Practica 7 - Número más probable (NMP) (1) - José Alejandro Del Campo Vázquez

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA (BT1007) 
 
PRACTICA 7. TÉCNICA DE RECUENTO POR EL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP). 
 
OBJETIVO: 
Aplicar una técnica indirecta en el recuento de microorganismos indicadores de 
prácticas antihigiénicas para determinar la calidad microbiológica de agua y alimentos. 
 
 
INTRODUCCIÓN: 
Las técnicas objeto de esta práctica difieren marcadamente en su naturaleza, 
precisión y exactitud, de las descritas en la práctica anterior. En tanto en estas últimas se 
efectúa un recuento real de unidades, (las colonias microbianas), a partir del cual, mediante 
cálculo, se llega a la cifra que expresará la carga microbiana presente; en las nuevas técnicas 
que se estudiarán, no existe tal recuento. La estimación del contenido en gérmenes se hace 
con base a la magnitud del cambio observado en los cultivos como resultado de la actividad 
bacteriana. Son pues, verdaderas estimaciones y no recuentos en el sentido estricto de la 
palabra a pesar de que los resultados se expresan en número de microorganismos por g. 6 
ml de material. 
 
La técnica de número más probable (NMP) encuentra amplia aplicación para 
determinar la calidad sanitaria del agua y alimentos. Como en el caso del recuento en placa, 
con la técnica del NMP solo se pone de manifiesto una parte del total de la flora bacteriana 
presente y su diseño particular, inclusive los medios de cultivo utilizados, siguen ese 
propósito. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Técnicas del número más probable (NMP) 
Está técnica descansa en una base estadística, matemática inobjetable, para expresar 
cuantitativamente la densidad de microorganismos en material. La prueba consiste en 
inocular series de tubos con un medio de cultivo y algún dispositivo o indicador que permita 
poner de manifiesto un microorganismo o un grupo particular de ellos. Un cierto número de 
tubos se inocula con volúmenes definidos de muestras; por ejemplo 3 tubos con 10 mI, 3 con 
1 ml y 3 con 0.1 ml, 6 5 con 10 ml, uno con 1 ml y uno con 0.1 mL ó 6 g. de muestra, etc. 
Después de la incubación es de esperarse, si la distribución de gérmenes viables es 
homogénea en la muestra original, un número de tubos positivos en proporción directa al 
contenido microbiano de la muestra. Para cada combinación de tubos positivos, con 
respecto a los inoculados, existe un número que puede consultarse en las tablas que para el 
efecto acompañan al método. 
 
En la preparación de estas tablas se ha utilizado el cálculo estadístico mediante 
fórmulas que conducen a límites de confianza para el numero que por tal razón se ha 
clasificado de más probable. Los límites de confianza de 0.95 significa que, de 100 ensayos 
practicados en la muestra bajo estudio, 95 de ellos darán resultados entre tales límites. 
 
La técnica de NMP requiere de mucho más material que la utilizada en los recuentos 
en placa y se considera en general, que posee una menor exactitud y precisión; es, sin 
embargo, incomparablemente más sensible ya que pone de manifiesto unos cuantos 
gérmenes o uno solo, en un gran volumen de muestra (teóricamente, litros). Por esta razón 
encuentra aplicación en el análisis del agua, por ejemplo, en donde la presencia de 2 
organismos coliformes en 100 ml, ya reclama atención especial en su sistema de 
abastecimiento. Para este propósito obviamente, no debe usarse, por impráctico, el 
recuento por vaciado en placa. 
 
Con frecuencia en la aplicación de la técnica de NMP para un grupo particular de 
microorganismos, el ensayo se extiende a dos o más estadíos; en el primero, que constituye 
la prueba presuntiva, los tubos positivos pueden ser el resultado de la actividad del 
microorganismo en cuestión, pues también de otros con comportamiento similar e incluso, 
de asociaciones de diferentes microorganismos. Lo que viene a ser la prueba presuntiva en 
la investigación de organismos coliformes, consiste en inocular alícuotas de la muestra de 
tubos de fermentación con caldo lactosado. En ello, estos microorganismos proliferan 
fácilmente fermentando la lactosa y liberando anhídrido carbónico que en gran cantidad se 
acumula en la campana o tubo de Durham. Un efecto semejante puede ocurrir en ausencia 
de organismos coliformes como resultado de la acción sinérgica de dos tipos de bacterias; 
una capaz de fermentar la lactosa hasta ácido láctico y pirúvico; y otra que metaboliza estos 
ácidos generando el gas aldehído y ácidos menores. Algunas bacterias Gram positivas 
también pueden, aunque en menor grado producir gas a partir de la lactosa. Se hace por ello 
indispensable efectuar un segundo ensayo, llamado prueba confirmatoria en el cuál los 
organismos coliformes en caso de existir, proliferan activamente en tanto que los falsos 
positivos serán inhibidos por la presencia de substancias selectivas antibacterianas 
adicionadas al medio de confirmación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIALES: REACTIVOS: 
 Mechero Bunsen * Caldo lactosado 
 Campanas Durham * Agua destilada 
 Tubos de ensayo * Diluyente de peptona 
 Micropipetas de 1000 μl y 200 μl. * Caldo verde brillante 
 Puntas para micropipetas estériles. 
 Frascos dilutores 
 Bolsas para estomacher 
 
 
 
 
 
 
 
 
METODOLOGÍA: 
 
PRUEBA PRESUNTIVA. 
1. Inocular tres tubos de caldo lauril sulfato con 1 ml de la dilución 10-1, tres tubos con 1ml 
de la dilución 10-2 y tres tubos con 1ml de la dilución 10-3. 
2. Incubar a 37ºC durante 48 horas. 
3. Observar en cada tubo la presencia de gas en cualquier cantidad dentro de la campana 
de fermentación. 
 
PRUEBA CONFIRMATIVA. 
1. Transferir de cada tubo positivo de 2 a 3 asadas del cultivo a un tubo de fermentación 
con caldo verde brillante- bilis 2%. 
2. Incubar a 35-37ºC durante 48 horas. 
3. La formación de gas dentro de la campana hace la prueba positiva. 
4. Determinar el NMP De Organismos coliformes de acuerdo con la tabla apropiada (No. 4). 
 
 
 
 
PRUEBA PRESUNTIVA 
CUESTIONARIO: 
1. Defina el concepto de organismos coliformes e indique la conformación del grupo. 
 
2. Mencione el fundamento de la técnica del número más probable (NMP). 
 
3. Explique el significado de la presencia del grupo coliforme en agua y alimentos. 
 
4. Indique la Norma Oficial Mexicana respecto a organismos coliformes en agua para uso y 
consumo humano (NOM-127-SSA1-1994)