09-14 - Percy Humberto Paucar Cueva

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Desafío Peru Veintitrés

31/5/2023

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Semana 9: Monitoreo ambiental:
Evaluación microbiológica de cuartos
limpios y ambientes controlados
Control microbiológico de los medicamentos – FB5096
Docente: Mg. Sergio Renan Quevedo Torres
e-mail: sergio.quevedo@uwiener.edu.pe
Facultad de Farmacia y Bioquímica
TEMARIO
2
1. Introducción
2. Clasificación de salas/cuartos limpios
3. Monitoreo microbiológico ambiental (MMA)
4. Programa de Monitoreo Microbiológico Ambiental
5. Plan de muestreo en el Programa de Monitoreo Microbiológico Ambiental
6. Importancia de un Programa de Monitoreo Microbiológico para Ambientes
Controlados
7. Conclusiones
Somos vwdadwos rna9Stros
Universidad
Norbert Wiener
Al finalizar la sesión el estudiante identifica y
describe la evaluación microbiológica en los
diversos tipos de cuartos limpios y superficies, en la
industria farmacéutica.
LOGRO DE LA SESIÓNLOGRO DE LA SESIÓ
-- ------------ Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos v~os maestros
REFLEXIÓN DESDE LA EXPERIENCIA
¿El ambiente de preparación
de productos citostáticos será
considerado una sala limpia?
¿Por qué?
¿Qué características observas?
RE XIÓN
&
- \ C'YlOlOJ.IC \
Somos v~ maestros
SD
• ,mmc
[I
Universidad
Norbert Wiener
 El MMA es un procedimiento que nos permite determinar el
contenido microbiano de áreas, superficies, personal, equipo y otros.
 El MMA no sólo se requiere para la elaboración de productos estériles,
sino también para los productos no estériles.
 Mantener un control microbiológico ambiental es indispensable para
asegurar la calidad de los productos elaborados y es un índice del
estado higiénico del ambiente que rodea a las instalaciones.
 Se aplica para locales cerrados y limpios donde el número y variedad
de microorganismos desarrollados deben ser bajos y pocos.
 Las estrategias de monitoreo se establecen de acuerdo al área o
superficie a muestrear.
1. Introducción
locales cerrados limpios
superficie a muestrear.
,
area o
Universidad
Norbert Wiener
La monitorización de un ambiente controlado puede abarcar:
Parámetros físicos (··aspectos funcionales .. ):
- Concentración de partículas en el aire.
- Presión diferencial 1
- ,Colmatación de filtros Cuantificación de microorganismos:
- Temperatura.
- Humedad relativa.
- En el aire.
- En superficies.
- - En siuelos. • ••
- En paredes.
- En equipos.
- En vestimenta.
- • • •
Somos verdaderos rnaGStros
Hay aspectos funcionales de los ambientes controlado1s que se
prestan a ser monitorizados:
Det erminación de la concentración de partículas en el aire median te
c 1ontadores de partículas on line
[ ªDebera urilizarse un sis re1na con1inuo de 1nedida pa1·a rnoniroriza.r la conc-enrración de panículas en la
zona de grado A y se recon~íenda para el en1orno de grado a ~1• (Anexo 1 de las GMPs europeas , 3A)].
Control de la p resión diferen c ial entre salas mediante
man ómetros dliferenciales.
Control de la colmatación de los fHtros mediante
manómetros d iferenciales.
Control de la temperatura y la HR ambiental
mediante t ermómetros e h igrómetros.
Somos verdaderos rnaGStros
----.,.~ -·· ,■ . I• ,_
-
f) -=-=-
2. Clasificación de salas/cuartos limpios
GMP Europea USP 24 ISO 14644-1
Zona Límite aceptado 209 E (1992) Límite aceptado ISO Número
yft,_*/ml Clase** yftJml
A <1 M 3.5 3 5
B 10 M 3.5 3 5
e 100 M 5.5 20 7
1
D 200 M 6.5 100 8
USP: United States ~ -ISO: Intemational ~ Organization. GMP: ~ ---
tivQll~ era~. * !.!L<;: Unidad formadora de colonias. **Partículas/m3
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Universidad
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2. Clasificación de salas/cuartos limpios
FED STD 209E fue oficialmente
cancelada por la Administración
de Servicios Generales de los
EE.UU. del Departament de
Comercio de 29 de noviembre de
2001, pero sigue siendo
ampliamente utilizado.
Clase
1
10
100
1.000
10.000
100.000
Somos vwdaderos maestros
máximo de partículas / ft 3
> 0,1 micra > 0 ,2 micras > 0,3 micras > 0,5 micras > 5 micras
35 7 3
350 75 30
750 300
1
10
100
1.000 7
10.000 70
100.000
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2. Clasificación de salas/cuartos limpios
EQUIVALENCIA 1S0-FED-GMP
GMP (UE) Grados ISO 14644-1 Fed. St. 209 1(EEUU)
(Internacional)
209 D 209E
A Clase ISO 5 C]ase 100 C]ase M 3.5
B
e Clase ISO 7 Clase 10.,000 C]ase M 5.5
D Clase ISO 8 Clase 100 .. 000 C]ase M 6.5
ota: a finales del 2001 las autoridades americanas derogaron el Fed. St. 209 que queda sustituida a todos los
efectos por la Norma ISO 14644.
Somos verdaderos rna9Stros
un1vers1aad
Norbert Wiener
ÁREA CRÍTICA (Grado A)
 Es un área limpia diseñada para prevenir la
contaminación microbiana, en la cual existe un
alto nivel de control microbiológico, ya que en
ella tienen lugar pasos del proceso donde no se
permite la contaminación microbiana.
 Aquí, el producto, envases primarios y cierres
estériles se exponen a condiciones ambientales
diseñadas para preservar la esterilidad.
 Estas áreas usualmente se clasifican como A. El
ambiente que rodea a la misma garantizará por
diseño la clasificación.
Ejemplo:
Zonas donde se realizan operaciones de alto
riesgo tales como las zonas de llenado, de
bandejas de tapones, de ampollas/viales
abiertos y de realización de conexiones
asépticas.
2. Clasificación de salas/cuartos limpios
alto nivel de control microbiológico
se exponen a condiciones ambientales
la esterilidad.
Somos vwdadcwos maestros
Ejemplo:
Zonas donde se realizan operaciones de alto
riesgo tales como las zonas de llenado, de
bandejas de tapones, de ampollas/viales
abiertos y de realización de conexiones
asept1cas
CUARTO LIMPIO (Grado B)
Diseñado, mantenido y controlado para
prevenir contaminación microbiana o por
partículas de los productos.
Es el entorno para la zona de grado A en
el caso de preparación y llenado
asépticos.
Los accesos al área deben ser de la
misma clase
2. Clasificación de salas/cuartos limpios
Es el entorno para la zona de grado A
-- -------------------------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos verdaderos maestros
ÁREA CONTROLADA (GRADOS C)
Área limpia que cuenta con un control
definido del ambiente respecto a la
contaminación microbiana o por
partículas, con instalaciones construidas y
utilizadas de tal manera que se reduzca la
introducción, generación y retención de
contaminantes dentro del área.
Permite almacenar material estéril y
limpio.
Ejemplo:
Zonas limpias para realizar fases menos críticas de la
fabricación de productos estériles o para realizar
actividades durante las cuales el producto no está
directamente expuesto (esto es, en un sistema cerrado).
2. Clasificación de salas/cuartos limpios
control
definido del ambiente
Ejemplo:
Zonas limpias para realizar fases menos críticas de la
fabricación de productos estériles o para realizar
-------------------1 actividades durante las cuales el producto no está
directamente expuesto (esto es en un sistema cerrado}
Somos vwdadcwos maestros
ÁREA DE APOYO (GRADO D)
Son áreas limpias clasificadas adyacentes a las
áreas donde se realiza el procesamiento aséptico.
En estas áreas se preparan los materiales para su
posterior limpieza, desinfección y/o esterilización/
despirogenización.
Además, pueden ser pesadas las materias primas
que componen una formulación no aséptica previo
a su introducción en el área de formulación.
2. Clasificación de salas/cuartos limpios
adyacentes a las
áreas donde se realiza el procesamiento aséptico.
Somos verdaderos mD9Str0$
Universidad
Norbert Wiener
 Las áreas limpias se diseñarán logrando obtener los niveles de limpieza del aire especificados tanto
para la condiciones de “REPOSO”, como para las condiciones de “OPERACIÓN”.
 Las áreas limpias destinadas a la fabricación de productos estériles se clasificarán, según las
características exigidas del aire en: A, B, C y D.
 Para alcanzar las clases B, C y D, el sistema de acondicionamiento y ventilación de aire estará
provisto de filtros de alta eficiencia, como filtros HEPA.
2. Clasificación de salas/cuartos limpios
Condicio,nes estáticas Condiciones diinámicas
-
Clases Número máximo permitido de particulas/m,;, ,equivalentes o por encima
01.S µ m Sµm O.Sµm Sµm
A 3 500 o 3 500 o
B 3 500 o 350 000 2. 000
e 350 000 2 000 3 500 000 2.0 000
D 3 500 000 20 000 no definida no detiinida
Tabla No. 1. Cllas.ificación de partículas en el aire para las áreas limpias utilizadas ,e·n la fabricación de productos estériles
Somos verdaderos rna9Stros
2. Clasificación de salas/cuartos limpios
A
D
Grado
A
B
e
D
Somos verdaderos rna9Stros
Ejemplos de operaciones para pr1oductos esterilizados al final
Llenado de ,roductos, c1uindo exista ries o, inusual
Pre ~araci.ón de soluciones, cuando exista riesir,o inusual. Llenado de roductos
Ej 1emplo, de operaciones para p,re_para1ci.1óo asé_pti1ca
~ - ~ - - - - --
... ... ,
Preparación y Uenado asépticos.
Zona de soporte directo ·para area de proceso
Preparación de soluci1ones para filtr-ar
Manipulación de co,mponentes tras su [avado
Universidad
Norbert Wiener
3. Monitoreo microbiológico ambiental (MMA)3. Monitoreo m·crobiológico a bie tal (M
Somos vGt"dadoros rnnastros
Equipos
Paredes
Vestimenta
(ropas y guantes)
nitorizac
robioló
Aire ambiente
Cuantificación de
microorganismos
Supeñicies
Suelos
- Estimación de la carga microbiana del entorno ("bioburden '')
- Determinación y evaluación de tendencias {61trends ")
• Mantener informados a los responsables
A)
ciad
ner
3. Monitoreo microbiológico ambiental (MMA)
 Se realizará el control microbiológico ambiental de las áreas limpias durante la producción,
cuando los materiales estén en la zona, se estén desarrollando las actividades de
procesamiento y esté presente el personal operativo.
 Se tendrá en cuenta que su realización no interfiera con la operación.
 Se realizará el muestreo de las superficies y el personal después de las operaciones críticas
 También se establecerá una vigilancia microbiológica adicional para las operaciones que no
pertenecen a la producción, por ejemplo, después de un proceso de limpieza e
higienización o una actividad de validación.
Somos v«dadoros mDGStros
Universidad
Norbert Wiener
3. Monitoreo microbiológico ambiental (MMA)
 Los resultados del MMA serán considerados como información relevante durante la
evaluación de la documentación del lote para liberar el producto.
3. Monitoreo m·crobiológico a bie tal (M A)
Limites recomendados p,ar.a ta contam inació,n microbio,lógica
Muestra de aire PI acas expuestas Placas de contacto Impresión de guantes, 5
Clase ufc/m3 (diárne,tro 90 m1m) (diámetro 55 mm) dedos
ufc/ 4 horas (a) ufc/p,laca ufc/guante
A ?'1 ?1 ? 1 ?1
B 10 5, 5 5
iC 100 50 25, -
D 200 100 50 -
Nota: Estos valores son promedios puntuales, según las ,estaciones fijas de muestr,eo establecidas por el
fabricante .
Somos vGt"dadoros rnnastros
Universidad
Norbert Wiener
 El programa de monitoreo debe realizarse cumpliendo con los requisitos
gubernamentales y las agencias regulatorias. Debe incluir:
- Medios de cultivo calificados capaces de cumplir con la detección de
bacterias y hongos y asegurar la detectabilidad de los microorganismos
después de la condiciones de exposición y a través de la vida útil del medio.
- Requerimientos para el flujo del personal, equipos y materiales de áreas
monitoreadas, como así también, accesos controlados de personal a
cuartos críticos.
- Sistema apropiado de almacenamiento de equipos cuando no se usan.
- Procedimientos escritos indicando los lugares de muestreo con un grado
de precisión tal que permita muestreos reproducibles.
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental4. Programa de monitoreo m·crobiológico ambiental
-- ------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos vordadGros maostros
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental4. Programa de monitoreo m·crobiológico ambiental
Somos verdadGros maostros
(a) Definición
de los puntos
de muestreo
Monitorización
(1) o
-o (1)
e: ~ ns ....
- ,n
Q. !
uE -
~ (e) Plan de acción
~ en caso de salida
de límites
Programa de control amblent!!__-
Es esencial que permita detectar los cambios a tiempo para poder tomar medidas. ivers·dad
rt Wiener
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
4. 1. Monitoreo del aire
 La evaluación de la calidad microbiológica del aire puede realizarse mediante métodos activos y pasivos
 Los métodos activos o volumétricos utilizan dispositivos para tomar un volumen definido de aire y luego
determinar las unidades formadores de colonias (UFC) presentes en él.
 Un ejemplo de estos dispositivos es el centrífugo de Reuter, el cual tiene una turbina que aspira el aire y
hace que las partículas impacten sobre una tira de agar colocada en la pared interna de la turbina.
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
( 4. l. Monitoreo del aire )
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VIDEO: Monitoreo del aire: Metodología
activa o Volumétrica
https://www.youtube.com/watch?v=-lDRDFM7_qc
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https://www.youtube.com/watch?v=-lDRDFM7_qc
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental4. Programa de monitoreo m·crobiológico ambiental
Muestreo activo de aire (resumen)
Limites recomendados de contaminación
Clasif icación ambiental microbiana
(valores medios) (ufc/m3)
Grado Clase Clase Anexo 1 FDA Sterile Guidanoe USP 2006
Anexo 1 ISO Fed. Std. 209 (GMPs europeas) <1116>
(GMPs 14644 (obsoleto)
europeas)
A 5 100 < 1 1 <3
e 7 10.000 100 10 < 20
D 8 100.000 200 100 < 100
-- ------------------------------- Un i ver s ·da d
Norbert Wiener
Somos verdadGros maostros
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
4. 1. Monitoreo del aire
 El método más empleado es el pasivo o por
sedimentación en placas de Petri.
 En este método los microorganismos viables
presentes en el aire, son llevados a la superficie del
medio sólido por las corrientes de aire presentes en el
área. Es un método fácil, económico que permite
obtener información sobre los microorganismos
capaces de sedimentar en el aire.
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
( 4. l. Monitoreo del aire )
Somos vordaderos maestros
Sedl 111e111ooión de por-1\scu los del
Gire
Contar las UF C
presentes en la
placa.
E,cpuesta G I G 11b iente
de 1 o 4 hrs
Incubar de 3 a 5
días
(de 30 a 35 °C)
Resultados
► UFC/P/Tiempo de
Exposición
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental4. Programa de monitoreo m·crobiológico ambiental
Placas de sedimentación (resumen)
Limites recomendados de contaminación
Clasific<lción ambiental microbiana
(valores medios) (ufc/m3)
Grado Clase Clase Anexo 1 FDA Sterile Guidance USP 2006
Anexo 1 ISO Fed. Std. 209 (GMPs europeas) 0 90 mm (ufc/4 h o ,-as} <1116>
(GMPs 14644 (obsoleto) 0 90 mm (ufc/4 horas)
europeas)
A 5 100 < 1 1 --·
e 7 10.000 50 5 •••
D 8 100.000 100 50 •••
-- -------------------------------- Un i ver s ·da d
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4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
4. 2. Monitoreo de superficies
 Se emplean el método de hisopado y el de placa
de contacto (Rodac):
a) El método de hisopado: Utiliza un hisopo
humedecido, el cual se frota en tres direcciones
sobre un área predeterminada (Cuadrado de
10cmx10cm), luego se coloca en un diluente para
liberar los microorganismos presentes y de allí se
toma una alícuota y se siembra en un medio sólido.
Este método se utiliza para superficies irregulares o
de difícil acceso.
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
( 4. 2. Monitoreo de superficies )
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VIDEO: Monitoreo de superficies Método del
hisopado
https://www.youtube.com/watch?v=zzSkk6KZB54
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https://www.youtube.com/watch?v=zzSkk6KZB54
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
4. 2. Monitoreo de superficies
b) El método de la placa de contacto (Rodac): Son placas
llena de un medio nutritivo sólido con una superficie
convexa que se presionan sobre la superficie plana a
evaluar. Es utilizado para superficies planas.
 El desarrollo de esta técnica comienza a partir de
placas Rodac con medio Agar TSA y se hace contactar
la superficie con el agar para luego incubar en las
condiciones específicas, los resultados se expresan
como UFC por placa.
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
( 4. 2. Monitoreo de superficies )
Somos vordaderos maestros
◄
.. ◄-- Agar 1 ]
_! ____ _ ____ ! ◄•--Fondo
Placa Rodac
Tome la muestra
Colocando el agar
en contacto con la
supeñicie
Exprese UFC/placa
Incube de 30-35 ºC,
de 3 a 5 días
Cuente las UFC
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VIDEO: Monitoreo de superficies Método de la placa de
contacto (Rodac)
https://www.youtube.com/watch?v=AQdMCq90S9E
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https://www.youtube.com/watch?v=AQdMCq90S9E
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental4. Programa de monitoreo m·crobiológico ambiental
Placas de contacto (resun,en)
Límites recomendados de
Clasificación ambiental contaminación microbiana
(valores 111edios) (ufc/placa)
Grado Clase Clase Anexo 1 FDA Sterile USP 2006 <1116>
Anexo 1 (GMPs ISO Fed. Std. 209 (GMPs europea Guidance
europeas) 14 644 (obsoleto) 0 55 mm (u fc/plac.a} 0 90 mm (ufc/4 hora.sJ
A 5 100 < 1 ••• 3 (su elo inclu ido)
e 7 10.000 25 ••• 5
10 ( suelo)
D 8 100.000 50 ••• ---
-- -------------------------------- Un i ver s ·da d
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Somos verdadGros maostros
 Los ensayos microbiológicos deben ser realizados y
supervisados por una persona experimentada,
calificada en microbiología o su equivalente.
 El personal debe estar adecuadamente entrenado,
capacitado y documentado acerca de todos los
conocimientos necesarios para trabajar en áreas
asépticas donde se aplican técnicas microbiológicas, de
buenas prácticas de laboratorio, el uso de los medios de
protección, así como la higiene y hábitos personales.
 Debe estar entrenado en el manejo seguro de
microorganismos para la contención de los mismos
dentro de las instalaciones del laboratorio.
Recordando … “Personal”
Somos verdaderos maGStros
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4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
4. 3. Monitoreo del personal
 El personal es el principal componente en las actividades
de un área y la principal fuente de contaminación.
 El monitoreo del personal constituye un buen indicador
de la disciplina tecnológica del mismo y es
recomendable realizarlo al final de las operaciones
críticas y del proceso.
 El método microbiológico empleado para el personal es
de acuerdo a la técnica de placa de contacto (Rodac) por
impresión de los cinco dedos de cada mano enguantada.
Los resultados se expresan en UFC por guantes.
4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
( 4. 3. Monitoreo del personal )
Somos vordaderos maestros
Imprimir los
cinco dedos r-... -. .., ....... .e -~~........,,, .. \
(~-.:--...... _· -A TS --<f. ,, l ,/ .,/ \..
gar -+ -~\ ,,/'¡'-", .:::¡ )
r====~ t l.~
Placa de Contact - , ,.//
Tipo Rodac !
Incubar de 30 a 35 ºC --->~ Contar las UFC
por guantes
48 a 72 horas
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4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
4. 3. Monitoreo del personal - Vestimenta necesaria para cada grado
 Grado D: Deberá quedar cubierto el cabello y, en su caso, la barba. Deberá llevarse un traje protector
general y zapatos o cubrecalzados, adecuados. Deberán tomarse medidas para evitar la entrada de
contaminación procedente del exterior en la zona limpia.
 Grado C: Deberá quedar cubierto el cabello, y en su caso, la barba y el bigote. Deberá llevarse un traje
de pantalón de una o dos piezas, recogido en las muñecas y con cuello alto, junto con zapatos o
cubrecalzados adecuados. Esta ropa no debe liberar prácticamente ninguna fibra ni partícula.
 Grado A/B: El cabello y, en su caso, la barba y el bigote se cubrirán totalmente con una cofia completa
que se introducirá en el cuello del traje; deberá utilizarse una máscara para evitar la emisión de gotitas.
Se utilizarán guantes apropiados esterilizados de goma o plástico, sin polvos de talco, y se llevará
calzado esterilizado o desinfectado.
4. Programa de moni oreo micro iológico ambiental
( 4. 3. Monitoreo del personal - Vestimenta necesaria para cada grado)
Somos vordadoros maestros
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4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental4. Programa de monitoreo m·crobiológico ambiental
Vestimenta (resumen)
Limites recomendados de contaminación
Clasifica.ción ambiental microbiana
(valores medios) (ufc/placa)
Grado Clase Clase Anexo 1 FDA Sterile USP 2006 <1 116>
Anexo 1 (GMPs ISO Fed. Std. 209 (GMPs europea Guidance (ufclplaca de contacto)
europeas) 14 644
(obsoleto) Jmp~.sión de guantes 5
dedo.s (ufcl guante) Guantes Ropa
A 5 100 < 1 3 5 ---
e 7 10.000 10 20 --- ---
D 8 100.000 --- --- --- ---
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4. Programa de monitoreo microbiológico ambiental
(A, B)
(C)
4. Programa de monitoreo m·crobiológico ambiental
Vestimenta {USP/NF 2003 <1116>)
Clasificación ufc / placa de contacto*
Guantes Ropa
Clase 100 3 5
Clase 1 O. 000 10 20
* La superficie de las placas de contacto varia desde 24 a 30 cm2 • Cuando las muestras se tomen
con escobillones1 el área cubierta deberá ser como mínimo de 24 cm21 pero inferior a 30 cm2 .
-- ----------------------------- Un i ver s ·da d
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Somos verdadGros maostros
5. Plan de muestreo en el Programa de Monitoreo Microbiológico
Ambiental
 Los procedimientos normalizados de trabajo (PNTs) deben especificar:
- Frecuencia del muestreo.
- Momento en que las muestras son tomadas.
- Duración del muestreo.
- Tamaño de la muestra.
- Lugares donde se toma la muestra (visualizados en un plano)
- Técnica y equipo de muestreo.
- Niveles de alerta y acción.
- Respuesta apropiada frente a desviaciones a los niveles de alerta y
acción.
- Clasificación de áreas.
- Requerimiento para la identificación de los aislamientos.
- Requerimiento para los estudios de tendencias
S. Plan de muestreo en el Programa de Monitoreo Microbiológico
Ambiental
---------------------------------
Somos vardadGros ~ros
Universidad
Norbert Wiener
5. Plan de muestreo en el Programa de Monitoreo Microbiológico
Ambiental
 La identificación de los microorganismos aislados proporciona información valiosa, ya que permite, por
ejemplo, detectar el paso de contaminación desde el entorno a la zona crítica.
S. Plan de muestreo en el Programa de Monitoreo Microbiológico
Ambiental
Recuento de Referencia 1 ne u b a e i ó n (temperaturas y tiempos>
USP 2006 <11 16,> 32, 5::t2,5º1C / 48 h
Aerobios
FDA Sterile Guidance 30-35°C / 48-72 h
USP 2006 <11 16> 22,5::t2,5°1C / 72 h
Hongos y levaduras
FDA Sterile G uidance 20-25°C / 5-7 días
Medios de cu ltivo más comúnmente usados
Wueden usa.-se medíos alternativos, siempre que se vaJiden. Debe haber- crecimiento aJ inocula.- con menos de 100 cfu de un organismo de prueba)
Para Aerobios Soybean-1Casein Cigest Aga r I Trypticase S1oy Agrar
(TSA) I Agar soja t riptona
Para Hongos y levaduras Agar Sabouraud
Somos vardadGros ~ros
lad
1er
6. Importancia de un Programa de Monitoreo Microbiológico para
Ambientes Controlados
 El programa de monitoreo microbiológico para ambientes controlados debe evaluar la efectividad de
las prácticas de limpieza y sanitización realizadas por el personal, que podría tener un impacto en la
carga biológica del ambiente.
 Debe proveer suficiente información para asegurar que el ambiente durante la manufactura está
operando dentro de un adecuado estado de control.
 El monitoreo microbiológico ambiental
y el análisis de los datos, por personal calificado, permitirá
saber si el estado del ambiente de manufactura se mantiene bajo control a través del tiempo.
 El ambiente debe ser muestreado durante una operación normal para permitir la colección de datos
significativos. Los muestreos deben ocurrir con los materiales en el área, las actividades de los
procesos en funcionamiento, y el personal en su puesto de trabajo y en actividad.
6. Importancia de un Programa de Monitoreo Microbiológico para
Ambientes Controlados
Somos vardadGros ~ros
Universidad
Norbert Wiener
6. Importancia de un Programa de Monitoreo Microbiológico para
Ambientes Controlados
 El monitoreo, cuando aplique, deberá incluir cuantificación de los muestreos de aire en los cuartos, del
aire comprimido que entre a áreas críticas, superficies, equipos, recipientes contenedores, pisos, paredes
y ropa del personal.
 El objetivo de un programa es obtener una estimación representativa de la bio-carga del ambiente.
 Cuando se cuente con un número representativo de datos, se analizarán y se evaluarán tendencias de los
mismos por parte de personal entrenado en el tema. Las tendencias pueden ser visualizadas mediante la
construcción de cartas de control estadístico que incluyan niveles de alerta y acción.
 Un ambiente controlado es definido por certificación correspondiente a una operación estándar. Los
parámetros que son evaluados incluyen integridad de filtros, velocidad del aire, patrones de aire,
renovaciones de aire, presiones diferenciales. Estos parámetros pueden afectar la bio-carga microbiológica
del ambiente. El diseño, construcción, y las operaciones, pueden variar mucho entre distintas empresas,
haciendo difícil generalizar requerimientos para estos parámetros.
6. Importancia de un Programa de Monitoreo Microbiológico para
Ambientes Controlados
Norbert Wiener
Somos vardadGros ~ros
7. Conclusiones
 La puesta en práctica del monitoreo microbiológico ambiental es una herramienta que permite
caracterizar desde el punto de vista microbiológico en qué condiciones realizamos las
diferentes operaciones.
 La evaluación tanto del grado de contaminación del aire como de la higiene de los equipos y del
personal son necesarias para establecer un control de inspección higiénico sanitario y llevar a
cabo un programa de limpieza y desinfección adecuados.
 Los resultados de los ensayos microbiológicos requieren un análisis cuidadoso para evaluar las
tendencias.
 Se deben lanzar niveles de alerta si se exceden los límites de carga microbiana de cada área
 Si se exceden los niveles con frecuencia se debe hacer una evaluación y tomar medidas para
disminuirla.
7.Conc s
Somos vcardadoros maestros
Semana 10: Examen Microbiológico de
Productos No Estériles. Parte I
Control microbiológico de los medicamentos – FB5096
Docente: Mg. Sergio Renan Quevedo Torres
e-mail: sergio.quevedo@uwiener.edu.pe
Facultad de Farmacia y Bioquímica
EXÁMENES MICROBIOLÓGICOS DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES
Parte I Parte IIA Parte IIB
• Pruebas de recuento
microbiano
• Pruebas de promoción
de crecimiento
• Prueba de productos
• Criterios de aceptación
• Límites de aceptabilidad
• Pruebas de
microorganismos
específicos: E. coli,
Salmonella.
• Promoción del
crecimiento
• Pruebas de productos
• Pruebas de
microorganismos
específicos: Pseudomonas
aeruginosa, S. aureus,
Clostridium, Candida
albicans.
• Pruebas de productos
• Aptitud del método
Al finalizar la sesión el estudiante reconoce
y explica las principales pruebas aplicadas
al control microbiológico de productos
farmacéuticos no estériles.
LOGRO DE LA SESIÓNLOGRO DE LA SESIÓ
-- ------------ Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos v~os maestros
REFLEXIÓN DESDE LA EXPERIENCIA
¿Cuál de los dos productos debería ser estéril? ¿Por qué?
¿Qué significa ser un “producto farmacéutico estéril”?
¿Los productos farmacéuticos no estériles permitirían todo tipo de carga
bacteriana? ¿Por qué?
¿Qué ejemplos de productos no estériles conoces? ¿En que se aplican?
REFLEXIÓ DES LAEX
Somos vardaderos ITIDQ<Stros
RIE CA
NVEVO
$ Pharysol ~
~ TOS pediátrico .,,
Ot:;r.;
Ji,,, " Calma la Tos Seca ~
Y Productiva ~
., Ayuda a eliminar ... { v'
_ la Mucosidad (J .
..
Universidad
,rbert Wiener
• La alteración de un producto no obligatoriamente estéril puede ser llevada a cabo por bacterias,
hongos y levaduras.
• Esto se pone de manifiesto por cambios de coloración, rancidez, cambio en la consistencia, cambio
de pH, separación de fases de una emulsión, enturbiamiento, aparición de olores extraños,
partículas o sedimento.
• Con el fin de obtener productos con una calidad higiénica aceptable es imprescindible el control
microbiológico de todas las materias primas y del agua usada para fabricación
• La correcta limpieza de áreas y equipos, las buenas prácticas higiénicas del personal un diseño
correcto de la formulación y del proceso de fabricación minimizan el riesgo de contaminación
microbiana
1. Introducción
Somos vordaderos maost
Universidad
Norbert Wiener
Factores intrínsecos a la formulación: drogas activas con acción antimicrobiana,
conservadores, pH, contenido de nutrientes, actividad acuosa, presión osmótica, potencial
de óxido-reducción y calidad higiénica de las materias primas empleadas, en especial las
de origen natural.
Factores extrínsecos: condiciones higiénicas durante la manufactura; contenido
microbiano del material de empaque.
1. Introducción
¿De qué va a depender el número y¡
diversidad de microorganismos presentes en
un producto no estérH?
Somos verdadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
1. Introducción
Los productos farmacéuticos no obligatoriamente estériles son los cuales sus vías de
administración son las siguientes:
Vía
inhalatoria
(excepto
Soluciones
Fisiológicas
para
nebulizar)
Vía cutánea, gingival,
nasal, auricular,
parches
transdérmicos
(límites para un
parche incluyendo la
capa adhesiva y el
soporte)
Vía
vaginal
Preparacion
es acuosas
para uso
oral
Preparaciones
no acuosas para
uso oral
Vía rectal
Aplicaciones
sobre escaras,
ulceraciones o
quemaduras
llA qué Uamamos '"'producto no estérU"?
-- --------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos vordaderos maostros
Promoción del crecimiento de los medios
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
Controles negativos
Preparación de cepas de prueba
CONTROLES PRELIMINARES AL ENSAYO MICROBIOLÓGICO DEL PRODUCTO
( Preparación de cepas de prueba J
( Controles negativos J
Promoción del crecimiento de los medios
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maostros
Universidad
Norbert Wiener
• Mediante medios de cultivos se evalúa: si la muestra
tiene gérmenes dentro de los límites establecidos y
que éstos no sean patógenos.
• Medio de cultivo óptimo: se encuentra libre de
gérmenes y aptos para que sean capaces de generar
el crecimiento de microorganismos si estos estuvieran
presenten en la muestra (Control de medios -
Pruebas de Promoción de crecimiento).
MEDIOS DE CULTIVO
Somos vQl"dadQros maestros
Universidad
Norber Wiener
• El método de recuento en placa es el más recomendado como medida cuantitativa de
microorganismos en un producto
• El número más probable (NMP) es generalmente el método menos exacto para los recuentos
microbianos, sin embargo, para una carga microbiana muy baja, puede ser el método más
apropiado. En general se acepta que pueden usarse procedimientos microbiológicos alternativos,
incluyendo métodos automatizados, siempre que haya sido demostrada su equivalencia con el
método de Farmacopea.
• La elección de un método se debe basar en factores tales como la naturaleza del producto y el
límite requerido de microorganismos. Cualquiera que sea el método elegido debe permitir
efectuar el ensayo en una muestra de tamaño suficiente para evaluar la conformidad con las
especificaciones y debe establecerse la idoneidad del método elegido
MÉTODO DE ENSAYO
método de recuento en placa
número más probable (NMP)
-- ----------------------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos vordaderos maostros
B. Preparación de los microorganismos de ensayo
• Se recomienda utilizar suspensiones de cepas de ensayo de colecciones reconocidas
• Es conveniente aplicar técnicas de mantenimiento de cultivo de modo que los
microorganismos viables utilizados para la inoculación no hayan experimentado más
de 5 pasajes a partir del lote de siembra primario original.
Recomendaciones:
• Para la preparación de las suspensiones de microorganismos es conveniente
utilizar una solución de peptona-cloruro de sodio tamponada a pH 7,0 o un
tampón fosfato a pH 7,2.
(!reparación de cepas de prueb~
Somos v«dadGros ~ros
~ . ·--~ ; ,;;·
Universidad
Norbert Wiener
. •.:..
Microorganismo
Preparación de la
cepa de ensayo
Ensayo de fertilidad
Idoneidad del método de recuento
en presencia del producto
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Staphylococcus
aureus tal como:
ATCC 6538; NCIMB
9518; CIP 4.83;
NBRC 13276
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja o
caldo con
hidrolizado de
caseína y de soja
30-35°C
18-24h
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja y
caldo con
hidrolizado de
caseína y de soja
≤100UFC
30-35°C
≤ 3 días
-
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de
soja.NMP: caldo
con hidrolizado de
caseína y de soja.
≤100UFC
30-35°C
≤ 3 días
-
Preparación de cepas de prueba( Preparación de cepas de prueba )
------------------------------------- Universidad
Norbert Wiener
Somos vordadoros maostros
Microorganismo
Preparación de
la cepa de
ensayo
Ensayo de fertilidad
Idoneidad del método de recuento
en presencia del producto
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Pseudomonas
aeruginosa tal como:
ATCC 9027; NCIMB
8626; CIP 82.118;
NBRC 13275
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja o
caldo con hidrolizado
de caseína y de soja
30-35°C
18-24h
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja y
caldo con hidrolizado
de caseína y de soja
≤100UFC
30-35°C
≤ 3 días
-
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de
soja.NMP: caldo con
hidrolizado de
caseína y de soja.
≤100UFC
30-35°C
≤ 3 días
-
Preparación de cepas de pruebae Preparación de cepas de prueba J
Somos vordadoros maostros
Universidad
Norbert Wiener
Microorganismo
Preparación de la
cepa de ensayo
Ensayo de fertilidad
Idoneidad del método de recuento
en presencia del producto
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Bacillus subtilis tal
como: ATCC 6633;
NCIMB 8054; CIP
52.62; NBRC 3134
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja o
caldo con
hidrolizado de
caseína y de soja
30-35°C
18-24h
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja y
caldo con
hidrolizado de
caseína y de soja
≤100UFC
30-35°C
≤ 3 días
-
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de
soja.NMP: caldo
con hidrolizado de
caseína y de soja.
≤100UFC
30-35°C
≤ 3 días
-
Preparación de cepas de prueba( Preparación de cepas de prueba )
------------------------------------- Universidad
Norbert Wiener
Somos vordadoros maostros
Microorganismo
Preparación de
la cepa de
ensayo
Ensayo de fertilidad
Idoneidad del método de recuento
en presencia del producto
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Candida albicans
tal como: ATCC
10231; NCPF
3179; IP 48.72;
NBRC 1594
Agar glucosado
de Sabouraud o
caldo glucosado
de Sabouraud
20-25°C
2-3 días
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja
≤100UFC
30-35°C
≤ 3 días
Agar-agar con
glucosado de
Sabouraud
≤100UFC
20-25°C
≤ 5 días
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja.
≤100UFC
30-35°C
≤ 5 días
NMP: no aplicable
Agar-agar con
glucosado de
Sabouraud
≤100UFC
20-25°C
≤ 5 días
Preparación de cepas de prueba( Preparación de cepas de prueba J
Somos vordadoros maostros
Universidad
Norbert Wiener
Microorganismo
Preparación de
la cepa de
ensayo
Ensayo de fertilidad
Idoneidad del método de recuento
en presencia del producto
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Recuento de
microorganismos
aerobios totales
Recuento de
levaduras y
mohos totales
Aspergillus
brasiliensis tal
como: ATCC
16404; IMI
49007; IP
1431.83; NBRC
9455
Agar-agar
Sabouraud -
dextrosa o agar-
agar con patata-
dextrosa
20-25°C
5-7 días, o hasta
buena
esporulación
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja
≤100UFC
30-35°C
≤ 5 días
Agar-agar
Sabouraud –
dextrosa
≤100UFC
20-25°C
≤ 5 días
Agar-agar con
hidrolizado de
caseína y de soja.
≤100UFC
30-35°C
≤ 5 días
NMP: no aplicable
Agar-agar
Sabouraud –
dextrosa
≤100UFC
20-25°C
≤ 5 días
Preparación de cepas de prueba( Preparación de cepas de prueba )
Somos vordadoros maostros
Universidad
Norbert Wiener
• Para verificar las condiciones de trabajo resulta conveniente preparar un control negativo
utilizando el diluyente elegido en lugar de la preparación a examinar.
• No se debe observar ningún crecimiento de microorganismos. Un resultado no conforme en
el control negativo, requiere una investigación
Control Negativo( Control Negar vo )
t/4)
Somos v~ maestros
A
?
Universidad
Norbert Wiener
• Determina la susceptibilidad del medio de cultivo usando
las diferentes técnicas microbiológicas
• Debe ser realizada por cada lote de medio de cultivo
adquirido (deshidratado o preparado
• Requerimientos:
a. El nuevo lote debe ser inoculado con una concentración
mínima conocida de microorganismos.
b. Los microorganismos usados deben ser los recomendados
en las Farmacopeas.
c. Los microorganismos utilizados no deben ser de un pase
mayor a cinco.
d. Los microorganismos deben ser derivados de colecciones
conocidas internacionalmente.
Promoción del crecimiento de los mediosPromoción del crecimiento de los medios
Somos vordadoros maestros
Promoción de crecimiento de
medio de col · o
Universidad
Norbert Wiener
Consideraciones:
• Se debe sembrar los medios de cultivo líquidos y las placas conteniendo medios de
cultivo sólidos para recuento (como máximo 100UFC) con los microorganismos
indicados.
• Para los medios sólidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor
superior a 2 del valor calculado para un inóculo normalizado al lote de medio
previamente controlado y aprobado.
• Los medios líquidos se pueden considerar adecuados si se observa un crecimiento
claramente visible de los microorganismos comparable al obtenido con un lote de
medio previamente controlado y aprobado
2. Pruebas de recuento microbiano Promoción del crecimiento de los mediosPromoción del crecimiento de los medios
~~PI -------------------------------
Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos vordaderos maostros
Somosv
PRUEBA DE PROMOCIÓN DE
CRECIMlENTO EN MEDIO SOLIDO
?aso l
Prep3rar el inoculo.
Paso 2
Inocular tas cajJ.s preparadas del
nuevo y del .:interior lote por dupli-
cado.
PJ-eo 3
Realizar el extendido de1 inoculo e
incubar.
Paso 4
H.1cer recuento del lote previamente
aprob.:ido.
?aso 5
HJcer recuento de coronias del lote
nuevo.
Paso 6
Comparar fos resultado~ de lo:; lote:;.
él recuento debe est,1r dentro del
factor de 2.
PRUEBA DE PROMOCIÓN DE
CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO
Paso 1
Prepar:ir el inoculo.
Pa~o 2
lnocuku las cajas preparadas del
nuevo y del .1nterior lote por dupli•
cado.
P.lso 3
Inocular un medio no selectivo.
P..l~o 4
Hacer recuento del lote previamente
aprobado.
Paso 5
Hacer la comparación visual de lo!i
dos lotes anal izados.
-----~~-----------1 1
Paso 6
Realizar el recuento en el medio no
selectivo el cual debe ser menor a.
100UFC.
:i
r
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
• La aptitud del método evalúa la capacidad de un método para
detectar los microorganismos previamente inoculados (en cantidad
conocida) en presencia del producto a examinar.
• Se prevé y evalúa si la ausencia de crecimiento en la muestra
corresponde a inactivantes que se encuentren en la formulación
• Permite comprobar que el método sirve para el fin previsto en la
formulación a evaluar.
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
Productos hidrosolubles
• Disolver o diluir (generalmente se prepara una
dilución 1 en 10) el producto a examinar en
solución tamponada de peptona-cloruro de sodio
a pH 7,0, tampón fosfato a pH 7,2 o caldo con
hidrolizado de caseína y de soja.
• Si es necesario, ajustar a pH 6-8.
• Puede ser necesaria la preparación de diluciones
adicionales con el mismo diluyente
A. Preparación de las muestras
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
Productos de naturaleza no lipídica insolubles en
agua
• Disolver o diluir el producto a examinar (generalmente
se prepara una dilución 1 en10) en solución tamponada
de peptona-cloruro de sodio a pH7,0, tampón de
fosfato a pH7,2 o caldo con hidrolizado de caseína y de
soja.
• Para facilitar la suspensión de sustancias difícilmente
humectables, puede añadirse un agente tensioactivo,
tal como 1g/L de polisorbato 80.
• Si es necesario, ajustar a pH 6-8. Puede ser necesaria
la preparación de diluciones adicionales con el mismo
diluyente
A. Preparación de las muestras
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
Productos de naturaleza lipídica
• Disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo,
esterilizado por filtración, o mezclarlo con la cantidad mínima
necesaria de polisorbato 80 estéril o de otro agente tensioactivo
estéril no inhibidor, calentar si es necesario a una temperatura no
superior a 40°C, o en casos excepcionales a una temperatura no
superior a 45°C.
• Mezclar cuidadosamente y, si es necesario, mantener a esa temperatura
en un baño de agua.
• Añadir una cantidad suficiente del diluyente elegido previamente
calentado para obtener una dilución 1 en 10 del producto original.
• Mezclar cuidadosamente mientras se mantiene la temperatura
durante el tiempo mínimo necesario para la formación de una
emulsión.
• Se pueden preparar diluciones1/10 adicionales utilizando el diluyente
elegido que contenga una concentración adecuada de polisorbato 80
estéril u otro agente tensioactivo estéril no inhibidor.
A. Preparación de las muestras
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos verdadoros maestros
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
nut nutricost - ---------
A_lph~ Alpha
Lipo1e Lipoic Acid
600MG 241
•- - 600MG 240 120
(¡~
~ ,.......,.....,_ s- s
.....__ klt-.-1 ~ ........,,. ____ _.,,
Universidad
Norbert Wiener
Productos líquidos o sólidos en forma de
aerosol
• Transferir asépticamente el producto a un
aparato de filtración por membrana o a un
envase estéril.
• Utilizar para cada uno de los envases a
examinar, el contenido total o un número
definido de dosis.
A. Preparación de las muestras
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
20 mi DE SOWCIÓN
Phonal
Universidad
Norbert Wiener
Parches transdérmicos
• Retirar las cubiertas protectoras (capas antiadherentes) de
los parches transdérmicos.
• Colocarlos, con el lado adherente hacia arriba, sobre
bandejas de plástico o de vidrio estériles.
• Cubrir la superficie adherente con un material poroso estéril,
por ejemplo gasa estéril, para evitar que los parches se
peguen entre sí.
• Transferir los parches a un volumen adecuado del diluyente
elegido que contiene inactivadores, tales como polisorbato
80 y/o lecitina.
• Agitar enérgicamente la preparación durante al menos
30min
A. Preparación de las muestras
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
SI FUMA 1 O O MÁS CIGARRILLOS AL DIA
COMIENCE CON LA FASE 1
AYUDA PARA DEJAR DE FUMAR
PARCHES TRANSO~RMICOS TRANSPARENTES
Universidad
Norbert Wiener
B. Inoculación y dilución
• Se añade inóculo de 100UFC como máximo a las muestras y control negativo.
• El volumen de la suspensión del inóculo no debe ser superior al 1% del volumen del producto
diluido.
• Demostración de recuperación microbiana a partir del producto es aceptable: ensayo sobre la
muestra preparada con el factor de dilución más bajo posible.
• Si esto no es posible debido a la actividad antimicrobiana o a la baja solubilidad, deben aplicarse
otros protocolos apropiados.
• Si no puede evitarse de otro modo la inhibición del crecimiento por la muestra, se puede proceder a
una neutralización, dilución o filtración, antes de la adición de la alícuota de la suspensión
microbiana.
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
C. Recuperación del producto en presencia del organismo
Filtración por
membrana
Métodos de
recuento en placa
Número mas
probable
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
Filtración por
membrana
Somos verdaderos maestros
ptitud del método de recuento en presencia del producto
Métodos de
recuento en placa
·•
•.
•
• •
• o
Número mas
probable
Universidad
Norbert Wiener
a. Filtración por membrana
• Filtros: tamaño de poro nominal no superior a 0,45μm.
• Transferir a la membrana filtrante una cantidad adecuada de la
muestra preparada, filtrar inmediatamente y lavar la membrana
filtrante con un volumen apropiado de diluyente.
• Para la determinación del recuento de microorganismos
aerobios totales (RMAT), transferir la membrana filtrante a la
superficie del agar-agar con hidrolizado de caseína y de soja.
• Para la determinación del recuento de levaduras/mohos
combinados totales (RLMT), transferir la membrana a la superficie
del agar-agar glucosado de Sabouraud.
• Incubar las placas y luego efectuar el recuento
C. Recuperación del producto en presencia del organismo
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
a. Filtración por membrana https://youtu.be/QcuYjK6Q7sc
C. Recuperación del producto en presencia del organismo
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
Universidad
orbert Wiener
b. Métodos de recuento
en placa
Método de vertido en placa
Placas Petri de 9cm de diámetro,
añadir a la placa 1mL de la
muestra preparada y 15-20mL de
agar-agar con hidrolizado de
caseína y de soja o agar-agar
glucosado de Sabouraud,
estando ambos medios a una
temperatura no superior a 45°C.
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
C. Recuperación del producto en presencia del organismo
Aptitud
del método de recuento en presencia del producto
Método de vertido en placa
Somos vordadoros maestros
Pour·plate method
Sample is pipetted
into sterile plate
Sterile medium is added and
mixed well with inoculum
lncubation
Subsurlace Surf a ce
colonies colonies
,=::::::::::;i:,
Typical pour•plate
results
Método de extensión en superficie
Extender un volumen medido, no inferior a 0,1mL de la muestra preparada
sobre la superficie del medio
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
b. Métodos de recuento
en placa
C. Recuperación del producto en presencia del organismo
Somos vordadoros maestros
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
l
Inoculación primaria
2
Estría en ángulo recto
Método de extensión en superficie
3
Estría en ángulo recto
para producir una
" estera' ' de desarrollo
c. Número mas probable
Número mas probable (NMP)
La precisión y la exactitud del método del NMP son
inferiores a las del método de filtración por membrana
ya las del método de recuento en placa. Se obtienen
resultados poco fiables particularmente en el recuento
de mohos.
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
C. Recuperación del producto en presencia del organismo
*
Somos vordadoros maestros
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
900 µl de solución buffer
Incubación
+
* 1100 µI de cada
dilución
Número mas probable (NMP)
Universidad
Norbert Wiener
https://youtu.be/p5TBOmFKVFo
c. Número mas probable
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
C. Recuperación del producto en presencia del organismo
Somos vordadoros maestros
Aptitud del método de recuento en presencia del producto
-
) >
J
CLSD C L SS
Dilucion /2 C'llUCQn l r r • t :S/ .lOtl
D itucio 1/2 - --Lit
-------------------------
Universidad
Norbert Wiener
D. Resultados e interpretación
• Cuando se verifica la idoneidad del método de filtración por membrana o del método de
recuento en placa, debe obtenerse un recuento medio de cualquiera de los organismos
de ensayo que no difiera en un factor superior a 2 del valor del control.
• Cuando se verifica la idoneidad del método del NMP, el valor calculado a partir del
inóculo debe estar entre los límites de confianza del 95 por ciento de los resultados
obtenidos con el control.
• Si los criterios anteriores no pueden ser cumplidos por uno o más de los
microorganismos ensayados con cualquiera de los métodos descritos: se utilizan para
examinar el producto el método y las condiciones de ensayo que permitan aproximarse
más a dichos criterios.
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
E. Neutralización/eliminación de la actividad antimicrobiana
• Comparar el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra
preparada vs. el número de microorganismos recuperados de la preparación
control.
• En caso de inhibición del crecimiento: modificar el procedimiento a seguir para
el ensayo particular de recuento para garantizar la validez de los resultados.
• La modificación del procedimiento puede incluir, por ejemplo,
• Un aumento del volumen del diluyente o del medio de cultivo
• La incorporación al diluyente de agentes neutralizantes específicos o
generales
• Una filtración por membrana.
• Una combinación de las modificaciones anteriores.
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Somos vordadoros maestros
• Estos agentes pueden utilizarse para neutralizar la actividad de los agentes
antimicrobianos añadiéndolos al diluyente elegido o al medio preferiblemente antes de
la esterilización.
• Si se utilizan, su eficacia y su ausencia de toxicidad para los microorganismos se deben
demostrar preparando un blanco con neutralizante y sin producto respectivamente.
E. Neutralización/eliminación de la actividad antimicrobiana: Agentes neutralizantes
Aptitud del método de recuento en presencia del productoAptitud del método de recuento en presencia del producto
Sustancia de Interferencia
'
Glutaraldehído, mercuriales
Fenólicos, alcohol, aldehídos, sorbato
Aldehídos
Compuestos de amonio cuaternario (CAC), parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas
CAC, yodo, parabenos
Mercuriales
Mercuriales, halógenos, aldehídos
EDT A ( edetato)
Somos vordadoros maestros
A.gentes Neutrallzantes
Potenciales/Método
Sulfito ácido de sodío (Bisulfito de sodio)
Dilución
Glicina
Lecitina
Polisorbato
Tioglicolato
Tiosulfato
Iones de Mg o Ca
Universidad
Norbert Wiener
3. Prueba de productos Cantidad usada para la prueba
• Usar 10g o 10ml del producto
a examinar
• Para líquidos o sólidos en
forma de aerosol: muestrar 10
envases.
• Para parches transdérmicos:
muestrear 10 parches
• Cuando sustancias activas
están en muestras muy
pequeñas (menos de 1000 ml
o 1000 g): la cantidad
analizada debe ser 1% de la
partida.
• Se debe escoger la(s)
muestra(s) al azar a partir del
material a granel o de los
envases disponibles para la
preparación
3. Prueba de productos
Somos v~os maestros
( __ c_a_n_t_id_a_d_us_a_d_a_p_a_r_a_l_a _P_ru_e_b_a __ J
NiQuitin
21 mg/24h CLEAR
PARCHES TRANSDÉRMICOS
nicotina
SI FUMA 1 O O MÁS CIGARRILLOS AL DIA
COMIENCE CON LA FASE 1
AYUDA PARA DEJAR DE FUMAR
PARCHES TAAlrilSOERMICOS TRANSPARENTES
!!!!l ~
A~ph~ Alpha
Lipo1e Lipoic Acid
;:~ _ , ___ ,-s
...___ ·---
'----------
Universidad
Norbert Wiener
3. Prueba de productos Examen del producto
Filtración por
membrana
Métodos de
recuento en placa
Número mas
probable
Mismos procedimientos que ya explicados
en aptitud del método
3. Prueba de productos
Filtración por
membrana
Somos verdaderos maestros
( ___ E_x_a_m_e_n_d_e_l p_r_o_d_u_c_tº _ _..)
Métodos de
recuento en placa
• o ,- o
Número mas
probable
o o
Universidad
Norbert Wiener
DEMASIADAS
COLONIAS
Cálculo de resultados
- Luego del período de incubación se realiza el conteo de
colonias de las placas
- Finalizado el conteo de colonias se debe aplicar la siguiente
fórmula para obtener el número de UFC/mL o UFC/mg
*mL o mg de muestra a analizar
UFC/ml ó UFC/mg= No de colonias x Factor dilución
mL de volumen sembrado
¿Cuál es el número de UFC/ml de la siguiente placa?
(._ __ c_a_' l_cu_l_o_d_e_re_s_u_lt_a_d_o_s _ _,,,,)
-
Somos vordadoros maestros
1 o l
11 O'
00
2 O
Universidad
Norbert Wiener
El criterio de aceptación en materia de calidad microbiológica, se interpreta
como sigue:
• 10¹ UFC: número máximo aceptable=20;
• 10² UFC: número máximo aceptable=200;
• 10³ UFC: número máximo aceptable=2000,
• Y así sucesivamente
3. Prueba de productos Interpretación de los resultados
Recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) = # de UFCs usando
Agar digerido de Caseína-Soja.
Recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) = #
UFC empleando Agar Sabourad Dexrosa.
3. Prueba de productos ( Interpretación de los resultados )
Recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) = # de UFCs usando
Agar digerido de Caseína-Soja.
Recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) = #
UFC empleando Agar Sabourad Dexrosa.
,V',~PI" --------------------------
Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos vordaderos maostros
Límites de aceptabilidad para productos farmacéuticos no estériles (Farmacopea Europea)
Vía de administración
Recuento de
microorganismos aerobios
totales (UFC/g o ml)
Recuento combinado de
hongos filamentosos y
levaduras (UFC/g o ml)
Microorganismos específicos (1 g o
ml)
Vía inhalatoria 10² 10¹
Ausencia de Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Gram
negativas tolerantes a la bilis
Vía oromucosal, cutánea,
gingival, nasal, auricular,
parches
transdérmicos
10² 10¹
Ausencia de Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa
Vía vaginal 10² 10¹
Ausencia de Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Candida
albicans
Vía oral: preparaciones acuosas 10²
10¹
Ausencia de Escherichia coli
Vía oral: preparaciones no
acuosa
10³
10²
Ausencia de Escherichia coli
Vía rectal 10³ 10² -
Aplicaciones sobre escaras,
ulceraciones o quemaduras
Ausencia de gérmenes revivificables
Somos v«dacklros maestros
Semana 11: Examen microbiológico de productos no estériles
IIA. Pruebas en Bacterias gram (-) tolerantes a la bilis:
Escherichia coli, Salmonella
Control microbiológico de los medicamentos – FB5096
Docente: Mg. Sergio Renan Quevedo Torres
e-mail: sergio.quevedo@uwiener.edu.pe
Facultad de Farmacia y Bioquímica
TEMARIO
85
1. Bacterias Gram (-) tolerantes a la bilis:
1.1. Escherichia coli
1.2. Salmonella sp.
2. Ensayos de microorganismos específicos
3. Preparación de las Cepas de Ensayo
4. Control Negativo
5. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad e inhibición de los medios
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
6.1. Escherichia coli
6.2. Salmonella sp.
Somos vwdadwos rna9Stros
Universidad
Norbert Wiener
Al finalizar la sesión el estudiante conoce y
describe los componentes, requisitos y
herramientas que se utilizan en un examen
microbiológico de productos no estériles, con
énfasis en las pruebas de bacterias Gram
negativas tolerantes a la bilis.
LOGRO DE LA SESIÓN
bacterias Gram
negativas tolerantes a la bilis.
-- -------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos vordac:Soros maostros
REFLEXIÓN DESDE LA EXPERIENCIA
¿Recuerdas los efectos
de E. coli y Salmonella
sp. en nuestro
organismo?
https://www.youtube.com/watch?v=5Kwmvg2W6FA
Somos vGl'dadGros maesi ros
Universidad
Norbert Wiener
https://www.youtube.com/watch?v=5Kwmvg2W6FA
Secreción compleja, que tiene diversas funciones:
 Dispersión y absorción de lípidos durante la digestión, es secretada por
la vesícula en el momento de ingestión de alimentos.
 Elimina el exceso de colesterol y otros productos del metabolismo
hepático.
 Posee potentes propiedades antimicrobianas: actúan como
detergentes en la membrana lipídica, desnaturalizan proteínas y causan
daños en el ADN, destruyendo la homeostasis bacteriana.
 Debido a estas propiedades, la capacidad de la flora intestinal y los
patógenos entéricos para tolerar la bilis es muy importante para su
supervivencia.
Bilis
1. Bacterias Gram (-) tolerantes a la bilis
Vesícula bilíar
Somos vordadoros maestros
1. Bacterias G am (-t o eran es a la bi is
El hígado segrega
la bilís y ésta se
a lmacena en la
vesícula biliar
1'/\.DAM. patógenos entéricos
capacidad de la flora intestinal y los
Universidad
Norbert Wiener
o Las bacterias Gram negativas se caracterizan por presentar una
doble membrana celular, una externa y otra citoplasmática, entre
las que se encuentra una fina pared de peptidoglicano, que les hace
no retener el colorante durante la tinción de Gram.
o La estructura de la membrana externa comprende una parte
exterior constituida por un complejo de lipopolisacáridos cuya
parte lipídica actúa como una endotoxina y es responsable de la
capacidad patógena del microorganismo.
o Esta membrana externa las protege de antibióticos como la
penicilina, colorantes o detergentes, característica que les permite
colonizar medios difícilmente colonizables por otros
microorganismos.
o Entre las bacterias Gram negativas resistentes a las sales biliares se
encuentra Escherichia, Pseudomonas y Aeromonas, Salmonella.
1. Bacterias Gram (-) tolerantes a la bilis1. Bacterias Gra
Somos vordadoros maestros
oleran es a a bil·s
(b)
Citosol
Proteínas
Espacio extracelular
Proteína (porina)
Fosfolf pidos
Universidad
Norbert Wiener
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CV V
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 Depende de las características físicas del producto a examinar.
 Si se utilizan sustancias tensioactivas para la preparación de las muestras, debe demostrarse la
ausencia de toxicidad para los microorganismos y su compatibilidad con los inactivadores utilizados.
 Debe establecerse la capacidad del ensayo para detectar microorganismos en presencia del producto
a examinar.
 Debe confirmarse la idoneidad del método cada vez que se introduzca alguna modificación en la
realización del ensayo, o en el producto, que pueda influir en los resultados.
2.1 . Preparación de la muestra
Somos vordaderos maost
Universidad
Norbert Wiener
3. Preparación de las Cepas de Ensayo
Para microorganismos aerobios/anaerobios facultativas
 Cultivar por separado cada una de las cepas bacterianas aerobias/anaerobias facultativas de ensayo en
caldo con hidrolizado de caseína de soja (Tryptic Soy Broth: TSB) o en agar-agar con hidrolizado de caseína
de soja a 30-35 °C durante 18-24 h.
 Utilizar disolución tamponada de peptona-cloruro de sodio a pH 7,0 o disolución tampón de fosfato a pH
7,2 para preparar las suspensiones problema. Utilizar las suspensiones antes de que transcurran 2 h o 24 h
si están conservadas a 2-8 °C.
3. Preparación de las Cepas de Ensayo
Stc,ph ylococcus aurer.Jis ATCC 6538~ NCl m 9518, Clf 4.83 o NBRC 13276
Pseudomonas aerug ino..;;a ATCC 9027~ NC.l.MB 8626~ CIP 82.118 o N BRC 13275
Escheric:hia coli ATCC 8739~ NCDAB 8545~ Clf 53. 126 o NBRC 3972
Sa/mone/laenterica snbesp. enterica serovar
ATCC 14028
Typhimurium o, como alternativa,
Salmonella enterica snbesp. enterica serovar NBRC 100797, NCTC 6017 o Cll' 80.39
Ahonv
Somos vordac:Soros maostros
4. Control Negativo
 Para verificar las condiciones de ensayo, se realiza un control negativo usando el diluyente elegido
en lugar de la preparación problema.
 No debe observarse crecimiento de microorganismos.
 Es recomendable realizar también un control negativo cuando se examinan los productos.
 Un mal resultado en el control negativo requiere una investigación.
( ___ 4_._c_o_n_t_ro __ e_g_a_t_iv_o __ )
-- ---------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos vwdadoros maostros
5. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad e inhibición de los medios
 Analizar y verificar cada lote de medio preparado para el ensayo y cada lote de medio preparado a
partir de un medio deshidratado o a partir de los ingredientes descritos.
A. Ensayo para determinar las propiedades de FERTILIDAD de medios líquidos:
Sembrar en una porción del medio líquido un pequeño número (como máx 100 UFC) del microorganismo
apropiado. Incubar a la temperatura especificada durante como máx el menor periodo de tiempo
especificado en el ensayo. Se observa un crecimiento claramente visible del microorganismo
comparable con el obtenido anteriormente con un lote de medio previamente ensayado y aprobado.
B. Ensayo para determinar las propiedades de FERTILIDAD de medios sólidos:
Aplicar el método de extensión en superficie, sembrando en cada placa un pequeño número (como máx
100 UFC) del microorganismo apropiado. Incubar a la temperatura especificada durante como máx el
menor periodo de tiempo especificado en el ensayo. Se observa un crecimiento del microorganismo
comparable con el obtenido anteriormente con un lote de medio previamente ensayado y aprobado.
S. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad e inhibición de los medios
Somos vardadcwos maGStros
Universidad
Norbert Wiener
5. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad e inhibición de los medios
C. Ensayo para determinar las propiedades de INHIBICIÓN de medios líquidos o sólidos:
Sembrar en el medio adecuado al menos 100 UFC del microorganismo apropiado. Incubar a la
temperatura especificada durante como mínimo el menor periodo de tiempo especificado en el
ensayo. No se observa crecimiento del microorganismo de ensayo.
S. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad
e inhibición de los medios
Somos vardadcwos maGStros
Universidad
Norbert Wiener
5. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad e inhibición de los medios
Propiedades de fertilidad, inhibición e indicativas del crecimiento en los medios, según Farmacopea
Norteamericana.
S. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad e inhibición de los medios
~
Prueba/Medio PropJedad
Prueba f2_Dra bacte[ias Gram•negativas tolerantes a la bilis
Caldo Mosseil para Enriquecimiento de f.n- Promodón del crecimiento
tero bacterias
Inhibitoria
Agar Vio leta Rojo Bilis Glucosa Promoción del crecí.miento+ Indicadora
Prueba de Escherichia coli
Caldo MacConkey Promoción del creci1miento
Inhibitoria
.Agar MacConkey Promoción del crecimiento + lndícadora
Somos vwdadwos maestros
C~pas de Pr.ueba
E. coli
P. oeruginosa
S. aureus
~ t"('J-/i
P. oerugjnosa
E. coli
S. aureus
E. coli
Universidad
Norbert Wiener
5. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad e inhibición de los medios
Propiedades de
fertilidad, inhibición
e indicativas del
crecimiento en los
medios, según
Farmacopea
Europea.
S. Promoción de crecimiento: Propiedades de fertilidad e inhibición de los medios
Ensayo
Ensayo para detectar
bacterias gram-negativas
resistentes a las sales
biliares
Ensayo para detectar
Escherichia coli
Ensayo para detectar
salmonelas
Somos vardadcwos maGStros
Medio
Caldo para enriquecimiento en
enterobacterias de Mossel
Agar-agar con violeta oristal, rojo
neutro, sales biliares y glucosa
Caldo de MacConkey
Agar-agar de MacConkey
Caldo para enriquecimiento en
salmonelas de Rappaport y
Vassiliadis
Agar-agar con xilosa. lisina y
desoxicolato
Propie,dad Cepas de ensayo
Ensayo de fertilidad
Inhibición
Ensayo de fertilidad
+ indicación
Ensayo de fertilidad
Inhibición
Ensayo de fertilidad
+ indicación
Ensayo de fertilidad
Inhibición
Ensayo de fertilidad
+ indicación
E. coli
p_ aeruginosa
S. aureus
E.coli
P. aeruginosa
E. coli
S. aureus
Eco#
Salmonella enterica
subespecie enterica serotipo
Typhimurium o Salmonella
enterica subespecie enterica
serotipo Abony
S. aureus
Salmonefla enterica
subespecie enterir:a serotipo
Typhimurium o Sa/monella
enterica subespecie enterica
serotipo Aboni'
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
 Preparación de la muestra y pre-incubación.
 Preparar una muestra usando una dilución 1/10 de al menos 1 g del producto a
examinar pero usando como diluyente caldo TSB, mezclar e incubar a 20-25 °C durante
un tiempo suficiente para revivificar las bacterias pero insuficiente para permitir su
multiplicación (generalmente 2 h pero no más de 5 h).
6.1. Bacterias gram negativas resistentes a las sales biliares
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Somos verdadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
 Ensayo para determinar la ausencia de bacterias gram-negativas resistentes a las sales biliares
 Utilizar el volumen correspondiente a 1 g del producto, preparado como se ha descrito, y sembrarlo
en caldo para enriquecimiento en enterobacterias de Mossel. Incubar a 30-35 °C durante 24-48 h.
 Realizar subcultivos sobre placas de agar-agar con violeta cristal, rojo neutro, sales biliares y glucosa
(medio VRBG). Incubar a 30-35 °C durante 18-24 h.
 El producto satisface el ensayo si no se observa crecimiento de colonias.
6.1. Bacterias gram negativas resistentes a las sales biliares
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Somos vordadoros maestros
Universidad
Norbert Wiener
Caldo de enriquecimiento de enterobacterias (EE) Mossel
 Se utiliza para el cultivo y
enriquecimiento de enterobacterias en
los alimentos.
 Cumple con los requisitos armonizados
de USP / EP / JP y no está destinado a
ser utilizado en el diagnóstico de
enfermedades u otras afecciones en
humanos.
 Fue desarrollado por Mossel, Visser y
Cornelissen para facilitar el crecimiento
de Enterobacteriaceae.
 Este medio contiene dextrosa para
mejorar el crecimiento de E. coli y
Salmonella sp. Fundamento: El medio de cultivo contiene dextrosa para facilitar el
crecimiento de la mayoría de las Enterobacterias, de esta forma se
asegura la detección del género Salmonella y de otros microorganismos
lactosa negativo. En este medio el verde brillante y la bilis son los que
actúan como agentes selectivos.
Caldo de enriquecimiento de enterobacterias (EE) Mossel
Digerido Pancreático de Caseína 2,0 g
Pe tona 8,0 g
Dextrosa 5,0 g
Fosfato disódico 8,0 g
Fosfato monopotásico 2,0 g
Bilis fresca deshidratada (oxgall) 10,0 g
Verde Brillante 13,5 mg
Agua destilada 1000 mi
Somos vwdackwos maestros
Uninoculated
Tube
Escherichia co/i
ATCC" 25922
Universidad
Norbert Wiener
Agar Bilis y Rojo Violeta con Glucosa (VRBG)
 Es un medio selectivo, que contiene bilis, colorante rojo violeta y glucosa, para
el aislamiento y la enumeración de enterobacterias.
 Está basado en el Medio MacConkey para la detección y enumeración de
Enterobacteriaceae Gram-negativos tolerantes a la bilis en productos lácteos y
alimentos
 En este medio, la lactosa se reemplaza por glucosa como carbohidrato.
 El grupo Enterobacteriaceae incluye bacterias coliformes fermentadoras de
lactosa (E. coli) y especies que no fermentan lactosa como Salmonella y
Shigella.
Agar Bilis y Rojo Vio1leta con Glucosa (VRBG)
Información práctica
Fórmula en Q/L
Aplicaciones Categorías
Recuento selectivo Enterobacterias Agar bacteriológico 15
Detección Enterobacterias Cristal violeta 0,002
Glucosa monohidratado 10
Industria: Aguas de consumo/ FarmacéuticaNeterinaria / Alimentación Cloruro sódico 5
Regulaciones: USP / ISO 11133 / Farmacopea Europea / ISO 21528
Somos vcardadoros maestros
. . . . . . . .• . • • • • • . . •- .. : . .. . - . . . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . . .. . ..
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• I • • :• • • • ..
Sales biliares
Digerido pancreático de gelatina
Ro'o neutro
Extracto de levadura
Universidad
Norbert Wiener
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
 Ensayo cuantitativo
Selección y subcultivo.
 Sembrar cantidades adecuadas de caldo para enriquecimiento en enterobacterias de Mossel con la
preparación descrita en preparación de la muestra o diluciones de dicha preparación que contengan
respectivamente 0,1 g, 0,01 g y 0,001 g (o 0,1 mL, 0,01 mL y 0,001 mL) del producto a examinar. Incubar
a 30-35 °C durante 24-48 h.
 Realizar subcultivos de cada uno de los cultivos en una placa de agar-agar con violeta cristal, rojo neutro,
sales biliares y glucosa. Incubar a 30-35 °C durante 18-24 h.
Interpretación.
 El crecimiento de colonias constituye un resultado positivo.
 Anotar la menor cantidad del producto que da un resultado positivo y la mayor cantidad que da un
resultado negativo.
 Determinar a partir de la Tabla del número probable de bacterias.
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Somos vwdadwos maestros
Universidad
Norbert Wiener
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Interpretación de los resultados
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Resultados obtenidos con una cantidad de producto de
0,1 g o 0,01 g o 0,001 g o
0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml
+ + +
+ +
+
Somos vardadcwos maGStros
Número más probable de
bacterias por gramo ,o
mililitro de producto
< 103 y> 102
< 102 y> 10
< 10
Universidad
Norbert Wiener
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
 Agregar un volumen de una dilución de la muestra equivalente a 1 g
o ml de producto a un volumen de Caldo TSB.
 Incubar entre 30 y 35° C durante 18 a 24
hs.
 Finalizado el período de incubación, aislar en Agar Mac Conkey.
 Incubar las placas entre 30° C y 35° C durante 18 a 72 hs.
 De observarse desarrollo, confirmar mediante pruebas de
identificación.
El producto satisface el ensayo si no se observan colonias o si los
ensayos de identificación son negativos.
6.2. Investigación de Escherichia coli
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
-- ------------------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos verdadGCos maestros
Agar Agar Macconkey
 Se utiliza para el aislamiento selectivo y la identificación de
Enterobacteriaceae de las heces, la orina, aguas residuales y
alimentos.
 También es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento
de bacterias Gram-negativas entéricas.
 La Farmacopea Europea, USP recomienda este medio
 Además, este medio se recomienda para la prueba de E. coli en
productos
CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS:
Escherichia coli: rojo o rosa; No mucoide; Redonda.
Información ráctica
Aplicaciones
Aislamiento selectivo
Aislamiento selectivo
Detección
Categorias
Enterobacterias
Escherichia coli
Shigella
Industria: Aguas de consumo / FarmacéuticaNeterinaria / Cosmética / Clínica / Alimentación /
Bebidas alcohólicas
Regulaciones: USP / Farmacopea Europea / ISO 21 150 / ISO 21567
Somos verdaderos maestros
Fórmula en /L
Agar bacteriológico
Cristal violeta
Lactosa
Mezcla de peptona
15 Sales biliares
0,001 Peptona de gelatina
10 Rojo neutro
3 Cloruro sódico
Norbert Wiener
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Preparación de la muestra y pre-incubación:
 Preparar el producto a examinar, como se describe en preparación de la muestra y usar
como mínimo 10 g o 10 mL para sembrar una cantidad adecuada de caldo TSB.
 Mezclar e incubar a 30-35 °C durante 18-24 h.
6.3. Investigación de Salmonella
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
-- ------------------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos verdadGCos maestros
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Selección y subcultivo:
 Transferir 0,1 mL de caldo TSB a 10 mL de caldo para enriquecimiento en Salmonellas de
Rappaport Vassiliadis. Incubar a 30-35 °C durante 18-24 h.
 Realizar subcultivos en placas de agar con xilosa, lisina y desoxicolato (XLD). Incubar a 30-35 °C
durante 18-48 h.
6.3. Investigación de Salmonella
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
-- ------------------------------- Un i ver sida d
Norbert Wiener
Somos verdadGCos maestros
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Interpretación:
 La posible presencia de Salmonella está indicada por el crecimiento de colonias rojas bien
desarrolladas, con o sin centros negros, que se confirma por los ensayos de identificación.
 El producto satisface el ensayo si no se observan colonias de los tipos descritos o sin son
negativos los ensayos de confirmación de la identificación.
6.3. Investigación de Salmonella
6. Pruebas de productos: Ensayos realizados a los productos
Somos vordadoros maostros
Universidad
Norbert Wiener
Caldo Rappaport Vassiliadis
 Medio utilizado para enriquecimiento selectivo de especies de Salmonella
spp. (excepto Salmonella typhi y Salmonella paratyphi A) a partir de
alimentos, medicamentos y otros materiales de importancia sanitaria.
 Su fórmula cumple con los requerimientos de la Armonización de
Farmacopeas EP, JP y USP.
 El enriquecimiento selectivo de especies de Salmonella se debe a la
capacidad de estos microorganismos de sobrevivir y multiplicarse a
presiones osmóticas relativamente altas (debido a la elevada
concentración de cloruro de magnesio en el medio), a pH relativamente
bajos, y porque se suprime el efecto tóxico del verde de malaquita hacia
las salmonellas debido a la presencia de cloruro de magnesio.
FÓRMULA (en gramos por litro)
PEPTONA DE SOJA ............................................................................................................ 4,5
CLORURO DE MAGNESIO.6H2O ......................................................................... 29,0
CLORURO DE SODIO ......................................................................................................... 8,0
FOSFATO DIPOTÁSICO ..................................................................................................... 0,4
FOSFATO MONOPOTÁSICO ......................................................................................... 0,6
VERDE DE MALAOUITA ............................................................................................ 0,036
pH FINAL: 5,2 ± 0,2
Somos verdaderos maestros
Control 37 ºC ~1
Left: uninoculated tube - Control
Center: Growth Mixture at 37ºC
Right: Growth Mixture at 41 ,5ºC
Agar XLD (agar de xilosa, lisina, desoxicolato)
 Se recomienda para la identificación de Salmonella en
productos alimenticios, después del preenriquecimiento en un
medio fluido no selectivo como el Agua Peptona Tamponada
(Cat. 1402) y enriquecimiento en un medio fluido selectivo
como la Base de Caldo Muller Kauffmann con Verde Brillante y
Novobiocina (MKTTN) ) (Cat. 1173), el Caldo Rappaport Soja
(Vassiliadis) (Cat. 1174) o el Medio Semisólido Modificado
Rappaport (Vassiliadis).
 Las colonias típicas de Salmonella en agar XLD tienen un
centro negro y una zona ligeramente transparente de color
rojizo debido al cambio de color del indicador.
 Las variantes de Salmonella H2S-negativas crecidas en agar
XLD son rosadas con un centro rosado más oscuro.
 La Salmonella lactosa positiva cultivada en agar XLD es
amarilla con o sin ennegrecimiento.
Somos verdaderos rna9Stros
Fórmula en g/L
Agar bacteriológico 13,5 Citrato de amonio férrico 0,8
Lactosa 7,5 L-Lisina clorhidratro 5
Rojo fenol 0,08 Cloruro sódico 5
Desoxicolato de sodio 1 Tiosulfato de sodio 6,8
Sacarosa 7 ,5 Xilosa 3,75
Extracto de levadura 3
Recovery in XLD (Mixed cultures)
Salmonella spp - tube 41,SºC
> 10 UFC in XLD
Semana 12: Examen microbiológico de productos no
estériles IIB. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Clostridium, Candida albicans
Control microbiológico de los medicamentos – FB5096
Docente: Mg. Sergio Renan Quevedo Torres
e-mail: sergio.quevedo@uwiener.edu.pe
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Al finalizar la sesión el estudiante conoce y
describe los componentes, requisitos y
herramientas que se utilizan en un examen
microbiológico de productos no estériles, con
énfasis en las pruebas de Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clostridium,
Candida albicans.
LOGRO DE LA SESIÓNLOG O DE ASESÓ
Pseudomonas
aeruginosa, Staphy/ococcus aureus, C/ostridium,
Gandida albicans.
Somos verd:xkwos maestros
Universidad
Norbert Wiener
REFLEXIÓN DESDE LA EXPERIENCIA
¿Recuerdas los efectos
de Candida albicans?
https://youtu.be/vhSAJGYN0H4
RE XIÓN
Hahtll
Somos v~ maestros
SD A EXPERIE CA
Universidad
Norbert Wiener
1.1. Candida albicans
• Hongo dimórfico, es decir, se desarrolla de
forma distinta en función de la temperatura
de crecimiento, como levadura, normalmente
a 37ºC en el huésped, y como hongo de
aspecto filamentoso.
• Reproduce de forma asexual por gemación.
• Forma de levadura presenta un aspecto de
células redondas u ovaladas agrupadas en
pequeños grupos, mientras que, en forma de
hongo filamentoso, las células se alargan y se
diversifican tomando la apariencia de
filamentos, pseudo-hifas o pseudo-micelio.
• Infección: Candidiasis
1. Microorganismos aerobiose 1. M"crioorgan·smos ae ob"os )
Somos vordadoros maestros
1.1. Candida albicans
Universidad
Norbert Wiener
1.1. Candida albicans
• Candidiasis: infección superficial que aparece principalmente en individuos con las defensas bajas, afectando a
la piel (intertrigo), a las mucosas (oral, genitourinaria o digestiva) y a las uñas (paroniquia o perionixis)
• Macroscópicamente, en agar Sabouraud

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