Classification, identification and typing en

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3 Clasificación, identificación y tipificación
de microorganismos
TL Pitt y MR Barer
PUNTOS CLAVE
Las algas (excluidas las algas verdiazules), los protozoos, los 
hongos y los hongos incluyen los eucariota ver cap. 2) 
microorganismos; sus células tienen el mismo tipo general de 
estructura y organización que las que se encuentran en plantas y 
animales. Las bacterias, incluidos los organismos de los grupos 
micoplasma, rickettsia y clamidia, junto con las algas verdeazuladas 
relacionadas, comprenden los microorganismos más pequeños, con 
la forma de organización celular descrita como
procariota. Las arqueas son un grupo filogenético distinto de procariotas 
que sólo tienen una relación ancestral remota con otros organismos 
(véase el capítulo 2). Dado que actualmente no se cree que las algas, los 
mohos limosos y las arqueas contengan especies de importancia médica 
o veterinaria, no se considerarán más. Las algas verdiazules no causan 
infección, pero ciertas especies producen potentes toxinas peptídicas 
que pueden afectar a personas o animales que ingieren agua 
contaminada.
Los virus son los agentes infecciosos más pequeños; tienen una 
estructura relativamente simple que no es comparable con la de una célula, y 
su modo de reproducción es fundamentalmente diferente al de los 
organismos celulares. Incluso más simples son viroides, fragmentos libres de 
proteínas de ARN circular monocatenario que causan enfermedades en las 
plantas. Otra clase de partículas infecciosas son priones, los agentes 
causantes de trastornos neurodegenerativos fatales en animales y en el 
hombre. Se postula que se trata de glicoproteínas de la membrana de la 
célula huésped que se producen de forma natural y que experimentan 
cambios conformativos en una isoforma infecciosa (v. Cap. 60).
• La taxonomía es la clasificación, nomenclatura e identificación 
de microbios (algas, protozoos, mohos limosos, hongos, 
bacterias, arqueas y virus). La denominación de organismos por 
género y especie se rige por un código internacional.
Las bacterias se pueden separar en dos divisiones principales por su 
reacción a la tinción de Gram, y exhiben una variedad de formas y 
tamaños, desde esféricas (cocos) hasta en forma de barra (bacilos) hasta 
filamentos y formas espirales. En la práctica clínica, las bacterias se 
clasifican por morfología macroscópica y microscópica, su requerimiento 
de oxígeno y actividad en pruebas fenotípicas y bioquímicas.
Se utilizan varios sistemas de pruebas de diagnóstico para detectar bacterias 
específicas en sistemas clínicos, incluidas sondas de genes específicos, 
reacción con anticuerpos en formatos ELISA, inmunofluorescencia y, cada vez 
más, tecnología basada en PCR.
Las diferentes especies bacterianas a menudo exhiben diferentes 
estructuras de población, muy diversas (panmícticas) o relativamente 
uniformes (clonales) dependiendo principalmente de la frecuencia de 
recombinación de genes (de fuentes externas).
La tipificación de los aislados bacterianos es necesaria para las 
investigaciones epidemiológicas en los brotes y para la vigilancia, y se ha 
desarrollado una variedad de métodos genéticos y fenotípicos para la 
identificación de cepas.
•
•
•
•
•
Los microorganismos pueden clasificarse en los siguientes grandes grupos 
biológicos:
1. Algas
2. Protozoos
3. Moldes de limo
4. Hongos
5. Bacterias
6. Archaea
7. Virus.
TAXONOMÍA
Taxonomía consta de tres componentes: clasificación, nomenclatura y identificación. 
La clasificación permite la agrupación ordenada de microorganismos, 
mientras que la nomenclatura se refiere al nombre de estos 
organismos y requiere un acuerdo para que todos utilicen el mismo 
nombre sin ambigüedades. Los cambios en la nomenclatura pueden 
dar lugar a confusión y están sujetos a
24
CLASIFICACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE MICRO-ORGANISMOS 3
reglas acordadas internacionalmente. En la práctica clínica, los microbiólogos 
generalmente se preocupan por la identificación
- la denominación correcta de los aislamientos de acuerdo con los sistemas 
de clasificación acordados. Estos componentes, junto con la taxonomía, 
conforman la disciplina general de
sistemática, que se ocupa de la evolución, la genética y la 
especiación de los organismos, y se conoce comúnmente como filogenética.
Los protozoos, hongos y helmintos se clasifican y nombran de 
acuerdo con las reglas estándar de clasificación y nomenclatura 
que se han desarrollado siguiendo el trabajo pionero del botánico 
sueco del siglo XVIII Linnaeus (Carl von Linné). Las grandes 
subdivisiones (clase, orden, familia, etc.) finalmente se clasifican en 
individuales especies designado por un binomio latino, el primer 
término del cual es el género, p.ej
Plasmodium ( género) falciparum especies). En ocasiones, es útil 
reconocer una variante biológica con propiedades particulares: así, Trypanosoma 
( género)
brucei especies) gambiense variante) difiere de la variante T. brucei 
brucei en ser patógeno para el hombre.
Las bacterias se clasifican de manera similar, pero la diversidad 
bacteriana abarca más variedad que el resto de la vida celular junta y la 
capacidad natural de las bacterias para la variación y adaptación 
genéticas y fenotípicas dificulta las clasificaciones rígidas. Hasta la 
fecha, la identificación se ha realizado predominantemente mediante el 
uso de claves que permiten la organización de rasgos bacterianos en 
función del crecimiento o actividad en sistemas que prueban sus 
propiedades bioquímicas. Algunas pruebas son definitivas de un género 
o especie, por ejemplo, la producción universal de la enzima catalasa y 
el citocromo c, respectivamente, por Estafilococo spp. y Pseudomonas 
aeruginosa. Otros caracteres pueden ser exclusivos de especies 
individuales y servir para diferenciarlos de organismos con perfiles de 
actividad bioquímica muy similares. Algunas bacterias no crecen en el 
laboratorio (bacilo de la lepra, treponemas) y puede ser necesaria la 
identificación por métodos genéticos. A medida que las tecnologías para 
el análisis genético se vuelven más fácilmente aplicables en los 
laboratorios clínicos, estas y otros métodos analíticos rápidos, como los 
basados en la espectrometría de masas, están reemplazando a los 
métodos bioquímicos tradicionales para lograr la identificación. Los 
rangos taxonómicos utilizados en la clasificación de bacterias son 
(ejemplo entre paréntesis):
• Reino (Prokaryotae)
• División (Gracilicutes)
• Clase (Betaproteobacteria)
• Orden (Burkholderiales)
• Familia (Burkholderiaceae)
• Género ( Burkholderia)
• Especies ( Burkholderia cepacia).
Algunos géneros, como Acinetobacter, se han subdividido en varias 
especies genómicas mediante análisis de homología de ADN. Algunos 
se nombran y otros se denominan solo mediante un número. Muchas 
de las especies genómicas no se pueden diferenciar con precisión 
mediante pruebas fenotípicas. Otra agrupación de subgénero en el uso 
actual reconoce los complejos de especies, que sediferencian en 
genomovares mediante métodos taxonómicos polifásicos. Un buen 
ejemplo de esto es el B. cepacia
complejo de organismos, que incluye un grupo muy diverso de organismos 
que van desde patógenos estrictamente vegetales hasta humanos.
En la actualidad, ninguna clasificación estándar de bacterias se 
acepta y aplica universalmente, aunque Manual de Bergey de 
bacteriología determinante se utiliza ampliamente como fuente 
autorizada. La nomenclatura bacteriana se rige por un código 
internacional preparado por el Comité Internacional de Bacteriología 
Sistemática y publicado como Listas aprobadas de nombres 
bacterianos
en el Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva; la mayoría 
de las especies nuevas también se describen por primera vez en esta revista, y 
se considera que una especie se ha publicado de forma válida solo si aparece 
en una lista de validación en esta revista.
El Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) clasifica los 
virus y publica sus informes en la revista Archivos de Virología. Los 
nombres latinos se utilizan siempre que es posible para los rangos de 
familia, subfamilia y género, pero en la actualidad no hay categorías 
formales superiores a la familia y no se utiliza nomenclatura binomial 
para las especies. Los virus no se prestan fácilmente a la clasificación 
de acuerdo con los principios linneanos, y los nombres vernáculos 
todavía tienen un amplio uso entre los virólogos médicos. Se remite a 
los lectores al trabajo estándar sobre taxonomía de virus
Clasificación y nomenclatura de virus y el sitio web de la base de 
datos de ICTV.
MÉTODOS DE CLASIFICACIÓN
Clasificación adansoniana o numérica
En la mayoría de los sistemas de clasificación bacteriana, los grupos 
principales se distinguen por caracteres fundamentales como la forma 
celular, la reacción de tinción de Gram y la formación de esporas; Los 
géneros y especies se distinguen generalmente por propiedades como 
reacciones de fermentación, requerimientos nutricionales y patogenicidad. 
La relativa "importancia" de los diferentes personajes en la definición de 
agrupaciones mayores y menores suele ser puramente arbitraria. Las 
incertidumbres de las elecciones arbitrarias se evitan en el sistema de 
taxonomía adansoniano. Este sistema determina los grados de relación 
entre las cepas mediante un
25
3 BIOLOGÍA MICROBIANA
Similitud porcentual
40 50 60 70 80 90100
componente del ADN bacteriano, que varía entre 25 y 80% molar en 
diferentes géneros. Sin embargo, para cualquier especie, el contenido de G + 
C es relativamente fijo o se encuentra dentro de un rango muy estrecho, y 
esto proporciona una base para la clasificación.
A
B
mi
I
C
F
GRAMO
J
D
H
Homología de ADN
Otro enfoque de clasificación es organizar los organismos 
individuales en grupos sobre la base de la
homología de sus secuencias de bases de ADN. Esto aprovecha el hecho de 
que las hebras dobles se vuelven a formar (aparean) a partir de hebras 
separadas durante el enfriamiento controlado de una preparación calentada 
de ADN. Este proceso se puede demostrar fácilmente con ADN homólogo 
adecuadamente calentado extraído de una sola especie, pero también puede 
ocurrir con ADN de dos especies relacionadas, de modo que se producen 
pares híbridos de cadenas de ADN. Estos emparejamientos híbridos ocurren 
con alta frecuencia entre regiones complementarias de ADN, y el grado de 
hibridación puede evaluarse si se utilizan preparaciones de ADN marcado. 
Los estudios de unión con ARN mensajero (ARNm) también pueden brindar 
información para complementar estas observaciones, que proporcionan 
evidencia genética de parentesco entre bacterias. Es poco probable que los 
organismos con diferentes proporciones de G + C muestren una homología de 
ADN significativa. Sin embargo, organismos con el mismo, o cercano, Las 
proporciones G + C no necesariamente muestran homología. Se ha descrito 
una nueva reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) (véanse 
las págs. 31 y 79-80) para la estimación del contenido de G + C.
X
Figura 3.1 Árbol taxonómico jerárquico ( dendrograma) preparado a partir de datos de matriz de 
similitud. Las líneas discontinuas X e y indican niveles de similitud en los que podría ser posible 
la separación en géneros y especies.
Y
coeficiente estadístico que tiene en cuenta la más amplia gama de 
caracteres, todos los cuales se consideran de igual peso. Está claro, 
por supuesto, que algunos caracteres, como la forma celular o la 
reacción de tinción de Gram, representan un compromiso genético 
mucho más amplio y permanente que otros caracteres que, al depender 
de uno o pocos genes, pueden ser inestables. Por esta razón, el 
método Adansoniano es más útil para la clasificación de cepas dentro 
de una agrupación más grande que comparte caracteres principales.
Al puntuar un gran número de caracteres fenotípicos, es posible estimar 
un coeficiente de similitud cuando se consideran caracteres positivos 
compartidos o coeficiente de coincidencia cuando se tienen en cuenta tanto 
los caracteres compartidos negativos como los positivos (coincidencias). 
Esta taxonomía numérica se realiza mejor en una computadora que puede 
calcular grados de similitud para un grupo de organismos diferentes; estos 
datos se muestran como un matriz de similitud o un árbol dendrograma Figura 
3.1 ) (ver también
Owen 2004 en Lectura recomendada lista).
Secuenciación de ARN ribosómico
La estructura del ARN ribosómico (ARNr) parece haberse conservado en 
gran medida durante el curso de la evolución, y las similitudes cercanas en 
las secuencias de nucleótidos reflejan relaciones filogenéticas. Los 
avances en la tecnología han hecho que la secuenciación de nucleótidos 
sea relativamente simple, y las secuencias de ADNr (y otros genes) de la 
mayoría de las especies bacterianas de importancia médica están 
disponibles en varios sitios de Internet. Se conocen muchas menos 
secuencias de genes de longitud completa para el rRNA 23S que para el 
rRNA 16S y las secuencias transcritas internas de 16S-23S. En la práctica, 
el ADN del organismo de prueba se extrae y amplifica mediante PCR 
utilizando cebadores universales. Se determina la secuencia de ADN del 
producto y la secuencia se compara con bases de datos para encontrar el 
ajuste más cercano. Generalmente se acepta que la similitud de secuencia 
entre 0,5% y 1. Se requiere 0% (con la especie tipo) para la identificación 
de un organismo desconocido, y menos del 97% de similitud es un punto 
de corte común para la diferenciación de especies. Sin embargo, 
diferentes especies de Mycobacterium
Composición del ADN
El enlace de hidrógeno entre los pares de bases de guanina y citosina 
(G – C) en el ADN es más fuerte que el que existe entre la adenina y la 
timina (A – T). Por tanto, la temperatura de fusión o desnaturalización 
del ADN (a la que se separan las dos hebras) está determinada 
principalmente por el contenido de G + C. A la temperatura de fusión, la 
separación de las hebras provoca un cambio marcado en las 
características de absorción de la luz a una longitud de onda de 260 nm, 
y esto se detecta fácilmente mediante espectrofotometría. Hay una 
gama muy amplia en G + C
26
S
o
n
CLASIFICACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE MICRO-ORGANISMOS 3
puede exhibir más del 97% de similitud en la secuencia de ADNr. Hay 
sistemas comerciales disponibles para la identificación de especies 
bacterianas (MicroSeq; Applied Biosystems, Foster City, California, EE. 
UU.).
La variación de la secuencia de nucleótidos en los genes ribosomales 
a veces es insuficiente para discriminar entre especies estrechamente 
relacionadas. Se han explorado otros genes candidatos, pero el recA El 
gen, que codifica una proteína esencial para la reparación y 
recombinación del ADN, parece ser uno de los más adecuados para el 
análisis filogenético, ya quedefine árboles evolutivos consistentes con los 
observados para los genes de ARNr. Los genes de mantenimiento 
adicionales que se utilizan para los estudios filogenéticos incluyen rpoB ( ARN 
polimerasa), groEL proteína de choque térmico) y gyrB ( DNAgyrase), entre 
otros.
Cuadro 3.1 Clasificación simplificada de algunos microorganismos celulares de 
importancia médica
Nombre de grupo común nombres de género normales
Eucariotas
Protozoos
Esporozoos
flagelados
Amebas
otro
Hongos
como moho
similar a la levadura
Dimórfico
Levadura verdadera
Procariotas
Bacterias
Actinobacterias
Plasmodium, Isospora, Toxoplasma,
Cryptosporidium
Giardia, Trichomonas, Trypanosoma,
Leishmania
Entamoeba, Naegleria, Acanthamoeba
Babesia, Balantidium
Epidermophyton, Trichophyton,
Microsporum, Aspergillus
Candida
Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides
Cryptococcus
CLASIFICACIÓN EN LA PRÁCTICA CLÍNICA
(Gram positivos altos en G + C)
Actinomyces, Streptomyces,
Corynebacterium, Nocardia,
Micobacterias, micrococos
(Gram positivos bajos en G + C)
Listeria, Bacilo, Clostridium * ,
Lactobacillus * , Eubacterium *
Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus
Veillonella * , Mycoplasma
(un grupo muy grande con 5 subdivisiones)
Neisseria, Moraxella
Enterobacterias - Escherichia, Klebsiella, Proteus, 
Salmonella, Shigella, Yersinia
Pseudomonas - Pseudomonas,
Burkholderia, Stenotrophomonas
Haemophilus, Bordetella, Brucella,
Pasteurella
Rickettsia, Coxiella
Vibrio, Spirillum, Campylobacter,
Helicobacter
Bacteroides * , Prevotella *
Borrelia, Treponema, Brachyspira,
Leptospira
Clamidia
La identificación de microorganismos en la práctica habitual requiere un 
enfoque pragmático de la taxonomía. El propósito principal de los 
nombres utilizados es comunicarse entre los equipos clínicos y de salud 
pública para que se pueda implementar una gestión adecuada de 
individuos y grupos. Desafortunadamente, a medida que aprendemos 
más sobre la interrelación de los microbios, en gran parte a través de los 
datos de la secuencia del genoma, se hace necesaria cierta reasignación 
y cambio de nombre para mantener una relación coherente con nuestra 
comprensión básica.
Cuadro 3.1 describe un esquema de clasificación simple pero práctico en el que 
los organismos se agrupan de acuerdo con unas pocas características 
compartidas; en la medida de lo posible, se han conciliado con la nomenclatura 
filogenética establecida relativamente recientemente. Dentro de estos grupos, 
los organismos pueden identificarse más, a veces a nivel de especie, mediante 
algunas pruebas complementarias. Los protozoos, helmintos y hongos a 
menudo se pueden identificar de manera definitiva basándose únicamente en 
criterios morfológicos (véanse los capítulos correspondientes).
Firmicutes
Bacilos grampositivos
Cocos grampositivos
Cocos gramnegativos **
Proteobacterias
Cocos gramnegativos
Bacilos gramnegativos
Gram-negativos curvados
y bacilos espirales
Bacteroidetetes
Espiroquetas
Clamidia
* Organismo anaeróbico.
* * Excepciones en un grupo predominantemente grampositivo.
Protozoos
Estos son organismos unicelulares no fotosintéticos con protoplasma 
claramente diferenciado en núcleo y citoplasma. Son relativamente grandes, 
con diámetros transversales principalmente en el rango de 2 a 100 µµ metro. 
Sus membranas superficiales varían en complejidad y rigidez desde una 
membrana delgada y flexible en las amebas, que permite cambios 
importantes en la forma celular y la protuberancia de pseudópodos con fines 
de locomoción e ingestión, hasta una película relativamente rígida en los 
protozoos ciliados, que conserva una célula característica. forma. La 
mayoría de las especies de vida libre y algunas especies parasitarias 
capturan, ingieren
y digerir partículas sólidas internamente de material alimenticio; muchos 
protozoos, por ejemplo, se alimentan de bacterias. Los protozoos, por lo 
tanto, se consideran generalmente como las formas más bajas de vida 
animal, aunque ciertos protozoos flagelados están estrechamente 
relacionados en su morfología y modo de desarrollo con las algas flageladas 
fotosintéticas en el reino vegetal. Los protozoos se reproducen 
asexualmente por fisión binaria o fisión múltiple ( esquizogonia),
y algunos también por un mecanismo sexual ( esporogonía).
27
3 BIOLOGÍA MICROBIANA
Los grupos más importantes de protozoos médicos son los los 
esporozoos parásitos del paludismo, etc.), amebas y flagelados (v. cap. 
62).
Los principales grupos filogenéticos de importancia médica bacterias 
son:
• Actinobacterias, estas también se reconocen como bacterias 
Gram-positivas con un alto contenido de G + C, muchas de las cuales son 
capaces de crecimiento filamentoso con verdadera ramificación y que 
pueden producir un tipo de micelio. Muchos miembros de este grupo no 
se tiñen bien con el método de Gram y, lo que es más importante, 
incluyen las micobacterias que pueden reconocerse con tinciones 
ácido-resistentes (véase el capítulo 2).
• Firmicutes, Bacterias Gram positivas bajas en G + C incluyendo bacilos, 
algunos de los cuales son formadores de esporas y cocos; el grupo 
incluye la mayoría de los grampositivos médicamente significativos. Dos 
grupos que presumiblemente han perdido su grampositividad,
Veillonella y Micoplasma se incluyen aquí.
• Proteobacterias, un grupo muy grande de bacterias 
gramnegativas (bacilos y cocos) con cinco subdivisiones 
(alfa, beta, gamma, delta y épsilon).
• Bacteroidetes, Anaerobios gramnegativos.
• Espiroquetas, que posee células con forma de espiral apretada 
y un flagelo interno.
• C hlamydiae, que son parásitos intracelulares estrictos.
Hongos
Estos son organismos no fotosintéticos que poseen paredes celulares 
relativamente rígidas. Pueden ser saprofitos o parásitos y absorben 
nutrientes solubles por difusión a través de la superficie celular.
Moldes crecen como filamentos ramificados ( hifas),
generalmente 2 a 10 µ m de ancho, que se entrelazan para formar una 
malla ( micelio). Las hifas son cenocíticas (es decir, tienen un 
protoplasma multinucleado continuo), ya sea no septadas o septadas 
con un poro central en cada pared transversal. Los mohos se 
reproducen mediante la formación de varios tipos de esporas sexuales y 
asexuales que se desarrollan a partir del micelio vegetativo (de 
alimentación) o de un micelio aéreo que efectúa su diseminación por el 
aire (v. Cap. 61).
Levaduras son células ovoides o esféricas que se reproducen 
asexualmente por gemación y también, en muchos casos, sexualmente, con 
la formación de esporas sexuales. No forman un micelio, aunque el 
intermedio hongos similares a la levadura forman un pseudo-micelio que 
consta de cadenas de células alargadas. los hongos dimórficos producen un 
micelio vegetativo en cultivo artificial, pero son similares a las levaduras en 
las lesiones infectadas. Los hongos superiores de la clase. Basidiomicetos ( hongos), 
que producen grandes estructuras fructíferas para la diseminación aérea de 
las esporas, no son infecciosas para los seres humanos ni los animales, 
aunque algunas especies sí lo son.
Actinobacterias
Estos incluyen bacterias productoras de antibióticos y una pequeña cantidad 
de patógenos altamente significativos.
• Actinomyces. Gram positivos, no acidorresistentes, tienden a 
fragmentarse en formas cocales y bacilares cortas y no a formar 
conidios; anaeróbico (p. ej. Actinomyces israelii).
• Streptomyces. El micelio vegetativo no se fragmenta en formas 
cortas; Los conidios se forman en cadenas de hifas aéreas (p. ej. Streptomyces 
griseus).
• Mycobacterium. Ácido rápido; Gram-positivo, pero no se tiñe 
fácilmente con el método de Gram; generalmente bacilar, raramente 
ramificado; hacer ácidos micólicos (p. ej. Tuberculosis 
micobacteriana).
• Nocardia. Similar a Actinomyces, pero aeróbico y sobre todo 
acidorresistente; hacer ácidos micólicos (p. ej.
Nocardia asteroides).• Corynebacterium. Bacilos grampositivos pleiomórficos (de forma 
variable); hacer ácidos micólicos (p. ej.
Corynebacterium diphtheriae).
Bacterias
Los principales grupos de bacterias se distinguen principalmente por la 
observación microscópica de su morfología y reacciones de tinción. El 
procedimiento de tinción de Gram, que refleja diferencias fundamentales en 
la estructura de la pared celular, separa la mayoría de las bacterias en dos 
grandes divisiones: Bacterias grampositivas y Bacterias Gram-negativo ( ver 
cap. 2). Cuando las bacterias pueden teñirse con Gram, la forma de las 
células y la agrupación son de valor práctico para la identificación. Sin 
embargo, en este punto, la relación del sistema de clasificación más 
antiguo, en gran parte fenotípico, con la clasificación filogenética más 
nueva basada en secuencias de ADN, que refleja las relaciones evolutivas 
entre grupos, comienza a romperse y las anomalías son evidentes. No 
obstante, los esquemas prácticos de identificación utilizados en los 
laboratorios clínicos se basan en gran medida en el reconocimiento de si 
las bacterias son Gram positivas o negativas, bacilares o de forma cocal, 
capaces de crecer aeróbicamente o anaeróbicamente (ver Capítulo 4) y si 
forman esporas.
Firmicutes
• Estreptococo. Cocos grampositivos, principalmente adherentes a cadenas 
debido a sucesivas divisiones celulares.
28
CLASIFICACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE MICRO-ORGANISMOS 3
ocurriendo en el mismo eje (p. ej. Streptococcus pyogenes); a 
veces predominantemente diplocócica (p. ej. Steotococos 
neumonia).
• Estafilococo. Cocos grampositivos, principalmente adherentes a 
agrupaciones irregulares debido a divisiones sucesivas que ocurren 
irregularmente en diferentes planos (p. Ej. Staph. aureus).
• Mycoplasma y ureoplasma. Cocos pleiomórficos que no 
producen peptidoglicano.
• Veillonella. Gram-negativos; generalmente cocos muy pequeños 
dispuestos principalmente en grupos y pares; anaeróbico (p. ej. Veillonella 
parvula).
• Bacilos Gram-positivos formadores de esporas. Los géneros clave 
médicamente relevantes aquí los géneros
Bacilo y Clostridium ( anaeróbico). Son Gram positivos, pero es 
probable que se conviertan en Gram negativos en culturas 
envejecidas. El tamaño, la forma y la posición de la espora pueden 
ayudar al reconocimiento de la especie, por ejemplo, la espora 
terminal abultada, esférica (forma de baqueta) de
Clostridium tetani.
• Bacilos gram positivos no esferorales. Estos incluyen varios 
géneros. Erysipelothrix y Lactobacillus
se distinguen por una tendencia a crecer en cadenas y filamentos, 
y Listeria por flagelos que confieren motilidad.
Espiroquetales
Estos organismos se diferencian de los otros grupos por ser filamentos 
espirales flexibles delgados que, a diferencia de la espirilla, son móviles 
sin posesión de flagelos. La reacción de tinción, cuando es demostrable, 
es Gram negativa. Las diferentes variedades se reconocen por su tamaño, 
forma, forma de onda y refractilidad, observadas en estado natural en 
películas húmedas sin teñir mediante microscopía de fondo oscuro. Los 
géneros de importancia médica incluyen
Borrelia, Treponema y Leptospira.
Clamidias
Las clamidias tienen un ciclo intracelular complejo (p. Ej.
Chlamydia trachomatis).
Virus
Los virus generalmente consisten en poco más que una hebra de ADN o 
ARN encerrada en una simple capa de proteína conocida como cápside. A 
veces, la nucleocápside completa puede estar encerrada en una envoltura 
de lipoproteínas derivada en gran parte de la célula huésped. Los virus 
sólo pueden crecer dentro de las células vivas de un huésped animal, 
vegetal o bacteriano apropiado; ninguno puede crecer en un medio 
nutritivo inanimado. Los virus que infectan y parasitan a las bacterias se 
denominan bacteriófagos o
fagos. Una clasificación simple de los virus que están involucrados en 
enfermedades humanas se muestra en Cuadro 3.2 .
Proteobacterias
Bacterias Gram-negativo.
• Alphaproteobacteria. Incluir el dependiente de la celda
Rickettsia grupo, el facultativamente intracelular
Brucella grupo y el Bartonella grupo.
• Betaproteobacteria. Neisseria - cocos, principalmente adherentes en 
pares y ligeramente alargados en ángulo recto al eje de pares (p. ej. 
Neisseria meningitidis). Burkholderia - bacilos Burkholderia 
pseudomallei).
• Gammaproteobacteria. Bacilos, incluidas las enterobacterias ( Escherichia 
coli), y los géneros
Pseudomonas, Legionella y los vibrios curvos (p. ej. Vibrio 
cólera).
• Deltaproteobacteria. Sin bacterias de importancia médica.
• Epsilonproteobacteria. Bacilos curvos y en espiral suelta, 
incluidos los géneros Helicobacter y
Campylobacter.
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Preciso o definitivo La identificación de bacterias requiere mucho tiempo, es 
polémica y es mejor realizarla en centros de referencia especializados. Para la 
mayoría de los propósitos clínicos, se requiere una guía clara y rápida sobre la 
posible causa de una infección y, en consecuencia, los microbiólogos 
generalmente se basan en unos pocos procedimientos simples, en particular 
microscopía y cultivo, respaldados, cuando sea necesario, por algunas pruebas 
complementarias para lograr un presunto
identificación. La microscopía es la prueba más rápida de todas, pero el 
cultivo lleva inevitablemente al menos 24 horas, a veces más. 
Constantemente se buscan pruebas más rápidas y los métodos de 
detección de antígenos y los métodos de detección genética están ahora 
bien establecidos (ver más abajo).
La mayoría de las muestras para examen bacteriológico, ya sean de 
seres humanos, animales o del medio ambiente, contienen mezclas de 
bacterias, y es fundamental obtener culturas puras de aislamientos 
individuales antes de embarcarse en la identificación. Los métodos no 
culturales, como la detección basada en antígenos o ácidos nucleicos, no
Bacteroidetes
Bacilos anaerobios gramnegativos no esferos.
• Bacteroides, Prevotella y Porphyromonas son los principales géneros.
29
3 BIOLOGÍA MICROBIANA
'gota colgante', la preparación se examina con iluminación ordinaria de 
campo brillante para observar la motilidad. Las cápsulas que rodean las 
células bacterianas se demuestran mediante una "tinción negativa" con 
tinta china; las cápsulas permanecen sin teñir contra el fondo de 
partículas de tinta. Para identificar micobacterias u otros organismos 
acidorresistentes, una preparación se tiñe con el método de 
Ziehl-Neelsen o una de sus modificaciones (vea la pág. 16). Los 
caracteres microscópicos de ciertos organismos en muestras patológicas 
pueden ser suficientes para la identificación presuntiva, por ejemplo, 
bacilos de la tuberculosis en el esputo, o T. pallidum en el exudado de un 
chancro. Sin embargo, muchas bacterias comparten características 
morfológicas similares y se deben realizar más pruebas para 
diferenciarlas.
Cuadro 3.2 Principales tipos de virus que causan enfermedades humanas Tipo de virus 
Ejemplos
Virus de ARN
ortomixovirus
Paramixovirus
Virus de la influenza A, B y C
Virus de la parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, 
virus sincitial respiratorio, virus Hendra, virus nipah, 
metapneumovirus humano Virus de la rabia
Virus de Lassa
virus de marburg y del Ébola muchos 
arbovirus, virus de la rubéola
virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis 
japonesa, virus del nilo occidental, virus de la hepatitis C
Virus Hantaan
Coronavirus humano, 229E (grupo 1), oC43 (grupo 2), 
nL63 (nuevos coronavirus similares al grupo 1), SARS 
(zoonosis)
virus tipo norwalk, virus de la hepatitis E Enterovirus: 
poliovirus (3 tipos), echovirus (31 tipos), virus Coxsackie A 
(24 tipos), virus Coxsackie B (6 tipos), enterovirus tipos 68 
a 71, virus de la hepatitis A (tipo 72) ), rinovirus, muchos 
serotipos
Virus de la inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2, virus 
linfotrópico T humanotipos I y II Rotavirus
Rabdovirus
Arenavirus
filovirus
Togavirus
flavivirus
Bunyavirus
Coronavirus
Calicivirus
Picornavirus
Características culturales
La aparición de crecimiento colonial en la superficie de un medio 
sólido, como el agar nutritivo, suele ser muy característica. Se presta 
atención al diámetro de las colonias, su contorno, su elevación, su 
translucidez (clara, translúcida u opaca) y color. Los cambios 
producidos en el medio (por ejemplo, hemólisis en un medio de agar 
sangre) también pueden ser significativos. La variedad de condiciones 
que apoyan el crecimiento es característica de organismos 
particulares. La capacidad o incapacidad del organismo para crecer en 
presencia (aerobio) o ausencia (anaerobio) de oxígeno, en una 
atmósfera de oxígeno reducido (microaerófilo) o en presencia de 
dióxido de carbono, o en medios que contengan factores inhibidores 
selectivos (p. Ej. sal biliar, agentes antimicrobianos específicos o pH 
bajo o alto) también pueden ser de importancia diagnóstica (ver Tabla 
4.1).
Retrovirus
Reovirus
Virus de ADN
Poxvirus
Virus del herpes
Variola, vaccinia, molluscum contagiosum virus, orf 
virus
Virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus varicelazoster, 
citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus del herpes 
humano tipos 6, 7 y 8 muchos serotipos
Virus JC, virus BK, virus del papiloma humano Virus de la 
hepatitis B
Virus B 19, nuevo parvovirus humano
Adenovirus
Papovavirus
Hepadnavirus
Parvovirus
SARS, síndrome respiratorio agudo severo.
Reacciones bioquímicas
Las especies que no pueden distinguirse por morfología y caracteres 
culturales pueden presentar diferencias metabólicas que pueden 
explotarse. Es habitual probar la capacidad del organismo para 
producir productos finales ácidos y gaseosos cuando se le presentan 
carbohidratos individuales (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, etc.) 
como única fuente de carbono. Otras pruebas determinan si la 
bacteria produce productos finales particulares (por ejemplo, indol o 
sulfuro de hidrógeno) cuando se cultiva en medios de cultivo 
adecuados, y si posee ciertas actividades enzimáticas, como oxidasa, 
catalasa, ureasa, gelatinasa o lecitinasa. Tradicionalmente, estas 
pruebas se han realizado de forma selectiva e individual de acuerdo 
con las recomendaciones de guías estándar, como la invaluable Manual 
de Cowan y Steel para la identificación de bacterias médicas. Sin 
embargo, hoy en día la mayoría de los laboratorios de diagnóstico 
utilizan
tiene esta desventaja; sin embargo, sí tienen la potencial limitación 
de ser muy específicos por lo que el investigador debe saber de 
antemano qué es necesario buscar.
Microscopía
La morfología y las reacciones de tinción de organismos individuales 
generalmente sirven como criterios preliminares para colocar una especie 
desconocida en su grupo biológico apropiado. Un frotis de tinción de Gram 
es suficiente para mostrar la reacción de Gram, el tamaño, la forma y la 
agrupación de las bacterias, y la disposición de las endosporas. Una 
película húmeda sin teñir puede examinarse con iluminación de fondo 
oscuro en el microscopio para observar la morfología de delicadas 
espiroquetas; una película húmeda sin teñir, o
30
CLASIFICACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE MICRO-ORGANISMOS 3
microgalerías de pruebas de identificación que, aunque caras, 
combinan sencillez y precisión. Los kits de prueba ahora están 
disponibles para varios grupos diferentes de organismos, incluidos 
enterobacterias, estafilococos, estreptococos y anaerobios. Otros kits 
facilitan la prueba de la utilización de fuentes de carbono, la 
asimilación de sustratos específicos y las enzimas producidas por un 
organismo.
En ocasiones, se pueden utilizar procedimientos más elaborados para el 
análisis de productos metabólicos o ácidos grasos de células completas. De 
hecho, un sistema de identificación basado en ácidos grasos totalmente 
automatizado, que combina cromatografía de gases de alta resolución y 
software de reconocimiento de patrones, se utiliza ampliamente para identificar 
una variedad de especies de bacterias aeróbicas y anaeróbicas. Los nuevos 
perfiles se agregan a una base de datos computarizada, aumentando así la 
sensibilidad del sistema. Los métodos de espectrometría de masas son 
prometedores para la identificación rápida, en particular la espectrometría de 
masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz 
(MALDI-TOF). Esto ofrece el análisis de cultivos bacterianos completos para 
espectros de masas únicos a partir de macromoléculas cargadas mediante 
pruebas rápidas de alto rendimiento con una base de datos en rápido 
crecimiento.
1. Amplificación de la diana mediante PCR, amplificación mediada por 
transcripción, amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, 
etc.
2. Amplificación de la sonda usando reacción en cadena de ligasa o replicasa 
Q-beta.
3. Amplificación de la señal, como en el ensayo de ADN ramificado.
Es posible detectar la presencia de un número creciente de especies 
mediante PCR de objetivos genéticos universales o específicos o 
mediante hibridación con sondas específicas. Como ocurre con los 
métodos convencionales, la tecnología de los ácidos nucleicos tiene sus 
limitaciones, siendo la más frecuente la contaminación de una muestra 
por productos de postamplificación. Otros factores incluyen la habilidad 
del operador, el diseño del cebador, la rigurosidad del ensayo, la 
presencia de compuestos inhibidores en la muestra y la ubicuidad del 
organismo buscado. Esto último es fundamental para la interpretación 
de los resultados, ya que muchos patógenos bacterianos ocurren 
naturalmente como comensales en ciertos sitios del cuerpo. Sin 
embargo, las nuevas tecnologías ofrecen una ventaja considerable 
sobre los métodos fenotípicos en términos de sensibilidad, y muchos 
sistemas de PCR optimizados afirman ser capaces de detectar de dos a 
diez bacterias por mililitro de muestra.
También se están utilizando y desarrollando ensayos de ácidos nucleicos 
para genes de resistencia a los antimicrobianos. Una innovación descrita 
recientemente puede tener el potencial de detectar, identificar la especie, 
subtipificar el organismo e identificar genes de resistencia en frotis de 
microscopio. La técnica utiliza ácido nucleico peptídico (PNA, 
pseudopéptidos) con capacidad de unión a ADN. Las moléculas de PNA
tienen un esqueleto de poliamida en lugar del azúcar fosfato de ADN y 
ARN, y las bases de nucleótidos unidas a este esqueleto son capaces 
de hibridar por apareamiento específico de bases con secuencias de 
ADN o ARN complementarias. También es posible la amplificación por 
PCR de genes diana en frotis de microscopio teñidos 
convencionalmente, y esto acelera la perspectiva de métodos de prueba 
muy rápidos y sensibles limitados solo por la especificidad del cebador 
para la diana.
La disponibilidad de numerosas secuencias genómicas procarióticas 
ha permitido el desarrollo de matrices de oligonucleótidos de alta 
densidad que constan de muchos miles de sondas diferentes. Estas 
matrices se construyen mediante síntesis de oligonucleótidos in situ sobre 
un soporte de vidrio mediante fotolitografía u otros métodos. La 
hibridación de los ácidos nucleicos diana premarcados con la sonda unida 
se detecta directamente con fluoresceína o ligandos radiactivos, o 
indirectamente utilizando conjugados enzimáticos. Las áreas de 
aplicación de las matrices de alta densidad incluyen secuenciación de 
ADN, genotipado de cepas, identificación de funciones de genes, 
ubicación de genes de resistencia, cambios en la expresión de ARNm y 
filogenia.
MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN INDIRECTA
Análisis dirigidos a genes
Estos son fragmentos de ADN que reconocen secuencias 
complementarias dentro de microorganismos (ver
pag. 79). La unión se detecta marcando el ADN con un marcador radiactivoo con un reactivo que se puede desarrollar para dar una reacción de color, 
como la biotina. Mediante la selección de fragmentos de ADN específicos 
para las características de los organismos individuales, las sondas 
genéticas se pueden adaptar a la identificación rápida de especies 
individuales en el material específico. Las desventajas de este enfoque son 
que el propio organismo puede estar muerto y no se dispone de un aislado 
viable para pruebas posteriores de susceptibilidad a agentes 
antimicrobianos, producción de toxinas o investigación epidemiológica.
El cultivo y la identificación preliminar de bacterias en el laboratorio 
requiere mucho tiempo y es relativamente laborioso. Las bacterias 
también pueden ser no cultivables, de crecimiento lento o exigentes en 
los requisitos de nutrientes. Las técnicas de ácido nucleico para la 
detección e identificación de bacterias han evolucionado en este 
contexto; Hoy en día se han desarrollado numerosos sistemas 
disponibles comercialmente y muchos se utilizan en laboratorios de 
diagnóstico. Las tecnologías se dividen en tres grupos básicos:
31
3 BIOLOGÍA MICROBIANA
parentesco. Recientemente se han desarrollado matrices con objetivos 
genéticos seleccionados en un formato de tubo Eppendorf. El chip está 
incrustado en el fondo del tubo y lleva conjuntos optimizados de sondas 
oligonucleotídicas específicas para ciertos organismos o para genes de 
resistencia a los antimicrobianos o factores de virulencia. De esta manera, los 
chips se pueden personalizar para bacterias individuales o grupos de 
bacterias. Todas las etapas del ensayo (preparación de la muestra a partir de 
colonias cultivadas en agar, amplificación por PCR, hibridación, conjugación 
con la molécula indicadora y detección mediante registro automático de 
imágenes) se llevan a cabo en un solo tubo en un plazo de 6 a 8 horas.
Un desarrollo muy utilizado es el de la PCR en tiempo real, que 
combina la amplificación de la muestra con un medio para la detección 
del producto específico por fluorescencia para que ambos pasos se 
realicen convenientemente en un solo tubo de reacción. El sistema tiene 
ventajas significativas sobre la PCR convencional en términos de rapidez, 
simplicidad y número de procedimientos manuales; la contaminación se 
elimina eficazmente cerrando el tubo después de la amplificación. El 
producto de ADN puede detectarse con un tinte fluorescente, o puede 
obtenerse una mayor especificidad con hibridación con sondas de 
oligonucleótidos específicas de secuencia marcadas con fluorescencia. 
La cuantificación del ADN diana también es posible con este sistema, lo 
que permite estimar el número de virus o bacterias en una muestra (ver 
págs. 79-80).
La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) dirigida a las copias 
múltiples del ARN ribosómico 16S también se ha utilizado para detectar 
bacterias directamente en muestras clínicas. Esta técnica utiliza sondas 
específicas para organismos diana en la muestra sin necesidad de 
cultivo y permite la cuantificación del recuento celular y la morfología. La 
sensibilidad y la especificidad varían según la sonda utilizada, pero si la 
sonda se optimiza, puede rivalizar con los métodos de cultivo 
convencionales.
fusionados con células tumorales "inmortales" in vitro. La progenie de estas 
células híbridas produce solo el tipo de anticuerpo apropiado para el 
precursor de la célula del bazo (ver
pag. 125).
Aglutinación de látex
Adsorbiendo un anticuerpo específico a partículas de látex inertes, se puede 
inducir una reacción de aglutinación visible en presencia de un antígeno 
homólogo. Este principio se puede aplicar a la inversa para detectar 
anticuerpos séricos. Los kits a base de látex se utilizan ampliamente para la 
agrupación serológica de organismos y la detección de toxinas producidas 
por bacterias durante el crecimiento.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
En el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), se une 
un anticuerpo específico a la superficie de un pozo de plástico y se 
agrega material que contiene el antígeno de prueba. Después del 
lavado, la presencia del antígeno se detecta mediante la adición de 
más anticuerpo específico, esta vez marcado con una enzima que 
puede iniciar una reacción de color cuando se le proporciona el 
sustrato apropiado. La intensidad del cambio de color está 
relacionada con la cantidad de antígeno unido. El método ELISA 
también puede usarse a la inversa para la detección cuantitativa de 
anticuerpos, adsorbiendo el antígeno purificado en el pocillo antes 
de agregar el suero de prueba; en este caso, el sistema ligado a 
enzimas utilizado para detectar la reacción antígeno-anticuerpo es 
una anti-globulina humana marcada. En ELISA de captura de 
anticuerpos de inmunoglobulina (Ig) M (MAC-ELISA), µ-
El anticuerpo de cadena (generalmente criado en cabras) está unido al pozo. Se 
agrega el suero de prueba y cualquier IgM se une al reactivo de captura; después 
del lavado, se añade el antígeno purificado (por ejemplo, el antígeno de rubéola), 
y esto se puede detectar con un anticuerpo marcado apropiado.
Reacciones de anticuerpos
Las especies y tipos de microorganismos pueden identificarse a menudo 
mediante reacciones serológicas específicas. Éstos dependen del hecho 
de que el suero de un animal inmunizado contra un microorganismo 
contiene anticuerpos específicos para la especie o tipo homólogo que 
reaccionan de manera característica (por ejemplo, aglutinación o 
precipitación) con el microorganismo particular. Estas sencillas pruebas 
in vitro se han utilizado durante muchos años en microbiología, sobre 
todo en la identificación formal de presuntos aislados de patógenos (por 
ejemplo, salmonelas) a partir de material clínico. La especificidad y la 
variedad de las pruebas de anticuerpos han mejorado enormemente 
gracias a la disponibilidad de anticuerpos monoclonicos.
Estos son producidos por el hibridoma técnica en la que las células del bazo 
productoras de anticuerpos individuales se
Hemaglutinación y hemadsorción
Ciertos virus, en particular los virus de la influenza, tienen la propiedad de 
unirse a receptores específicos en la superficie de los glóbulos rojos 
apropiados. De esta manera, las partículas de virus actúan como puentes que 
unen a los glóbulos rojos en grupos visibles. En el cultivo de tejidos, estas 
hemaglutininas pueden aparecer en la superficie de las células infectadas con 
un virus. Si se agregan glóbulos rojos al cultivo de tejidos, se adhieren a la 
superficie de las células infectadas, un fenómeno conocido como hemadsorción. 
Los glóbulos rojos también se pueden recubrir con un anticuerpo específico 
para que se aglutinen en presencia de la partícula de virus homóloga en un
32
CLASIFICACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE MICRO-ORGANISMOS 3
Cuadro 3.3 Poblaciones panmícticas versus clonales
Reproducción Recombinación
Sexual * frecuente
Asexual Raro
Arreglo de alelos
Aislado
asociación no aleatoria
mutación
normal
normal
Presiones selectivas
seleccion natural
Ambiental
Panmíctico
Clónico
* Se refiere a la recombinación entre elementos genéticos de diferentes organismos en bacterias.
de manera similar a la descrita anteriormente para la aglutinación de látex.
TIPIFICACIÓN DE BACTERIAS
Microscopía de fluorescencia y
inmunofluorescencia
Las diferentes especies bacterianas a menudo exhiben diferentes 
estructuras de población. Algunas especies se caracterizan por 
poblaciones muy diversas en un extremo y miembros muy similares en el 
otro. La frecuencia de recombinación de genes cromosómicos (véase el 
capítulo 6) se considera el principal determinante de la estructura de una 
población de una especie dada, y esta frecuencia varía de ausente a baja 
a muy alta. Las poblaciones altamente recombinantes se denominan panmíctico 
en contraste con clónico
poblaciones donde la recombinación es poco frecuente( Mesa
3.3 ). Especies como Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus influenzae 
son naturalmente transformables, es decir, son capaces de absorber 
ADN (foráneo y nativo) de su entorno, y sus poblaciones se 
caracterizan por una alta frecuencia de recombinación, segregación 
de alelos y mutación relativamente baja. En poblaciones clonales 
como Salmonella enterica, la recombinación es rara y existe una 
asociación no aleatoria de alelos en un contexto de intercambio 
genético limitado. Las mutaciones ocurren como resultado de 
presiones naturales y selectivas, pero estas no son suficientes para 
alterar el linaje clonal y las células hijas continúan pareciéndose al 
padre ancestral. Por lo tanto, los clones bacterianos no son idénticos 
a sus padres, pero muestran una serie de características en común 
con sus ancestros. Muchas especies se caracterizan por una 
considerable diversidad genética pero con expansión clonal de una 
subpoblación. Algunos de estos clones pueden ser transitorios, 
aunque otros pueden persistir y diseminarse a nivel nacional y 
mundial.
Por mecanografía identificamos una subdivisión reconocible de una 
especie que sirve como marcador de referencia con el que se pueden 
comparar otros aislamientos de la misma especie. Una población de 
bacterias que se presume desciende de una sola bacteria, tal como se 
encuentra en un hábitat natural, en cultivos primarios del hábitat y en 
subcultivos de los cultivos primarios, se denomina tensión.
Cada cultivo primario de una fuente natural se llama un aislar. La 
distinción entre cepas y aislamientos puede ser importante; Por 
ejemplo, los cultivos de bacilos tifoideos aislados de diez pacientes 
diferentes deben considerarse simplemente como diez aislados a no 
ser que
Cuando ciertos tintes se exponen a la luz ultravioleta, absorben energía y 
emiten luz visible; es decir, emiten fluorescencia. Los tejidos u 
organismos teñidos con dicho tinte y examinados con luz ultravioleta en 
un microscopio especialmente adaptado se ven como objetos 
fluorescentes; por ejemplo, la auramina se puede usar de esta manera 
para teñir
Tuberculosis micobacteriana. Las moléculas de anticuerpos pueden marcarse 
mediante conjugación con un tinte fluorocromo como el isotiocianato de 
fluoresceína (que tiene una fluorescencia verde) o la rodamina (rojo 
anaranjado). Cuando se permite que el anticuerpo fluorescente reaccione con 
el antígeno homólogo expuesto en la superficie de una célula, este inmunofluorescencia 
directa El procedimiento proporciona un método altamente sensible para la 
identificación del antígeno particular. Para este procedimiento es necesario 
tener un conjugado de anticuerpo específico para cada antígeno; sin 
embargo, se puede usar un anticuerpo no conjugado y la reacción luego se 
detecta mediante la adición de un conjugado de antiglobulina, que 
reaccionará con cualquier anticuerpo de la especie en la que se generó el 
anticuerpo.
Reacción en cadena de la inmuno-polimerasa
Esta técnica surgió de la fusión de la tecnología de anticuerpos con 
métodos de PCR con el objetivo de mejorar la capacidad de los sistemas 
de detección de antígenos. En la inmuno-PCR, se utiliza una molécula 
enlazadora con afinidad de unión biespecífica para el ADN y los 
anticuerpos para unir una molécula de ADN (marcador) a un complejo 
antígeno-anticuerpo. Esto produce un conjugado 
antígeno-anticuerpo-ADN específico. El marcador de ADN adjunto
se puede amplificar mediante PCR con cebadores apropiados, y la 
presencia de productos de amplificación muestra que el ADN marcador 
está unido a complejos antígeno-anticuerpo, lo que indica la presencia 
de antígeno. Se informa que la sensibilidad mejorada de la 
inmuno-PCR lograda sobre ELISA es superior a 10 5, teóricamente 
permitiendo tan solo 580 moléculas de antígeno (9,6 × 10 - 22
lunares) para ser detectados.
33
3 BIOLOGÍA MICROBIANA
La evidencia epidemiológica o de otro tipo indica que los pacientes han 
sido infectados de una fuente común con el mismo tensión. La 
capacidad de discriminar entre cepas similares puede ser de gran valor 
epidemiológico para rastrear fuentes o modos de propagación de la 
infección en una comunidad o en una sala de hospital, y se han ideado 
varios métodos de tipificación. Las cepas pueden distinguirse solo en 
caracteres menores y generalmente es más simple establecer 
diferencias entre aislamientos de una fuente común que probar 
inequívocamente su identidad. La demostración de una respuesta 
idéntica mediante un único método de tipificación reproducible no es 
prueba de que dos cepas sean iguales. Sin embargo, la confianza con 
la que se puede inferir la similitud aumenta considerablemente si se 
utiliza más de un método de tipificación.
La tipificación puede informar diferentes niveles de investigación 
epidemiológica, que van desde la microepidemiología (investigación 
local), la macroepidemiología (regional, nacional, internacional) hasta el 
análisis de la estructura de la población (evolución de cepas y patrones 
globales de propagación). Los datos obtenidos pueden ayudar en el 
control de la infección al excluir fuentes, identificar portadores y 
establecer la prevalencia de cepas individuales. Las razones comunes 
para la tipificación microbiana son identificar fuentes comunes o 
puntuales, discriminar entre infecciones de cepas mixtas, distinguir 
reinfección de recaída y, ocasionalmente, identificar un tipo y asociación 
de enfermedad (p. Ej. Escherichia coli O157 y síndrome urémico 
hemolítico, tipos de piel y garganta del grupo A Str. pyogenes, etc.).
Los métodos de tipificación deben ser reproducibles tanto en el 
laboratorio como clínicamente. El primero se establece fácilmente 
mediante pruebas repetidas en una muestra de cepas 
experimentales, pero también debe establecerse in vivo 
examinando múltiples pares de aislamientos de fuentes únicas para 
determinar la estabilidad de las características de la cepa probadas 
por el método de tipificación utilizado. Un método de tipificación 
también debe discriminar de manera adecuada y clara entre 
diferentes poblaciones y ser integral, es decir, asignar la mayoría de 
las poblaciones a un tipo. Los datos de mecanografía deberían 
estar en un formato que se asimile fácilmente en las bases de datos 
y deberían poder incorporarse a la imagen nacional para informar a 
otros trabajadores en el campo. Muy pocos métodos de 
mecanografía, si es que hay alguno, cumplirán estos criterios y, por 
lo tanto, es necesario utilizar métodos diferentes.
biotipos de la especie, y estos pueden ser marcadores de cepa eficaces. En 
la práctica, la biotipificación suele ser menos discriminatoria que otros 
métodos de tipificación de cepas y puede ser inestable debido a la pérdida de 
la propiedad. Las diferencias entre las cepas también pueden detectarse por 
variaciones en la sensibilidad a concentraciones fijas de sustancias químicas 
como metales pesados, un proceso conocido como
resistotipado. Los requisitos nutricionales del aislado (aminoácidos) para 
el crecimiento también se pueden utilizar para definir la auxotipo de un 
aislado.
Serotipificación
Muchas estructuras de la superficie de las bacterias (lipopolisacárido y 
membrana externa, flagelos, cápsulas, etc.) son antigénicas y los 
anticuerpos generados contra ellas se pueden usar para agrupar los 
aislados en definidos serotipos. Algunas especies se caracterizan por 
numerosos tipos antigénicos y la serotipificación de estas especies es muy 
discriminatoria, mientras que para otras la conservación de los epítopos 
antigénicos hace que la serotipificación sea de escaso valor para fines 
epidemiológicos. Miembros de la especie Salmonella enterica se definen 
por sus serotipos somáticos y flagelares (v. cap. 24). Los antígenos 
capsulares pueden estar asociados con la patogenicidad del organismo, y 
muchas vacunas protegen al individuo contra la infecciónal estimular los 
anticuerpos contra los epítopos del antígeno capsular. La aglutinación de 
suspensiones bacterianas con anticuerpos de conejo es el método más 
utilizado para la tipificación, pero otras técnicas como la precipitación en 
geles de agar, ELISA y la hinchazón capsular ( Figura 3.2 ) puede ser 
usado.
Biotipado
Figura 3.2 Reacción de hinchazón capsular de Klebsiella pneumoniae. El anticuerpo adsorbido a la cápsula 
altera el índice de refracción, lo que permite la visualización de la cápsula alrededor de la célula en su interior.
Las reacciones de prueba bioquímica que no son universalmente positivas o 
negativas dentro de una especie pueden definir
34
CLASIFICACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE MICRO-ORGANISMOS 3
Tipificación de fagos Esquemas que utilizan fagos adaptados (un solo fago propagado en 
diferentes cepas) que son específicos para un sitio receptor en particular, 
como el polisacárido Vi de Salmonella enterica el serotipo Typhi son 
relativamente reproducibles y las diferencias menores son significativas y 
reproducibles. Por otro lado, un conjunto de fagos que comprenda fagos 
aleatorios no relacionados puede adherirse a varios sitios receptores 
diferentes y tener diferentes propiedades biológicas, por lo que es poco 
probable que sea altamente reproducible, pero puede discriminar 
adecuadamente. Esta falta de estabilidad da como resultado la definición 
de grupos de fagos amplios en lugar de tipos definidos, y es el caso de Staph. 
aureus donde al menos dos reacciones líticas fuertes deben estar 
presentes en los patrones de los aislados antes de que puedan 
denominarse cepas distintas.
Las bacterias a menudo muestran una susceptibilidad diferencial a la lisis 
por ciertos bacteriófagos. El fago se adsorbe a un receptor específico en la 
superficie bacteriana e inyecta su ADN en el huésped. El ADN del fago 
puede integrarse de manera estable en el cromosoma bacteriano y este 
estado se conoce como lisogenia; los fagos capaces de esto se llaman fagos 
templados. En la lisogenia, una pequeña proporción de las células 
huésped expresan los genes del fago, y se produce cierta lisis celular y 
liberación de la progenie del fago. Alternativamente, el ADN del fago 
puede entrar en un ciclo replicativo, lo que conduce a la muerte del 
huésped y a la producción de nuevas partículas del fago. Estos lítico o virulento 
los fagos salvajes lisan la bacteria al final del ciclo replicativo y liberan un 
gran número de partículas de fagos hijas que infectan las células vecinas.
Este proceso conduce a una inhibición visible del crecimiento de las 
células huésped ( Figura 3.3 ). los tipo de fago del cultivo se identifica de 
acuerdo con el patrón de susceptibilidad a un conjunto de fagos líticos y / o 
templados. Los fagos líticos pueden recuperarse fácilmente de aguas 
residuales, aguas residuales y de río, y los fagos templados pueden 
liberarse de una cepa lisogénica por inducción con radiación ultravioleta o 
mutágenos químicos.
Los factores críticos que gobiernan la interpretación de los resultados de 
la tipificación de fagos son la discriminación y la reproducibilidad. Si el 
sistema es altamente discriminatorio y reproducible, cualquier diferencia en 
los patrones de lisis de los aislamientos indicará que representan cepas 
diferentes.
Tipificación de bacteriocina
Las bacteriocinas son sustancias antibacterianas naturales, elaboradas por 
la mayoría de las especies bacterianas, que son activas principalmente 
contra cepas del mismo género que la cepa productora. La tipificación de 
bacteriocina puede definir el espectro de bacteriocinas producidas por 
cepas de campo, o la sensibilidad de estas cepas a bacteriocinas de un 
panel estándar de cepas. Los patrones de producción o susceptibilidad a 
las bacteriocinas permiten la división de especies en tipos de bacteriocina.
Tipificación de proteínas
Las bacterias fabrican miles de proteínas que pueden visualizarse mediante 
electroforesis en geles de acrilamida en presencia de un detergente fuerte. 
Las proteínas se separan de acuerdo con el tamaño molecular y, después 
de teñir con un tinte, se puede comparar el patrón de bandas de cada 
aislado. Este sistema se ha utilizado con éxito para tipificar muchas 
especies de bacterias y hongos, pero carece de reproducibilidad. La 
investigación de poblaciones microbianas mediante electroforesis en gel de 
enzimas metabólicas, que luego pueden ser detectadas por sustratos 
específicos, también se ha aplicado ampliamente en el pasado para el 
análisis clonal dentro de especies.
Tipificación de endonucleasas de restricción
Endonucleasas de restricción son una familia de enzimas que cada una 
corta el ADN en un sitio de reconocimiento de secuencia específico, lo 
que puede ser raro o frecuente en el ADN de la especie que se examina. 
La frecuencia con la que una enzima corta en una especie particular 
depende de la secuencia de oligonucleótidos, la frecuencia del sitio de 
restricción y el porcentaje de contenido de G + C de la especie. Por 
ejemplo, el sitio de reconocimiento de la enzima
Sma Yo tengo 5 ′ - CCC ↓ GGG-3 ′ (↓ sitio de escisión) y este
Figura 3.3 Lisis mediada por fagos de una cepa pigmentada roja de Serratia marcescens.
35
3 BIOLOGÍA MICROBIANA
cortes con poca frecuencia en el genoma rico en AT de Staph. aureus, mientras 
que la enzima Xba Yo (5 ′ - T ↓ CTAGA-3 ′) es un cortador raro en la mayoría de 
las especies gramnegativas con un alto contenido de GC. Por este medio se 
pueden analizar tanto el ADN plásmido como el cromosómico. Las 
endonucleasas de corte frecuente generan numerosos fragmentos pequeños 
que pueden resolverse mediante electroforesis convencional en gel de 
agarosa y detectarse mediante tinción con un tinte. La resolución de la 
electroforesis en gel de agarosa convencional no supera los 20 kb y la 
separación óptima en geles de longitud estándar se consigue entre 1 y 15 
kb.
Los grandes fragmentos de ADN producidos por enzimas de corte 
poco frecuentes deben separarse en campos eléctricos especiales con 
una corriente pulsada ( electroforesis en gel de campo pulsado; PFGE). 
En esta técnica, las bacterias se encierran en un tapón de agarosa (para 
minimizar el cizallamiento del ADN) y las células se digieren con la 
enzima proteinasa K antes de que el ADN se digiera con la enzima. Al 
introducir un pulso o un cambio en la dirección del campo eléctrico, se 
pueden separar fragmentos de hasta 10 Mb. El tiempo que tardan los 
fragmentos en reorientarse hacia el campo eléctrico alternativo es 
proporcional a su tamaño molecular y al lugar al que migran en el campo 
eléctrico. El aparato más utilizado es el campo eléctrico homogéneo de 
contorno sujeto (CHEF), que tiene 24 electrodos dispuestos en una 
matriz hexagonal. Los tiempos de ejecución son a menudo del orden de 
30 a 40 horas, pero se han descrito protocolos más cortos y rápidos. 
Varios factores influyen en la calidad de los resultados,
incluyendo la calidad y concentración del ADN, la concentración de 
agarosa, el voltaje y los tiempos de pulso, y la fuerza y temperatura del 
tampón.
La interpretación de perfiles PFGE puede ser problemática. Para algunas 
especies, los criterios de Tenover (ver Lectura recomendada list) se puede 
aplicar para establecer la importancia de las diferencias en los perfiles de 
bandas de las cepas. Como regla general, los aislamientos de un incidente 
bajo investigación que no muestran diferencias en los perfiles pueden 
considerarse indistinguibles, aquellos con una a tres diferencias de banda 
como estrechamente relacionados, cuatro a seis bandas como posiblemente 
relacionadas y siete o más diferencias de banda como indicativo. cepas 
distintas. Sin embargo, esta regla debe aplicarse con cierto grado de 
precaución ya que algunas especies (p. Ej. Enterococcus faecium) puede 
exhibir una variación significativa (diferencias de seis a diezbandas) 
aparentemente dentro de los miembros del mismo clon. Se encuentran 
disponibles varios paquetes de análisis asistidos por computadora que 
calculan coeficientes de similitud entre cepas y los representan como 
dendrogramas ( Figura 3.4 ). Dos coeficientes comúnmente empleados, 
Jaccard y Dice, utilizan el número de bandas concordantes en los perfiles y el 
número total de posibles posiciones de banda para calcular el porcentaje de 
similitud entre los aislados. El coeficiente de Pearson ofrece la ventaja de que 
no es necesario definir posiciones de banda específicas. A menudo se usa un 
punto de corte del 85% de similitud pero, en cuanto a la regla de diferencia de 
bandas, esto debe establecerse experimentando con conjuntos de 
deformaciones relacionados y no relacionados.
20 30 40 50 60 70 80 90100
Figura 3.4 Perfiles de electroforesis en gel de campo pulsado de Xbal resúmenes de DnA de PD. aeruginosa aislamientos. El dendrograma muestra un porcentaje relativo de similitud de perfiles calculados con el coeficiente de 
Pearson.
36
CLASIFICACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE MICRO-ORGANISMOS 3
Tipificación de sonda genética que indirectamente de las movilidades electroforéticas de sus productos 
génicos, como fue el caso de su técnica original, la electroforesis 
enzimática multilocus. Los genes domésticos no están sujetos a fuerzas 
selectivas como los genes variables y se diversifican lentamente. Se 
emplean múltiples genes (generalmente siete) para superar los efectos de 
la recombinación en un solo locus, lo que podría distorsionar la 
interpretación de la relación de las cepas que se comparan. La tipificación 
de secuencias multilocus (MLST) puede denominarse con razón 
genotipado definitivo, ya que los datos de secuencia no son ambiguos y las 
bases de datos de perfiles alélicos de aislamientos de especies 
individuales son accesibles a través de Internet. El nivel de discriminación 
de MLST depende del grado de diversidad dentro de la población para 
generar alelos en cada locus, pero algunas especies altamente uniformes 
como M. tuberculosis no son susceptibles de análisis por la técnica. 
Recientemente, se ha buscado una mayor discriminación en los genes 
asociados a la virulencia necesarios para la supervivencia y propagación 
del organismo sobre la base de que estos genes están expuestos a 
cambios ambientales frecuentes y, por tanto, proporcionan un mayor grado 
de variación de secuencia. Las regiones intergénicas de genes 
seleccionados se amplifican mediante PCR y se secuencia un fragmento 
interno de 500 pb para identificar polimorfismos alélicos.
Una variante de MLST denominada tipificación de restricción multilocus 
introduce la digestión de restricción de genes de mantenimiento amplificados 
y elimina la necesidad de secuenciación. Los polimorfismos de longitud de 
los fragmentos de restricción (RFLP) se pueden clasificar en patrones de 
tipo y revelar estructuras de población similares a las de MLST.
Las sondas de ADN (ver más arriba) para la tipificación de cepas consisten en 
secuencias universales, aleatorias o específicas clonadas que pueden 
detectar la heterogeneidad del sitio de restricción en el ADN diana. La 
detección de la variación en los loci del gen rDNA es la base de ribotipado, y 
este método se ha aplicado universalmente a la tipificación de varias 
especies. Otras sondas de uso común son secuencias de inserción
(longitudes de ADN involucradas en la transposición; ver Capítulo 6) que pueden 
definir las estructuras clonales de las poblaciones.
Tipificación por reacción en cadena de la polimerasa
La PCR es una técnica que permite amplificar secuencias específicas de 
ADN. Se preparan múltiples copias de regiones del genoma definidas por 
cebadores oligonucleotídicos específicos mediante ciclos repetidos de 
amplificación en condiciones controladas. Estos métodos se pueden 
utilizar para estudiar el ADN de cualquier fuente. Se han descrito varias 
variaciones sobre el tema de la PCR, y el uso de estas técnicas continúa 
expandiéndose y desarrollándose. Las huellas dactilares de ADN 
mediadas por PCR utilizan las regiones variables de las moléculas de 
ADN. Estos pueden ser números variables de regiones repetidas en 
tándem o áreas con secuencias de reconocimiento de endonucleasas de 
restricción. Para realizar la tipificación por PCR, es necesario conocer las 
secuencias de las regiones limítrofes para que se puedan sintetizar 
cebadores oligonucleotídicos específicos. Los cebadores pueden ser 
específicos para una secuencia conocida o ser aleatorios. amplificación 
aleatoria de ADN polimórfico ( RAPD) y PCR cebada arbitrariamente ( AP-PCR). 
Ambos enfoques tienen problemas de reproducibilidad como resultado de 
un cebado falso, bandas tenues frente a bandas nítidas y variación en la 
migración electroforética de los productos. La PCR basada en secuencias 
repetitivas (rep-PCR) indica la variación en múltiples secuencias 
repetitivas intercaladas en regiones intergénicas dispersas por todo el 
genoma. Un sistema rep-PCR automatizado y estandarizado ha 
demostrado ser útil para la tipificación de cepas de varias especies y se 
informa que proporciona una discriminación similar a la de PFGE (códigos 
de barras bacterianos, Houston, Texas, EE. UU.). Polimorfismo de 
longitud de fragmento amplificado una secuencia de ADN-
técnica basada que combina endonucleasa de restricción
digestión con PCR. La incorporación de una etiqueta fluorescente y el uso 
de un secuenciador de ADN capilar permite una estandarización óptima de 
la reproducibilidad y resolución de las diferencias de un solo par de bases 
entre genomas.
Análisis de repetición en tándem de número variable
Las repeticiones en tándem de número variable (VNTR) son secuencias de 
nucleótidos cortas (20 a 100 pb) que varían en número de copias en los 
genomas bacterianos. Se cree que surgen a través del deslizamiento de la 
cadena de ADN durante la replicación y su función es desconocida. Los loci 
de VNTR separados se identifican a partir de secuencias publicadas y a 
menudo se encuentran en regiones intergénicas y marcos de lectura 
abiertos anotados. Los cebadores están diseñados para amplificar de cinco 
a ocho loci y los productos secuenciados para generar un perfil digital. La 
tipificación VNTR es rápida y reproducible, y relativamente sencilla de 
realizar. Se puede lograr una mejor discriminación mediante la identificación 
de más loci, pero existe un debate sobre su estabilidad en el tiempo.
Tipificación basada en el genoma completo
Escritura de secuencia multilocus
El advenimiento de nuevos métodos de secuenciación de ADN de alto rendimiento está 
marcando el comienzo de una nueva era en la que se está volviendo factible comparar 
y tipificar bacterias basándose en
Esta técnica indexa la variación alélica en varios genes domésticos 
mediante secuenciación de nucleótidos en lugar de
37
3 BIOLOGÍA MICROBIANA
datos de la secuencia del genoma completo. Estas tecnologías de 
secuenciación masivamente paralelas producen lecturas de 
secuencias de nucleótidos relativamente cortas, pero a una escala tal 
que pueden ensamblarse en una secuencia comparada con las 
obtenidas de aislamientos anteriores de ese organismo. Esto permite 
hacer una comparación de todo el genoma y establecer una relación 
evolutiva más o menos definitiva con otros
aislamientos contemporáneos e históricos. Los costos de tales análisis 
se están volviendo rápidamente competitivos con los métodos de 
mecanografía tradicionales. Tales análisis tienen el potencial de 
transformar la bacteriología médica al producir información 
epidemiológica inequívoca e identificar elementos genéticos como los 
que codifican resistencia a antibióticos y antígenos significativos bajo 
presiones de selección.
Lectura recomendada
Barrow GI, Fieltro RKA, editores: Manual de Cowan y Steel para el
Identificación de bacterias médicas,ed. 3, Cambridge, 1993, Cambridge University Press.
Garrity Gm, editor: Manual de Bergey de bacteriología sistemática, ed 2,
nueva york, 2005 Springer.
Kaufmann mE: electroforesis en gel de campo pulsado. En Woodford n, Johnson
AP, editores: Métodos en Medicina Molecular, Vol. 15: Bacteriología molecular: protocolos y 
aplicaciones clínicas, Totowa, Nueva Jersey, 1998, Humana Press, págs. 33–50.
murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, et al, editores: Manual de Clínica
Microbiología, ed. 8, Washington, DC, 2003, ASm Press. owen RJ: Taxonómica 
bacteriana: encontrar la madera a través del
árboles filogenéticos, Métodos en biología molecular 266: 353–384,
2004.
Schleifer KH: Clasificación de Bacterias y Arqueaea: Pasado, presente y
futuro, Microbiología sistemática y aplicada 32: 533–542, 2009. Spratt BG, feil 
EJ, Smith nH: Population genetics of bacterial
patógenos. En Sussman m, editor: Microbiología Médica Molecular,
San Diego, 2002, Academic Press, págs. 445–484.
Tenover fC, Arbeit RD, Goering RV, et al: Interpretación del ADN cromosómico
patrones de restricción producidos por electroforesis en gel de campo pulsado: criterios para la 
tipificación de cepas, Revista de microbiología clínica 33: 2233–2239, 1995.
Van Regenmortel mHV, fauquet Cm, obispo DHL, editores: Virus
Taxonomía. Clasificación y nomenclatura de virus. San Diego,
2000, Prensa académica.
Woese CR: Interpretando el árbol filogenético universal, Procedimientos de
la Academia Nacional de Ciencias de los EE. UU. 97: 8392–8396, 2000.
Sitios web
Base de datos de genotipado en la Universidad de Oxford. http://www.mlst.net/
Centro nacional de información biotecnológica para la secuencia de rRnA
análisis. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/
Diferenciación ribosómica de microorganismos médicos para secuencia de rRnA
análisis. http://www.ridom-rdna.de/
Base de datos universal de virus del Comité Internacional de Taxonomía
de virus. http://www.ictvdb.org/
38
http://www.mlst.net/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/
http://www.ridom-rdna.de/
http://www.ictvdb.org/
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	Biochemical reactions
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