Metodos de estudio de bacterias - Maria Guadalupe Cuadras Zazueta

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Alumna: Cuadras Zazueta Maria Guadalupe 
Matricula: 20040245 
Grupo: C-102 Matutino 
Profesor: Dra. Gabriela Servín de la Mora López 
Materia: Bacteriología 
Programa: Ciencias Biomédicas 
Unidad Regional Culiacán 
Fecha de entrega: 28/04/2022 
 
 
Metodos de estudio de bacterias 
 
 
 
1. Métodos directos: se basan en la enumeración directa de las células bacterianas. 
Las técnicas utilizadas son: 
➢ Conteo Directo al Microscopio CDM: Una pequeña cantidad de muestra se 
expone uniformemente sobre un área prescrita de un portaobjeto la cual 
después de secada se tiñe y las células individuales o agregados de bacterias 
son contadas en varios campos usando un microscopio compuesto con una 
iluminación convencional. A partir del número de células o agregados 
contados y del número de campos examinados, se calcula un conteo por 
mililitro de la muestra original. 
➢ Epifluorescencia Directa (DEFT): se basa en el filtrado de la muestra a 
través de una membrana que retiene mohos, bacterias y levaduras y en teñir 
estos microorganismos con el colorante fluorescente para su conteo 
mediante microscopio de epifluorescencia. 
➢ Dispensor de placa (Plate Loop): fue adaptado ampliamente para la 
estimación de la calidad de la muestra y se emplea un asa calibrada para 
transferir una porción definida de una muestra en una placa de Petri en una 
sola operación. El equipo ensamblado consiste en un asa de platino 
calibrado que se inserta al final de una aguja hipodérmica (Lver-lok) en un 
ángulo de 30o. La aguja esta acoplada a un dispositivo que pipetea de forma 
continua un diluyente estéril administrado con la pipeta. El resto de la 
prueba incluye el vaciado de las placas, incubación y conteo de colonias que 
se lleva a cabo de la misma forma que el método convencional de conteo en 
placa o CSP. 
➢ Sistema de Conteo en Espiral: dispone de un dispensador que deposita de 
forma continua un volumen decreciente de líquido en la superficie de una 
placa de agar que gira a una velocidad adecuada mientras el dispensador se 
mueve desde el centro hasta el extremo, dando lugar a una espiral de 
Arquímedes. El sistema diluye y siembra de forma que se puede determinar 
un intervalo amplio de conteo de colonias en una sola placa. Se le señalan 
como limitaciones el costo y algunas dificultades para el conteo de mohos 
(Fung, 1994). 
➢ Petrifilm: consiste en dos piezas fílmicas que contactan con el nutriente de 
medio en su estado sólido. La muestra diluida es aplicada sobre el film y 
después de incubada, las colonias son contadas mediante el revelado. La 
técnica se ha empleado en la estimación de psicrófilos con resultados 
aproximados de 48 horas incluyendo el período de preincubación. Los 
valores de correlación son posibles entre 75 y 80 y se plantea como ventaja 
la ausencia de costo inicial significativo y el bajo costo por muestra. 
 
2. Métodos indirectos: están relacionados con la actividad metabólica o con 
mediciones de constituyentes específicos de la célula durante el crecimiento y se 
clasifican de la siguiente forma: 
Primer grupo: Actividad metabólica 
 
 
➢ Catalasa: La catalasa es una enzima presente en las células de la mayoría de 
los animales y plantas, la cual cataliza la reacción: 
2H2O2-----2H2O + O2 
ROOH + AH2 ----- H2O + ROH + A 
No está tan claro si el papel de la catalasa es solamente descomponer el 
H2O2, o también catalizar mediante la catalasa y el H2O2, incluyendo 
metanol, etanol, ácido fórmico y fenoles. Se escriben dos métodos para esta 
determinación, uno es el método de la columna de gas con pipeta de Pasteur 
y el segundo sistema es el que se conoce comercialmente como 
CATALASAMETER (equipo automatizado). 
➢ Reductasa: Los tests de reducción de colorantes se han utilizado durante 
muchos años como indicadores de la calidad microbiológica. Están basados 
en la medición de la actividad metabólica de las bacterias, ya que muchas de 
ellas poseen las enzimas deshidrogenasas, las cuales transfieren hidrógeno 
de un sustrato a un aceptor biológico reduciéndolo. Tal es el uso de la 
Prueba de Reducción del Azul de Metileno, de la Resazurina y del 
Trifenilfetrazolium. En el procedimiento se utilizan patrones de azul de 
metileno o resazurina y se observa el proceso de reducción del colorante (de 
azul a blanco para el azul de metileno; de azul apizarrado a rosa o blanco 
para la resazurina). El tiempo necesario para que se produzca la reducción 
del colorante está relacionado con el número de microorganismos de la 
muestra. 
➢ Citocromo E oxidasa: Esta enzima cataliza la reducción del oxígeno a H2O 
y es una importante terminal en el mecanismo de la respiración de ciertas 
bacterias, la misma puede ser utilizada como una medida de activad 
metabólica y del número de M.O. En la detección se utiliza una prueba de 
reducción de colorantes con N,N1, N1 tetrametil - p – fenileno-diamina 
(TMPD), el cual ha sido extensamente utilizado en importantes pruebas 
taxonómicas. La prueba fue utilizada en la determinación y enumeración de 
psicrófilos Gram negativos, la misma es simples, fácil y rápida brindando 
resultados en 5 min. El método puede detectar 104 ufc/mL o más, no siendo 
sensible para determinar organismos psicrófilos. 
➢ Microcalorimetría: Se basa en la medida de los pequeños cambios en la 
producción de calor resultante del crecimiento microbiano, estando 
implicadas las modificaciones en la entalpía. Esta técnica se ha utilizado con 
éxito para el recuento de bacterias durante la alteración de conservas 
enlatadas y el pan, así como la diferenciación entre las Enterobacterias. Para 
la determinación de los datos microcalorimétricos se obliga el empleo de 
calorímetros especiales, los cuales pueden ser automatizados o 
computarizados, los dos tipos más utilizados son los Calorímetros 
adiabáticos y los Fluxométricos térmicos. El CALVET es uno de los más 
empleados. 
 
 
➢ Flujo citométrico: Es un método automatizado para el conteo de células 
individuales previamente separadas y teñidas sobre una lámina, al pasar por 
un flujo laminar ubicado en el plano focal del detector. 
➢ Turbidimetría: Las bacterias (y cualquier otra materia suspendida), absorben 
y dispersan la luz transmitida la cual es medida de una frecuencia fija 
registrando así los cambios turbidimétricos del medio de cultivo líquido al 
relacionarlo con el control estéril, cambios cualitativos que indican el 
crecimiento microbiano y los mismos pueden ser cuantificables cuando son 
calibrados contra parámetros cuantificables conocidos, tales como el conteo 
celular y/o el peso seco. 
 Segundo grupo 
➢ Piruvato: El piruvato es un compuesto intermedio dentro de una gama amplia 
de elementos formados por la actividad metabólica y por ello es 
constituyente de todas las células bacterianas. Se sugiere la medición del 
piruvato como un indicador de la calidad higiénica de la muestra. la medición 
del piruvato no es un método factible para determinar la calidad higiénica por 
ejemplo de la leche con bajos niveles microbianos, siendo solo útil para 
detectar leches con altos conteos bacterianos (1x108ufc/mL). La prueba tiene 
como ventajas su rapidez y facilidad de automatización. 
➢ Bioluminiscencia: Se basa en una serie de reacciones enzimáticas 
(generalmente a cargo de oxidasas) que cursan con una emisión de luz y tiene 
lugar en determinados seres vivos, como por ejemplo en la luciérnaga. Para 
su procedimiento se obtiene la enzima luciferasa de un coleóptero de la 
familia Lampyres, el Photinus pyralis, la cual, en presencia de sus dos 
sustratos, luciferina y ATP microbiano, produce una reacción 
bioluminiscente que se puede medir con un espectrofotómetro. La luz 
emitida es proporcional a la cantidad de ATP presente en la muestra, se 
puede por lo tanto hacer una estimación del número de M.O ya que el 
contenido de ATP en las células bacterianas es generalmenteconstante (1 fg 
ATP/cel) sobre circunstancias determinadas en las cuales la luciferina y 
luciferasa estén en exceso. 
 
3. Métodos alternativos: 
➢ Inmunoensayos: La prueba de inmunoensayo se basa en una interacción de 
antígenos y anticuerpos que pueden ser visualizada por aglutinación o 
formación de grumos, desarrollo de colores a partir de sustratos 
cromogéticos, formación de una inmunobanda o fluorescencia. El test de 
ELISA para detectar Salmonella y Listeria se desarrolló sobre los años 80, 
este test emplea micro ELISA acompañada de Ac monoclonales para 
Salmonella o Listeria. En estudios efectuados sobre las muestras 
contaminadas artificialmente con Salmonella, para evaluar kit de ELISA con 
 
 
el método convencional no se encontraron diferencias significativas ni en su 
sensibilidad ni especificidad. 
➢ PCR: El PCR es una técnica utilizada para amplificar un segmento de DNA 
que es franqueado por dos regiones de la frecuencia conocida. Es un 
protocolo típico de PCR la DNA polimerasa termoestable y un 5´ 3´ 
oligonucleótido especifico son sometidos a una serie de reacciones de 
polimerización para amplificar la molécula de DNA a 102 moléculas. El 
DNA amplificado es detectado mediante el uso de gel agarosa o una 
hibridación meridional empleando una prueba sexológica. Esta técnica ha 
sido una alternativa atractiva para la detección de bajas concentraciones de 
M.O patógenos (102 ufc/g). Esta técnica es altamente sensible, específica y 
no requiere de cultivos de enriquecimientos. Sus principales limitaciones la 
constituyen la obtención del preparado de DNA para la amplificación, la 
producción de un preparado PCR no especifico y el requerimiento de un 
ambiente de trabajo muy limpio. También los M.O que son muertos durante 
el procesamiento no son reconocidos como tale y si un DNA está presente lo 
dará como falsos positivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referencias 
Davila Fernandez Nuria, H. G. (Julio de 2006). Métodos de ensayos rápidos de detección de 
microorganismos en la leche. REDVET. Revista Electrónica de Veterinaria, VII(7), 1-18. 
Recuperado el 28 de Abril de 2022, de 
https://www.redalyc.org/pdf/636/63612753003.pdf