Detección HIV

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Método de ELISA para la detección de anticuerpos anti HIV-1 y anti HIV-2
T.P. nº 3. Virología
2020
Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) son retrovirus transmitidos por la exposición a ciertos fluidos corporales infectados, principalmente secreciones genitales, sangre o productos contaminados derivados de la sangre y pasaje a través de la placenta.
La evidencia serológica de la infección por HIV-1 y HIV-2 puede ser obtenida determinando la presencia de antígenos y anticuerpos en el suero de individuos en los que se sospecha la infección. 
Los antígenos, generalmente, pueden ser detectados en la fase aguda y durante la fase sintomática de la enfermedad. 
Los anticuerpos pueden determinarse a lo largo de toda la infección, comenzando en la fase aguda o inmediatamente después de ella.
Fundamentos del método
Los pocillos de la policubeta están recubiertos con antígenos recombinantes de los virus HIV-1 y HIV-2. 
La muestra de suero del paciente se incuba en los pocillos. 
Si la muestra contiene anticuerpos contra HIV-1 o HIV-2, los mismos se unirán a los antígenos sensibilizados en la placa. 
El material no unido es removido por lavado. 
En el paso siguiente, se agrega el conjugado que contiene los mismos antígenos de la placa conjugados a peroxidasa. 
Estos se unirán a los anticuerpos si estaban presentes en la muestra. 
El conjugado no unido se remueve por lavado. 
A continuación, se agrega una solución conteniendo tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno. 
Las muestras reactivas desarrollan color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico.
Presentación del kits de trabajo
Conservar a 4 ºC
Todos los reactivos tienen que estar a temperatura ambiente al momento de su utilización
Protocolo de trabajo
Muestra del paciente
50 ul
Control (-) suero humano no reactivo inactivado y Control (+) suero humano inactivado conteniendo anticuerpos anti HIV-1 y anti HIV-2
50 ul de cada uno por duplicado
Placa para ELISA recubierta con antígenos recombinantes de HIV-1 y HIV-2
Incubar la placa 30 minutos a 37º C
Aspirar el líquido de cada pocillo (desecharlo en un recipiente que contenga 5% de hipoclorito de sodio)
Buffer de lavado concentrado: buffer salino con tensioactivo (25X). 
La dilución se prepara utilizando haciendo una dilución 1/25 en agua desionizada. La solución de lavado preparada es estable en heladera durante 3 meses. 
Lavar 5 veces con buffer de lavado (cada lavado 100 l.pocillo-1)
Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líquido residual (invertir la policubeta y golpearla varias veces sobre papel absorbente).
Conjugado: antígenos recombinantes unidos a peroxidasa
Listo para usar
Dispensar 100 ul del conjugado diluido en cada uno de los pocillos.
Incubar 30 minutos en estufa a 37º C 
Aspirar el líquido de cada pocillo (desecharlo en un recipiente que contenga 5% de hipoclorito de sodio)
Lavar 5 veces con buffer de lavado (cada lavado 100 l.pocillo-1)
Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líquido residual (invertir la policubeta y golpearla varias veces sobre papel absorbente).
Revelador TMB: solución de tetrametilbencidina y peróxido de hidrogeno (listo para usar.
Dispensar 100 ul del revelador en cada uno de los pocillos.
Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Tapar la placa con papel de aluminio. 
Stopper: ácido sulfúrico 2N
Dispensar 100 ul del stopper por pocillo. 
Leer la placa (color estable: 10 minutos).
Resultados
Control Positivo: se desarrolla color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reacción con el ácido sulfúrico.
Control negativo: no se observa desarrollo de color. 
Para el caso de la muestra del paciente no se observa desarrollo de color.