POLIMORFISMO DE LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN - Adelfo Morales Gonzalez

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TALLER EN CLASE
TEMA: POLIMORFISMO DE LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN
(RFLPs)
INTRODUCCIÓN 
Las técnicas de biología molecular, tienen múltiples aplicaciones, dentro de las cuales se encuentra la causa de muchas enfermedades que tienen un origen genético. La técnica PCR-RFLPs, se basa en la identificación de secuencias específicas de un gen amplificado previamente por PCR, que son reconocidas por enzimas de restricción (E.R), las cuáles cortan en la secuencia de reconocimiento. Una de las enzimas más empleadas es la Eco RI, la cual se obtiene de la E. coli, y reconoce la secuencia GAA TCC, por lo tanto entre mayor sea el número de veces que se encuentre la secuencia, mayor será el número de cortes o restricciones que se observen. El tamaño de la longitud de los diferentes fragmentos que se producen depende de la distancia que hay entre los sitios de corte. Si tenemos un fragmento amplificado LINEAL, como los que se producen normalmente en una PCR, y es reconocido una vez por una enzima, se producen DOS fragmentos, si la enzima encuentra la secuencia diana dos veces, genera TRES fragmentos, y así sucesivamente. Si amplificamos un fragmento de 1000 pares de bases, y la secuencia de reconocimiento está en la posición 500, entonces se producen 2 FRAGMENTOS, de 500 pb. En el gel de agarosa, solo se observará UN FRAGMENTO PORQUE POSEEN EL MISMO TAMAÑO (500PB).
ANTES DE CONTESTAR LAS SIGUIENTES PREGUNTAS, LEER MUY DETENIDAMENTE LA INTRODUCCIÓN (SI ES NECESARIO LEA DOS O TRES VECES) y déjese llevar por la lógica. 
1. De acuerdo a lo anterior responda las siguientes preguntas: Si tiene un plásmido circular de 5000 pares de bases y lo somete a una E.R, llene el siguiente cuadro, guiándose de la casilla número 3
	Número de veces que posee la secuencia diana y posición de cortes ( )
	1 (2000)
	2 (1000 y 
3500)
	3 (500, 1500, 4800)
	4 (100, 
500, 1000, 
3000)
	4 (500, 
1500, 
2800, 
4800)
	Número de fragmentos que se producen
	1
	2
	3
	4
	4
	Tamaño de los fragmentos 
	5000
	2500 y 2500 pb
	1000, 3300, 700 pb. ( el total debe dar 5.000)
	400,500,2000,
2100 pb
	1000,1300,
2000,700
	Número de bandas que se observan en el gel. 
	1
	1
	3
	4
	4
	* si se representa un circulo de 5000 pares, entonces el par de bases número 5000 estará en contacto con el par de bases número 1 (se representa en la dirección de las manecillas del reloj). Recuerde que en la representación circular desde 500 a 1500 hay 1000 pares de bases, desde 1500 hasta 4800 hay 3300 pb, y desde 4800 hasta 500 hay 700 pb).
2. Represente en un círculo, la información de la casilla número 5 del cuadro anterior (tamaño del plásmido, sitios de corte, y tamaño de los fragmentos)
3- Llene el siguiente cuadro para un fragmento LINEAL de 5000 pares de bases. 
	Número de veces que posee la secuencia diana y posición de cortes ( )
	1 (2000)
	2 (1000 y 
3500)
	3 (500, 1500, 4800)
	4 (100, 
500, 1000, 
3000)
	4 (500, 
1500, 
2800, 
4800)
	Número de fragmentos que se producen
	2
	3
	4
	5
	5
	Tamaño de los fragmentos 
	2000, 3000 pb
	1000, 2500, 1500 pb
	500, 1000, 3300, 200 pb
	100,400,
500,2000,
2000
	500,1000,
1300,2000,
200
	Número de bandas que se observan en el gel. 
	2
	3
	4
	4
	5
	a.
	Tamaño del fragmento completo sin restricción ( no digerido): __212 pb
	b.
	Número de bandas originadas por el alelo E3 que se observarán en el gel____4__
	c.
	Numero de bandas originadas por el alelo E2 que se observarán en el gel____3___
	d.
	Número de bandas originadas que se observarán por el alelo E4____5__
	e.
	Número de bandas que se observan si un individuo es heterocigótico E2E3__7___
	f.
	Número de bandas que se observan 
En individuos heterocigóticos E3E4 __9__
 
4 
5 
6 De acuerdo a la información suministrada para el siguiente patrón de restricció n conteste las siguientes preguntas: 
5. Empleando marcadores de peso molecular apropiados, represente los resultados para cada uno de los encisos del punto anterior, de tal forma que en el carril 1 represente el marcador de peso, en el carril 2 las bandas del enciso A, en el carril 3 las bandas del enciso B, y así sucesivamente. 
	Número de veces que posee la secuencia diana y posición de cortes ( )
	3 ( 38, 129 y 177 )
	3 (38 y 129 )
	4 (38,57,129,y 177)
	Número de fragmentos que se producen
	4
	4
	5
	Tamaño de los fragmentos 
	38,91,48 y 35 pb
	38,91,83 pb
	38,19,72,48,35 pb
	Número de bandas que se observan en el gel. 
	4
	3
	5
 
4. De acuerdo a la información mostrada para el punto número 4, cuál sería el patrón de bandas que se espera para un grupo de diez personas consiguiente caracterización molecular de 10 individuos: (UTILICE LOS 
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	10
	Individuo
	E1E1
	E2E2
	E1E3
	E2E4
	E3E4
	E4E4
	E3E2
	E2E3
	E2E2
	E4E4
	Genotipo
MARCADORES DE PESO MOLECULAR APROPIADOS).
5. De acuerdo a la información del punto anterior, determine; 
A. frecuencias alélicas
B. frecuencias genotípicas.
C, frecuencias fenotípicas (CONSULTE EN CUALQUIER FUENTE, CÓMO ES LA ASIGNACIÓN FENOTPICA PARA ESTOS ALELOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER).
6. Esquematice los resultados en la electroforesis del punto 7.