rflps Salmonella

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UNIVERSIDAD DE LA GUAJIRA 
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS 
PROGRAMA DE BIOLOGÍA 
BIOLOGÍA MOLECULAR 
TRABAJO DE LABORATORIO 02 
PRUEBAS DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN EN PCR IN - SILICO RFLP CON EL GENOMA COMPLETO DE SALMONELLA ENTÉRICA Y 4 CEPAS DE LA MISMA ESPECIE. 
DESCRIPCIÓN DEL TRABAJO 
La PCR in Silico, hace referencia a las herramientas informáticas utilizadas para calcular los resultados teóricos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un conjunto determinado de cebadores (sondas) para amplificar las secuencias de ADN de un genoma secuenciado o transcriptoma. (Kumar & Chordia, 2015). 
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). (Teijón, J. M. (2006) 
Salmonella es un patógeno transmitido por el consumo de alimentos y agua contaminada, de elevada prevalencia. La PCR representa una valiosa alternativa para el estudio de los genes a nivel mundial, en Salmonella. Los fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLPs) son un tipo de polimorfismo que resulta de la variación en la secuencia de ADN reconocida por las enzimas de restricción. Estas son enzimas bacterianas que se utilizan para cortar moléculas de ADN en lugares conocidos, esta técnica permite identificar especies que presentan similitud, en este caso la Salmonella entérica y diferentes cepas. 
Para este trabajo se escogió la Salmonella entérica debido a que esta es una bacteria común, y tiene numerosas investigaciones, por lo cual hay diferentes estudios de varias cepas de la especie de la Salmonella entérica. 
Objetivos 
Objetivo general 
• describir la metodología de la PCR In - Silico - RFLP usando el genoma completo del modelo de Salmonella entérica y 4 cepas de Salmonella entérica usando enzimas de restricción 
Objetivo Específico 
Comparar los resultados obtenidos por las mismas en enzimas de restricción en PCR In - Silico RFLP en el genoma completo de Salmonella entérica modelo y 4 cepas de la misma especie.
Metodología 
Para la utilización de las enzimas de restricción en la especie Salmonella entérica y las cepas que se usaron de la misma especie, se hizo una revisión bibliográfica en la base de dato de la página web del NCBI (Cheraghchi et al.,2014) y (Soler et al., 2014) con el fin de saber que enzimas de digestión pudieran cortar el genoma completo. Además de estos se hizo una revisión en la página web de la PCR In - Silico de las enzimas de digestión que podrían cortar el genoma del género de Salmonella, con el fin de obtener las enzimas modelos de restricción (TaqI y BamhI), para Salmonella entérica y las cepas Salmonella entérica. ya con todo este dato se realizó el corte con las mismas enzimas, usando los mismos cebadores en cada uno de los genomas de las especies usadas con el objetivo de realizar una electroforesis y comparar los cortes realizados en cada una de las especies usado para determinar similitud. 
Resultados 
Figura 1: Especie modelo de Salmonella entérica datos obtenidos en PCR RFLP.
Figura 2 Cepas de la especie Salmonella a) Salmonella entérica serovar Newport str. USMARC-S3124.1 b) Salmonella enterica serovar Typhi str. P-stx-12 c) Salmonella enterica serovar Montevideo d) Salmonella enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150.
Figura 3: Representación electroforética de un RFLP en Salmonella entérica 
ANÁLISIS DE RESULTADOS 
La figura 1 y 2 muestra los resultados de los cortes que realizó las enzimas de digestión TaqI y BamhI en la especie Salmonella entérica y las cuatro cepas que se usaron en la cual se puede observar la similitud de los resultados en la figura 3 en la electroforesis, en la cual las enzimas de restricción cortan por igual en cada una de las especies de Salmonella entérica 
en la base 180bs esto se puede deber a la relación clonal que existe entre las 4 cepas. ahora la electroforesis también muestra diferencia en los cortes que realizaron la enzimas de restricción una de la causas que pueden influir en la diferencia de los cortes es que Salmonella entérica puede adquirir genes de elementos genéticos móviles (MGEs) como lo señala Haider et al., 2022 permitiendo a dicha especie una mayor flexibilidad y poblaciones bacterianas variadas de la misma especie, otros factores que pudieran estar contribuyendo a la diferencia en los cortes de la enzimas de restricción es que hay regiones génicas entre ellas los genes gyrA, gyrB, parC y parE entre otros que son más susceptibles a mutaciones genéticas modificando el genoma de Salmonella enterica afectando codones como er-83, Gly-81 y Asp-87 (Talavera et., 2007), por último un estudio llevado por Miró et al., 2004 menciona una relación con mutaciones en las topoisomerasas que pueden afectar el genoma 
de Salmonella entérica haciéndola resistente acierto tipos de antibióticos modificando su genoma por lo cual enzimas digestivas no pudieran reconocer el corte o el corte en el genoma se podría presentar en otra posición del genoma. 
CONCLUSIÓN 
Los resultados de la PCR-RFLP arrojaron resultados que permitieron con éxito comparar la similitud clonal entre cepas de Salmonella entérica y además diferenciar mutaciones puntuales que pudieron haber surgido en las cepas de Salmonella entérica por lo que esta técnica podría ser efectiva para detectar las mutaciones descritas con mayor frecuencia en Salmonella entérica (análisis de resultados), a pesar que las enzimas de restricción pueden cortar partes iguales el genoma de las especies en estudio en cierto punto, no significa que las enzimas de digestión corten todas la cepas de manera igual y es esto lo que permite comparar genéticamente a Salmonella entérica con sus cepas. Sin Embargo, aunque en los resultados se presentaron diferentes explicaciones acerca de las posibles mutaciones que pudieron haber surgido en las cepas de Salmonella entérica, estas no son suficientes para explicar el surgimiento de las cepas de Salmonella entérica en estudio, debido a que los objetivos del trabajo y la metodología usada van más encaminado a mostrar similitudes y diferencias entre cepas de la misma especie 
Bibliografía 
● Cheraghchi, N., Khaki, P., Moradi Bidhendi, S., & Sabokbar, A. (2014). Identification of Isolated Salmonella enterica Serotype gallinarum Biotype Pullorum and Gallinarum by PCR-RFLP. Jundishapur journal of microbiology, 7(9), e19135. https://doi.org/10.5812/jjm.19135 
● Haider, MZ, Shabbir, M., Yaqub, T., Sattar, A., Maan, MK, Mahmood, S., Mehmood, T. y Aslam, HB (2022). Sistema CRISPR-Cas: una asociación del sistema inmunitario adaptativo con la resistencia a los antibióticos en Salmonella enterica Serovar Enteritidis. Investigación internacional de BioMed, 2022, 9080396. https://doi.org/10.1155/2022/9080396 
● http://insilico.ehu.es/PCR/index.php?mo=Salmonella 
● Kumar, A., & Chordia, N. (2015). In silico PCR primer designing and validation. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1275, 143–151. 
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2365-6_10 
● Miró, E., Vergés, C., García, I., Mirelis, B., Navarro, F., Coll, P., ... & Martínez Martínez, L. (2004). Resistencia a quinolonas y betalactámicos en Salmonella enterica, y su relación con mutaciones en las topoisomerasas, alteraciones en la permeabilidad celular y expresión de un mecanismo de expulsión activa. Enfermedades infecciosas y microbiología clínica, 22(4), 204-211.
● Soler-García, A. A., De Jesús, A. J., Taylor, K., & Brown, E. W. (2014). Differentiation of Salmonella strains from the SARA, SARB and SARC reference collections by using three genes PCR-RFLP and the 2100 Agilent Bioanalyzer. Frontiers in microbiology, 5, 417. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00417 
● Talavera-Rojas, M., Vazquez-Chagoyan, J. C., Flores-Bello, R., Robles-Gonzalez, F., Lagunas-Bernabe,S., & Alonso-Fresan, M. U. (2007). GyrA gene mutations and fluoroquinolone resistance in Salmonella isolates from pigs in central Mexico. Veterinary record, 160(18), 630. 
● Teijón, J. M. (2006). Fundamentos de bioquímica estructural. Editorial Tébar.