LPH-terapia - Rodríguez Rivas César Iván

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Universidad Autónoma de querétaro
Optativa de Especialidad II
Facultad de Ingenieŕıa
Nanoveh́ıculos de PEI-PEG en
terapia génica para labio y/o paladar
hendido.
Alumno:
Alegŕıa Garćıa Lorena Beatriz
Ramı́rez Ochoa Gabriel Trinidad
Rodŕıguez Rivas César Iván
Rodŕıguez Ruiz Steffany
Ingenieŕıa en Nanotecnoloǵıa
Profesor: Dr. Héctor Paul Reyes Pool
20 de mayo de 2021
Índice
1. Introducción 2
2. Marco Teórico 3
2.1. Terapia génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.1.1. Métodos de transferencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.1.2. Vectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.1.3. Marcadores genéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2. Nanotecnoloǵıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.3. Gen IRF6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3. Definición del problema 6
4. Justificación 7
5. Hipótesis 7
6. Objetivos 7
6.1. Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
6.2. Objetivos especificos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
7. Métodos y materiales 8
7.1. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
7.1.1. Polietilenimina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
7.1.2. Polietilenglicol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
7.2. Śıntesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
7.3. Mecanismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
7.3.1. Administración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
7.3.2. Interacción con la célula diana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
7.3.3. Transfección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8. Caracterización 12
9. Viabilidad 13
10.Conclusiones 13
Referencias 14
2
Resumen
La terapia génica es una estrategia terapéutica que implica la introducción de
material genético en los pacientes, con la finalidad de corregir las deficiencias celu-
lares expresadas en el fenotipo y sanar enfermedades hereditarias o adquiridas.
Una de las enfermedades que se encuentra en constante contacto con la población
queretana, es el labio y/o paladar hendido el cual comienza a originarse durante las
primeras semanas de gestación. En este documento se pretende generar una terapia
génica dirigida hacia este sector en donde por medio de un nanoveh́ıculo el gen en
cuestión pueda expresarse de manera correcta y aśı empezar a tratar la enfermedad
desde su origen.
1
1. Introducción
Cada año a nivel mundial aproximada-
mente el 3 % de los nacimientos son afecta-
dos por defectos congénitos o estructurales
mayores [1] que han tratado de ser explica-
dos de acuerdo a los conocimientos imperan-
tes en las diferentes épocas y culturas donde
se presentan.[2]
Entre estos defectos, el labio y paladar
hendido (LPH) representa la malformación
congénita de mayor frecuente en el área de
la cabeza y el cuello, constituyendo un 65 %
de todas las malformaciones craneofaciales,
en cuyo carácter no sindrómico (LPHNS)
se manifiestan como entidades aisladas, sin
otras alteraciones cognitivas o estructura-
les aparentes, correspondiendo aproximada-
mente del 50 % a 70 % de los casos de LPH
a nivel global. [3]
El labio y el paladar hendido se consi-
dera una condición debilitante la cual tie-
ne graves efectos adversos de larga dura-
ción en la evolución f́ısica y psicológica [4],
asociados con el desarrollo dental, proble-
mas de la alimentación, la audición, el ha-
bla, la estética y las alteraciones psicológicas
implicadas.[5]
A pesar de ser conceptualizada por la
población en general como una enfermedad
no grave, [6] sus implicaciones deben ser co-
rregidas a diversos grados por la ciruǵıa, tra-
tamiento dental, terapia del habla y la inter-
vención psicosocial.
A nivel mundial, el LPH afecta a alre-
dedor del 1.5 individuos por cada 1,000 na-
cidos vivos, con una incidencia de 250,000
casos al año, con enormes variaciones entre
áreas geográficas y grupos étnicos.[12] .
Para Estados Unidos se refiere una fre-
cuencia de este padecimiento de 10 a 12 in-
dividuos por cada 10,000 nacimientos, hasta
1 individuo por cada 800 nacimientos.
En páıses latinoamericanos, Brasil repor-
ta una prevalencia de que vaŕıa de 1 cada
2,500 nacidos vivos y en México, según la di-
rectiva de prevención, tratamiento, manejo
y rehabilitación de niños con labio y paladar
hendido, existen 1 a 1.39 casos por cada 700
a 1,000 nacimientos, por lo que cada año se
reporta una incidencia de 3,321 nuevos ca-
sos.
El desarrollo normal de las estructuras
faciales ocurre durante la semana 4 a 7, en el
cual los procesos nasales laterales se pliegan
al proceso maxilar para formar el paladar
primario, la parte central del labio superior
y la nariz.
Figura 1: Vista lateral de la organización de
la cabeza y la faringe en un embrión hu-
mano de 30 d́ıas. Los diferentes tejidos se
muestran por separado, pero alineados por
medio de las ĺıneas discontinuas.
Estas estructuras proceden del mesen-
quima del primer arco faringeo que a su vez
se divide en los procesos mandibular, maxi-
lar y frontonasal como se puede observar en
2
la Figura 1.
Por otro lado, durante las semanas 8 a
12 las palatinas secundarias se fusionan pa-
ra formar el paladar duro y blando, tradu-
ciéndose el fracaso en cualquiera de estos
puntos de unión en una hendidura, y a ve-
ces, junto con hipodoncia, como se muestra
en la Figura 2.
Figura 2: Vista ventral del paladar, la enćıa,
el labio y la nariz. A. Normal. B. Labio hen-
dido unilateral que se extiende hasta la na-
riz. C. Fisura unilateral que afecta el labio
y el maxilar, y se extiende hasta el foramen
incisivo. D. Fisura bilateral que afecta el la-
bio y el maxilar. E. Paladar hendido aisla-
do. F. Paladar hendido combinado con labio
hendido anterior unilateral.
Las alteraciones en los genes asociados
a la formación de las estructuras faciales,
exposiciones nocivas ambientales y deficien-
cias de nutrientes, han sido implicados en la
presencia de LPH [1], de tal manera que el
desarrollo de las hendiduras orofaciales en
un individuo dependerá de la interacción de
varios genes que se afectan moderadamente
con factores ambientales[13].
Los genes relacionados con labio y/o pa-
ladar hendido no sindrómico que han sido
identificados son: [17][18]
TGF − α
TGF − β3
MSX1
IRF6
TBX22
CY P1A1 y
MTHFR
RARA
Aunque el gen IRF6 es el que representa
mayor interés ya que ha sido estudiada con
frecuencia y es fuertemente asociada con el
riesgo de fisura oral y facial [21], otra estre-
cha relación es por los hallazgos que indican
al IRF6 implicado en la fusión del paladar
mediado por TGFβ3.
2. Marco Teórico
2.1. Terapia génica
La terapia génica es una estrategia pa-
ra el tratamiento de diferentes enfermedades
hereditarias, infecciosas, cáncer, autoimmu-
nitarias, entre otras.
Esta terapia está vinculada con diferen-
tes áreas médicas, como la bioloǵıa molecu-
lar, la genética, la viroloǵıa, la bioqúımica y
la biof́ısica que hacen posible su progreso.
Este tratamiento implica la introducción
de material genético en los pacientes, con la
finalidad de corregir las deficiencias celula-
res expresadas en el fenotipo para sanar las
enfermedades hereditarias o adquiridas.
También incluye a la transferencia géni-
ca con el propósito médico de prevención,
diagnóstico y terapéutica.[7]
3
2.1.1. Métodos de transferencia
Los métodos de transferencia de genes se
dividen en:
1. Métodos ex vivo, en la que los genes
se transfieren a células que posterior-
mente se introducen en el paciente
2. Métodos in vivo , donde los genes
se introducen directamente en los te-
jidos. [8]
Figura 3: Terapia génica ex vivo
La transferencia de genesse realiza por
medio de vectores. Estos son sistemas úti-
les en el proceso de transferencia de un gen
exógeno a la célula, que facilitan la entrada
y la biodisponibilidad intracelular del mis-
mo. Los vectores se dividen en virales y no
virales.[9]
2.1.2. Vectores
Para cualquier tipo de gene delivery se
necesita un vector de transferencia que trans-
porte, proteja y transfiera el gen terapéuti-
co de forma segura y eficaz y que además le
confiera la especificidad de alcanzar única-
mente a las células diana.
El vector es la clave del éxito de la tera-
pia génica. Un virus es algo más que un gru-
po de genes que se autorreplican cubiertos
de una cobertura con protéınas que le dan
entrada espećıfica a un tipo celular concreto.
Por ello, tradicionalmente, se ha aprove-
chado el cromosoma de virus humanos con
especificidad natural para determinados te-
jidos, después de haber reemplazado algún
segmento génico que le confiriera virulencia
al virus, por el gen terapéutico.[10][11]
Figura 4: Vectores de terapia génica
Los principales tipos de vectores vira-
les son: Los Retrovirus, los Adenovirus, los
virus asociados a los adenovirus, los liposo-
mas y el DNA desnudo (o naked DNA).
Los vectores virales constituyen los sis-
temas más eficaces para transferir genes, ya
que son capaces de infectar una elevada pro-
porción de células diana y son incapaces de
replicarse ni producir enfermedad en el pa-
ciente tratado.
Mientras que los vectores no virales
incluyen: el bombardeo de part́ıculas, la in-
yección directa de ADN, los liposomas ca-
tiońıcos, la transferencia de genes mediante
receptores, los receptores de asialoglicopro-
téınas, entre otros.
4
2.1.3. Marcadores genéticos
Los marcadores moleculares o genéticos
son sitios que están distribuidos a lo largo
del DNA , pueden estar situados dentro de
la secuencia de un gen (marcador codifican-
te) o pueden ser secuencias que se encuen-
tren cerca de un gen (marcador no codifi-
cante) o también pueden ser sitios identifi-
cados por medio de protocolos de bioloǵıa
molecular; dependiendo del tipo de ADN en
los que se detecten pueden ser genómicos o
mitocondriales [24].
Las caracteŕısticas de los marcadores mo-
leculares son las siguientes: [25]
Que sea polimórfico
Preferentemente codominante
Heredable
Que no sea afectado por el ambiente
Asociado a caracteŕısticas fenot́ıpicas
que aparecen en la edad adulta
Asociado a caracteŕısticas de baja he-
redabilidad porque responde más rápi-
do a la selección.
2.2. Nanotecnoloǵıa
La nanotecnoloǵıa es un campo que ha
sido desarrollado desde hace algunas déca-
das, a partir de ese momento su expansión
ha sido de carácter exponencial y ha llama-
do la atención de diversos campos para su
estudio.
En adición a ello, la bio-nanotecnoloǵıa
es una ciencia que mediante el uso de com-
ponentes básicos biológicos pretende fabri-
car con potenciales aplicaciones, no solo pa-
ra el reconocimiento molecular, sino tam-
bién para administración mejorada de fárma-
cos.
Del mismo modo, la terapia génica ha
obtenido un gran interés por los investgia-
dores debido a ser una potencial alternativa
para ciruǵıa y tratamientos farmacológicos.
A pesar de que podŕıa ser una opción de
tratamiento prometedora su seguridad sigue
siendo un tema de debate. Es por esto que
se han utilizado diferentes tipos de nano-
part́ıculas biocompatibles para administrar
genes destinados a la terapia génica que lo-
gren superar las desventajas presentadas en
los métodos tradicionales para la entrega de
material genético. [14]
Recientemente, algunos poĺımeros catióni-
cos han sido investigados como vectores no
virales para el tratamiento de diversas enfer-
medades. Estos poĺımeros presentan curio-
sas caracteŕısiticas ya que ofrecen ventajas
como:
menor riesgo inmunológico
śıntesis menos complejas
estructuras modificables
interacciones electrostáticas con el áci-
do nucleico
Han sido empleados como transportado-
res de genes gracias a su facilidad para la
formación de ácidos nucleicos, presentar bue-
na compatibilidad y degradabilidad. Mate-
riales natturales como el quitosano, gelati-
na, dextrano, etc.
Estos han demostrado una buena capa-
cidad para condensar el material genético
y entregarlo dentro de la célula con baja
toxicidad e inmunogenicidad, sin embargo,
5
se han evidenciado proboelas de solubilidad
y baja eficiencia de transfección, lo que los
vuelve materiales desventajosos con respec-
to a los sintéticos. [15]
Los poĺımeros sintéticos han logrado su-
perar los inconvenientes presentados con su
contraparte, debido a que puede tenerse un
mejor control de sus propiedades mediante
modificaciones en su estructura, entre ellos
se encuentra el PEI, siendo uno de los poĺıme-
ros más estudados debido a su alta eficeincia
y habilidad de escape de los endosomas. [15]
2.3. Gen IRF6
En cuanto a los genes que han sido iden-
tificados como papel importante en LPH hay
una larga lista.
Existen múltiples variantes genéticas que
influyen en el riesgo de LPH, pero también
algunos de estos genes pueden ser diferen-
cialmente etiquetados por marcadores po-
limórficos en una población espećıfica.
Cabe resaltar que en la mayoŕıa de las
poblaciones los genes causales o loci identi-
ficados a través de marcadores polimórficos
ha sido el IRF6 (factor regulador de inter-
ferón 6), localizado en 1q32.2. [17] [18]
Este es considerado un gen de codifica-
ción de protéınas, como se muestra en la Fi-
gura 5, que constituye un elemento clave en
el desarrollo oral y maxilofacial, por lo que
los cambios en el mismo se convierten en un
factor de riesgo significativo para las fisuras
labiales y palatinas.
Además, es actualmente un descubrimien-
to prometedor, ya que constituye una evi-
dencia de que se pueden mapear las varian-
tes genéticas que intervienen para la apari-
ción de estas alteraciones.
Figura 5: Protéınas que interactúan para el
IRF6
Hasta la fecha, por lo menos 200 dife-
rentes mutaciones en el gen IRF6 han sido
descritas, la mayoŕıa asociadas a mutaciones
por supresión de alguna protéına.[22]
3. Definición del proble-
ma
Los casos de LPH en el estado de Queréta-
ro reportados por la SS, y de acuerdo con los
nacimientos reportados por el INEGI, mues-
tran una prevalencia de 0.33, 0.38 y 0.41 por
cada 1000 casos en 2011, 2012 y 2013, res-
pectivamente, lo que confirmó un aumento
del padecimiento.
Actualmente esta enfermedad aqueja a
una gran parte de la población de Queréta-
ro, por ello, proponemos hacer uso de un
nanoacarreador que trasnporte la región co-
rrecta del gen IRF6 que ha mostrado cam-
bios en uno o más nucleotidos y llegue hasta
el embrión para corregir dicha anomaĺıa an-
tes del nacimiento.
6
4. Justificación
Se seleccionó el gen IRF6 debido a que
se encuentra relacionado con la formación
de tejido conectivo, proliferación de quera-
tinocitos y también en la formación de la
epidermis oral.
Sus alelos comunes se han asociado con
casos no sindrómicos de labio y paladar hen-
dido, a través de estudios de asociación de
todo el genoma y en muchos estudios can-
didatos a nivel mundial.
Otra razón fue que el IRF6 es el me-
jor candidato en cuanto a su función y ubi-
cación cercana a los marcadores encontra-
dos en una población italiana donde se en-
contró evidencia de que esta relacionado con
LPH.
En México el estudio realizado por el
departamento de bioloǵıa molecular e his-
tocompatibilidad del Hospital general “Dr.
Manuel Gea González” también lo asoció,
en la población de Cadereyta, Querétaro; la
cual fue elegida por su alta incidencia de
LPH.[23]
Se realizó un estudio por parte de la Fa-
cultad de Medicina de la UAQ en el que
el gen IRF6 mostró las caracteŕısticas nece-
sarias para ser considerado como marcador
genético.[23]
El veh́ıculo empleado como acarreador
para un correcto transporte y entrega del
gen es un PEGilado de polietileneimina (PEI)
ya que el PEI presentabuena eficiencia de
transfección, habilidad de escape para los
endosomas y en adición ofrece buenos reul-
tados para terapia génica in vivo e in vitro.
Sin embargo estas ventajas se ven demeri-
tadas por el hecho de que tiene baja biode-
grabilidad y citotoxicidad.
Es por esto, que hemos decidido reali-
zarle una modificación superficial con Poli-
etilenglicol (PEG) con el fin de mejorar su
biocompatibilidad, aumentar su estabilidad.
De esta manera protegeŕıamos a los dos or-
ganismos vivos con los que se planea traba-
jar y nos aseguraŕıamos de que la molécula
llegue al sitio espećıfico adecuadamente.
5. Hipótesis
La combinación entre terapia génica y
nanotecnoloǵıa es una técnica que permi-
te corregir las mutaciones en el gen IRF6
durante el periodo fetal, evitando labio y/o
paladar hendido en neonatos.
6. Objetivos
6.1. Objetivo general
Proponer una posible terapia para la mal-
formación no sindrómica de labio y paladar
hendido en la población de Querétaro apli-
cando nanotecnoloǵıa y terapia génica.
6.2. Objetivos especificos
Minimizar los posibles efectos adver-
sos generados por la terápia.
Lograr que el acarreador llegue a las
células espećıficas (mesenquima del pri-
mer arco faŕıngeo).
Lograr que la liberación por parte del
acarrreador se dé solamente dentro del
núcleo de la célula.
7
Obtener una terápia más segura y efi-
ciente, aśı como de menor costo, que
las tradicionales.
7. Métodos y materiales
7.1. Materiales
7.1.1. Polietilenimina
La polietilenimina (PEI) es un poĺımero
catiónico que ha mostrado un potencial sig-
nificativo para administrar genes in vitro e
in vivo.
Es un poĺımero soluble en agua en el que
la unidad repetida de PEI son dos átomos de
carbono seguidos de un átomo de nitrógeno.
En condiciones fisiológicas, aproximada-
mente el 20 % de los nitrógenos están pro-
tonados y como se mencionó anteriormente
tiene una alta eficiencia de transfección y
habilidad de escape de los endosomas.
PEI se presenta en dos formas estructu-
rales: lineal y ramificada, como se mues-
tra en la Figura 6. Algunos estudios han de-
mostrado que la PEI lineal es más eficaz que
la PEI ramificada in vitro e in vivo.
Figura 6: Estructuras qúımicas del PEI. A.
PEI lineal, B. PEI ramificado
Pese a la eficiencia de este poĺımero co-
mo vector génico, tiene un carácter no de-
gradable y citotoxicidad asociada, lo que ha
limitado sus aplicaciones terapéuticas. [19]
Con el fin de no limitar este estándar
de oro, en la literatura se han realizado en-
foques donde se copolimeriza con segmentos
biocompatibles como el polietilenglicol, dex-
trano y quitosano.
Siendo uno de los procesos más men-
cionados la PEGilación, donde se modifican
moléculas mediante una conjugación de en-
lace covalente con el PEG.
7.1.2. Polietilenglicol
El PEG, también conocido como macro-
gol, es un segmento hidrof́ılico protector que
previene interacciones indeseables con com-
ponentes de la sangre u otras biomoléculas;
adicionalmente, le confiere estabilidad co-
loidal a las part́ıculas que forma cuando el
poĺımero interacciona con el ADN o ARN.
Figura 7: Estructura qúımica del PEG.
Las modificaciones de superficie para la
liberación de fármacos con PEG ha sido foco
de atención debido a:
Aumento de biocompatibilidad
Aumento en los tiempos de circulación
sistémica
Alteración de biodistribución
8
7.2. Śıntesis
La śıntesis de nuestra molécula se ha ba-
sado en la reportada por Peterson [20]. Pri-
meramente se activó PEG disuelto en Clo-
roformo Anhidro para la reacción de los gru-
pos amino del PEG a 60oC durante alrede-
dor de 8 horas.
Las soluciones de reacción se concentra-
ron a 100 g/L y posteriormente se vertieron
en éter diet́ılico para la obtención de un co-
poĺımero por precipitación y finalmente los
productos se secaron al vaćıo.
Se pretende realizar varios experimetos
de caracterización como Resonancia Magnéti-
ca Nuclear (RMN); con el fin de verificar la
estructura de los copoĺımeros obtenidos.
Del mismo modo, realizar cromatrograf́ıa
de exclusión por tamaño con el fin de ubicar
la ausencia, o no, de homopoĺımeros de las
dos materias prima sin reaccionar. En la fi-
gura 8 se muestra brevemente la manera en
que se generaron estos nanoveh́ıculos.
Figura 8: Esquema de la śıntesis de PEI-
PEG.
Se agregaron soluciones de poĺımero a
soluciones del gen en volúmenes iguales, man-
teniéndose en agitación y posterior incuba-
ción durante aproximadamente 10 minutos.
Tanto las soluciones madre del gen, co-
mo del poĺımero se diluyeron con NaCl y
se filtraron, siempre cuidando que todas las
soluciones de poĺımero, tuvieran una misma
concentración de PEI.
7.3. Mecanismo
El labio y/o paladar hendido (ya sea sin-
drómico o no) se detecta en la mayoria de
los casos hasta el nacimiento, aun en la ac-
tualidad es muy dif́ıcil hacer el diagnóstico
de un paladar hendido antes del parto (a
menos que se detecte en asociación con un
gran labio leporino), pero con las mejoras en
la tecnoloǵıa de ultrasonido, el diagnóstico
prenatal de labio leporino aislado es cada
vez más común.
Al existir antecedentes familiares de la
hendidura o preocupación por una posible
fisura por otras razones, se realiza un ultra-
sonido de diagnóstico completo y pruebas
genéticas.
Por esta razón la terapia que se apli-
cará a diagnósticos entre las semanas 5 a 7
para embarazos con antecedentes familiares.
Es de suma importancia que la terapia
se dé en estas semanas debido a que a fi-
nal de la semana 7 se fusionan los procesos
maxilares con los procesos nasales mediales
para formar el labio superior, durante este
peŕıodo el mesenquima que dará lugar a los
tejidos que forman estos procesos, expresa
el receptor para FGF-8 (factor que desem-
peña un papel fundamental en la formación
del esqueleto facial), siendo de esta forma
que podemos usar el receptor para este fac-
9
tor como marcador molecular de modo que
la edición génica se encuentre dirigida para
el grupo célular de interes.
La terapia génica propuesta es del tipo
in vivo con un vector no viral, en su interior
se encuentra la enzima Cas9, ARN CRISPR
activadora trans ( tracrRNA ), buffers y RNA
gúıa:
”TTCTTTTTTCTTCCTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTGGAGATGGGGTC”
El cual está flanqueada 10 bases rio arriba y
10 bases rio abajo, esto con el propósito de
que la corrección de la región del gen IRF6
sea más especifica.
7.3.1. Administración
Una vez teniendo nuestro nanovehiculo
con la formulación en su interior, se admi-
nistra por medio de inyección, sin embargo
al tratarse de una teraṕıa aplicada durante
el periodo de gestación lo ideal es adminis-
trarlo a través del cordón umbilical.
Figura 9: Principales venas y arterias a la
cuarta semana de gestación
Su interior está formado por tres vasos
sangúıneos: una vena y dos arterias. La pri-
mera transporta al feto ox́ıgeno y nutrien-
tes (azúcar, vitaminas, sales minerales) que
proceden de la sangre materna. Las arte-
rias, por su parte, transportan las sustan-
cias de desecho metabólicas (por ejemplo, el
anh́ıdrido carbónico y la urea) a la placen-
ta, que las vaciará de nuevo en el torrente
sangúıneo materno.
Debido a esto, la administración se rea-
liza en la vena umbilical para que las na-
nopart́ıculas de PEI-PEG entren al sistema
del embrión y posteriormente a las células
objetivo.
7.3.2. Interacción con la célula diana
La primer barrera que se presenta es el
epitelio de los vasos sangúıneos, ya que la
población de las células diana no se encuen-
tra en la sangre, el vector debe salir de del
torrente sangúıneo. En condiciones norma-
les se puede atravesar el epitelio disconti-
nuo sin necesidad de ligandos para lograr la
extravasación, este presenta espacios entre
las células endoteliales (fenestraciones) que
oscilan entre los 30 y 500 nm, conveniente-
mente el tamaño de las nanoparticulas de
PEI-PEG no superan los 70 nm lo que su-
pone una muy considerable ventaja.Sin embargo, es necesario realizar ensa-
yos con y sin ligandos que favorescan la ex-
travasación, ya que sino logran pasar la ba-
rrera endotelial y no se obtienen reultados
positivos para la terapia se podŕıan malin-
terpretar los mismos.
Una vez en el espacio extracelular los an-
ticuerpos FGF-8 antihumano/conejo (antiFGF-
8) en los PEI-PEG son fundamentales pa-
ra que puedan interaccionar de manera es-
pećıfica con el mesenquima presente en el
primer arco faringeo, la unión se puede lle-
var por dos v́ıas muy similares, en una los
antiFGF-8 interacciona con las moléculas de
10
FGF-8 circundantes, de esta forma el re-
ceptor para FGF-8 presente en el mesen-
quima interaccionará con la molécula FGF-
8 que ya se encuentra conjugada en el na-
noveh́ıculo formando un sándwich entre el
anticuerpo-FGF-8 , molécula de FGF-8 y re-
ceptor de FGF-8; por otro lado en lo que se
diferenćıa es que la molécula de FGF-8 ya se
encuentre unida a su receptor al momento
de la llegada de la nanopart́ıcula de PEI-
PEG.
Figura 10: Proceso de vectorización de ma-
terial génetico con nanopart́ıculas
Independientemente de cualquiera de las
dos v́ıas, se lleva a cabo el proceso de endo-
citosis, una vez dentro de la célula se debe
mantener ı́ntegro el contenido de las PEI-
PEG, convenientemente una de las propie-
dades del PEI es que puede proteger mate-
rial genético de la degradación en el com-
partimento de endosomas / lisosomas, debi-
do al efecto de esponja de protones, como se
muestra en la figura 11.
El PEI es un poĺımero que contiene ami-
nas aisladas por grupos etileno y es hidrófo-
bo debido a su rica estructura en etileno.
La cadena de PEI se carga positivamente en
entornos ácidos, lo que se debe a la proto-
nación de amina secundaria a lo largo de la
columna vertebral. Debido a que el poĺımero
puede absorber iones H+, muestra propie-
dades tampón débiles, que son cŕıticas pa-
ra su uso como agente de administración de
material genético.
Figura 11: Mecanismo basado en la esponja
de protones (efecto tamponante del pH)
Eventualmente, la presión osmótica cau-
sa el hinchamiento y ruptura de los endo-
somas liberando su contenido al citosol y
aśı las part́ıculas se encontrarán libres en
el citosol listas para entrar al nucleo de la
célula y comenzar con la transfección.
7.3.3. Transfección
El transporte nucleocitoplasmático (NCT)
describe el intercambio de cargas molecula-
res a través de la envoltura nuclear (NE) que
encierra el núcleo del citoplasma en las célu-
las eucariotas. Esto está mediado por cana-
les de aproximadamente 60 nm de diámetro
en la NE conocidos como complejos de po-
ros nucleares (NPC), que forman las únicas
puertas de entrada acuosas al genoma. Los
NPC son permeables a moléculas pequeñas
de menos de 40 kDa (aproximadamente 5
nm), pero la entrada de grandes entidades
11
inespećıficas se ve afectada.[26]
Esta funcionalidad de barrera selectiva
se atribuye a varias protéınas altamente di-
námicas e intŕınsecamente desordenadas co-
nocidas como nucleoporinas fenilalanina-gli-
cina (FG Nups) que se encuentran dentro
del canal central NPC. El acceso exclusivo a
los NPC está reservado para los receptores
de transporte solubles conocidos como ca-
rioferinas (Kaps) que introducen cargas bio-
qúımicamente espećıficas que portan señales
de localización nuclear (NLS).
Para atravesar la barrera nuclear, se pro-
pone usar Kaps como receptor de importa-
ción, ejercen interacciones de unión multiva-
lentes con las FG Nups. La Kap β 1 forma
un heterod́ımero con un adaptador Kap α
(Kap α • Kap β 1), que autentica y se une
a las NLS. Para completar la importación
nuclear, las cargas NLS que transitan en el
complejo de poro nuclear deben liberarse en
el núcleo. Para esto se usa la GTPasa Ran,
que se une a Kap1 en su forma unida a GTP
(RanGTP) para liberar las cargas de Kap y
NLS dentro del núcleo.[26]
Paralelamente los poĺımeros catiónicos
liberan el contenido de las nanopart́ıculas de
PEI-PEG por interacción competitiva con el
ADN genómico, dando lugar al proceso de
edición génica.
Figura 12: Mecanismo de transporte nuclear
que implica carioferinas
Se estudió la actividad de transfección
del nanoveh́ıculo elegido para la elaboración
de este trabajo.
Primeramente se menciona que a pesar
de la PEGilación, los copoĺımeros resultan-
tes mostraron una actividad de transfección
muy similar a comparación con el homo-
poĺımero PEI.
Cabe señalar, que hay una teoŕıa bas-
tante amplia de que los copoĺımeros podŕıan
tener una mayor eficiencia a tamaños mayo-
res, sin embargo se requeren estudios poste-
riores para esta aseveración.
La complejidad del proceso de transfe-
rencia de genes, impide una correlación di-
recta de los resultados de transfección con
un único parámetro, ya sea f́ısico o qúımi-
co. Por lo que valores como el potencial z o
el tamaño, no podŕıan por śı solos explicar
apropiadamente la trasfección, se necesitan
más estudios para sustentar cualquier resul-
tado obtenido.
8. Caracterización
Para estudiar el tamaño y estructura del
complejo se propone realizar caracterizacio-
nes por medio de AFM (microscoṕıa de fuer-
za atómica) debido a que nos permite ob-
tener una observación directa en solución
acuosa con el objetivo de observar la topo-
graf́ıa de las nanopart́ıculas catiónicas po-
liméricas.
Para la estimación de la carga superficial
del complejo, se podŕıa medir el potencial z
mediante LDA (analisis discrimminante li-
neal).
Se propone ensayos de retardo de gel de
12
agarosa o ensayos de cambio de movilidad
electroforética (EMSA) que pueden ser utli-
zados para estudiar la condensación y for-
mación del complejos de ADN en función
de la relaión N/P.
La hemocompatibilidad se evalúa en con-
diciones in vitro usando hemolysis y agrega-
ción de eritrocitos. Siendo este paso un pre-
rrequisito para la administración intraveno-
sa del complejo tanto en animales como hu-
manos. Para la evaluación de citotoxicidad,
es posible hacer uso de un ensayo lactato
deshidrogenasa (LDH), el cual provee infor-
mación de las interacciones destructivas del
complejo con las membranas celulares.
Mediante microscoṕıa de fluoresencia de
campo ancho seŕıa posible evaluar la absor-
ción nuclear de del ADN acarreado, pun-
to importante para la viabilidad de esta te-
rapéutica, debido a la necesidad de llevar el
ADN normal hata el núcleo de la célula.
9. Viabilidad
Con base a la bibliograf́ıa consultada y
en comparación con aplicaciones en terapéuti-
ca génica por parte de los nanoveh́ıculos pro-
puestos de PEI-PEG se puede inferir que
el proyecto es claramente viable. Por obvias
razones se tienen que hacer ensayos para de-
terminar la dosis efectiva, siendo esto muy
importante para disminuir el riesgo de toxi-
cidad por bioacumulación; aśı como también
pruebas hematológicas, ya que la v́ıa de ad-
ministración es por el torrente sangúıneo.
Durante las pruebas in vivo en animales,
se aprovecha el hecho de que se usan anti-
cuerpos anti- humano/conejo para obtener
resultados significativos. Otro punto impor-
tante en esta prueba es que existe la posi-
bilidad de que debido a las propiedades del
nanoveh́ıculo, este se introduzca en alguna
celula que no sea perteneciente a la pobla-
ción diana, en esta situación la problemática
es mı́nima ya que simplemente se corrige la
región del gen IRF6, el cual puede o no ex-
presarlo sin riesgo; lo que podŕıa suponer un
problema es la bioacumulación.
La terapia génica actualmente atravie-
sa dificultades para lograr que los vectores
alcancen el material genético, acompañado
por el estigma de los casos fallidos, merman-
do la confianza que puede tener la población
en la aplicación de esta terapia. El trabajo
en conjunto con la nanotecnoloǵıa abre ca-
mino a una terapia más segura y efectiva,
para el LPH es una opción viable como al-
ternativa al único tratamiento actual que es
la ciruǵıa y que involucra un alto costomo-
netario y psicológico para las familias afec-
tadas.
10. Conclusiones
En la actualidad es claro el rechazo a
técnicas que involucren modificaciones a ni-
vel genético por parte de la sociedad. Es
entendible, pues se nos ha dado a entender
que el ADN es el código biológico que dicta
quiénes somos y cómo nos desarrollaremos
a los largo de nuestras vidas.
Sin embargo, olvidamos que el entorno
también modifica el desarrollo de cada uno.
Además, los seres humanos tendemos a re-
chazar lo que es nuevo, tan solo porque nos
acostumbramos a lo anterior que ya nos tie-
ne en una zona de comodidad.
Aunque el estudio del genoma y la tera-
pia génica tienen ya décadas siendo desarro-
llados. Es notable el hecho de que se necesi-
13
tan muchos más estudios novedosos que con-
sigan una aplicación práctica de la misma,
aśı eventualmente el conocimiento se irá di-
fundiendo en la sociedad que acabará por
aceptar y hasta preferir estos nuevos trata-
mientos a los convencionales.No solo debi-
do a que son más rápidos, sino que también
ofrecen soluciones a problemas ni siquiera
antes considerados.
Este trabajo es un ejemplo claro de las
posibilidades prácticas que tiene la fusión de
la nanotecnoloǵıa y la terápia génica. Pues
más allá de poder evitar el desarrollo de
LPH, con la adición de nanoveh́ıculos co-
mo los mostrados en este documento; esto
puede extrapolarse para tratar o evitar casi
cualquier condición o enfermedad dada por
algún fallo en el código genético. Podŕıamos
hablar de aplicaciones para malformaciones,
alteraciones de la vista u otros sentidos e
incluso evitar mayores incidencias de enfer-
medades como el cáncer y la diabetes.
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