USO DEL MICROSCOPIO Y TÉCNICAS DE TINCIÓN BACTERIANA (Tinción Simple) - Adelfo Morales Gonzalez

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USO DEL MICROSCOPIO Y TÉCNICAS DE TINCIÓN BACTERIANA (Tinción Simple)
RESUMEN
El microscopio ha sido un instrumento de vital importancia para la Microbiología y para muchas otras ramas como la medicina. En esta práctica por medio de videos se observaron y profundizaron los conocimientos sobre el microscopio, sus partes, usos, tipos e historia desde su creación hasta la actualidad, los cuales han sido fundamentales para la realización de grandes descubrimientos, sumado a esto llegan las tinciones las cuales en microbiología son una de las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para la identificación de microorganismos como bacterias, parásitos, hongos y el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Este trabajo aborda una corta descripción, de los diferentes tipos de microscopios existentes, la importancia de las tinciones, como se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos, así como algunas de las aplicaciones más importantes en la Microbiología. 
INTRODUCCIÓN
Una de las herramientas indispensables sin duda es el microscopio, este nos permite observar aquellos microorganismos que se escapan de nuestro campo visual, de ahí la importancia de conocerlo y los más valioso su buen manejo a la hora de realizar los laboratorios que requieran de su utilización. Existen dos tipos de microscopios simples y los compuestos que se valen de la luz como fuente de energía para formar imágenes aumentadas y detalladas de objetos. por otra parte existen técnicas de coloración o tinción que permiten observar al microscopio con mayor facilidad algún tipo de muestra, estas técnicas permite destacar características morfológicas de los microorganismos, por lo que junto al microscopio dan una óptica mejorada de lo que se observa debido a esto se han desarrollado diferentes tipos de colorantes que tiñen zonas específicas dentro de lo tejido o la célula, lo que ha permitido distinguir, enfermedades, estructuras de los tejidos, entre otros usos dentro de la microbiología y campos afines (López, 2104). Este trabajo tiene como fin primero, conocer y relacionarse con el uso adecuado del microscopio sus función y su cuidados y segundo conocer diferentes tipo de tinción y el empleo de estos.
ESTADO DEL ARTE 
El Microscopio es un instrumento óptico, que nos permite visualizar imágenes difícilmente perceptibles con nuestros órganos visuales es un instrumento básico para el estudio de células y tejidos vegetales ya que su poder resolutivo le da la capacidad de hacer que aquellos objetos que están muy juntos aparezcan separados, para que nos demos una idea el poder resolutivo del ojo humano es de aproximadamente 0.1 mm, de modo que si dos líneas están separadas entre sí por menos de 0.1 mm, dichas líneas aparecerán como una sola línea, no importa cuánto se acerque el observador a ellas; para tener un ejemplo, la mayoría de las células tienen un diámetro inferior a 0.1 mm es decir sin ayuda de lentes la vemos como una sola estructura (Lanfranconi 2001).
Los microscopios empleados en microscopia común son de tipo óptico o compuesto y el estereoscopio o de disección existen una gran variedad de modelos pero el que inauguró la era de la microscopía en el siglo XVII fue el microscopio óptico, este es el tipo más básico de microscopio, se caracterizan por tener un tubo que lleva dos sistemas de lentes: el ocular en el extremo superior y el objetivo en el extremo inferior; la imagen se forma por el objetivo y se magnifica por el ocular (Vargas 2004). Los microscopios equipados con un solo ocular se llaman monoculares; aquellos con dos oculares, binoculares y dependiendo de su tipo, un microscopio puede estar equipado con varios objetivos intercambiables, los más comunes son 2.5x (lupa), 10x, 40x y 100x. 
Existen varios tipos de microscopio, cada uno con diferentes características y principios de funcionamiento, algunos de los más representativos se muestran en la siguiente tabla .
Tabla 1. Tipos de microscopios 
	Microscopio Compuesto
Microscopio Monocular 
	El microscopio compuesto es el tipo elemental de microscopio óptico. El término compuesto indica que se utilizan dos o más lentes para obtener la imagen aumentada. Esta denominación se utiliza en contraposición a la de microscopio simple, que se refiere a los microscopios que funcionan con una sola lente y que se conocen comúnmente como lupas.
El microscopio monocular es aquel que sólo tiene un ocular y por lo tanto permite observar la muestra solo con un ojo. Debido a la sencillez de este tipo de microscopio es habitualmente utilizado por estudiantes o aficionados a la microscopía.
	
	Microscopio Binocular 
	 El microscopio binocular incluye dos oculares de modo que es posible utilizar los dos ojos para examinar una muestra. En los microscopios binoculares la imagen proveniente del objetivo se divide en dos mediante un prisma óptico.
	
	Microscopio Estereoscópico 
	Un microscopio estereoscópico es un tipo de microscopio binocular porque está equipado con dos oculares. Sin embargo, a diferencia del microscopio binocular convencional donde se ve exactamente la misma imagen en los dos oculares, en el microscopio estereoscópico la imagen en cada ocular es distinta. La combinación de las dos imágenes provenientes de los dos oculares produce el efecto de estar viendo una imagen en tres dimensiones. 
	
Por otro lado los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse directamente al microscopio de campo. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observación de la movilidad bacteriana. Los microscopios de contraste de fases, interferencia diferencial (DIC o la microscopía de Nomarski) y campo oscuro permiten aumentar el contraste, empleandose para la observación de vainas, filamentos u otras estructuras bacterianas.
La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste.Una de las técnicas utilizadas es la tinción simple donde se utiliza un colorante, generalmente básico, como por ejemplo, azul de metileno, cristal violeta y fucsina. Todos los microorganismos toman el mismo color, con este tipo de coloración no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares. La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos (López y Torres 2005). Sin embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido. Las técnicas de coloración simple pueden ser positivas o negativas. En las tinciones positivas el colorante es fijado por las células apareciendo los microorganismos de color oscuro o coloreado sobre un fondo luminoso o claro. Ejemplo: tinción de azul de metileno, tinción de Gram, etc. Mientras que, en las tinciones negativas los microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tiñe y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro. Ejemplo: tinción con nigrosina.
METODOLOGÍA
La práctica virtual se desarrolló en 3 partes, inicialmente fue suministrado un material por parte de la docente el cual se titulaba Microscopio óptico: componentes, enfoque y cuidado se realizó la respectiva observación del material y luego se procedió a discutirlo con la clase. seguidamente fue suministrado otro material que llevaba por nombre Tinción simple se realizó la observación y se procedió a debatir con la clase acerca de esta técnica ,su manejo y funcionamiento. Finalmente se realizó una observación microscópica de diferentes muestras por parte de la docente en un simulador virtual donde se explicó el manejo de esa plataforma ( MyScope Explore).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se corroboró que el uso del microscopio es de gran utilidad ya que alo largo del tiempo ha permitido realizar grandes observaciones que han sido de vital importancia en el campo científico a diferencia de muchos años atrás antes de la fabricación de los microscopios cuando era imposible ver las bacterias y microorganismo, por lo que este instrumento es imprescindible en los laboratorios de investigación.
la correcta utilización del microscopio lleva consigo una serie de pasos que son fundamentales para el mantenimiento y funcionamiento del equipo por lo que es sumamente importante conocer como esta compuesto el equipo cual es la manera correcta de manipularlo y que tipo de muestras se pueden observar con los diferentes objetivos ya que si algunos de los objetivos se utiliza de manera errónea especialmente el de 100x puede dañar el lente y afectaría directamente al microscopio
por otro lado se pudo observar la importancia de las tinciones las cuales son de gran importancia para la identificación de microorganismos ya que aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que por medio de los colorantes sea de mayor facilidad la identificación de estos y también la de ciertas estructuras ya que los colorantes nos permiten clasificar bacterias, permiten hacer visibles a los organismos microscópicos y revelan su forma y tamaño.
Por último se hizo uso de la plataforma MyScope la cual fue desarrollada por Microscopy Australia. Esta es una plataforma que proporciona información sobre la ciencia fundamental detrás de diferentes microscopios, explora lo que se puede y no se puede medir con diferentes sistemas y proporciona una experiencia operativa realista en microscopios de alta gama.el uso de esta plataforma fue de mucha utilidad ya que por medio de esta plataforma pudimos obtener un aprendizaje y a la vez una práctica en línea acerca de la microscopía.
CONCLUSIÓN
La importancia del laboratorio del uso del microscopio lo que busca es minimizar los errores de un mal uso del microscopio, como levantarlos en vez de arrastrarlo, de cómo debe ser la correcta limpieza de los lentes buscando alargar la vida útil de este, además de cómo deben prepararse las muestras antes y durante la observación, en cuanto la tinción es importante recalcar sus usos dentro del campo de microscopía pues permiten teñir zonas específicas de los microorganismos ayudando hacer más fácil su identificación, además otros campo como la medicina se benefician de su uso al permitir diagnosticar agentes infecciosos, por lo que la tinción son herramientas de gran uso universal que aún hoy en día siguen vigentes 
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Investigar cuales son las estructuras celulares o moléculas responsables de
la tinción simple realizada, de ejemplo de otros colorantes que podrían
utilizarse
Los colorantes son moléculas cargadas positivas que se combinan con los constituyentes cargados negativamente en las células, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos ejemplos de estos son el azul de metileno, el cristal de violeta y la safranina otro colorantes son lo cargados negativamente y combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente como las proteínas entre estos colorantes encontramos la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo, otro grupo de tinciones son sustancias liposolubles; que se combinan con los materiales lipídicos de la célula, uno de estos ejemplo es colorante negro Sudán, otros colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula ha sido tratada con otra sustancia química, denominada mordiente que es una sustancia que se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante ejemplo de estos es acido tánico (Vázquez et al., 2011)
2. Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por
Qué se debe utilizar el aceite de inmersión al utilizar el objetivo de 100X
-Limpiar las lentes regularmente con paños secos o de telas muy suaves como la gamuza
-Evitar los diluyentes y substancias abrasivas para su limpieza
-Mantener en perfecto estado las partes o piezas mecánicas
-Guardarlos en sitios secos, evitando su exposición prolongada a la luz directa del sol
-Si cualquier líquido es derramado sobre estos dispositivos se deben secar inmediatamente con materiales de gran absorción
-Si el microscopio se debe conectar a la red eléctrica, verificar que cumpla las especificaciones de la electricidad a la cual se desea servir y desconectarlo una vez finalizado su uso.
-Si es necesario trasladarlos a otro lugar, se debe usar el estuche acolchado para prevenir rupturas.
Por qué la gota de aceite de inmersión, tiene el mismo índice de refracción que el vidrio, entre el objetivo de 100X y el portaobjetos (placa) lo que reduce significativamente la dispersión de la luz que ocurriría por lo que incrementa la resolución de la imagen. (Lanfranconi, 2001)
Entre la desventajas están las células se mueren y no se pueden ver en su actividad, colorea solamente una parte de la célula con la que haya afinidad, y nada más, el resto no lo colorea, en el interior de la célula dificulta la observación de orgánulos dentro de la célula y este método preserva el extendido por poco tiempo
3. Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple 
Una de las limitantes de la tinción simple es que si no extendemos la tinción de manera uniforme puede presentar algunos gránulos en su interior lo que dificultará la observación de los microorganismos. Además de eso la tinción simple colorea solamente una sola estructura, y nada más, el resto no lo colorea y por último en este tipo de tinción las moléculas de colorante pueden forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefacto.
4. Explique cómo se lleva a cabo la preparación de un frotis a partir de una
muestra natural o de un cultivo
REALIZACIÓN DEL FROTIS BACTERIANO
 Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio.
tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.
 FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS
Por calor: Pasar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.
Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.
 TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO
Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuación se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se produciría la destrucción de las células.
Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotisconsigo.
 Secar el porta: en ningún caso se debe frotar el porta.
 Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. 
5. Porque debe fijarse la muestra a la hora de realizar la coloración de un
frotis bacteriano y como se realiza este procedimiento.
por que es una serie de alcoholes que puede modificarse en función de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparación quede totalmente deshidratada. se realiza manteniendo el portaobjetos en alcohol por 5 minutos. 
6. Cuáles son las fuente de error frecuentes en la preparación de un frotis
La sobreexposición, o la exposición en una zona incorrecta de la flama (zona fría, zona caliente y zona de fusión) repercutirán en el efecto deseado; es muy común provocar alteraciones morfológicas y destrucción de la célula, (López et al., 2014).
BIBLIOGRAFÍA 
· López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S., Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investig. en discapacidades, 3(1), 10-18.
· Lanfranconi, M. (2001). Historia de la Microscopía. Introducción a la Biología. Fac. de Ciencias Exactas y Naturales.
· Vázquez, C., Martín, A., de Silóniz, M. I., & Serrano, S. (2011). Técnicas básicas de Microbiología. Observación de bacterias. Reduca (Biología), 3(5).
· Lanfranconi, M. (2001). Historia de la Microscopía. Introducción a la Biología. Fac. de Ciencias Exactas y Naturales.
· Varga, J. G. (2004). Microscopía electrónica de barrido ambiental. Revista de plásticos modernos: Ciencia y tecnología de polímeros, (571), 51-61.
· López, A. I. S., Pazos, V., & Torres, D. (2005). Aislamiento y selección de bacterias pertenecientes al género Bacillus con potencialidades para el control biológico en semilleros de tabaco. Centro Agrícola, 32(3), 25-29.