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PRÁCTICA 11 FARMACOGNOSIA LABORATORIO EN LÍNEA ENE-JUN-2021 IDENTIFICACIÓN DE TANINOS Y SAPONINAS EN MATERIAL VEGETAL Objetivo: El alumno identificará la presencia de saponinas y taninos en diferentes materiales vegetales mediante pruebas cualitativas que forman parte de un tamiz fitoquímico. Antecedentes: El tamizaje Fitoquímico o “Screening” Fitoquímico es una de las etapas iniciales de la investigación Fitoquímica del potencial biológico y farmacológico que poseen las plantas., que permite determinar cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos presentes en una planta y a partir de allí, orientar la extracción o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés. El tamizaje Fitoquímico consiste en la extracción de la planta con solventes apropiados y la aplicación de reacciones de coloración y precipitación. Debe permitir la evaluación rápida con reacciones sensibles reproducibles y de bajo costo. Los resultados del tamizaje fitoquímico constituyen únicamente una orientación y deben interpretarse en conjunto con los resultados de un screening farmacológico. La cantidad de material vegetal necesario para hacer las pruebas varia de 5g a 200 g. Taninos Figura 1. Estructura de un tanino Los taninos son compuestos polifenólicos, más o menos complejos, de origen vegetal, masa molecular relativamente elevada, sabor astringente, conocidos y empleados desde hace muchos siglos por su propiedad terapéutica como cicatrizantes en uso externo y antidiarreicos como uso interno, por su propiedad de ser capaces de convertir la piel en cuero, es decir de curtir las pieles. Esto se debe a su capacidad para unirse a macromoléculas como hidratos de carbono y proteínas. Precipitan con sales de metales pesados, proteínas y alcaloides. Clasificación Taninos hidrolizables o hidrosolubles (pirogálicos). En estos se distinguen los taninos gálicos. Figura 2. Unidades estructurales de los taninos hidrolizables Taninos condensados o proantocianidinas: no hidrosolubles, son polímeros flavánicos, están constituidos por unidades de flavan-3-oles o catequinas unidos entre sí por enlaces C-C. Se diferencian de los taninos hidrolizables en que sus moléculas son más resistentes a la ruptura. Figura 3. Unidades estructurales de los taninos condensados Taninos mixtos o complejos: Son taninos elágicos modificados que resultado de la adición de un derivado 2-fenil-cromano con una molécula de éster y glucosa. Es decir, estructuras intermedias entre las 2 categorías clásicas de taninos. Finalmente se han aislado de algas Feoficeae los llamados florotaninos, polímeros del floroglucinol. Los taninos son sustancias amorfas solubles en agua, que forman soluciones coloidales, en alcohol y en acetona. Son insolubles en solventes apolares como éter y cloroformo. Precipitan con numerosos reactivos (sales de hierro, plomo, cobre), alcaloides y proteínas. Aplicaciones Farmacológicas: o Astringentes en cosmetología en la preparación de lociones y tónicos. o Antidiarreicos y además de disminuir el peristaltismo tienen acción antiséptica, esta acción se ejerce también en uso externo, por lo que son útiles en tratamiento de dermatosis y quemaduras. o El efecto antidiarreico lo ejercen en el intestino y para evitar ardor en el estómago que producirían, se administran combinados con albúmina o gelatina. De esta forma el tanino no se libera hasta llegar al intestino donde hay medio básico. o Antifúngicos o Vasoconstrictores: tratamiento de várices y hemorroides (en supositorios, por ejemplo). o Inhibidores enzimáticos. o Antídotos de alcaloides y metales pesados. El efecto antinutriente de los taninos presentes en muchos alimentos ha sido objeto de numerosas investigaciones. Son factores antinutrientes que disminuyen el peso y la eficacia de los alimentos y aumentan el nitrógeno fecal. Las causas de estos efectos pueden ser varias, parece que la más importante es la formación de complejos con proteínas de la dieta. Los taninos tienen también aplicaciones industriales en la preparación de barnices, pinturas, adhesivos, plásticos y resinas. Tabla 1. Características de taninos hidrolizables y condensados Tabla 2. Reacciones cualitativas de identificación de taninos Saponinas Las saponinas (del latín sapo que significa jabón) son heterósidos o glucósidos de esteroides o de triterpenoides, llamadas así por sus propiedades como las del jabón: cada molécula está constituida por un elemento soluble en lípidos (el esteroide o el triterpenoide, llamado sapogenina) y un elemento soluble en agua (el azúcar), y forman una espuma cuando son agitadas en agua. Se forma espuma debido a que las saponinas disminuyen la tensión superficial del agua. Son por lo tanto tensoactivos naturales. Las saponinas son tóxicas, se cree que su toxicidad proviene de su habilidad para formar complejos con esteroles: Las saponinas podrían interferir en la asimilación de esteroles por el sistema digestivo, o romper las membranas de las células luego de ser absorbidas hacia la corriente sanguínea. Además de sus propiedades detergentes, también poseen propiedades hemolíticas, si se inyectan en el torrente sanguíneo. No todas las plantas que contienen propiedades hemolíticas contienen saponinas. Las saponinas tienen un elevado peso molecular y su aislamiento en estado puro ofrece ciertas dificultades. Como heterósidos que son, se hidrolizan con ácidos, dando una genina (sapogenina) y diversos azúcares y ácidos urónicos relacionados. Según la estructura de la sapogenina se conocen dos grupos (Saponinas triterpénicas): Tienen el aglicón con 30 átomos de carbono llamados triterpeno. Dicho aglicón procede de la ruta biosintética de la condensación isoprénica también denominada ruta del ácido mevalónico. Las saponinas triterpénicas derivan todas del dammarano. Figura 4. Estructura precursora de las saponinas ● Triterpenas pentacíclicos, con enlaces heterosídicos en el C3 que tienen un origen biogenético común (vía del ácido mevalónico y unidades isoprenoides). Son las saponinas más frecuentes. Figura 5. Saponinas pentacíclicas ● Terpenoides tetracíclicos. Conservan la estructura básica del dammarano con 3 ciclos de 6 miembros y un ciclo de 5 miembros. Figura 6. Saponinas tetracíclicas ● (Saponinas de tipo esteroidal). Se biosintetizan también por la ruta del ácido mevalónico y son menos frecuentes que las saponinas triterpénicas pentacíclicas. Figura 7. Saponinas esteroidales Es frecuente también encontrar saponinas por ejemplo (Solanum sp) que en vez de O en el anillo F o de OH en la cadena unida a en la posición 22 tienen Nitrógeno (amina), por lo cual se consideran saponinas y alcaloides a la vez. Figura 8. Estructura de un heterósido de saponina Figura 9. Planta Solanum sp Figura 10. Alcaloides esteroidales aislados e identificados de los frutos del Solanum jamaicense En dicotiledóneas hay principalmente saponinas triterpénicas y ocasionalmente saponinas esteroídicas. En monocotiledóneas rara vez hay saponinas triterpénicas y hay casi exclusivamente saponinas esteroídicas. Las saponinas puedes estar localizadas en cualquier órgano del vegetal, pero tienen tendencia a acumularse en mayor concentración en las partes subterráneas (raíz, rizoma). Las saponinas tienen una acción hemolítica, característico de las saponinas triterpénicas, variable según los sustituyentes de la estructura (los grupos carboxílicos disminuyen el poder hemolítico. Las saponinas esteroídicas monodesmosídicas son hemolíticas, mientras que las bidesmosídicas no lo son. Debido a su poder hemolítico resultan muy tóxicas si se administran por vía intravenosa, mientras que por vía oral su toxicidad es muy baja. Al ser heterósidos, son soluble en agua y en disolventes orgánicos polares como etanoly metanol e insolubles en disolventes orgánicos apolares como cloroformo, éter y hexano). Los aglicones libres (sapogeninas) no son solubles en agua y sí en disolventes orgánicos apolares. Las saponinas se pueden valorar por métodos físicos como el llamado Test e índice afrosimétrico; o por métodos biológicos como el Índice Hemolítico o el Índice del Pez. Índice de espuma o afrosimétrico: Es la máxima dilución del extracto de la droga a la que se produce una espuma persistente en determinadas condiciones. Se determina utilizando una serie de tubos donde se coloca el extracto acuoso y agua, haciendo diferentes diluciones. Se agita cada tubo durante 15 segundos y se deja en reposo 15 minutos. Debido a la agitación se forma espuma y al reposar el nivel de espuma desciende. Se considera espuma persistente, si transcurridos los 15 min la espuma tiene una altura superior a 1 cm. Si este índice es menor a 20 puede decirse prácticamente que la muestra no contiene saponinas. Índice de hemólisis: Es la máxima dilución del extracto de la droga a la cual se produce hemólisis total. Se determina haciendo diferentes diluciones del extracto y se añade una suspensión de sangre citrada. Índice de pez: Es una constante propuesta por Kobert y se define como la concentración de saponina que en 100 ml de solución determina la muerte de un pez de una especie determinada y un peso dado después de una hora de inmersión en la solución. Los peces que se emplean para este índice son generalmente Leuciscus rutilis o Carassius vulgaris, de dos a cuatro cm de longitud aproximadamente. Aplicaciones Farmacológicas o Acción irritante de las células que se manifiesta a nivel: o Pulmonar: produciendo un aumento de las secreciones, efecto expectorante y antitusivo. o Renal: Aumentan la circulación sanguínea a nivel renal aumentando consecuentemente la filtración glomerular y surtiendo un efecto diurético. o Efecto antiedematoso y antiinflamatorio: Sobre todo a nivel de insuficiencia venosa en extremidades inferiores. o Acción antihemorroidal y cicatrizante o Acción antimicrobiana: antimicótica, antivírico y molusquicida: Resultan tóxicos para moluscos, lo cual es de interés para luchar contra la esquistosomiasis de países del tercer mundo, ya que Schistosoma sp utiliza como huésped intermediario a un molusco (caracol) son molusquicidas únicamente las saponinas monodesmosídicas, pero por hidrólisis las bidesmosídicas se pueden compartir en monodesmosídicas. Dichas acciones son debidas mayoritariamente a las saponinas triterpénicas. o Las saponinas se utilizan en la industria farmacéutica como espumantes y emulgentes. Las saponinas esteroídicas se utilizan sobre todo industrialmente para obtener los aglicones esteroídicos que son precursores por hemisíntesis de los fármacos esteroídicos (hormonas sexuales, glucocorticoides). Figura 11. Fórmula de un glucocorticoide Figura 12. Medicamentos glucocortocoides Figura 13. Hormonas sexuales Figura 14 y 15. Levonogestrel medicamento y su fórmula química Metodología: MATERIALES Material vegetal Regla Agua potable Baño maría Acetona Alcohol etílico 96° 10 g de NaCl 2 g de Grenetina 25 g de Cal (Óxido de calcio) o Hipoclorito de sodio Frascos para maceración Tubos de ensayo o vasos para las pruebas Jeringa de 5 ml para medir volúmenes Lentes de seguridad, guantes, bata Balanza PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS: NOTAS: Los extractos deberán tener al menos 48 h de maceración. De preferencia preparar los extractos con material vegetal seco. 1. Preparar un extracto utilizando como solvente agua y otro con una mezcla acetona-agua (6:4) de las siguientes drogas vegetales (AL MENOS 10 POR EQUIPO): Semillas de Quinoa, soya, germinado de lenteja, trigo o soya, agua de remojo de leguminosas (frijoles, habas, garbanzos, etc), raíz de zarzaparrilla, hojuelas de avena, frutos de anís estrellado, canela, hojas de alfalfa, hojas de laurel, hojas de sen, hojas de espinacas, hojas de eucalipto, hojas de nogal, hojas de hammamelis, hojas de frambuesa, hojas de zarzamora, ajo, uvas con semillas, piña, chícharos, espárragos, bolsitas de té verde, té negro, café, flores de manzanilla, de árnica, de lavanda, de caléndula. Presencia de saponinas: Colocarse su equipo de protección personal completo. Utilizar el extracto de agua y realizar el siguiente tamiz fitoquímico: A) Test afrosimétrico. 1. En un tubo colocar agua como control negativo del experimento. 2. Tomar entre 5 y 10 ml de extracto (dependiendo del tamaño del tubo) 3. Calentar a fuego lento en un baño maría por 2 min. 4. Dejar reposar por 1 h. 5. Agitar vigorosamente entre 10 y 30 s y observar la formación de espuma. 6. Se valora la persistencia de la aparición de la espuma con cruces: 5-20min (+), 20-25 min (++), >30 min (+++). 7. Para los extractos que tengan (++) y (+++) reportar la altura de la espuma formada. Presencia de taninos: Colocarse su equipo de protección personal completo. Decantar los extractos Utilizar el extracto de acetona-agua y realizar el siguiente tamiz fitoquímico: B) Prueba de precipitación con gelatina y NaCl: 1. Preparar una solución de NaCl con grenetina disolviendo 10 g de NaCl y 2 g de grenetina en 100 ml de agua caliente (dejar hidratar la grenetina por unos minutos), agitar para homogenizar la solución. 2. Preparar un tubo control negativo con agua potable. 3. Colocar 5 ml del extracto + 10 ml de una mezcla de etanol-agua (8:2), pasar a un tubo de ensayo y adicionar 10 gotas (1 ml) de la solución de NaCl y gelatina. 4. Agitar suavemente y observar cuando empiece la turbidez. 5. Todos los taninos dan precipitado con solución de gelatina. 6. Dejar reposar los tubos entre 30 y 40 min y comparar la apariencia al inicio de la prueba y trascurrido este tiempo, algunos vegetales tienen bajo contenido de taninos y la turbidez aparece más lentamente. C) Prueba con agua de cal: Preparación de agua con cal: La cal es un compuesto altamente cáustico y al mezclarlo con agua produce una reacción exotérmica, asegúrese de tener puestos guantes y lentes de seguridad para la preparación de esta solución. 1. Mezclar 25 g de cal en 225 ml de agua, agitar y dejar reposar por 1 h. 2. Utilizar la solución de la parte superior para agregar gota a gota en un tubo o vaso que contenga 5 ml del extracto, hasta observar la formación de un precipitado. D) Prueba con hipoclorito de sodio: 1. Agregar 3 gotas y observar la apariencia del extracto. Resultados: Reportar en una tabla como esta, los resultados obtenidos. Droga vegetal Test afrosimétrico Precipitación con gelatina y NaCl Agua de cal Hipoclorito de sodio Positivo para Taninos Saponinas Cuestionario: 1) Describir la ruta biosintética para la síntesis de saponinas esteroidales y triterpénicas. 2) Buscar productos herbolarios a base de saponinas disponibles en el mercado mexicano. 3) Investigar la metodología de la prueba de hemólisis para la identificación de saponinas. 4) Investigar si hay otras pruebas para la identificación y cuantificación de saponinas y taninos a parte de las mencionadas en la práctica y describir en qué consisten: Referencias bibliográficas: 1. Castillo Olvera G. Zavala Cuevas D. Carrillo Inungaray M.L. Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca. Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Análisis fitoquímico: una herramienta para develar el potencial biológico y farmacológico de las plantas. Disponible en: https://www.eumed.net/rev/tlatemoani/24/analisis- fitoquimico.html#:~:text=El%20tamiz%20fitoqu%C3%ADmico%20es%20una,farmacol%C3 %B3gico%20que%20poseen%20las%20plantas.&text=Las%20plantas%20producen%20un %20amplio,por%20microorganismos%2C%20insectos%20y%20herb%C3%ADvoros. 2. Salazar Cabrera F.T. JaimeLópez M.V. Universidad Autónoma de Nicaragua. Facultad de Ciencias e Ingeniería. Departamento de Química y Farmacia. Tamizaje Fitoquímico en las hojas frescas de laurelillo [Cordia inermis (Mill.) I. M. Johnst.]. Laboratorio de Control de Calidad de Medicamentos. UNAN-León. agosto – octubre 2010. 3. Palma R. Mac Donald D. Cuyos M. Dueñas R. Foy Valencia E. Universidad Palma. Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Bioquímica y Nutrición. Revista Biotempo 2005, Volumen 5,31- 36. EXTRACCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE SAPONINAS EN Agaricus bisporus. 4. Kuklinski Claudia. "Farmacognosia. Taninos. Saponinas”. Omega. Barcelona. 2000. p. 112- 116, 146-151. 5. Villar del Fresno Ángel María (1999). Farmacognosia General. Taninos. Editorial Síntesis. p. 219-233. 6. Bruneton Jean. “Farmacognosia. Fitoquímica. Plantas Medicinales”. Taninos y saponinas, 2ª Ed. Acribia, I.J.R., Zaragoza, España, 2001.p. 369-372 Reporte debe incluir: a) Antecedentes b) Diagrama de flujo de las actividades c) Resultados: tabla y fotos de las pruebas: LEER LA RÚBRICA ANTES DE LA PRÁCTICA. d) Cuestionario e) Conclusiones f) Bibliografía https://www.eumed.net/rev/tlatemoani/24/analisis-fitoquimico.html#:~:text=El%20tamiz%20fitoqu%C3%ADmico%20es%20una,farmacol%C3%B3gico%20que%20poseen%20las%20plantas.&text=Las%20plantas%20producen%20un%20amplio,por%20microorganismos%2C%20insectos%20y%20herb%C3%ADvoros https://www.eumed.net/rev/tlatemoani/24/analisis-fitoquimico.html#:~:text=El%20tamiz%20fitoqu%C3%ADmico%20es%20una,farmacol%C3%B3gico%20que%20poseen%20las%20plantas.&text=Las%20plantas%20producen%20un%20amplio,por%20microorganismos%2C%20insectos%20y%20herb%C3%ADvoros https://www.eumed.net/rev/tlatemoani/24/analisis-fitoquimico.html#:~:text=El%20tamiz%20fitoqu%C3%ADmico%20es%20una,farmacol%C3%B3gico%20que%20poseen%20las%20plantas.&text=Las%20plantas%20producen%20un%20amplio,por%20microorganismos%2C%20insectos%20y%20herb%C3%ADvoros https://www.eumed.net/rev/tlatemoani/24/analisis-fitoquimico.html#:~:text=El%20tamiz%20fitoqu%C3%ADmico%20es%20una,farmacol%C3%B3gico%20que%20poseen%20las%20plantas.&text=Las%20plantas%20producen%20un%20amplio,por%20microorganismos%2C%20insectos%20y%20herb%C3%ADvoros
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