Guía de TP 1

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Anatomía e Histología 
 
TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 
 
Métodos de estudio 
Microscopía y Técnicas Histológicas 
 
 
Autores: 
Prof. Tit. Dra. Ana M. Puyó 
Prof. Adj. Farm. Adriana Donoso 
Bioq. Matías Fabiani 
Bioq. Amal P. Gregosa Merlino 
Bioq. Andrea E. Iglesias Molli 
Bioq. Julieta S. Merlo 
 
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 
Métodos de estudio 
Microscopía y Técnicas Histológicas 
 
A. OBJETIVOS 
 
● Conocer los distintos tipos de microscopios y sus aplicaciones. 
● Conocer las partes, los usos, y el manejo del microscopio óptico compuesto de 
campo claro. 
● Relacionar los conceptos de aumento y límite de resolución de un microscopio, 
saber calcularlos y cómo modificarlos. 
● Reconocer distintos tipos de microscopios ópticos: campo claro, campo oscuro, 
contraste de fase, fluorescencia, polarización, confocal y fuerza atómica; y conocer 
las diferencias y los usos de cada uno. 
● Conocer las principales diferencias entre microscopía óptica y electrónica. 
● Conocer las diferencias y los usos de los microscopios electrónicos de transmisión y 
de barrido. 
● Conocer las técnicas utilizadas para la observación de células vivas y sus 
fundamentos. 
● Interpretar la técnica histológica convencional, sus pasos, y el fundamento de cada 
uno de ellos. 
● Conocer los colorantes más comúnmente utilizados en la técnica histológica 
convencional, y comprender los conceptos de acidofilia, basofilia y metacromasia. 
● Conocer los fundamentos y usos de otras técnicas como las técnicas histoquímicas 
de PAS, Feulgen, Sudán e inmunohistoquímicas, hibridación in situ y 
radioautografía. 
 
 
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B. INTRODUCCIÓN AL TRABAJO PRÁCTICO 
 
B.1. MICROSCOPÍA 
 
B.1.I. Microscopio óptico compuesto de campo claro 
El microscopio óptico compuesto de campo claro (MOCC), como los que usaremos en los 
trabajos prácticos (TPs) de nuestra asignatura, consta de tres partes fundamentales: 
● la mecánica 
● la óptica 
● el sistema de iluminación 
La parte mecánica está formada por: 
● El estativo compuesto por el pie (base) y la columna, elementos que están 
destinados fundamentalmente a servir de sostén a todos los componentes del 
MOCC y de permitir la vinculación entre ellos. 
● La platina, superficie perpendicular al eje óptico del MOCC sobre la cual se coloca 
el preparado. Mediante un sistema de correderas, el preparado puede ser 
desplazado hacia adelante, hacia atrás y hacia los laterales. Además, la platina tiene 
un sistema de calibre que permite ubicar un área de interés con precisión. 
● El tubo, paralelo al eje óptico del MOCC, sirve como soporte del sistema óptico. 
● Los tornillos macrométrico y micrométrico, de movimiento rápido y lento 
respectivamente, permiten el desplazamiento hacia arriba y abajo de la platina para 
lograr el enfoque del preparado. 
El sistema óptico está formado por distintos tipos de lentes convergentes que se ubican en 
un eje óptico (línea recta virtual con la que coinciden los ejes de cada una de las lentes que 
constituyen el sistema óptico): 
● Las lentes oculares, llamadas así por estar próximas a los ojos, se encuentran 
montadas en el extremo superior del tubo. Los MOCC monoculares son aquellos 
que tienen una sola lente ocular, y los binoculares, los que tienen dos. El aumento 
de las lentes oculares suele ser de 10X (la X al lado del número indica el aumento). 
Los microscopios trinoculares son básicamente microscopios binoculares a los que 
se ha adicionado una salida, en la cual se puede montar una cámara fotográfica 
para captar imágenes de los preparados. Con la finalidad de indicar o señalar 
células o estructuras en el campo del microscopio es habitual montar un pelo, 
puntero o señalador en el ocular. 
Ae
H
 
 
 
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● Las lentes objetivos, llamados así por estar próximas al objeto de estudio, se 
encuentran en la parte inferior del tubo. Se ubican en una placa giratoria conocida 
como revólver que permite utilizar los diferentes objetivos colocándolos en el eje 
óptico. 
Los objetivos secos son aquellos que no requieren medios especiales entre la lente 
y el preparado histológico, y por lo tanto ese espacio está ocupado por aire. De 
acuerdo con el aumento de la lente, estos objetivos pueden ser 4X (objetivo de 
campo), 10X (objetivo seco débil) y 40X (objetivo seco fuerte). 
Los objetivos de inmersión son aquellos en los que se interpone un medio distinto 
al aire (en general algún tipo de aceite) entre la lente y el preparado histológico para 
aumentar el índice de refracción del medio (índice de refracción del aire ≈ 1, índice 
de refracción de aceite de cedro ≈ 1,5). El objetivo de 100X es un objetivo de 
inmersión. 
El sistema de iluminación está formado por: 
● La fuente de luz, incorporada en la base del MOCC, de la cual parten los rayos de 
luz en dirección al condensador determinada por un sistema de prismas. 
● El condensador, formado por un sistema de lentes que condensan la luz en un 
punto determinado. Este punto puede modificarse desplazando la altura del 
condensador. 
● El diafragma, que regula la entrada de los rayos periféricos que inciden sobre el 
preparado. 
● Los filtros, ubicados en el portafiltros sobre la fuente de iluminación, que modifican 
la longitud de onda de la luz que incidirá sobre la muestra. Los más comúnmente 
usados son los azules que filtran los rayos amarillos y rojos. 
 Ae
H
 
 
 
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ACTIVIDAD 1: Señale en la siguiente figura las diferentes partes de un microscopio óptico 
convencional. 
 
 
 
 
Ae
H
 
 
 
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B.1.II. Aumento y resolución de un microscopio 
B.1.II.a. Aumento 
El aumento de un microscopio es una de sus características esenciales que definen su 
calidad y el tipo de muestras que se podrán observar. El aumento total de un microscopio 
indica en qué medida este puede aumentar la imagen de la muestra observada. 
En el caso del microscopio óptico compuesto, el aumento de la muestra se produce en dos 
etapas, primero en las lentes del objetivo y a continuación en las lentes del ocular. De este 
modo, es necesario conocer el aumento de estas dos partes del microscopio para conocer 
el aumento total que se obtiene, el que se puede calcular fácilmente multiplicando el 
aumento del objetivo por el aumento del ocular: 
Aumento total del microscopio = Aumento objetivo × Aumento ocular 
Este proceso de aumento se puede explicar en base a la naturaleza de las lentes, que no 
son más que cuerpos con la capacidad de desviar los rayos de luz. En el caso de las lentes 
convergentes, los rayos que inciden de forma paralela son desviados de modo que 
convergen en un punto llamado foco. 
 
 
Figura 1: Rayos de luz a través de una lente convergente. 
 
Al mirar una muestra a través de este tipo de lentes, este efecto de convergencia genera 
una imagen virtual de mayor tamaño que la original. 
El principio óptico de un microscopio se basa en aplicar este proceso con dos lentes. La 
imagen intermedia que se genera entre el objetivo y el ocular recibe el nombre de imagen 
real. La siguiente figura muestra de forma esquemática como se genera la imagen virtual de 
la muestra que es observada a través del ocular del microscopio. 
La imagen final resultante de ambas lentes (objetivo y ocular) será virtual, invertida y 
aumentada con respecto a la muestra colocada en la platina. 
Ae
H
 
 
 
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Figura 2: Esquema de funcionamiento de un microscopio considerando una lente objetivo y 
una lente ocular. 
 
Aunque la figura anterior muestra solo dos lentes, los microscopios reales utilizan siempre 
un mayor número de lentes. Estas otras lentes se utilizan para corregir aberraciones ópticas 
y así obtener una imagen más nítida. 
Cuando se observa un preparado histológico, la superficie examinada dependerá del 
objetivo utilizado. Algo importante que debe tener en cuenta es que cuanto mayor sea el 
aumento del objetivo, menor serála superficie observada. Así, los diámetros del campo 
observado son de aproximadamente 1500 µm con el objetivo de 10X, 400 µm con el 
objetivo de 40X, y 150 µm con el de 100X. En las observaciones que realice de los 
preparados durante el trabajo práctico, compare la magnificación del campo observado para 
cada aumento. 
 
B.1.II.b. Resolución 
El aumento de una imagen debe ir siempre asociado con una buena resolución, de lo 
contrario obtenemos una imagen aumentada en la que no se pueden apreciar los detalles. 
Esto ocurre si se combinan distintas lentes con la intención de obtener una imagen de gran 
aumento. Llega un punto en que se aumenta la imagen pero no la resolución, de modo que 
la imagen aumentada no añade nueva información. Sería equivalente a hacer zoom en una 
imagen digital, a partir de un momento la imagen se ve pixelada y al seguir aumentándola 
solo se ven los pixeles a mayor tamaño. 
La resolución obtenida mediante una lente viene definida por su apertura numérica (AN), 
que es una propiedad característica de las lentes y de la cual depende la cantidad de luz 
que penetra en un objetivo. La AN queda definida por la siguiente fórmula: 
AN = n × sen α 
Ae
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donde n es el índice de refracción del medio entre la lente objetivo y la muestra; y sen α es 
el seno del semiángulo de apertura (semiángulo del haz de luz captado por el objetivo). 
Para observar una muestra con buena resolución se debe observar con un aumento que 
esté entre 500 y 1000 veces la apertura numérica del objetivo. Este rango de aumento se 
conoce como aumento útil. Si se sigue aumentando la imagen por encima de este rango la 
imagen aparecerá borrosa sin ganancia de resolución. En este caso el aumento se conoce 
como aumento vacío. 
El límite de resolución (LR) de un sistema óptico se define como la mínima distancia que 
debe existir entre dos puntos próximos para que puedan discriminarse por separado. Puede 
ser calculado según la siguiente fórmula: 
 λ × 0,61 
LR = ————— 
 AN 
donde λ es la longitud de onda de la luz incidente (nm); AN es la amplitud numérica; y 0,61 
es una constante de contraste mínima. 
A partir del cálculo del límite de resolución se puede estimar el poder resolutivo (PR) de 
dicho sistema óptico. Se considera al PR como la capacidad de las lentes de distinguir con 
nitidez dos puntos cercanos ubicados en el plano del objeto. Se podría definir como “la 
capacidad de dar detalles” del instrumento óptico. Esta capacidad es adimensional, e 
inversamente proporcional al límite de resolución del instrumento. Por ende, cuanto menor 
sea el LR (menor distancia entre dos puntos sin que estos se confundan), mayor será el PR 
y mayor la capacidad de obtener detalles. 
Observen que el PR es independiente del aumento total obtenido por la combinación de las 
lentes utilizadas. Un concepto que debe quedar claro es que aumentar no es resolver, 
nunca se podrán ver detalles de estructuras menores al LR por más que se utilicen 
aumentos mayores. 
 
ACTIVIDAD 2: 
a) Calcular el aumento total para cada objetivo (10X, 40X, 100X) usando un ocular de 10X. 
10X : ___________40X: ___________100X:___________ 
b) Calcular el LR máximo que puede obtener con un objetivo de semiángulo de apertura de 
70º (sen 70º = 0,94) utilizando luz de una longitud de onda de 450 nm. Justifique. 
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ 
c) Compare el LR anterior con el obtenido con un objetivo similar, pero colocando aceite de 
inmersión entre la lente y el preparado. Justifique. 
Ae
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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ 
 
ACTIVIDAD 3: Observando la fórmula de LR, pensar dos posibles estrategias para 
disminuir el mismo y aumentar el PR. 
1)________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________ 
2)________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________ 
 
ACTIVIDAD 4: Investigar en la bibliografía sugerida y completar los datos que se solicitan a 
continuación. 
● LR del ojo humano: ___________________________________________________ 
● LR del MOCC: _______________________________________________________ 
● LR del Microscopio Electrónico de Transmisión (MET): _______________________ 
 
B.1.III. Otros microscopios ópticos 
El microscopio de campo oscuro se utiliza para analizar partículas pequeñas, que 
presentan muy poco contraste con el MOCC. Para la microscopia de campo oscuro, se 
emplea un condensador que impide que llegue luz directa al objetivo, sino sólo la luz 
desviada o dispersada por las pequeñas partículas que se desea investigar. El objeto se 
visualiza luminoso sobre un fondo oscuro. En la clínica, el uso de este microscopio tiene 
una importante aplicación para determinar la presencia de la espiroqueta Treponema 
pallidum, el microorganismo causante de la sífilis. 
El microscopio de contraste de fase se utiliza para el estudio de células y tejidos vivos, no 
teñidos, aprovechando las diferencias que hay en el índice de refracción de los distintos 
componentes de la muestra. Cuando la luz atraviesa regiones más densas, y por lo tanto 
con mayor índice de refracción, se refracta y queda fuera de fase con respecto al haz de luz 
inicial, generando zonas más oscuras en contraste con el fondo claro. 
El microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es la capacidad que tienen ciertas 
moléculas de absorber luz en el espectro ultravioleta (UV) y emitirla en el espectro visible. 
Este microscopio utiliza una fuente de luz UV, y sirve para evidenciar la presencia de 
moleculas con fluorescencia natural o moléculas marcadas fluorescentemente, que se 
observan de color brillante frente a un fondo negro. 
El microscopio de polarización se basa en el hecho de que las moléculas muy ordenadas 
pueden rotar el ángulo del plano de la luz polarizada dando lugar a la birrefringencia. 
Estructuralmente es muy similar al MOCC, con el agregado de un filtro polarizador entre la 
Ae
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fuente de luz y el condensador, y de un filtro analizador entre la lente objetivo y el 
observador, ambos filtros con la capacidad de rotarse, para evaluar el grado en que cada 
estructura afecta a la luz polarizada. 
El microscopio confocal permite la visualización de la muestra en tres dimensiones con 
muy alto poder resolutivo, a través de un sistema de iluminación láser que forma un barrido 
superficial y que elimina los rayos de luz fuera de foco. Se explora cada punto de la muestra 
por separado, y la imagen se reconstruye a través de un sistema informático. 
El microscopio de fuerza atómica utiliza un sistema de iluminación láser y una sonda 
mecánica para realizar un rastreo de la superficie de la muestra, y permite la caracterización 
de muestras en el orden de los nanómetros. 
 
ACTIVIDAD 5: ¿Cómo es el poder resolutivo del MOCC respecto del de cada uno de los 
microscopios ópticos descriptos? Justifique. 
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________ 
 
B.1.IV. Microscopía electrónica 
El microscopio electrónico tiene la característica de poder alcanzar menor límite de 
resolución que el microscopio óptico y por lo tanto lograr un mayor poder resolutivo. Para 
esto, la fuente de luz visible(longitud de onda de 450 nm aprox.) del MOCC es reemplazada 
por un haz de electrones (longitud de onda del orden de 0,005 nm). 
Además, el microscopio electrónico tiene lentes compuestas por bobinas electromagnéticas 
(denominadas lentes electromagnéticas), en cuyos campos electromagnéticos se desvía el 
haz de electrones, de modo similar a como se refracta el haz de la luz visible en una lente 
de cristal. También, la AN del microscopio electrónico es mucho menor que en el 
microscopio óptico. 
Teniendo en cuenta la fórmula vista anteriormente, podemos entender cómo impacta la 
modificación de la longitud de onda y la AN sobre el límite de resolución, y podemos inferir 
cómo será el poder resolutivo del microscopio. 
El microscopio electrónico de transmisión (MET) tiene un diseño bastante similar al 
MOCC, en donde el haz de electrones atraviesa la muestra, y permite observar 
características ultraestructurales. La muestra a observar debe procesarse de manera 
particular, los cortes son mucho más delgadas (entre 50 y 150 nm de espesor), ya que el 
poder de penetración del haz de electrones es mucho menor que el de la radiación 
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electromagnética, y la tinción se hace con iones de metales pesados. La imagen se obtiene 
a través de una pantalla o placa fotosensible, en donde las zonas de la muestra que han 
sido atravesadas por los electrones aparecen blancas, y las zonas que han absorbido los 
electrones (por su densidad natural o por su tinción con metales pesados) aparecen 
oscuras. 
El microscopio electrónico de barrido (MEB) o scanning permite observar la superficie 
de las muestras. Los electrones chocan con la superficie de las células, la cual está cubierta 
por una delgada película de carbón o metales como el oro, y se dispersan perdiendo 
energía o se reflejan. Estos electrones secundarios emitidos son recogidos mediante 
detectores y se procesan para formar una imagen tridimensional. 
 
ACTIVIDAD 6: Completar el siguiente cuadro. 
 
Microscopio óptico 
compuesto de campo claro 
(MOCC) 
Microscopio electrónico de 
transmisión (MET) 
Fuente de iluminación 
Longitud de onda de la 
fuente de iluminación (λ) 
 
Límite de resolución del 
microscopio 
 
Poder resolutivo del 
microscopio 
 
Medio en el que se 
encuentra montado el 
preparado para su 
observación 
 
Posibilidad de ver células 
vivas 
 
Capacidad de ver la 
ultraestructura celular 
 
 
 
 
 
 
 
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B.2. TÉCNICAS PARA LA OBSERVACIÓN DE CÉLULAS Y TEJIDOS 
La observación microscópica puede ser realizada tanto sobre células y tejidos vivos como 
muertos. Dependiendo el estado del material a observar, las técnicas utilizadas serán 
distintas. 
B.2.I. Técnicas para la observación de células vivas 
La observación de células vivas puede realizarse: 
● De forma directa, es decir, sin el agregado de ninguna sustancia colorante, mediante 
la utilización de microscopios ópticos, en especial aquellos de campo oscuro o de 
contraste de fase, ya que generan una mejor imagen aún en ausencia de colorantes. 
● Con colorantes vitales, que atraviesan la membrana plasmática y tiñen estructuras 
celulares sin afectar los procesos vitales de las células. El procedimiento puede 
llevarse a cabo: a) in vivo o intravital, mediante la administración del colorante a 
animales de experimentación vivos (por ingestión, inyección o inmersión); y b) in 
vitro o supravital, mediante la administración del colorante a células en cultivo o a 
células vivas esparcidas sobre un portaobjetos. Algunos ejemplos de estos 
colorantes son el azul de metileno, que tiñe los núcleos de color azul y los 
citoplasmas de celeste, o el Verde Jano, utilizado para la observación de 
mitocondrias, que se tiñen de color verde. 
Estas técnicas, de gran utilidad cuando se requiere la observación de células vivas y 
procesos dinámicos, no brindan información o detalle sobre otras estructuras celulares, 
además de presentar la desventaja de no preservar la muestra en el tiempo. Por ello, 
habitualmente se recurre a la observación de materiales procesados adecuadamente post 
mortem. 
B.2.II. Técnica Histológica Convencional 
Del órgano al preparado histológico 
¿Cómo obtenemos preparados histológicos a partir de órganos? En nuestra asignatura la 
mayoría de los preparados que observaremos se obtuvieron a partir del desarrollo de la 
técnica histológica convencional (THC). La THC básicamente nos permite obtener a partir 
de un órgano cortes finos de aproximadamente 5-15 µm, que se colorearán y montarán 
sobre un portaobjetos. De esta manera los haces de luz del MOCC atravesarán dichos 
cortes y se formará la imagen del preparado en el sistema de lentes del microscopio. La 
THC comprende cuatro pasos básicos, en forma ordenada y secuencial, que expondremos 
con mayor profundidad, se trata de: 1) Fijación; 2) Inclusión; 3) Tinción; y 4) Montaje. 
1) Fijación 
Ae
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Cuando un órgano es extirpado deja de estar irrigado, lo que lleva a la descomposición del 
mismo por la falta de llegada de los nutrientes esenciales. Para evitar este proceso de 
degradación (que llevaría a la pérdida de la morfología histológica normal) se utilizan 
fijadores, siendo uno de ellos es el formaldehído, el que mediante la formación de enlaces 
covalentes entre las macromoléculas fija los tejidos evitando la desorganización estructural 
causada por la descomposición. 
2) Inclusión 
Hasta aquí tenemos al órgano conservado en el fijador seleccionado. El paso siguiente 
sería cortarlo en finos cortes de 5-15 µm, pero para ello es necesario armar un bloque (el 
cual contendrá al órgano fijado) que se adhiere a un soporte (generalmente de madera). 
Dicho conjunto se denomina taco. El material que se utiliza para embeber al órgano puede 
ser parafina o una resina sintética tipo paraplast. La parafina es más económica y presenta 
las características de ser sólida a temperatura ambiente y de fundir a 55º aproximadamente. 
Como la parafina es hidrofóbica, para que penetre dentro del órgano, el mismo debe 
deshidratarse previamente. Esta deshidratación se realiza utilizando pasajes en los 
alcoholes de concentración creciente. Luego se realiza un paso de aclaración con xilol, un 
solvente orgánico no polar, que remueve todos los restos de alcohol y es miscible con la 
parafina. Se sigue el siguiente esquema: 
Alcohol 70° → Alcohol 95° → Alcohol 100° → Xilol 
La muestra fijada y deshidratada es colocada en un molde en el cual se vierte parafina 
líquida. Cuando la parafina se enfría quedará conformado el bloque, que será pegado al 
soporte de madera, listo para ser cortado con el micrótomo. 
 
 
Figura 3: Bloque de parafina adherido a un soporte de madera. El conjunto se denomina 
taco. 
 
Ae
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Figura 4: Micrótomo. 
 
3) Tinción 
Los cortes finos que se observan en la figura anterior se colocan sobre un portaobjetos, se 
introducen 10 minutos en la estufa a 55° (punto de fusión de la parafina) para que la 
parafina se funda y así el corte quede pegado al portaobjetos. De lo contrario pueden 
desprenderse en el paso siguiente al sumergirlos en xilol. 
Los colorantes que utilizamos tienen la característica de ser hidrosolubles. Los cortes en el 
portaobjeto se encuentran en parafina (hidrofóbica), en consecuencia, se procede a 
remover la parafina con xilol y realizar la hidratación de los cortes sumergiendo los 
portaobjetos en alcoholes decrecientes, finalmente en agua. El esquema ahora es el 
siguiente: 
Xilol → Alcohol 100º → Alcohol 95º → Alcohol 70º → Agua 
Los cortes se encuentran ahora hidratados y como son incoloros no son aún aptos para su 
examen bajo el microscopio óptico, por lo que necesitan ser coloreados. Los dos principales 
colorantes utilizados en la THC son la eosina, la cual se comporta como colorante ácido, y 
la hematoxilina, como colorante básico. 
4) Montaje 
Paraque los cortes teñidos perduren en el tiempo debe realizarse el montaje. Para ello se 
coloca un cubreobjeto sobre el preparado con un medio de montaje interpuesto, el bálsamo 
de Canadá. Este último tiene la característica de ser hidrofóbico, y como los cortes se 
hidrataron para colorearse, debe realizarse el camino inverso para volver a deshidratarlos. 
En consecuencia, se pasa por alcoholes crecientes hasta llegar al xilol. Una vez 
deshidratados se coloca el bálsamo, luego el cubreobjeto, y se deja secar. Una vez que el 
medio de montaje se solidifica, el preparado está listo para su observación En la figura 
siguiente se observa cómo queda el preparado. 
Ae
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Figura 5: Preparado histológico. 
 
B.2.II.a. Colorantes. Conceptos de acidofilia, basofilia, ortocromasia y metacromasia 
En histología tradicionalmente se denomina colorante básico a aquel que posee cargas 
netas positivas. Algunos ejemplos de colorantes básicos son la hematoxilina, azul de 
Alcian, azul de metileno, azul de toluidina, verde de metilo y los azures. Y colorante 
ácido se denomina a aquel que tiene cargas netas negativas. Los colorantes ácidos más 
utilizados en histología humana son la eosina, la floxina, y el naranja G. 
Aquellas estructuras celulares o extracelulares que tengan carga neta positiva, tendrán 
afinidad para unir colorantes con carga negativa, es decir, ácidos, y es por ello que a dichas 
estructuras se las denomina acidófilas (afinidad por el colorante ácido). Por el contrario, 
aquellas estructuras con carga neta negativa presentarán afinidad por los colorantes con 
carga positiva, es decir, básicos, y por ello se las denomina basófilas (afinidad por el 
colorante básico). 
En base a esto, podemos definir los conceptos de acidofilia y basofilia de la siguiente 
manera: 
► ACIDOFILIA: capacidad de ciertos componentes celulares y/o extracelulares 
básicos (catiónicos, con carga neta positiva) de formar uniones salinas o 
electrostáticas con colorantes ácidos (aniónicos, con carga neta negativa). 
► BASOFILIA: capacidad de ciertos componentes celulares y/o extracelulares ácidos 
(aniónicos, con carga neta negativa) de formar uniones salinas o electrostáticas con 
colorantes básicos (catiónicos, con carga neta positiva). 
Es decir, la acidofilia o basofilia son características propias de las estructuras celulares o 
tisulares, y dependen exclusivamente de la carga eléctrica neta que poseen. Por lo tanto, 
son independientes de los colorantes particulares utilizados. 
Ae
H
 
 
 
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Cabe destacar que, si bien el azul de Alcián es un colorante básico con afinidad por 
estructuras con cargas negativas, es muy comúnmente utilizado en histología para 
evidenciar la presencia de estructuras celulares y extracelulares ricas en polisacáridos 
ácidos, como los que se encuentran en la matriz extracelular del cartílago (GAGs), o en el 
interior de las células caliciformes (mucina). Si bien permite poner en evidencia una 
sustancia química en particular, es un colorante y no una técnica, y puede utilizarse solo o 
como colorante adicional a la hematoxilina y eosina en la técnica histológica convencional, 
por lo cual no se lo incluye dentro de las técnicas histoquímicas. 
 
ACTIVIDAD 7: Marcar con una cruz aquellas estructuras celulares o extracelulares que 
presentan acidofilia o basofilia. 
Estructuras celulares o extracelulares Acidofilia Basofilia 
Núcleo celular 
Zonas citoplasmáticas ricas en RER 
Zonas citoplasmáticas ricas en mitocondrias 
Zonas citoplasmáticas ricas en proteínas 
Matriz extracelular rica en GAGs 
Matriz extracelular rica en fibras colágenas 
 
Teniendo en cuenta la capacidad de un colorante de mantener o de variar su espectro de 
absorción electromagnético (es decir el color con el que van a observarse), podemos definir 
los siguientes conceptos: 
► ORTOCROMASIA: Es la capacidad que tienen los colorantes básicos o ácidos de 
mantener invariable su espectro de absorción electromagnético al formar uniones 
salinas con los componentes celulares o extracelulares que tiñen. Las estructuras se 
tiñen con el color propio del colorante. Esto sucede para la mayoría de los 
colorantes. 
► METACROMASIA: Es la capacidad que tienen algunos colorantes básicos del tipo 
de las tiazinas de variar su espectro de absorción electromagnético al formar 
uniones salinas con determinados componentes celulares o extracelulares 
caracterizados por ser polímeros polianiónicos. Es decir, que tiñen a las estructuras 
de un color diferente al propio. El fenómeno de metacromasia se debe a la 
polimerización espontánea de las moléculas del colorante debido a la unión a grupos 
celulares con carga negativa muy próximos unos a los otros, hecho que provoca un 
cambio en el espectro de absorción del colorante. Como colorantes metacromáticos 
podemos nombrar a la tionina, el violeta de metilo, el azul de bromotimol, y el azul de 
toluidina. Como estructuras celulares y/o extracelulares metacromáticas podemos 
mencionar a la sustancia intercelular del cartílago, por poseer abundante 
Ae
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glucosaminoglucanos (GAGs) ácidos sulfatados, y los gránulos de los mastocitos, 
células presentes en el tejido conectivo laxo de las mucosas. 
Es decir que la ortocromasia y la metacromasia, a diferencia de la basofilia y la acidofilia, no 
depende únicamente de la estructura celular o extracelular, sino también de la naturaleza 
química del colorante. 
B.2.III. Técnicas Histoquímicas 
Las técnicas histoquímicas se utilizan para poner en evidencia determinadas sustancias 
químicas en células o tejidos y en general su fundamento se basa en una reacción química 
entre la sustancia a evidenciar y la sustancia colorante. Algunas de estas técnicas requieren 
de métodos especiales de fijación, que mantengan la integridad y ubicación de las 
estructuras, así como la conservación de las sustancias que se desean investigar. 
De acuerdo con su fundamento, los métodos histoquímicos pueden ser químicos, físicos, 
enzimáticos o inmunoenzimáticos. 
B.2.III.a. Técnica de PAS (Peryodic Acid Schiff) 
El fundamento de esta técnica se basa en la oxidación con ácido peryódico de grupos 
alcoholes presentes en azúcares, liberando grupos aldehídos, de carácter reductor. 
Posteriormente, éstos reducen al reactivo de Schiff (fucsina decolorada o leucofucsina), 
tornándolo fucsia. Esta técnica es utilizada para evidenciar la presencia de polisacáridos, 
glucoproteínas, y proteoglucanos. 
A las estructuras celulares o extracelulares ricas en estas sustancias se las denomina 
entonces PAS+ (PAS positivas), y entre ellas podemos mencionar: 
● el producto de secreción de las células caliciformes (mucina); 
● las membranas o láminas basales que se encuentran debajo de los epitelios y 
alrededor de algunas células como las de músculo liso; 
● la sustancia intercelular del cartílago; 
● el glucocálix o cubierta celular que se encuentra por la cara externa de la membrana 
plasmática en algunos tipos celulares; 
● gránulos de glucógeno, que constituyen la sustancia de reserva energética en 
algunas células. 
B.2.III.b. Técnica de Feulgen 
Esta técnica es específica para evidenciar el ADN. Su fundamento se basa en una hidrólisis 
ácida controlada del tejido con ácido clorhídrico (1N, 60°C) primero, lo que produce la 
ruptura de las uniones entre las bases púricas del ADN y los azúcares, liberándose así los 
grupos aldehído de los azúcares. En un segundo paso, estos grupos aldehídos libres 
reducen al reactivo de Schiff, haciendo que éste se torne fucsia. 
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Esta técnica, al igual que la de PAS, utilizan el mismo colorante: el reactivo de Schiff, o 
fucsina decolorada. Sin embargo, el fundamento de ambas técnicas es distinto, permitiendo 
evidenciar sustancias químicas distintas. 
Cabe aclarar que en esta técnica el ARN se hidroliza completamente, y por esto no 
interfiereen la reacción. 
B.2.III.c. Técnica de Sudán 
La técnica de tinción de Sudán no implica, a diferencia de las mencionadas anteriormente, 
reacción química alguna, sino que se usan sustancias coloreadas solubles en lípidos. Estas 
sustancias se denominan Sudanes, de los cuales existen varios tipos (Sudán rojo, Sudán 
negro) que colorean distintos tipos de lípidos. Estos colorantes se incorporan a los tejidos 
en un vehículo en el cual son solubles, atraviesan las membranas celulares y quedan 
retenidos en los lípidos del tejido, tiñéndolos. 
En este caso, el tejido debe ser fijado por congelación para evitar la pérdida de los lípidos 
por solubilización en los solventes orgánicos utilizados en la fijación de la técnica histológica 
convencional. 
B.2.III.d. Técnicas enzimáticas 
Son técnicas destinadas a la detección de enzimas celulares, por lo cual los cortes de tejido 
se incuban en condiciones adecuadas con un sustrato específico para la enzima que se 
desea evidenciar. Como el producto de reacción enzimático en general no es visible, se 
recurre a reacciones adicionales para poder visualizarlo. Por ejemplo, se usan reactivos que 
con el producto dan un compuesto coloreado que precipita y se hace visible al microscopio. 
Así pueden detectarse enzimas como la fosfatasa ácida (presente en lisosomas), la 
peroxidasa, deshidrogensas, entre otras. 
 B.2.III.e. Técnicas inmunohistoquímicas 
Son un grupo de técnicas histoquímicas que incorporan la utilización de anticuerpos 
específicos como reactivos para la localización de determinados componentes celulares o 
tisulares, permitiendo evidenciar sustancias que se encuentran en muy pequeñas 
cantidades debido a la alta sensibilidad de detección de los anticuerpos. 
B.2.III.f. Radioautografía 
La radioautografía se utiliza para localizar átomos marcados radioactivamente en los 
precursores de los aminoácidos que integran las proteínas y los nucleótidos que integran los 
ácidos nucleicos presentes en los tejidos. Las moléculas precursoras marcadas pueden 
inyectarse en los animales o introducirse en células y tejidos. Una vez obtenida la muestra y 
montada sobre el portaobjetos, se utiliza una emulsión fotográfica sensible a la 
radioactividad que forme una delgada película sobre la superficie. Los sitios en donde hubo 
emisión de radioactividad aparecen como gránulos en la emulsión fotográfica, que pueden 
observarse en el MOCC. 
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La radioautografía puede practicarse también sobre cortes más delgados de material 
incluído en plástico para su observación con el MET, aunque los procesamientos de la 
muestra son más delicados, se obtiene una resolución mucho mayor y una detección más 
precisa. 
 
B.2.III.g. Hibridación in situ 
Se denomina hibridación al proceso por el cual dos moléculas de ácido nucleico 
monocatenarios (ADN o ARN) con complementariedad en la secuencia de bases 
nucleotídicas, se unen entre sí para formar una doble cadena. El método de hibridación in 
situ permite detectar secuencias específicas de ácido nucleicos a través de la unión por 
complementariedad con sondas de ADN monocatenario marcadas radioactivamente. 
 
C. DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO 
C.1. Partes del microscopio 
Trabajando con los MOCC que tienen en las mesadas de TP, deben reconocer todas sus 
partes. 
C.2. Cálculo del aumento y del límite de resolución del MOCC 
Cada una de las lentes objetivos tiene una serie de inscripciones que suelen ser en orden: 
el aumento de la lente, la apertura numérica, el largo total del tubo y el grosor de la lente. 
Utilizando un MOCC, calculen el aumento total y el límite de resolución que se logra con 
cada una de las lentes objetivos. 
C.3. Cómo enfocar un preparado histológico con el MOCC 
Para enfocar un preparado histológico deben seguirse los siguientes pasos: 
1) Seleccionar la lente objetivo de menor aumento (4X o 10X). 
2) Ubicar el portaobjetos con el preparado histológico en la platina, teniendo en cuenta que 
el cubreobjetos quede del lado superior. 
3) Encender el MO y asegurarse que el haz de luz atraviese el objeto a observar. De no ser 
así, acomodar el portaobjetos con las correderas de forma tal que el preparado sea 
atravesado por el haz de luz. 
4) Observando el preparado directamente apoyado en la platina y sin mirar aún a través de 
él/los ocular/es, subir la platina lo máximo posible con el tornillo macrométrico, 
asegurándose que el cubreobjetos no toque la lente objetivo. 
5) Mirando por la/las lente/s ocular/es, bajar la platina con el tornillo macrométrico, hasta 
conseguir el foco. Ajustar el foco con el tornillo micrométrico. 
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Cambio de aumento: 
1) Colocar la estructura que desea ver con mayor/menor aumento en el centro del campo. 
2) Sin mover la platina, seleccionar la lente objetivo con el aumento siguiente (para subir el 
aumento: 4X → 10X → 40X), girando el revólver. 
3) Ajustar el foco con el tornillo micrométrico. Al subir el aumento probablemente sea 
necesario subir un poco la platina con el tornillo micrométrico; y al disminuir el aumento, 
bajarla. 
Recomendaciones importantes: 
• Nunca usar la lente objetivo de 100X. Solamente se utilizará en determinadas 
ocasiones, en las cuáles los encargados de enfocar los preparados van a ser 
siempre los ayudantes de mesada o encargados de comisión. 
• Nunca enfocar con las lentes objetivo de 40X. El proceso de enfoque debe realizarse 
siempre con una lente objetivo de tipo seco débil (4X o 10X), y una vez que el 
preparado se encuentra enfocado, puede utilizarse el objetivo de 40X. 
• Solamente va a subirse la platina con el tornillo macrométrico en proceso de 
enfoque, y debe hacerse mirando directamente el preparado apoyado en la platina, 
para asegurarse que el cubreobjetos no toque el objetivo. 
• Nunca usar el tornillo macrométrico con las lentes objetivo de 40X o 100X. El tornillo 
macrométrico solo puede ser usado con una lente objetivo de tipo seco débil (4X y 
10X). Cuando el MO se encuentre enfocado con los objetivos de 40X o 100X, solo 
puede usarse el tornillo micrométrico para ajustar el foco. 
• Nunca pasar de una lente objetivo de 4X a una de 40X, o viceversa. Siempre que se 
desee cambiar el aumento, debe seleccionarse la lente objetivo el aumento 
inmediatamente superior o inmediatamente inferior, pasando por la lente objetivo de 
10X cada vez que se pase de 4X a 40X o viceversa. 
C.4. Observación de preparados histológicos 
Se dispondrán de distintos preparados histológicos para practicar enfoque y observar la 
tinción, aplicando los conceptos estudiados de estructuras basófilas y acidófilas. 
C.5. Observación de extendidos de mucosa bucal 
Como parte del desarrollo del trabajo práctico observaremos células vivas al microscopio. 
Para ello utilizaremos un colorante vital como es el azul de metileno. Las células las 
obtendremos a partir de un hisopado de la mucosa bucal, dichas células se descaman de 
las capas más superficiales de un epitelio que presenta varias capas celulares y se 
denomina plano estratificado. 
Con ayuda de voluntarios se realizará un hisopado en la cavidad bucal, sobre la cara interna 
de la mejilla. Acto seguido el hisopo se frotará sobre un portaobjetos realizando un 
extendido, una gota de azul de metileno se colocará sobre el mismo. Finalmente se procede 
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a poner un cubreobjetos y eliminar con papel absorbente el excedente de colorante, se pasa 
a colocar el portaobjetos en el MOC y enfocar. 
Como el azul de metileno es un colorante básico se teñirán los núcleos de las células, 
mientras que el citoplasma adquirirá un color celeste pálido. 
 
 
C.6. Observación de microfotografías obtenidas del microscopio electrónico. 
Se dispondrá de microfotografías obtenidas del microscopio electrónico (ME) de transmisión 
y del de barrido. Se apreciarán como se observan las distintas organelas celulares al ME. 
 
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