cambios en las reservas de hierro (Kalantar-Zadeh 
y Aronoff, 2009). 
La terapéutica con rHuEpo se ha expandido hacia otros pacientes, indicándose en estados 
anémicos presentes en diferentes patologías como síndromes mielodisplásicos, cáncer, SIDA, 
transplante de médula ósea y, en general, en pacientes con anemia de enfermedades crónicas 
(anemia of chronic disease, ACD) (De Marchi et al., 1993; Biesma, 1999; Bron et al., 2001; 
Damacco et al., 2002). Sin embargo, como fuera mencionado anteriormente, la acción no 
eritropoyética aún está en estudio. Un caso particular es el de la administración de Epo en 
diferentes tipos de cánceres. A pesar de los tratamientos exitosos de la anemia, desde 2003 el 
péndulo del tratamiento con ESA en pacientes con cáncer comenzó a oscilar hacia otro lado. 
Los informes afirmaron que los pacientes con cáncer tratados con ESA tuvieron una 
supervivencia más corta en comparación con los pacientes no tratados. Estos datos han 
provocado una controversia y condujeron a un uso clínico reducido de la hormona. Se han 
Introducción 
14 
 
propuesto tres mecanismos para explicar el peor pronóstico en pacientes con cáncer tratados 
con Epo: A. Activación de receptores de Epo que existen en la superficie de las células 
cancerosas. B. Eventos tromboembólicoscausados por un aumento excesivo de Hb inducido 
por Epo. C. Angiogénesis inducida por Epo que permite que el tumor crezca y se propague 
(Oster et al.,2012). 
 
Resistencia a la eritropoyetina 
La resistencia a ESA o hiporespuesta es un término utilizado para describir a los pacientes que 
requieren dosis de ESA cada vez más altas para mantener una concentración de Hb o que, a 
pesar de recibir dosis elevadas de ESA, no alcanzan la concentración de Hb deseada (Sibbel et 
al., 2015). 
Una de las estrategias para tratar las anemias refractarias o disminuir los tiempos de aplicación 
fue incrementar las dosis de ESAs (Hung et al., 2014). Sin embargo, el aumento de la dosis de 
ESA en hiporespondedores tiene poco efecto para contrarrestar la anemia (Gaweda et al., 
2010). Diversos ensayos clínicos asociaron el uso de altas dosis de ESAs con riesgos 
cardiovasculares (McCullough et al., 2013), debido principalmente al aumento de la viscosidad 
sanguínea. Otro efecto negativo es el aumento de la presión arterial debido a la acción de Epo 
sobre la producción de endotelina-1, prostaglandina-2 y tromboxanos, y la activación del 
sistema renina-angiotensina (Lee et al., 2007). Streja y colaboradores (2008) sugirieron que el 
uso de ESAs genera mayor mortalidad en pacientes en diálisis debido a trombocitosis reactiva. 
No obstante, dosis alta de ESAs se administran comúnmente a hiporespondedores con un alto 
costo para el sistema de salud en detrimento de los pacientes. 
La anemia presente en la insuficiencia renal crónica ha sido, adjudicada, principalmente, a una 
reducida expresión de Epo debida al daño del parénquima renal. Sin embargo, se ha reportado 
que la anemia persiste en los pacientes aun cuando los niveles de Epo superan alrededor de 
cinco veces los de individuos normales. Esta disparidad es indicativa de la deficiencia en la 
respuesta celular a la Epo (van der Putten, 2008). 
Se considera que, al menos un 10 % de los pacientes con insuficiencia renal crónica son 
resistentes a las ESAs. Este hallazgo es clínicamente importante, porque la resistencia a Epo 
está asociada con mayor riesgo de mortalidad (Zhang et al., 2004; Okazaki et al., 2014). Una 
respuesta insuficiente al tratamiento puede ser multifactorial, siendo la principal causa el 
faltante de hierro, absoluto o funcional (Priyadarshi y Shapiro, 2006). A pesar de la corrección 
de la ferremia se encuentran otros factores que pueden afectar el tratamiento. 
Aproximadamente el 30 % de los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal (End 
Stage Renal Disease, ESRD) presentan un aumento significativo de citoquinas proinflamatorias 
(Kaysen y Kumar, 2003), en parte por una falla en el clearence de las mismas (Dai et al., 2017). 
La condición de inflamación crónica es una de las principales causas de ACD. Una hipótesis 
postula que las citoquinas inflamatorias antagonizan con el accionar de la Epo endógena y 
exógena al inhibir directamente a los precursores eritroides y alterando el metabolismo del 
hierro (van der Puten, 2008). Las citoquinas proinflamatorias, IL-1 y en especial TNF-, 
Introducción 
15 
 
aumentan la expresión de los factores de transcripción GATA-2 y NF-kB los cuales inhiben la 
transcripción del gen de la Epo (La Ferla et al., 2002). El INF-γ inhibe la expresión del EpoR 
haciendo a las células progenitoras susceptibles a la acción apoptótica de las citoquinas 
proinflamatorias (van der Puten, 2008). A su vez, la IL-6 favorece el aumento de la proteína 
reguladora de hierro, hepcidina, generando una disminución de la biodisponibilidad del hierro 
para la eritropoyesis (Nemeth et al., 2004; Wrighting y Andrrews, 2006). 
En los pacientes con ESRD, a medida que la función renal decae, aumenta la retención de 
productos prooxidantes, ocasionando estrés oxidativo, que genera la activación de células 
mononucleares y la estimulación de una respuesta inflamatoria (Locatelli et al., 2003; 
Dounousi et al., 2006). La acumulación de toxinas urémicas, entre las cuales se encuentran las 
citoquinas proinflamatorias, se debe a la pérdida de la función del riñón y se la considera como 
otra causa de resistencia a las ESAs (Nangaku et al., 2015). 
El aumento de algunas de estas “toxinas urémicas” lleva a la modificación de proteínas 
plasmáticas y a la pérdida de función de las mismas. Un ejemplo es la acumulación de cianato, 
derivado de la hidrólisis de urea, que ocasiona la carbamilación espontánea de las proteínas 
circulantes (Kraus et al., 2001). Kalim y colaboradores (2013) demostraron una asociación 
entre la cabamilación de la albúmina con la resistencia a la Epo y evaluaron la presencia de 
albúmina carbamilada como marcador de posible modificación de otras proteínas plasmáticas. 
En nuestro laboratorio demostramos que la carbamilación de Epo conduce a la disminución de 
sus actividades eritropoyética y proangiogénica (Chamorro et al., 2013; Chamorro et al., 2015; 
Maltaneri et al., 2017). A partir de estos hallazgos, se puede sugerir un efecto semejante sobre 
las funciones de las proteínas y, en particular, de la Epo a causa de la acumulación patológica 
de distintas sustancias. Otra toxina urémica que ha sido relacionada con la capacidad de 
modificar la estructura proteica y con elevada presencia en pacientes con ESRD es la 
homocisteína (Perna et al., 2005). 
 
II. Hiperhomocisteinemia: homocisteína y homocisteína tiolactona 
 
Homocisteína 
Niveles elevados de homocisteína (Hcy) en sangre constituyen un factor independiente de 
riesgo cardiovascular (Jourde-Chiche et al., 2011). La Hcy es un aminoácido no esencial 
involucrado en el metabolismo de la metionina, la cual incorpora adenosina trifosfato (ATP) y 
se convierte en S-adenosilmetionina (SAM), principal donante directa de grupos metilo del 
organismo. En reacciones de transmetilación catalizadas por metiltrasferasas (MT), la SAM se 
convierte en S-adenosilhomocisteína (SAH) al ceder un metilo altamente reactivo. SAH es un 
inhibidor competitivo de las metiltransferasas, por lo que el proceso depende de la relación 
SAM/SAH. De forma tal de mantener la capacidad de metilación en una célula, SAH es 
rápidamente transformada en adenosina (Ado) y Hcy por la enzima reversible, SAH-hidrolasa. 
Termodinámicamente está favorecida la formación de SAH a partir de Ado y Hcy, por eso 
ambas son removidas rápidamente para mantener el equilibrio SAM/SAH (Figura J). 
Introducción 
16 
 
La transulfuración de la Hcy ocurre en ciertos tejidos, como hígado y riñón. En esta vía la Hcy, 
luego de la acción de la cistationin-β-sintetasa, se convierte en cisteína. Esta puede convertirse 
en glutatión, taurina o metabolizarse a sulfato y excretarse por orina (Kery et al., 1994). 
Existen dos rutas de remetilación mediante las cuales la Hcy se convierte en metionina por 
ganancia de un grupo metilo. La primera utiliza 5-metiltetrahidrofolato (5-metilTHF) como 
donante de metilo, por acción de la metionin-sintetasa y vitamina B12 como coenzima, 
involucra al ciclo del ácido fólico y es la vía de remetilación preponderante. La otra posee como 
dador de metilo a la betaína y es catalizada por la betain-homocistein-metiltransferasa (Mudd 
et al., 1975). 
 
 
Figura J. Esquema del metabolismo de la homocisteína. La metionina se transforma en S-
adenosilmetionina (SAM). Al ceder metilos para las transmetilasas (MT), SAM se convierte en 
S-adenosilhomocisteina (SAH), la cual es hidrolizada a homocisteína (Hcy) y adenosina (Ado) 
por la SAH hidrolasa. Luego la Hcy puede ingresar a una de las dos vías de remetilación, una 
involucra betaína y betaín-homocistein-metiltransferasa (vía de la izquierda) y la otra al ácido 
fólico y vitamina B12 (derecha). En algunos tejidos existe otra vía de eliminación de Hcy, la 
transulfuración. Esta involucra a la cistationin-β-sintetasa y la conversión final de la Hcy en 
glutation (abajo). Imagen adaptada de Genoud, 2015. 
 
Hiperhomocisteinemia 
Diversosfactores genéticos, nutricionales y otros tales como sexo, edad, drogas y procesos 
patológicos pueden afectar los niveles de Hcy plasmática (Schneede et al., 2000). El aumento 
de la concentración de Hcy en sangre se conoce como hiperhomocisteinemia (HHcy), de la cual 
se han definido tres niveles: leve (13-24 µM), moderada (25-100 µM) y severa (hasta 500 µM) 
Introducción 
17 
 
en comparación con los niveles bajo condiciones normales (5-10 M) (Sharma et al., 2014). La 
HHcy es considerada el desencadenante no solo de enfermedades cardíacas sino también, de 
degeneración de la mácula, enfermedad de Alzheimer, pérdida de la audición y complicaciones 
obstétricas (Kim et al., 2018). 
La prevalencia de HHcy en pacientes que desarrollan ESRD es de un 85 % al 100 % (van 
Guldener et al., 1999). En pacientes en hemodiálisis se asoció la presencia de anemia e HHcy 
con pronóstico negativo (Anees et al., 2010). Una interesante interacción entre Hcy y Epo ha 
sido sugerida en relación con el síndrome de anemia cardio-renal, un complejo desorden 
clínico en el que cada una de las patologías afecta negativamente a las demás, causando la 
progresión de la enfermedad (Righetti, 2012). 
 
Homocisteína tiolactona 
No hay discusión acerca del riesgo cardiovascular que representa la HHcy, aunque en un 
principio se debatía sobre el mecanismo involucrado. A principios del milenio, se propuso que 
el éster cíclico homocisteina tiolactona (HTL) también estaría involucrado en los efectos 
nocivos de la HHcy. 
La HTL se genera por un error de edición de la metionil-tRNA-sintetasa (MetRS). Debido a la 
similitud estructural, en lugar de metionina se introduce Hcy en el sitio activo de la enzima 
(Figura K). Este proceso ocurre en dos pasos. Primero, Hcy reacciona con ATP en el sitio activo 
de la MetRS dando un MetRS-hidrosil adenilato. Luego, el tiolato de la cadena lateral desplaza 
al AMP (adenosil monofosfato) del grupo carboxilo activado de la Hcy dando como resultado el 
éster cíclico, HTL. Al generarse en el sitio activo de la MetRS, la concentración de HTL aumenta 
al aumentar la relación Hcy/Met (Jakubowski, 2000). 
 
 
Figura K. Formación de la homocisteina tiolactona. En un primer paso Hcy reacciona con ATP 
en el sitio activo de la MetRS dando MetRS-hidrosil adenilato (A). En el segundo paso, el tiolato 
de la Hcy desplaza al AMP dando como resultado HTL (B). Figura adaptada de Jakubowski, 
2000. 
 
La Hcy y la HTL son moléculas altamente reactivas, capaces de reaccionar de manera 
espontánea, no enzimática, en condiciones fisiológicas con proteínas y otros compuestos 
biológicos. La Hcy se une mediante puentes disulfuro con los residuos cisteína de diversas 
proteínas, esta reacción se conoce como S-homocisteinilación mientras que el grupo carbonilo 
de HTL forma una unión amida con el grupo ε-amino de los residuos lisina de las proteínas, en 
Introducción 
18 
 
una reacción conocida como N-homocisteinilación (Figura L). Tanto la S-homocisteinilación 
como la N-homocisteinilación se vinculan con cambios estructurales y funcionales de las 
moléculas. 
 
 
Figura L. Reacciones de S-homocisteinilación y N-homocisteinilación. (A) La Hcy se une 
mediante puentes disulfuro con las proteínas. (B) El grupo carboxilo de la HTL reacciona con el 
grupo ε-amino de los residuos lisina de las proteínas. 
 
Perna y colaboradores (2006) demostraron que, en pacientes renales en hemodiálisis, las 
concentraciones de proteínas plasmáticas S-homocisteiniladas y N-homocisteiniladas eran más 
elevadas que en individuos sanos. Por otra parte, los niveles elevados de HTL y de proteínas N-
homocisteiniladas, como consecuencia de alteraciones genéticas, nutricionales o condiciones 
patológicas, han sido asociados con la predisposición a aterotrombosis y anormalidades 
neurológicas. Una hipótesis (Chwatko et al., 2007) propone que la transformación de Hcy en 
HTL, seguida de la modificación postraduccional no enzimática de las proteínas, es el 
mecanismo subyacente que contribuye a la patología observada en la HHcy. 
 
Adenosina 
La adenosina (Ado) es un nucleósido purínico endógeno ubicuo con capacidad regulatoria en 
todos los tejidos del organismo (Borea et al., 2016). La actividad biológica de la Ado es 
mediada por cuatro receptores de membrana pertenecientes a la familia GPCRs: A1, A2A, A2B y 
A3 (Borea et al., 2015). Ado es producida tanto intra- como extra-celularmente mediante la 
acción de enzimas específicas y su concentración extracelular es fuertemente regulada entre 
30-200 nmol/L (Fredholm et al., 2011). 
Fuera de la célula, la Ado es generada a partir del catabolismo de precursores como ATP o 
AMP cíclico (AMPC) por la 5’-nucleotidasa (5´-NT) extracelular (Jackson y Dubey, 2004; Vallon 
et al., 2009). En el interior de la célula, la Ado puede ser generada por dos mecanismos, uno 
consta de desfosforilación del AMP mediado por 5’-NT. El otro camino involucra al proceso de 
metilación. Como fuera ya mencionado en la Figura J, las reacciones de transmetilación utilizan 
SAM como dador de metilo, convirtiéndose en SAH. El destino inmediato de este compuesto 
Introducción 
19 
 
es su hidrólisis a Hcy y Ado. Dado que esta hidrólisis es rápidamente reversible, resulta 
necesario que estos compuestos sean metabolizados en forma eficiente. Los caminos del 
metabolismo de la Hcy involucran transulfuración a cisteína o remetilación a metionina, 
mientras que la Ado es convertida a adenosina fosfato por la adenosilquinasa (AK) o a inosina 
(Ino) por la adenosildeaminasa (ADA). La Ado intracelular también pude ser transportada al 
espacio extracelular vía transportadores bi-direccionales mediante difusión facilitada (Pastor-
Anglada y Pérez-Torras, 2015) (Figura M). 
 
 
Figura M. Metabolismo de la adenosina. Adaptada de Riksen et al., 2005. 
 
Además de la tasa de síntesis extracelular, la investigación también se ha centrado en el 
mecanismo que regula la acumulación externa de Ado, la cual depende de la captación celular. 
Los niveles extracelulares de Ado son finamente regulados por transportadores de nucleósidos 
que equilibran los niveles extracelulares de Ado en las células sanas. Sin embargo, los modelos 
de enfermedad renal crónica muestran un desbalance de este equilibrio con niveles 
persistentemente altos de Ado, lo que afecta las funciones celulares (Oyarzún et al., 2017). Las 
consecuencias más notables del papel patogénico de la señalización de Ado desequilibrada en 
la enfermedad renal crónica son la glomerulopatía (Cárdenas et al., 2013) y la fibrosis renal 
(Kretschmar et al., 2016). Debido a varias limitaciones al cuantificar Ado en muestras 
biológicas, como por ejemplo su vida media corta debido a la acción de diversas enzimas 
ampliamente distribuidas y a la necesidad de contar con equipos complejos como 
espectrómetros de masa o cromatógrafos de alta resolución, la investigación clínica que asocia 
la desregulación de los niveles de Ado con enfermedades es escasa. Sin embargo, existe 
evidencia concluyente recolectada de pacientes diabéticos con insuficiencia renal crónica. Xia y 
colaboradores (2009) mostraron que los niveles dispares de Ado y el producto catabólico 
inosina en el plasma de pacientes con nefropatía diabética son concurrentes con la progresión 
de la enfermedad; mientras que en individuos sanos o en pacientes diabéticos sin daños 
renales se encuentran niveles de Ado dentro de los niveles basales. 
Lo que se conoce a nivel intracelular es que, bajo condiciones de exceso extracelular de Hcy o 
Ado, existe una captación de ambos compuestos y la reversibilidad del sentido de reacción de 
la enzima SAH hidrolasa, causando la acumulación de SAH (Figura N) reduciendo la 
Introducción 
20 
 
disponibilidad de Ado intracelular (Hultberg et al., 2000; Riksen et al., 2005). Esto no solo 
inhibe las reacciones de metilación, sino que se han reportado otros metabolismos afectados 
porel exceso de ambos factores. 
 
 
Figura N. Movilización de adenosina en presencia de exceso de adenosina y/o homocisteína. 
La SAH hidrolasa es una enzima reversible. En presencia de HHcy o exceso de Ado, se favorece 
la formación de SAH. Adaptado de Risken et al., 2005. 
 
En condiciones de hipoxia se ha reportado un aumento en la concentración de Ado, como 
medio de protección tisular, logrando una rápida recuperación a gran altitud (Song et al., 
2017). Sin embargo, el aumento de la concentración de Ado en hipoxia/isquemia hasta niveles 
molares también está asociado con condiciones patológicas que involucran la demanda de 
energía (Fredholm, 2014). 
Por otro lado, durante los procesos inflamatorios, el aumento de Ado lleva al incremento de 
citoquinas proinflamatorias (IL-6, IL-8) (Cekic y Linden, 2016). 
En discrepancia con lo mencionado más arriba, Chen y colaboradores (2002) y Riksen y 
colaboradores (2003) han detectado una disminución de la concentración plasmática de Ado 
en pacientes con HHcy. Ellos sostienen que al aumentar la concentración de Hcy, se favorece la 
producción de SAH reduciendo la disponibilidad de Ado intracelular. Esto ocasiona un cambio 
de sentido del transportador, provocando la entrada de Ado extracelular y finalmente una 
reducción de la actividad biológica de la Ado a través de la unión con sus receptores, siendo 
este otro posible mecanismo patogénico de la Hcy (Riksen et al, 2005). 
Independientemente del mecanismo involucrado, los trabajos concuerdan con la presencia de 
altas concentraciones de SAH durante la enfermedad renal crónica y sugieren que este 
compuesto está implicado en la patogenia de HHcy. 
Considerando las diferencias observadas por varios autores con respecto a la participación de 
Ado en distintos procesos fisiopatológicos, surge el interés por estudiar posibles efectos 
negativos de la acumulación de Ado sobre la actividad de células eritroides, así como un 
posible mecanismo indirecto para explicar el aumento de la sensibilidad de algunos tipos 
celulares a la acción de la Hcy. 
 
 
Hipótesis y 
Objetivos 
Hipótesis y Objetivos 
 
21 
 
El uso de eritropoyetina recombinante (rHuEpo) en el tratamiento de la anemia de 
enfermedades crónicas fue un gran avance para mejorar la calidad de vida de los pacientes, 
principalmente por la eliminación de la necesidad de transfusiones y disminución de la 
mortalidad. Desafortunadamente, una proporción considerable de pacientes con enfermedad 
renal en etapa terminal exhibe una respuesta hematológica subóptima o resistencia al 
tratamiento con Epo, como lo demuestra la persistencia de anemia a pesar de la dosificación 
adecuada o la necesidad de una terapia de Epo en dosis elevadas para lograr el objetivo de 
hemoglobina recomendado. 
Por otro lado, diversos ensayos clínicos advierten sobre los efectos negativos del uso de 
rHuEpo en altas dosis, además de reportar asociaciones entre diferentes toxinas urémicas y 
resistencia a la Epo. Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos involucrados en la 
resistencia al tratamiento o los efectos negativos aún no son claros. 
 
Hipótesis 
 
En base a datos previos que muestran resistencia al tratamiento con rHuEpo asociado a 
diversas patologías, para el desarrollo de esta Tesis Doctoral se plantearon las siguientes 
hipótesis: 
 La acumulación de “toxinas” en sangre, característica de la enfermedad renal terminal, 
sumada a la presencia de citoquinas proinflamatorias, interviene en la resistencia al 
tratamiento con Epo tanto por modificación de la proteína como por intervención en 
su actividad biológica. 
 Altas concentraciones de Epo desregulan la actividad biológica de la citoquina en 
diversos modelos celulares. 
 
Objetivo general 
 
El objetivo general de esta Tesis Doctoral es estudiar la implicancia de factores aún no 
evaluados en la baja respuesta a la Epo y avanzar en el conocimiento de los mecanismos 
moleculares involucrados. La investigación se centró en modelos in vitro de 
hiperhomocisteinemia, en base a estudios que sugieren una posible interacción entre 
homocisteína y otros factores asociados con Epo en la anemia del síndrome cardio-renal. 
 
Objetivos específicos 
A partir del objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos: 
 Estudio de la función proliferativa y antiapoptótica de eritropoyetina modificada por 
N-homocisteinilación en células con capacidad de diferenciación eritroide 
dependientes de Epo, en un marco que relaciona estructura-función. 
Hipótesis y Objetivos 
 
22 
 
 Estudio del efecto de TNF-α sobre distintas funciones de eritropoyetina en presencia 
de homocisteína y adenosina. Investigación de mecanismos de acción en células 
eritropoyéticas inmaduras y hemoglobinizadas. 
 Estudio de la implicancia de altas concentraciones de eritropoyetina sobre su acción 
eritropoyética y antiapoptótica en células con capacidad de diferenciación eritroide y 
sobre su acción proangiogénica en células endoteliales. 
 
 
Materiales y 
Métodos 
Materiales y Métodos 
23 
 
I. Equipos, software y reactivos 
I.1 Equipos 
 Cabina de Bioseguridad de clase II (Nuaire) 
 Centrífuga refrigerada (HERMLE Z323K) 
 Cuba electroforética (Bio-Rad) para PAGE y electrotransferencia 
 Cuba electroforética Liberty 2 (Biokey American Instruments, INC.) para fragmentos de RT-
PCR 
 Digitalizador de imágenes (Amersham Imager 600, GE Healthcare Liffe Sciences) 
 Equipo para la obtención de agua ultra-pura (Millipore Simplicity 185) 
 Espectrofotómetro (Jasco V650) 
 Espectrofluorímetro (Aminco -Bowman) 
 Espectropolarímetro (Jasco J-850), equipado con cubeta Peltier de temperatura controlada 
 Estufa de cultivo (Revco RMI3000S-7VBA) 
 Fuente de poder (EPS 600, Pharmacia) 
 G:BOX Chemi System acoplado a cámara digital (Syngene) 
 Lector de microplacas Modelo 680 (Bio-Rad) 
 Microscopio (Nikon XS100) 
 Microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert 135), con cámara digital acoplada 
(Nikon Coolpix 5000) 
 NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific) 
 Termociclador Little Genius (Bioer Technology Co., LTD) para RT-PCR 
 Termociclador iCycler iQ5 (Bio-Rad) para Real-Time RT-PCR 
 Zetasizer Nano S DLS (Malvern Instruments) para mediciones de dispersión de luz dinámica 
 
I.2 Servicios 
 Citómetro de flujo (FACS ARIA, BD Biosciences, Servicio de Citometría, FCEN, UBA) 
 P/ACETM MDQ Capillary Electrophoresis System (Beckman Coulter), equipado con detector 
de arreglo de diodos (Photo Diode Array, PDA) y filtros de 208 y 214 nm (STAN-IQUIBICEN, 
UBA-CONICET) 
 QExactive Mass Spectrometer acoplado a nanoHPLC EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific, 
servicio del Centro de Estudios Químicos y Biológicos por Espectrometría de Masa, STAN-
CEQUIBIEM, UBA-CONICET) 
 UltraFlex II (Bruker) para MALDI-TOF (servicio del Centro de Estudios Químicos y Biológicos 
por Espectrometría de Masa, STAN-CEQUIBIEM, UBA-CONICET) 
 
I.3 Software 
 Algoritmo K2D3 (http://k2d3.ogic.ca/, cálculo de contribuciones de estructura secundaria) 
 AxionVision (adquisición de microfotografía en visible y fluorescencia, análisis de imágenes) 
 BioRad CFX Manager (análisis de real-time RT-PCR) 
 Cyflogic (análisis de resultados de citometría de flujo) 
 GeneSys (toma de fotografías de geles en G:BOX) 
 GraphPad Prism 6 (gráficos y análisis estadístico) 
 ImageJ (densitometría de geles) 
 32 KaratTMSoftware (análisis de resultados de isoelectroenfoque) 
 RStudio (análisis estadístico) 
 
 
 
Materiales y Métodos 
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I.4 Reactivos y anticuerpos 
Todas las sales, ácidos y solventes utilizados fueron de calidad analítica (Merck, Mallinckrodt, 
Sigma-Aldrich o similar). 
 
Amersham – GE: 
 Membrana de nitrocelulosa 
 
BD Biosciences: 
 Anticuerpo primario anti-caspasa 3 activada, monoclonal, conejo (559565) 
 Kit para detección de apoptosis Anexina V-FITC/Ioduro de propidio 
 Reactivos Cytofix/Cytoperm y PermWash