Técnicas cromatográficas

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Permite el análisis rápido y exacto de gases, vapores líquidos e identificar los componentes 
individuales de las mezclas gaseosas. Inició a finales de 1952 y se ha desarrollado 
notablemente en separación, identificación y determinación de compuestos volátiles (gases y 
líquidos) de puntos de ebullición de hasta 350-400°C. El método tiene las ventajas de ser 
sensible, rápido y sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra información 
cuantitativa exacta con cantidades muy pequeñas de muestra. 
 
En cromatografía de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una 
columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de un fase móvil de un gas inerte 
a diferencia de los otros tipo de cromatografía, la fase móvil no interacciona con la moléculas 
del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna. 
 
Existen dos tipos de cromatografía de gases: la cromatografía Gas-Sólido (GCS) y la 
cromatografía gas líquido (GLC). 
 
Gas portador. Entre los gases portadores deben ser químicamente inertes, se encuentran el 
helio, nitrógeno y el hidrógeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los 
reguladores de presión, manómetros y medidores de caudal. Además el sistema de gas 
portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. 
 
Figura 1. Regulador de presión de dos niveles. 
 
Sistema de inyección de muestra. La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de 
un tamaño adecuado y que sea introducida como un tapón de vapor, la inyección lenta de las 
muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de las bandas y una pobre 
resolución. El método más común de inyección de muestra implica el uso de una micro jeringa 
para inyectar una muestra líquida o gaseosa a través de un diafragma o de goma de silicona 
en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara 
demuestra normalmente está unos 50°C por encima del punto de ebullición del componente 
menos volátil de la muestra. 
 
Configuración de la columna y del horno para la columna. En cromatografía de gases se usan 
dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. La temperatura de 
la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha de regularse a las 
décimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno de 
temperatura controlada , la temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición 
de la muestra y del grado de separación requerida. 
 
Sistemas de detección. El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientes 
características: 
1. Sensibilidad adecuada 
2. Buena estabilidad y reproducibilidad 
3. Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud 
4. Intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente 
hasta al menos 400°C 
5. Tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal 
6. Alta fiabilidad y manejo sencillo 
7. Respuesta semejante para todos los solutos o por el contrario una respuesta selectiva 
y altamente predecible para uno o más tipos de soluto 
8. No destructivo de la muestra. 
 
Tipos de Columnas. Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y capilares o 
semi capilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene lugar la separación 
cromatográfica. Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, 
vidrio y teflón; con un diámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia 
está en torno a 1.000-2.000 (platos teóricos/m). Suelen emplearse para muestras poco 
complejas, máximo 10 componentes. La columna está rellena de un material sólido (soporte), 
finamente dividido y homogéneo; recubierto, por una capa de 0,05-1 μm de espesor, de fase 
estacionaria líquida. Está configurada en forma helicoidal, con un diámetro de unos 15 cm, 
para poder ser instalada en el horno termostatizado. 
 
Fase estacionaria. La elección de la fase estacionaria de una columna cromatográfica ha de 
reunir una serie de requisitos como: 
● Baja volatilidad, su punto de ebullición debe de ser por lo menos 100°C superior a la 
temperatura máxima de operación de la columna. 
● Estabilidad térmica. 
● Cromatografía de gases. 
● Inercia química. 
● Los valores del factor de capacidad (k´) y del factor de selectividad (α) de los analitos 
deben estar dentro de los intervalos aconsejados. 
 
Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos básicos: WCOT, de pared 
recubierta y SCOT, de soporte recubierto. Las WCOT son simplemente tubos capilares donde 
la pared interna se ha recubierto con una finísima capa de fase estacionaria. Las columnas 
SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en 
las columnas de relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. 
 
Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta última, 
ya que en su fabricación se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la 
superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar están las WCOT, 
luego las SCOT y por último las columnas de relleno. 
 
Se produce la retención de los analitos en una fase estacionaria sólida como 
consecuencia de la absorción física. Esta técnica no ha encontrado una gran aplicación 
excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular debido a 
la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de 
picos de elución con colas muy significativas (como consecuencia del carácter no lineal 
del proceso de adsorción). 
 
La cromatografía gas-sólido se basa en la adsorción de sustancias gaseosas sobre 
superficies sólidas. Los coeficientes de distribución son generalmente mucho mayores 
que en el caso de la cromatografía gas-líquido. En consecuencia la cromatografía gas-
sólido es útil para la separación de los componentes como del aire, sulfuro de hidrógeno, 
disulfuro de carbono, óxidos de nitrógeno, monóxido de carbono, dióxido de carbono y gases 
nobles. 
 
Tamices moleculares 
Son intercambiadores de iones de silicato de aluminio, cuyo tamaño de poro depende del tipo 
de catión presente. Los preparados comerciales de esos materiales están disponibles en 
tamaños de partícula de 40/60 mesh a 100/120 mesh. Los tamices se clasifican según el 
diámetro máximo de las moléculas que pueden penetrar en los poros. Los tamices 
moleculares comerciales se encuentran con tamaños de poro de 4, 5, 10 y 13 amstrongs. Las 
moléculas más pequeñas que las dimensiones anteriores penetran en el interior de las 
partículas donde tiene lugar la adsorción, para estas moléculas el área de la superficie 
disponible son enorme cuando se compara con el área disponible para las moléculas más 
grandes. Por ello, los tamices moleculares se pueden utilizar para separar las moléculas 
pequeñas de las grandes. 
 
Polímeros porosos 
Las bolitas de los polímeros porosos de tamaño uniforme se fabrican a partir de estireno 
polimerizado con divinilbenceno. El tamaño de poro en estas bolitas es uniforme y se controla 
por el grado de polimerización. Los polímeros porosos han encontrado una gran aplicación 
en la separación de especies polares gaseosas tales como sulfuro de hidrógeno, óxidos de 
nitrógeno, agua, dióxido de carbono, metanol y cloruro de vinilo. 
 
Figura 2. Aplicación de una columna abierta revestida con un polímero poroso. 
Aplicaciones 
La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas es la técnica 
instrumental más comúnmente empleada en el análisis de anfetaminas y sus derivados. La 
derivatización es requerida para mejorar la cromatografía, en cuanto a la sensibilidad y 
reproducibilidad de aminas primariasy secundarias. 
 
Los derivados de las anfetaminas tales como: 3,4-metilendioxi (MDA), 3,4-
metilenodioxietilanfetamina (MDEA) y 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) constituyen 
un grupo de estimulantes del sistema nervioso que producen efectos cardiovasculares y del 
comportamiento bien identificados. 
 
Por otro lado, se sabe que los ácidos grasos trans incrementan el colesterol LDL y disminuyen 
el colesterol HDL en sangre; consecuentemente, una ingesta excesiva de ácidos grasos 
trans aumenta el riesgo de enfermedad cardiovascular. 
 
La aumentada preocupación por los ácidos grasos trans requiere de métodos precisos 
y convenientes para el análisis de productos comerciales. Dentro de estos métodos la 
cromatografía de gases se ha usado preferencialmente dado su conveniencia y su 
sensibilidad. Bis cianopropil polisiloxano o bis cianopropilsiloxano polisilfenileno son las 
fases estacionarias comúnmente usadas en el análisis de ácidos grasos trans en 
correspondencia a la necesidad por una alta resolución entre los picos de los metil-ésteres 
de los ácidos grasos (FAME). 
 
Existen varios métodos analíticos oficiales utilizando estas fases estacionarias tales 
como los métodos del AOAC (Asociación Oficial De Químicos Agricultores) y AOCS 
(Asociación Americana de Químicos y Aceites) (por sus siglas en inglés). A pesar de que 
el método de AOCS es muy preciso tiene varias desventajas, tales como: 
 
● Tiempo de análisis mayor debido a la longitud de la columna (100 m). 
● Dificultad en la identificación de los picos debido a su fase estacionaria de bis 
cianopropil polisiloxano. 
● Grandes costos económicos debidos al uso de un estándar caro. 
 
Por lo tanto debe buscarse un método más conveniente de GC, particularmente para 
el propósito de control de calidad. 
 
La cromatografía de gases constituye un poderoso instrumento en la determinación de 
los componentes de una muestra, al permitir tanto la separación de éstos como su detección 
individual. Una gran ventaja de este método es la rapidez y su límite de detección, un 
requisito indispensable para el análisis es que la muestra debe ser volátil. 
Los parámetros de la cromatografía de gases dependen de la temperatura a la cual se esté 
trabajando y del flujo del gas de arrastre. Dependiendo de la fase estacionaria utilizada la 
cromatografía de gas se subdivide en: gas-líquido y gas sólido. 
Las partes esenciales de un equipo de cromatografía son: fuente de gas portador, 
sistema de regulación de caudales, bloque termostato de inyección de las muestras, 
columna termostatada, detector termostatado, con amplificador de señal y registro gráfico y 
caudalímetro de precisión. 
 
 
 
 
 
 
La cromatografía es un método físico de separación, basado en la distribución de los 
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra móvil. En 
cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que 
contiene a la fase estacionaria. La cromatografía líquida se lleva a cabo en una columna de 
vidrio. 
 
La Cromatografía de líquidos, es una técnica de análisis químico ampliamente utilizada, la 
cual permite separar físicamente y cuantitativamente los distintos componentes de una 
solución por la absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla, consta de dos fases, 
una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye permanente 
durante el análisis, y que en este caso es un líquido. La tabla 1 muestra los tipos de 
cromatografía líquida que existen así como su separación cromatográfica. 
 
Tabla 1. Clasificación de las separaciones cromatográficas 
 
 
Es una técnica adecuada para separar compuestos orgánicos neutros, principalmente 
los no polares con masas moleculares inferiores a 5000. La cromatografía de capa 
fina (TLC) es un ejemplo de cromatografía de adsorción. 
En esta técnica; la fase estacionaria, es la superficie de un sólido finamente dividido. 
El soluto compite por los sitios de la superficie del sólido con el disolvente , 
resultando una retención de la adsorción. 
Las fases que se utilizan en esta cromatografía, son la sílice y la alúmina; 
prefiriéndose la primera. 
La tendencia de adsorción, disminuye en el orden: 
ácido>alcohol>carbonilo>éster>hidrocarburo. A continuación se muestra 
una cromatografía de absorción. 
En una cromatografía líquido-sólido, si el disolvente tiene una fuerza alta de elución, 
extrae las sustancias absorbidas más rápidamente que uno con valor menor. 
Aplicaciones 
· Análisis de moléculas no ionizantes, insolubles en agua, e isómeros. 
· Separación de vitaminas y sus metabolitos. 
· Análisis de drogas de abuso, y farmacéuticas 
· Análisis de pigmentos vegetales 
 
La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en un 
sólido inerte, el más usado es el ácido silícico o gel de sílice. La fase móvil puede ser 
un disolvente puro o una mezcla de disolventes, la polaridad puede ser notablemente 
diferente a la del líquido estacionario. Consiste en aplicar una gota de la solución con 
la mezcla de sustancias a separar en la parte inferior de una tira de papel y se colocan 
en un recipiente con un solvente, de manera que, este los vaya impregnando; el 
disolvente se elige de manera tal que uno de ellos se adsorba más al soporte que el 
otro; a medida que el disolvente avance a lo largo del soporte los líquidos suben 
espontáneamente por capilaridad. Sus aplicaciones son la resolución de los 
numerosos aminoácidos formados en la hidrólisis de una proteína, la separación y 
análisis de alcoholes alifáticos y la separación de derivados de azúcares. 
 
Figura 3.Separación de moléculas pequeñas por cromatografía de partición 
 
Se lleva a cabo con empaques de columna que tiene grupos funcionales cargados 
unidos a una matriz polimérica. Los grupos funcionales enlazados permanentemente 
y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retención más 
común es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase móvil con el 
grupo cargado de la fase estacionaria. Los empaques cargados positivamente se 
utilizan para el intercambio con especies aniónicas. Los más comunes son las aminas 
cuaternarias, las cuales son fuertemente básicas y en su forma OH presentan las 
propiedades de una base fuerte. La cromatografía de intercambio iónico puede 
efectuarse con alguno de los varios tipos de empaques, el intercambiador puede 
también estar enlazado a macropartículas de sílice por medio de reacciones de 
sililación o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso. El 
proceso primario en la cromatografía de intercambio iónico involucra la 
adsorción/desorción de materiales iónicos cargados en la fase móvil con una fase 
estacionara permanentemente cargadas. Un ejemplo es cuando una resina ionizada, 
inicialmente en forma H, en contacto con una solución que contiene iones K+, existe 
un equilibrio: 
 
La fase de resina presenta preferencia por: el ion de carga mayor, el ion con menor 
radio solvatado, el ion que tenga mayor polarizabilidad. 
Las aplicaciones de intercambio catiónico son que los cationes inorgánicos se pueden 
determinar en alimentos, tales como los alimentos dietéticos bajos en sodio, y en 
muestras de orina y en intercambio aniónico se pueden separar los ácidos HCN, 
carbónico, silícico y bórico de los ácidos fosfórico, sulfúrico y clorhídrico. 
 
Es una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatográfica empacada 
de tal manera que las partículas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaños 
de poros o de redes de poros con el fin de que las moléculas de soluto sean retenidas 
oexcluidas basándose en su forma y tamaño y no en el peso molecular. Las 
moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los poros y son arrastrados alrededor 
de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de “cama de 
vacío” de la fase móvil y las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porque 
tiene más espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de difusión hacia 
los poros que tienen accesibles. Lo que es el empaquetamiento de columnas están 
los polímeros macromoleculares semirígidos, los entrecruzados, las sílices rígidas o 
las de “poro controlado”. Los materiales semirígidos se hinchan ligeramente se debe 
tener cierto cuidado en su uso ya que se limitan a una presión de 300psi. La 
cromatografía de exclusión requiere un solo disolvente durante el análisis en el cual 
se pueda disolver la muestra. El único inconveniente que puede presentarse con los 
disolventes es la relación de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra 
inyectada difiere mucho con la viscosidad de la fase móvil se pueden dar, una 
distorsión en los picos cromatográficos y cambios anómalos en los tiempos de 
retención. 
 
 
 
Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre 
un plano, éste puede ser un papel, que esté impregnado con una sustancia que actúe 
de fase estacionaria o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal 
como una placa de vidrio. La cromatografía plana tiene como fase móvil un líquido y 
como fase estacionaria un líquido o un sólido dispuestos sobre una superficie plana; 
En cuestión de aplicaciones se utiliza para separar e identificar los componentes de 
pequeñas muestras de substancias inorgánicas, orgánicas y bioquímicas, se usa en 
determinadas aplicaciones con una finalidad didáctica, también para la separación 
de muestras clínicas y bioquímicas así como en otras aplicaciones analíticas 
generales por su gran sencillez y bajo costo. 
 
Se utilizan papeles especiales de elevada pureza. Es una técnica muy sencilla, se utiliza una 
tira de papel de filtro como soporte para la separación. El mecanismo que interviene en la 
separación fundamentalmente de reparto. La fase estacionaria está constituida por el agua 
absorbida sobre las moléculas de celulosa del papel. El papel utilizado puede ser papel de 
filtro estándar o papel, La fase móvil se selecciona empíricamente, se emplean mezclas 
consistentes en compuestos orgánicos, agua y otras especies (ácidos, bases, agentes 
complejantes) que modifiquen la solubilidad de los compuestos de la muestra. 
 
Se realiza en placas de vidrio o plástico recubiertos con una capa delgada de 
partículas finamente divididas contenidas en la fase estacionaria. El mecanismo 
predominante es la adsorción. Los materiales más usados han sido: gel de sílice, alúmina, 
celita, poliamidas. La fase móvil el disolvente a utilizar debe reunir una serie de 
características: inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase estacionaria, 
elevada pureza, adecuada viscosidad y tensión superficial, bajo punto de ebullición 
para facilitar el secado de las placas, económico y baja inflamabilidad y toxicidad. 
 
Figura 4. Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de sílice) de algunos aminoácidos. 
 
El HPLC se utiliza para: detección y cuantificación de sacarina benzoatos, cafeína y 
aspartame en refrescos; detección de ciclomato en jugos de fruta; separación de ésteres de 
ácidos grasos por fase inversa y con argentación de columnas; separación de triglicéridos por 
la longitud de la cadena y el grado de instauración por fase inversa y detector de dispersión 
luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas; determinación del contenido de Vit 
A y sus precursores en margarina y aceites de hígado por fase inversa; determinación del 
contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal. 
 
Un equipo para HPLC puede ser representado por la siguiente imagen: 
 
Figura 5.Esquema de los componentes de un HPLC 
 
La fase móvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes; algo 
importantes es que deben ser grado HPLC, esto implica un 99% o más de pureza 
para evitar contaminantes que puedan interferir en la elución de la muestra o bien que 
contengan algunas pequeñas partículas que puedan tapar la columna; por lo que es 
necesario filtrarlos antes de que entren a la columna. 
 
La bomba envía el disolvente hacia la válvula inyectora que es una válvula de seis 
vías que permite introducir al disolvente, la muestra contenida en el loop de volumen 
calibrado. El cual da una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia; esta 
señal es enviada al registrador que a su vez da un cromatograma de intensidad en 
función del tiempo (imagen); en el cual, lo ideal es obtener picos gaussianos los cuales 
corresponden cada uno a un componente diferente de la muestra. 
 
Figura 6. Cromatograma típico obtenido por un HPLC 
 
En HPLC existen dos tipos básicos de detectores: 
● Los basados en una propiedad de la disolución. 
● Los basados en una propiedad del soluto. 
 
Algunos de los detectores más usados son: detectores de absorbancia, detectores 
de fluorescencia, detectores de Índice de refracción, detector de dispersión de 
luz, detectores electroquímicos, detectores por espectrometría de masas. 
 
El integrador calcula el área de cada pico, la cual se puede relacionar con la 
concentración del componente si se tiene una curva patrón; si no se cuenta con ella, sólo 
sería cualitativa. 
 
Debido a que los detectores que se usan en estos equipos no son destructivos, es 
posible recuperar los productos que salen de él, y de esta manera realizar otro tipo 
de separaciones (Ej. analíticas) 
 
Como algunas de las fases móviles usadas en HPLC pueden ser químicamente activas 
como ácidos, bases o líquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema 
están fabricados con materiales resistentes, por lo que la mayoría de las partes en 
contacto con la fase móvil suelen estar fabricadas con acero inoxidable. 
Los disolventes más usados en HPLC son agua, disoluciones tampón acuosas y 
disolventes orgánicos como el metanol. Deben ser espectroscópicamente puros, exentos 
de partículas sólidas y desgasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco 
soluble como el helio. 
 
Como fase estacionaria lo más común es usar partículas microporosas esféricas de 
sílice muy puro, que son permeables al disolvente. 
 
Los componentes básicos de un sistema para HPLC son: 
A. Depósitos para la fase móvil (disolventes). 
El disolvente no deberá extraer especie alguna del material con el que estén 
construidos. Suelen ser botellas de vidrio y tubos de teflón. Están provistos de unos filtros, 
indispensables para eliminar los gases disueltos y partículas que pueda contener la fase 
móvil. 
 
B. Sistema de bombeo para proporcionar presión a la fase móvil. 
Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeño tamaño de las partículas 
de la fase estacionaria, se utiliza una bomba que es la encargada de introducir la fase móvil 
o disolvente a través de la columna. 
 
Los sistemas de bombeo deberán reunir las siguientes características: 
● Generar presiones superiores a 6000 psi. 
● Capaces de cubrir un amplio rango de flujo entre 0,1 y 10 ml/min con una precisión 
del 0,5 % y que esté libre de pulsaciones. 
● Construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados. 
 
Las bombas empleadas en HPLC son de tres tipos: 
1. Bombas recíprocas o de vaivén: están formadas por una pequeña cámara cilíndrica 
que se llena y luego se vacía por oscilación de un pistónde zafiro; sus principales 
ventajas son que se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal 
constante, pudiéndose adaptar a la técnica de elución con gradiente, debido a su 
pequeño volumen interno. 
2. Bombas neumáticas o de presión constante: hacen uso de la presión de un gas 
aplicado al recipiente conteniendo la fase móvil. Son sencillas, no provocan 
pulsaciones pero están limitadas a presiones relativamente bajas. 
3. Bombas de desplazamiento o tipo jeringa, consisten en una cámara equipada 
con un mecanismo de tornillo. Suministran un flujo libre de pulsaciones pero con una 
capacidad limitada a unos 250 mL. 
 
C. Sistema de inyección de muestras. 
Los volúmenes que se inyectan de muestra deberán ser pequeños para evitar la 
sobrecarga de la columna. Hay varios tipos: 
● El método más simple es la utilización de una jeringa de alta presión con un 
diafragma (“septum”) a la entrada de la columna. Está limitado a una presión máxima 
de operación de 1500 psi. 
● Las válvulas de inyección con bucles de volumen conocido, es el método más 
utilizado. 
 
D. Columna cromatográfica. 
En las columnas cromatográficas es donde se produce la velocidad diferencial de los 
solutos que permite su separación. El material de las columnas cromatográficas suele 
ser de acero inoxidable cuya longitud varía de 5 a 30 cm y un diámetro de 1 a 5 mm. La 
eficacia de las columnas aumenta al disminuir el tamaño de las partículas de la fase 
estacionaria. El tamaño típico de las partículas es de 3-10 um. 
 
Figura 7.Componentes básicos de un sistema para HPLC. 
 
Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la 
columna con otra más corta, la precolumna, que retiene por adsorción las impurezas de forma 
irreversible. 
 
E. Termostatos para las columnas. 
No es necesario el control estricto de la temperatura de la columna, pero las separaciones 
resultan más reproducibles cuando la temperatura se mantiene constante. Los 
instrumentos comerciales modernos están equipados con calentadores que regulan la 
temperatura de la columna. 
 
F. Detectores. 
El papel del detector es indicar los momentos de aparición de los componentes, y 
proporcionar indicación cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado 
depende de la naturaleza de la muestra y deberá reunir una serie de características 
como son, tener una sensibilidad elevada, buena estabilidad y reproducibilidad. Amplio 
margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presión y la temperatura. Se pueden 
clasificar de la forma siguiente: 
 
● El detector se coloca al final de las columnas, responde a la concentración del soluto 
y se registra en función del tiempo y obteniéndose una serie de picos, generando 
un gráfico que se denomina cromatograma. La posición de los picos en el 
eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra. 
 
Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase móvil. 
Suelen ser muy selectivos y sensibles: 
 
❖ Detectores de absorbancia ultravioleta: su fundamento es la espectrofotometría 
de absorción de luz visible y ultravioleta de un componente a una determinada 
longitud de onda. Los datos de absorbancia se representan en función de la longitud 
de onda y del tiempo. 
 
❖ Detectores de fluorescencia: son muy sensibles y selectivos, el principio de operación 
se basa en la irradiación con la luz UV al componente de interés y la posterior medida 
de la luz fluorescente emitida por éste. 
 
❖ Detectores electroquímicos: ofrece ventajas debido a su especificidad, sensibilidad 
y amplia aplicabilidad, especialmente para compuestos orgánicos. Responde a 
analitos que puedan oxidarse (fenoles, aminas, peróxidos) o reducirse (cetonas, 
aldehídos). Las técnicas electroquímicas más utilizadas con esta finalidad son la 
amperometría, voltamperometría y culombimetría. 
 
Los detectores basados en una propiedad de la disolución, responden a un conjunto amplio 
de solutos, pero suelen ser poco sensibles: 
 
❖ Detectores de índice de refracción: está formado por una celda con dos 
compartimentos, en uno se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se 
hace pasar luz visible paralela. Cuando entra en la celda soluto de distinto índice de 
refracción al disolvente el has se desvía y varía la señal dada por la fotocélula. El 
principal inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de temperatura 
y no resultan apropiados para trabajar con la modalidad de elución con gradiente. 
 
❖ Detectores de conductividad: son los más utilizados cuando los solutos eluidos son 
iónicos, como ácidos y bases, así como cationes y aniones inorgánicos después de 
su separación por cromatografía de cambio iónico. Tienen elevada sensibilidad, 
baratos y de larga duración. 
 
Características de los detectores: 
➔ Sensibilidad: medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra 
en una señal eléctrica medible. 
➔ Linealidad: rango de masa o concentración de muestra sobre el cual el detector 
mantiene una sensibilidad constante sin una desviación arbitraria. 
 
El significado práctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la 
concentración para la cual el detector es confiable. Hay dos límites en la curva de linealidad: 
 
● El límite de concentración inferior, que es dado por el límite de detección. 
● El límite Superior, definido por un porcentaje de desviación arbitrario de la curva de 
linealidad. 
 
➔ Rango Dinámico Lineal: rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante. 
➔ Ruido: es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal. El 
significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante 
en la determinación de la cantidad mínima detectable y el límite inferior del rango 
lineal. 
➔ Límite de Detección: mínima cantidad de sustancia que puede producir una señal que 
sea el doble del nivel de ruido. 
 
➔ Corriente de Fondo: señal constante de salida generada por el proceso en el 
que un detector está operativo sin que alguna sustancia pasea través de él 
(permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector). 
 
G. Sistema para el tratamiento de datos y registrador. 
La separación efectuada se conserva en un registro individual llamado cromatograma. 
Un cromatograma es una imagen que traduce visualmente en una pantalla o en un 
papel la evolución, en función del tiempo, de un parámetro que depende de la concentración 
instantánea del soluto a la salida de la columna. Este gráfico se obtiene gracias a un detector 
situado a la salida de la columna. 
 
Figura 8. Montaje cromatográfico y cromatograma. 
 
La cromatografía HPLC es una técnica muy eficiente para separar compuestos, identificar y 
cuantificar sustancias que se encuentran en mezclas. Consiste de una fase móvil líquida, y 
una estacionaria (no polar); el uso de los distintos detectores, se define según la naturaleza 
de la muestra que se va a tratar. 
 
Tiene una gran importancia industrial debido a su amplio campo de aplicaciones. 
 
● Farmacéutica: se utiliza en antibióticos, esteroides, analgésicos, aminoácidos, proteínas, 
carbohidratos, lípidos. 
● Alimentaria: edulcorantes, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos. 
● Química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes. 
● Agroquímica: fenoles, pesticidas y herbicidas. 
También es importante en ámbitos como el forense (identificación de drogas, alcohol en 
sangre y narcóticos), y en investigaciónquímica (ácidos biliares, metabolitos, etc). 
 
 
 
UNAM. (2007). Técnicas Cromatográficas. Recuperado de: 
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf. Consultado el 28 de 
abril de 2020. 
 
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf