Tec Enz Parte 3

Vista previa del material en texto

Estado estacionario en la cinética enzimatica
Para la reacción E+S ↔ ES → 
E + P, la gráfica muestra la 
variación de las 
concentraciones de (S), (E), 
(ES) y (P) en función del 
tiempo.
Tras un breve periodo, (ES) 
alcanza un estado estacionario 
en el que ES se consume con 
una velocidad ≈ a la de su 
formación, de modo que 
d(ES)/dt ≈ 0.
• Se han exagerado las concentraciones de E y ES para mayor claridad. 
• Obsérvese que (E)+(ES)=(E0), y que ES disminuye muy lentamente a 
medida que se consume (S), con el correspondiente aumento de (E).
Tiempo
C
on
ce
nt
ra
ci
on
es
(S) (P)
E0
(ES)
(E)
Estado estacionario en la cinética 
enzimatica
• En el estado estacionario las velocidades formación y degradación de ES son 
iguales:
 k
1
(E)(S) = k
-1
(ES) + k
2
 (ES)
Reordenando:
Donde KM es la constante de Michaelis-Menten; esta ecuación puede 
re-escribirse como:
 KM (ES) = (E) (S)
Sustituyendo E0 en la ecuación de arriba:
 (ES) (KM + S) = (E0) (S); 
Sustituyendo (ES) en la expresión de velocidad (V0):
Ecuación de Michaelis-Menten
Estado estacionario en la cinética enzimatica
V0=½Vmax
Vmax
S=KM
(S)V
el
oc
id
ad
 in
ic
ia
l (
V
0)
A concentraciones de S elevadas: (S)>>KM, la reacción se aproxima a 
una velocidad máxima (Vmax) ya que las moléculas de enzima están 
saturadas; es decir, todas las moléculas de E están saturadas con S y 
están realizando el paso catalítico. Por tanto en este momento KM + (S) 
≈ (S), entonces: Vmax= k2(E0)= k2(ES), y: 
Ec. de Michaelis-Menten
Variación de la velocidad de reacción 
en función de la concentración del 
sustrato, según la cinética de 
Michaelis-Menten.
Cuando (S)=KM, la reacción tiene 
exactamente la mitad de su velocidad 
máxima. Hay una aproximación 
asintótica a Vmax. 
[S] y sus relaciones con K
M
• A. [S] <<K
M
 Esto es cuando [S] <0.01 K
M 
 Entonces K
M 
+ S ≈ K
M 
, y la Ec. De Michaelis-Menten queda:
V
0
= V
M
[S]/ K
M 
=k
2 
[E
0
] [S] / K
M 
= k’ [S]
Donde k’ = V
M 
/ K
M. 
Esta ec. funciona bien cuando [S]≤0.05 K
M. 
Esta es una reacción de 
primer orden con respecto a la concentración del sustrato (S).
• B. [S] >>K
M. 
Cuando [S] ≥ 100 K
M
, entonces K
M
 puede ignorarse de la ec. de M.M. , 
y V
0
= V
M 
= k
2 
[E
0
] 
Que describe la situación cuando la E está saturada con el sustrato, y es una reacción de 
orden cero con respecto a la concentración de S.
• C. [S] = K
M
 Sustituyendo en la ec. de M.M. este valor:
Esta es la definición operacional de K
M
. K
M
 es la constante de disociación dinámica bajo 
condiciones de estado estacionario y se acerca a K
s
 que es la constante verdadera de 
disociación, solamente cuando k
2
<< k
-1 
. 
[S] y sus relaciones con K
M
• k
1
 es del orden de 106 a108 M-1s-1que es cercano a 109 M-1s-1 para la máxima 
velocidad de difusión de una molécula pequeña en solución viajando al sitio activo 
de una enzima.
• k
-1
usualmente es menor que k
1 
y varía de entre 101 a 104 s-1. El valor de k
2
 oscila 
entre 101 y 106 s-1. Esta constante es mejor denominarla k
cat
 puesto que en muchos 
casos la constante observada experimentalmente no es una sola constante así como 
se ha definido a k
2
.
• Entonces para la reacción 
puede sustituirse a k
2
 y k
3
 por una cte. mas general como k
cat
:
El valor de K
cat
 depende de los pasos del proceso que sean limitantes de la 
velocidad, por lo cual la V
M
 puede definirse como: V
M
=k
cat
(E
0
).
Dado que k
cat
 incluye a k
2 
como un caso especial, puede llamarse k
cat
 siempre 
en lugar de k
2
Significado de K
M
 y k
cat
• K
M
 solamente puede asociarse con la afinidad de la enzima por S cuando 
en una reacción de dos pasos k
2
<<k
-1
, ya que sería K
M
≈k
-1
/k
1
= K
s
• Una enzima con una K
M
 alta requiere una concentración de S mayor para 
alcanzar una velocidad de reacción dada, que una enzima con una con K
M
 
baja, pero la misma k
cat 
• K
cat 
(s-1) mide la producción catalítica de producto en condiciones óptimas 
(E saturada). Su valor indica el número de moléculas de S recambiadas por 
molécula de E por segundo. A veces se denomina número de recambio.
• K
cat
/K
M
 indica la eficiencia enzimática, así como su especificidad y permite 
comparar diferentes E. Cuando S<<K
M
, la mayor parte de la enzima está 
libre: E
0
≈E, entonces:
 V
0
≈ (k
cat
/K
M
) (E) (S)
• Esta ecuación permita una comparación directa de la eficacia de 
una E respecto a diversos sustratos (A y B) en concentraciones 
iguales: 
 VA/VB=(kcat/KM)A / (kcat/KM)B
Determinación de K
M
 y V
M
• Conviene mejor linealizar la ecuación de M.M. 
Se mencionarán tres métodos.
• Deben obtenerse datos dentro de la región de 
K
M
. 
• Se obtienen mejores resultados si V
0
 se 
obtiene a 6-10 [S], en el rango de 0.1 K
M 
a 10 
K
M
, o bien cuando [S]= 0.3 K
M
 a 3 K
M
. 
• Debe obtenerse la desviación estándar tanto 
para K
M
 como para V
M
. 
Determinación de K
M
 y V
M
• Método de Lineweaver-Burk (1934). Es el más frecuentemente usado, y se 
toma la doble recíproca:
• Método de Augustinsson. La ec. de Lineweaver-Burk se multiplica por [S]:
Pend.= 1/VM
Ord.=KM/VMInt.= -KM
[S] (M)
[S
] /
 V
0 (
s)
Determinación de K
M
 y V
M
Método gráfico de Augustinsson
▪Método de Eddie-Hofstee. La ec. De M.M. se puede 
re-arreglar:
 V0KM + V0 [S] = VM [S]; sustrayendo V0KM de cada lado:
 V0 [S] = VM [S] – V0KM; dividiendo por [S], da:
Determinación de K
M
 y V
M
Ord.= VM
Pend.= - KM
Int.=VM/KM
Gráfico según el método de 
Eadie-Hofstee
• Cada método tiene sus ventajas y desventajas, pero el de 
Lineweaver-Burk ha reportado más que los otros dos combinados.
• En la gráfica de Eadie-Hofstee el parámetro menos preciso, V0, 
aparece en ambos ejes (x e y) de modo que la precisión global de la 
determinación de KM y VM puede disminuir.
•Deben espaciarse uniformemente los datos experimentales a lo largo 
de la línea 
V0
V0/S
Determinación de K
M
 y V
M
[S] (Mx105) V0 (M 
s-1x106)
2.00 1.67
4.00 2.86
6.00 3.70
10.0 4.95
20.0 6.50
30.0 7.40
50.0 8.14
• Determine a partir de estos datos 
los parámetros cinéticos V
M
 y K
M
, 
utilizando los tres modelos antes 
mencionados.
VM=9.69x10
-6 Ms-1
KM=9.60x10
-5 M
REACCIONES DE DOS SUSTRATOS
• Las reacciones de las hidrolasas pueden tratarse mediante las ecuaciones de un 
sustrato. Las mayoría de las otras enzimas involucran reacciones de dos o más 
sustratos.
• Considere la reacción global A + B ↔ P + Q
• Los productos pueden denominarse a partir de la letra P, según Cleland (1963).
• Pueden distinguirse tres mecanismos en las reacciones de dos sustratos
A. MECANISMO ORDENADO
• El sustrato se añade y los productos se eliminan en orden:
• Se tienen involucrados complejos binarios de adsorción (EA y EQ) y dos complejos 
ternarios (EAB y EPQ)
• Este mecanismo fue designado por Cleland (1963) como Bi Bi y se indica 
esquemáticamente como:
A. MECANISMO ORDENADO
• La designación Bi Bi indica dos sustratos y dos productos involucrados
B. Mecanismo aleatorio 
Los sustratos A y B se añaden y los productos P y Q se liberan de la enzima de manera 
aleatoria.
A B
E
P Q
EA EAB
EPQ
EQ E
k2 B
k-2B
k4A
k-4A
k6
k-6P
k -8Q
k8
B. Mecanismo aleatorio
• Se aplica un mecanismo de equilibrio rápido aleatorio en las ecuaciones 
anteriores.
• Se tienen cuatro intermediarios de adsorción binarios (EA, EB, EP, EQ), y 
dos ternarios (EAB, EPQ). El paso de formación y ruptura de enlaces se 
define como EAB↔EPQ. Este mecanismo se designa como “Aleatorio Bi 
Bi”, que se puede mostrar como el siguiente diagrama:
EAB
EPQ
A B
EA
E
B A
EB
P Q
E
Q P
EQ
EP
Mecanismo de Ping Pong
• Se denomina así porque solamente un sustrato (o un producto) puede ser 
enlazado a la enzima a la vez en una reacción de dos sustratos y dos productos:• En esta reacción cuatro complejos binarios de adsorción están involucrados (EA, 
FP, FB, EQ), pero ningún complejo ternario
• Los pasos de formación y ruptura de enlaces están señalados como EA↔FP y FB↔ 
EQ.
• Existe un cambio transitorio de la naturaleza de la enzima, como se indica por el 
uso de F, ya que podría diferir de la original en términos del estado de oxidación 
de un metal, otro cofactor, o cambios conformacionales, etc.
El mecanismo se denomina “Ping Pong Bi Bi, y se puede indicar 
como en el siguiente diagrama:
E
A
EA
FP
P
F
B
FB
EQ
Q
E
Duarte-Vazquez et al., 2007. Broccoli wastes as a source of 
peroxidase. J. Agric. Food Chem. En prensa
Determinación de las constantes para reacciones 
ordenadas, aleatorias, o ping pong
Where V
max
= maximum velocity, K
a
 and K
b
 = K
m
 for substrates A (H
2
O
2
) and B 
(ABTS) respectively, A
0
 and B
0 
= substrates A and B concentrations. 
The initial velocities (v
0
) were determined as a function of both substrate 
concentrations. When A
0
 is constant, Eq. (1) yields a slope and intercept given by:
(1)
(2) (3)
A replot of y-intercepts obtained by using Eq. 3 versus 1/(A
0
) will produce a 
straight line with a slope and intercept given by:
(4) (5)
Therefore, constants K
a
, K
b
, and V
max
 can be determined from eqs. 2, 4, and 5. 
Determinación de las constantes para 
reacciones ordenadas, aleatorias, o ping pong
Double reciprocal plots according to Eq. 1, measured at pH 4.6, are shown in 
Figure A, where the parallel lines indicate that broccoli peroxidase follows a 
two-substrate ping-pong mechanisms as shown by Childs and Bardsley for 
horseradish peroxidase. 
The slopes (Eq. 2) and y-intercepts (Eq. 3) from Figure A were determined, 
and the calculated intercepts were plotted against 1/A
0
. 
A plot of y-intercept against 1/A
0
 gave a straight line (Figure B). From the 
intercept of this figure the V
max
 value was calculated 
(A) (B)
Reacciones consecutivas
Si las ctes. de velocidad para las sigs. reacciones son k1 
and k2; , combinando las ecs. de 
velocidad con un balance de masa para el sistema 
tenemos:
Para el reactivo A: 
Para el reactivo B: 
Para el reactivo C:
Las soluciones analíticas para estas ecuaciones 
(suponiendo que las concentraciones iniciales de cada 
sustancia excepto A es cero) Son:
Reacciones consecutivas
Estado estacionario
Si la aproximación al edo. estacionario se aplica, entonces la 
derivada de la concentración del intermediario se puede asignar 
como cero.
, luego 
Reacciones consecutivas
Validez:
Concentración vs. tiempo. 
Concentración de 
intermediario en verde, 
producto en azul y 
substrate en rojo (k2/k1 = 
0.5)
Concentración vs. tiempo. 
Concentración de intermediario en 
verde, producto en azul y sustrato 
en rojo, (k2 / k1 = 10)
Reacciones consecutivas
La solución analítica equivale a la aproximada cuando: k2 >> k1 , 
debido a que entonces 
 
.
Por tanto es válido aplicar la aproximación de edo. estacionario 
sólo si la segunda reacción es mucho más rápida que la primera 
(k2/k1>10), debido a que la forma intermediaria se forma 
lentamente y reacciona rápidamente, por lo que su concentración 
permanece baja.
Las gráficas muestran dos casos calculados de la solución analitica: 
concentraciones de A (rojo), B (verde) y C (azul): 
Cuando la primera reacción es rápida, no es válido considerar que la 
variación de [B] es muy pequeña, porque [B] ni es baja ni constante: 
primero A se transforma rápidamente en B y éste se acumula por su 
lenta desaparición. 
Reacciones consecutivas
Con la disminución en la concentración de A su velocidad de 
transformación disminuye al mismo tiempo que la vel. de 
reacción de B a C aumenta cuando más B se forma, 
alcanzando éste un máximo a: 
En adelante, la concentración de B disminuye.
Cuando la segunda reacción es más rápida, después de un pequeño 
periodo de inducción, la concentración de B permanece baja (y ~ 
cte.) debido a que su velocidad de formación y desaparición son 
casi iguales y la aproximación de estado estacionario puede usarse.
Consecuencias cinéticas de la inhibición 
enzimática
• Los inhibidores (I) enzimáticos tienen importancia práctica en campos 
como la toxicología, farmacología, ciencia de los alimentos y nutrición
• Los I son de gran valor en la elucidación de mecanismos de reaccíones 
catalizadas por enzimas, determinación de grupos en sitios activos de 
enzimas, y en el establecimiento de las secuencias de rutas metabólicas
• Se usan también para el control de plagas, incluyendo insectos y 
malezas.
TIPOS DE INHIBIDORES
Por conveniencia se dividen en dos tipos, los irreversibles y los reversibles, 
basados en consideraciones cinéticas
A. Inhibidores Irreversibles
Son aquellos que reaccionan con una enzimas para forma enlaces covalentes. 
estables cinéticamente.
Aunque el enlace covalente entre l y S pueda en algunos casos ser revertidos 
por tratamiento químico, desde el punto de vista cinético la reacción es 
irreversible.
Inhibidores irreversibles
 E + I → EI
La velocidad de inhibición depende entre otras cosas de k
1
, E, y (I).
Cuando la reacción de un inhibidor irreversible con E involucra un grupo en o 
cerca del sitio activo, la presencia del sustrato (o un I competitivo) puede 
cambiar la velocidad de la reacción de I con E. 
En la mayoría de los casos la velocidad de reacción disminuye con la 
concentración del sustrato hasta la saturación aunque en algunos casos la 
velocidad aumenta con un aumento en S.
La inhibición irreversible puede distinguirse de la verdaderamente reversible 
observando la actividad residual a diferentes intervalos de tiempo, 
preincubando la E con el I antes de añadir el S o determinando el efecto de 
dilución en la actividad.
Diálisis y Cromatografía de filtración en gel podrían usarse para distinguir 
entre inhibición reversible e irreversible
k1
INHIBIDORES IRREVERSIBLES
• La velocidad de reacción del I con la E puede tratarse por la ecuaciones 
cinéticas anteriores para un proceso irreversible. 
• Los I irreversibles son importante para determinar los grupos reactivos 
en o cerca del sitio activo de E, para medir cambios en la reactividad de 
éstos grupos en presencia o ausencia de ligandos (S, cofactores, I 
reversibles), y en el control de la actividad enzimática en el 
procesamiento de alimentos, farmacología, y toxicología. 
B. INHIBIDORES REVERSIBLES
• Los I reversibles reaccionan con una Enzima E
x
, de manera reversible:
 E
x
 + I ↔ E
x
I
• Los I reversibles pueden dividirse en tres tipos distintos, basados en sus 
efecto sobre la pendiente y ordenada al origen en una gráfica de doble 
recíproca de Vo vs S comparada con la misma reacción en ausencia de I.
TIPOS DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS
Tipo de 
Inhibitor
Sitio de unión a la enzima Efecto cinético
Inhibidor 
competitivo
Específico al sitio catalítico, donde 
compite con el S para enlazarse en un 
proceso del tipo equilibrio dinámico. La 
Inhibición es reversible por el S.
Vmax no cambia, Km 
definido como [S] 
requerido para ½ actividad 
máxima, aumenta
Inhibidor 
no-competiti
vo
Enlaza E o el complejo ES en lugar 
diferente al sitio catalítico. 
El enlazamiento al S no se afecta, pero 
el complejo ESI no forma productos. 
La inhibición no es reversible por 
aumento en [S]. 
Km no cambia; Vmax 
disminuye 
proporcionalmen-te a la [I] 
Inhibidor 
acompetitivo
Se enlaza solo al complejo ES en 
lugares diferentes al sitio catalítico. 
El enlazamiento de S modifica la 
estructura de la E haciendo el sitio 
inhibidor-sitio de enlace disponible. 
Adición de S no elimina la inhibición
Aparentemente Vmax 
disminuye; Km definido 
como [S] requerido para 
½ actividad máxima, 
disminuye.Lineweaver-Burk Plots of Inhibited Enzymes
INHIBIDORES REVERSIBLES
• Para entender el mecanismo de acción de un I debe determinarse si los 
cambios (en pendiente, ordenada al origen o ambos) son una función 
lineal de la concentración del inhibidor.
• La relación puede ser lineal, parabólica o hiperbólica (Fig. siguiente)
• Cuando un compuesto se combina con solamente una forma enzimática 
para disminuir su actividad, el efecto siempre es inhibición lineal.
• Cuando el compuesto se combina con 2 diferentes formas enzimáticas 
(dos puntos conectados por una ruta reversible) para producir un efecto 
múltiple en la pendiente o la ordenada al origen, y si ambas 
combinaciones resultan en una menor actividad, se observa inhibición 
parabólica. 
• Cuando el compuesto se combina con dos diferentes forma enzimáticas, 
pero causa una disminución de actividad en un punto y activación en el 
otro, afectando la pendiente y/o en la ordenada al origen, se tiene una 
inhibición hiperbólica.
Modelos de Inhibición competitiva
1. Modelo clásico. S e I compiten 
por el mismo sitio de enlace, ya 
que son estructuralmente 
semejantes
2. S e I son mutuamente 
excluyentes debido a 
impedimento estérico
3. S e I comparten un grupo de 
enlace común en la enzima
4. Los sitios de enlace son distintos 
para S e I, pero se traslapan.
5. El enlace del I a un sitio de 
inhibición diferente, causa un 
cambio conformacional en la 
enzima que distorsiona o 
enmascara el sito de enlace del 
sustrato 
Patrones de inhibición
P
en
di
en
te
 (ú
 o
rd
en
ad
a 
al
 o
rig
en
)
[I]
Lineal
ParabólicoHiperbólico
Patrones de inhibición lineales, hiperbólicos o 
parabólicos. Las pendientes ú ordenadas al origen se 
obtienen de las figuras anteriores y se grafican contra 
[I].
Patrones lineales de inhibición
• Aquí se hace énfasis en ejemplos donde una re-gráfica de pendientes (y/o 
ordenadas al origen) da una relación lineal con [I].
• Se designará a v
0
, V, K, pend
0
, y ord
0
 para indicar velocidad inicial, 
velocidad máxima, concentración de sustrato a 0.5 V, pendiente, y 
ordenada al origen respectivamente, en ausencia del inhibidor, y v’
0
, V’, K’, 
pend
1
, y ord
1
 para indicar los mismos parámetros en presencia del 
inhibidor, respectivamente.
• Todos los sustratos excepto uno, todos los cofactores, pH, T y E
0
 se 
mantienen constantes en una serie de experimentos.
• Se considera que [I] >> [E
0
], K
i 
≥10-7 M, de manera que [I
0
] puede usarse en 
la ecuaciones.
• Si K
i 
< 10-7 M, entonces [I
0
] no puede usarse en las ecuaciones que se 
mencionarán.
Patrones lineales de inhibición
• K’ y V’ serán ctes. verdaderas cuando
• A) Existe solo un S involucrado en la reacción
• B) Los demás S están presentes en condiciones saturantes, que 
usualmente no es el caso
• C) Cuando el I no afecta en particular éstos parámetros
• Para evitar mencionar a éstas como ctes. verdaderas se usarán V’ y K’ para 
éstos parámetros en presencia de inhibidores
• Similarmente se usarán K y V para designar a éstos parámetros en 
ausencia de inhibidores cuando se describa un caso general o cuando se 
discuta una reacción multisustrato
• La cte. K
i
 representa la concentración de I que duplica la pendiente o el 
término de intercepto. Esto no equivale a la concentración de I que 
disminuye a la mitad la velocidad inicial.
Patrones lineales de inhibición
• Bajo las anteriores condiciones, la velocidad inicial variará con la 
concentración del sustrato, de acuerdo a:
Inhibición Lineal Competitiva
La consecuencia de la presencia de un inhibidor competitivo en una reacción 
enzimática se muestra en la sig. figura:
v 0
 / 
V
S/K
 0.2
0.4
0.6
0.8 
1.0
1 2 10 30
V=V´
Inhibición lineal competitiva. V y 
K son ctes. en ausencia de I; V’ y K’ 
son ctes. aparentes en presencia 
del I. La línea sólida es en ausencia 
de I, la línea punteada es en 
presencia de [I]1= Ki 
K K’
Inhibición Lineal Competitiva
• A altas concentraciones de S, donde [S]>>K
M
, la influencia del I se elimina y la V
M
 en 
presencia y ausencia del I es la misma.
• No obstante la [S] requerida para dar una velocidad =0.5 V aumenta en presencia del 
inhibidor (K vs K’). La relación entre estos dos valores de K es:
• Como se muestra en la gráfica de recíprocos (siguiente), solamente la pendiente 
cambia en presencia del inhibidor competitivo. En el caso de inhibición lineal 
competitiva este cambio es una constante:
• K
i 
puede determinarse fácilmente, ya que: 
Inhibición Lineal Competitiva
Ord0=1/V=1/V’
Pend0=K/V
[I]0=0
[I]1Pend1=[1+(I)1/Ki] K/V=K’/ V
-(
1/
 {K
 [1
+(
I) 1
/ K
i]}
= 
-1
/K
’
- 1
/K
1/S
1/
v 0
[I]1 = Ki
Inhibición Lineal Competitiva
• K
i
 también puede determinarse del cociente de intercepto sobre el eje X, 
donde int
0
/int
1
= 1 + [(I)/K
i
].
• Los mejores valores de K
i
 se determinan por la ordenada al origen de una 
re-gráfica de las pendientes vs [I], de las gráficas originales.
• Los inhibidores competitivos pueden usarse como sondas para determinar 
la naturaleza estructural de un sitio activo. 
• Por ejemplo, para determinar la importancia de cada segmento de una 
molécula de ATP que contribuyen a su enlace con el sitio activo de una 
enzima que requiera ATP, podría determinarse la K
i
 para el ADP, AMP, 
ribosa, ión trifosfato etc.
• Muchos de esos constituyentes del ATP son catalíticamente inactivos, por 
lo que se usan estudios de inhibición para monitorear su enlazamiento a la 
enzima. 
Esquema de reacción para la inhibición 
competitiva
La velocidad inicial de la reacción es proporcional a 
la concentración en estado estacionario del 
complejo ES.
Inhibición Lineal no-Competitiva
• En presencia de un inhibidor no competitivo la velocidad máxima obtenida 
es menor que cuando no existe inhibidor.
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
v 0
/V
S/K
V
V’
K=K’
1 2 3 10 30
Inhibición lineal 
no-competitiva simple. V y K 
son ctes. en ausencia de I; V’ y 
K’ son ctes. aparentes en 
presencia de I. La línea sólida 
es en ausencia de I; la línea 
discontinua es en presencia de 
[I]1 = Ki 
Inhibición Lineal no-Competitiva
• Puesto que el S y el I no compiten por el mismo sitio de enlace de la enzima, o 
algunas veces por la misma forma de la E, la inhibición no puede eliminarse 
añadiendo mas S como en la inhibición competitiva
• La diferencia entre la vel. max. observada en ausencia y presencia de un I no 
competitivo es función de la concentración del I y de K
i
 (ordenada al origen):
• En esta inhibición cambian la ordenada al origen y la pendiente de una doble 
recíproca en presencia del I. La relación entre [ I ] y su efecto en la pend. y ord. 
al origen es: 
Inhibición Lineal no-Competitiva
Ord0=1/V
Pend0=K/V
[I]0=0
[I]1Pend1=[1+(I)1/Ki] K/V=K’/ V’
- 1
/K
=-
1/
K
’
1/S
1/
v 0
(Ord.)1= [1+(I)1/Ki] 1/V
Inhibición lineal simple no competitiva. [I]1=Ki, donde Ki ord. origen = Ki pend.
Inhibición Lineal no-Competitiva
• La pendiente y ordenada al origen pueden no cambiar en la misma 
magnitud en presencia del inhibidor.
• K
i
 
ord. Origen 
puede ser mayor, igual o menor que K
i
 
pend.
, resultando en una 
familia de líneas recíprocas obtenidas a diferentes [I] que convergirán a la 
izquierda y arriba del eje “x” (Fig. abajo), sobre el eje “x” (Fig. anterior) o a 
la izquierda y debajo del eje “x” (Fig. abajo). El control (I)
0
=0 es el mismo y 
permite una fácil comparación de los datos.
[ I ]0=0
[ I ]1
[ I ]2[ I ]3
1/S
1/
v 0
[ I ]0=0
[ I ]1
[ I ]2[ I ]3
1/S
1/
v 0
Ki ord. Origen=1.67 Ki pend. [I]0, [I]1, [I]2, 
[I]3= 0, 0.5, 1.5 y 3.0 veces Ki pend. 
Ki ord. Origen=0.75 Ki pend. [I]0, [I]1, [I]2, [I]3= 0, 
0.5, 1.5 y 3.0 veces Ki pend.
Inhibición Lineal no-Competitiva
• El caso donde K
i pend. 
= K
i ord. Origen 
se denomina inhibición no competitiva lineal 
simple, y K
i
 puede calcularse ya sea del cambio en la pendiente o en la ord. origen. 
En este caso no cambia K como función de la concentracióndel inhibidor, y K’=K.
• En los otros dos casos existe un cambio en K, de modo que la relación entre K en 
ausencia y presencia de I es:
• K’ puede ser mayor que, igual (inhibición simple lineal no competitiva), o menor que 
K, dependiendo de los valores relativos de K
i pend.
 y K
i ord. origen
Equilibrios en la inhibición no competitiva
Un inhibidor clásico no competitivo no tiene efecto sobre el 
enlace del sustrato y viceversa. 
S e I se enlazan reversible e independientemente en sitios 
diferentes. Esto es, I se enlaza a E y a ES; S se enlaza a E 
y a EI. 
El complejo ESI es catalíticamente inactivo; I puede 
prevenir el posicionamiento apropiado del centro catalítico.
Inhibición lineal acompetitiva
• La inhibición acompetitiva tampoco puede ser eliminada por aumento en la [S] a 
niveles saturantes (ver fig.). V’ y K’ cambian por la misma cantidad y en la misma 
dirección, como se muestra:
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
v 0
/V
V
V’
1 2 3 10 30
S/K
Inhibición lineal acompetitiva. 
V y K son ctes. en ausencia de 
I; V’ y K’ son ctes. aparentes en 
presencia de I. La línea sólida 
denota ausencia de I; la línea 
punteada representa presencia 
de [I]1= KiK’
K
Inhibición lineal acompetitiva
• Sabemos también que:
• En presencia de un inhibidor acompetitivo, K’ y V’ siempre serán menores que 
K y V, pero la relación K’/V’ será una constante igual a K/V.
• Como consecuencia, una familia de líneas recíprocas serán paralelas. Cada línea 
tiene la misma pendiente, pero una ordenada al origen que difiere de aquella 
en ausencia del inhibidor por el factor constante: 1 + [(I) / K
i
]
Inhibición lineal acompetitiva
1/S
1/
v 0
(Pend.)1=K/V
[I]1
(Pend.)0=K/V
[I]0=0
(Ord.)1= [1+(I)1/Ki] 1/V
(Ord)0=1/V
0
Inhibición lineal acompetitiva. [I]1= 2 Ki
Ejemplo de Inhibición enzimática
La sacarosa (azúcar común) es hidrolizada a glucosa y 
fructosa a través de un experimento clásico de cinética. La 
reacción es catalizada por la enzima invertasa (0.05 mM). 
Usando los siguientes datos experimentales, determine por el 
método de Lineweaver-Burk, qué tipo de inhibición de esta 
reacción se obtiene al agregar urea 2 M, y obtener el valor de 
ki. Obtener KM, VM y kcat . 
Conc. de 
sacarosa (M)
Vo (M min
-1) V’ (M min-1)
0.0292 0.182 0.083
0.0584 0.265 0.119
0.0876 0.311 0.154
0.117 0.330 0.167
0.175 0.372 0.192
Inhibición Enzimática
• Del tipo de inhibición encontrado, uno debe ser capaz de efectuar 
predicciones razonables acerca de la forma de la enzima con la cual el 
inhibidor reacciona y del mecanismo de adición del sustrato a la E y 
liberación del producto de la enzima
• Este raciocinio puede ser pensado en reversa, donde dado un mecanismo 
particular de adición de S y liberación de producto y de la forma de la 
enzima con la cual el inhibidor se combina, debe ser posible predecirse el 
tipo de inhibición esperado.
• Todas las enzimas son sensibles al pH debido a que son proteínas, siendo 
activas la mayoría de las proteínas en el rango 5 a 9.
• Esto es el resultado de los efectos del pH en una combinación de los 
siguientes factores:
Efecto del pH en la Cinética Enzimática
Efecto del pH en la Cinética Enzimática
– Concentración de la enzima 
– Unión del S a la E, concentración del sustrato y su ionización 
– Temperatura 
– Fuerza iónica
– Naturaleza química del buffer; 
– Concentración de iones metálicos
– Concentración de conservadores como glicerol, compuestos con –SH
– Actividad catalítica de la enzima 
– Ionización del sustrato
– Variación de la estructura de la proteína (usualmente significativa a 
valores extremos de pH)
• Las velocidades iniciales para muchas reacciones enzimáticas exhiben 
curvas en forma de campana en función del pH
Efecto del pH en la Cinética Enzimática
En esta expansión del mecanismo simple de reacción de un S sin reacción hacia 
atrás, se considera que solamente EH y ESH son catalíticamente activos.
Estas curvas reflejan que ciertos aminoácidos deben estar en un determinado estado 
de ionización para que haya actividad enzimática. Puede aplicarse el sig. modelo 
para el efecto del pH:
Efecto del pH en la Cinética Enzimática
• La ec. De Michaelis-Menten para este modelo es:
• Aquí los parámetros aparentes de Michaelis-Menten se definen como:
V’
max
= V
max
/ f
2 
 y K’
M
= K
M
 (f
1
/f
2
)
Donde: 
V
max
 y K
M
 se refieren a las formas activas de la enzima, EH y ESH. Notar que a cualquier 
pH dado, la ec. de arriba se comporta como una ec. simple de M-M, pero debido a la 
dependencia del pH de f
1
 y f
2
, V
0 
varía con el pH en forma de una campana.
pH
5 6 7 8 9
V0
Efecto del pH en la vel. Inicial
de reacción de la fumarasa
Efecto del pH en la Cinética Enzimática
• Las constantes de ionizacion de las enzimas que obedecen la ec. anterior 
pueden evaluarse por análisis de las curvas de log V’
max
vs pH, que da 
valores de K
ES1
 y K
ES2
, y del log (V’
max
/K’
M
) vs pH, que da K
E1
 y K
E2.
• Esto requiere la determinación de los parámetros de M.M. de la enzima a 
cada uno de los diferentes valores de pH.
log V’max
log(V’max/K’M)
pKES1 pKE1 pKE2 pKES2
pH
Dependencia del pH con (a) 
log V’max, (b) log (V’max/K’M), 
ilustrando cómo los valores 
de las ctes. de ionización 
moleculares pueden 
determinarse por 
extrapolación gráfica. 
(a)
(b)
Efecto del pH en la Cinética Enzimática
• Los pK’s medidos, a menudo proporcionan información valiosa para identificar 
algunos residuos de aminoácidos esenciales para la actividad enzimática
• Por ejemplo, un pK medido de ~4 sugiere que un residuo de Asp o Glu es esencial 
para la enzima. 
• Similarmente, pK’s de ~6, o ~10 sugieren la participación de un residuo de His o Lis, 
respectivamente. No obstante, un grupo dado ácido-base puede cambiar varias 
unidades de pH de su valor esperado, como consecuencia de una influencia 
electrostática de grupos cargados cercanos, así como la proximidad de regiones de 
baja polaridad.
• Por ejemplo, el grupo carboxilato de un residuo de Glu que forma un puente salino 
con un residuo de Lis se estabiliza por una carga positiva cercana y por tanto tiene un 
menor pK que de otra manera no tendría; esto es, se protona con mayor dificultad.
• Por el contrario, un grupo carboxilato inmerso en una región de baja polaridad es 
menos ácido que normalmente, porque atrae protones más fuertemente que si 
estuviera en una región de mayor polaridad.
• La identificación de un pK cinéticamente caracterizado con un residuo de aa 
particular debe por tanto verificarse por otro tipo de mediciones tal como reactivos 
específicos para grupos químicos que inactiven un aa putativo esencial.
 Three major regulatory 
chemical reactions. (a) 
Acetylation - addition of an 
acetyl group to lysine's R 
group by acetyltransferase. 
(b) Methylation - addition of 
a methyl group to DNA's 
base (e.g. cytosine) by 
methylase. (c) 
Phosphorylation - addition of 
a phosphate group to the R 
group of tyrosine, serine or 
threonine (only tyrosine is 
shown here) by protein 
kinase.
The role of rotamase and 
protein disulfide isomerase 
(PDI). The reactions catalyzed 
by the two enzymes can assist 
a peptide chain to fold into a 
correct three-dimensional 
structure.
Hemicelulasas
¿ PREGUNTAS ?
GRACIAS!