Detección de HBsAg

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Método de ELISA para la detección del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B
T.P. nº 3. Virología
2020
La hepatitis B es una enfermedad del hígado causada por el virus de la hepatitis B (HBV). 
Puede cursar en forma asintomática, o como un proceso agudo o crónico. 
En los casos más graves puede derivar en cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular primario. 
Se transmite principalmente por contacto parenteral, percutáneo, o sexual. También se ha observado transmisión perinatal y horizontal. 
Fundamentos del método
- Los pocillos de la policubeta están recubiertos con anticuerpo de cobayo anti-HBs (anti-HBsAg) que actúa como anticuerpo de captura. 
- La muestra se incuba en uno de los pocillos. Si la misma contiene HBsAg, éste formará un complejo con el anticuerpo unido a la placa. 
- El material no unido se elimina por lavado. 
- En el siguiente paso, se agrega el anticuerpo de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa, que se unirá con los complejos anticuerpo-antígeno formados previamente. 
- El conjugado no unido se remueve por lavado. 
- Posteriormente, se agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno. 
- En los casos en que el HBsAg esté presente en la muestra, se desarrolla color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción 
Presentación del kits de trabajo
Conservar a 4 ºC
Todos los reactivos tienen que estar a temperatura ambiente al momento de su utilización
Protocolo de trabajo
Muestra del paciente
100 ul
Control (-) suero con conservantes y Control (+) suero que contiene HBsAg inactivado.
100 ul de cada uno por duplicado
Placa para ELISA recubierta con Ac de cobayo Anti HBs
Incubar la placa 1 hora a 37º C
Aspirar el líquido de cada pocillo (desecharlo en un recipiente que contenga 5% de hipoclorito de sodio)
Buffer de lavado concentrado: buffer salino con tensioactivo (25X). 
La dilución se prepara utilizando haciendo una dilución 1/25 en agua desionizada. La solución de lavado preparada es estable en heladera durante 3 meses. 
Lavar 5 veces con buffer de lavado (cada lavado 100 l.pocillo-1)
Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líquido residual (invertir la policubeta y golpearla varias veces sobre papel absorbente).
Conjugado concentrado: anticuerpo de cabra anti HBs conjugado con peroxidasa (51X)
Diluyente de conjugado: buffer tris conteniendo proteínas y conservantes.
Para preparar la solución de trabajo (1X) diluir 1 parte del conjugado concentrado + 50 partes del diluyente de conjugado. Solución estable 7 días a 4º C. Preparar al momento de llevar a cabo el ensayo. 
Dispensar 100 ul del conjugado diluido en cada uno de los pocillos.
Incubar 30 minutos en estufa a 37º C 
Aspirar el líquido de cada pocillo (desecharlo en un recipiente que contenga 5% de hipoclorito de sodio)
Lavar 5 veces con buffer de lavado (cada lavado 100 l.pocillo-1)
Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líquido residual (invertir la policubeta y golpearla varias veces sobre papel absorbente).
Revelador TMB: solución de tetrametilbencidina (100X)
Diluyente de TMB: buffer citrato y peróxido de hidrógeno.
Para la obtención del revelador listo para usar, diluir 1 parte del TMB (100X) + 100 partes de diluyente de TMB (conservar protegido de la luz).
Dispensar 100 ul del revelador en cada uno de los pocillos.
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Tapar la placa con papel de aluminio. 
Stopper: ácido sulfúrico 2N
Dispensar 100 ul del stopper por pocillo. 
Leer la placa (color estable: 30 minutos).
Resultados
Control Positivo: se desarrolla color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con el ácido sulfúrico.
Control negativo: no se observa desarrollo de color. 
Para el caso de la muestra del paciente se observa desarrollo de color amarillo cuando se detiene la reacción.