AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS

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PRÁCTICA Nº 8
AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS.
Natalia Montes, Elisa Cárdenas, Pedro Bertel.
UNIVERSIDAD DE SUCRE
Facultad de Educación y Ciencia
Biología II Semestre
RESUMEN.
Las mitocondrias son orgánulos dinámicos, cuya papel principal en la célula es la generación
de ATP a través de un sistema de fosforilación oxidativa. Estas son de gran importancia en
los seres vivos ya que permiten que dentro de estos se lleve a cabo el proceso de la
respiración celular. En esta práctica de laboratorio se realizó el aislamiento de las
mitocondrias de corazón de pollo, con el fin de observar sus características en relación a sus
patrones de sedimentación y su composición por medio de tinción con colorantes
indiferentes, ácidos y básicos.
Palabras claves: mitocondrias, generación de ATP, fosforilación oxidativa, respiración
celular.
ABSTRACT: Mitochondria are dynamic organelles, whose main role in the cell is the
generation of ATP through an oxidative phosphorylation system. These are of great
importance in living beings since they allow the process of cellular respiration to take place
within them. In this laboratory practice, the isolation of chicken heart mitochondria was
carried out, in order to observe their characteristics in relation to their sedimentation patterns
and their composition by means of staining with indifferent, acid and basic dyes.
Keywords: mitochondria, ATP generation, oxidative phosphorylation, cellular respiration.
INTRODUCCIÓN.
El origen de las mitocondrias parte desde
hace 2000 millones de años atrás, por
medio de la endosimbiosis de un
organismo del grupo de las proteobacterias
con un ancestro de las células eucariotas
que contenía un núcleo, cuya relación fue
de gran importancia y beneficiosa para
ambos organismos, debido a que se
brindaban protección y nutrientes.
Las mitocondrias ocupan 15 a 20% del
volumen de una célula hepática promedio
de mamíferos y contienen más de mil
proteínas diferentes. A menudo las
mitocondrias se relacionan con gotitas de
aceite que contienen ácidos grasos a partir
de las cuales obtienen materias primas
para oxidar.
Estos son orgánulos dinámicos, cuya
función principal es la generación de ATP
a través de un sistema de fosforilación
oxidativo. También participan en
numerosas rutas metabólicas, como son: la
síntesis de nucleótidos, modulación de
señales y la muerte celular. Estas
estructuralmente cuentan con una
membrana, compuesta por una membrana
mitocondrial externa y otra interna, aparte
de esto, estas cuentan con su propio
genoma denominado ADN mitocondrial.
OBJETIVOS.
- Comprender los procesos metodológicos
para la purificación de mitocondrias.
- Aprender los elementos básicos de
centrifugación para la purificación de
mitocondrias.
- Aislar la mitocondrias de tejidos
animales.
- Diferenciar mitocondrias de órganos
animales por tinción.
MATERIALES.
- 3 Cajas de Petri.
- Probeta de 50 ml.
- Filtro de malla de tela.
- Gasas
- Embudo.
- Gradilla
- Tubos de fondo cónico, en polipropileno
transparente de 15 ml.
- Tubos Eppendorf de 1.5 ml.
- Vaso de precipitado.
- Rotor con cabezal oscilante.
- Adaptador para rotor de cabezal oscilante
para tubos de 15 ml.
- Propipeta automática.
- Pipetas de 5 y 10 ml.
- Micropipetas con puntas desechables de
0.1-1ml y 0.02-0.2 ml.
- Pipetas Pasteur.
- Láminas porta y cubreobjetos
- Lámpara de alcohol.
- Tejidos y soluciones:
- Corazón de pollo
- Agua desionizada.
- Guantes.
- Tijeras quirúrgicas.
REACTIVOS.
- Sudán IV al 2%, Azul de Metileno al 2%
y Eosina al 2%, disueltos en
amortiguadores fosfatos.
- Gradiente discontinuo de sacarosa al:
30%, 25%, 20%, 15% y 10% disuelta en
amortiguador fosfatos (peso/volumen).
Nota el gradiente puede ser también en
Percol a una concentración 60%, 50%,
40%, 30%, 20%disueltas en amortiguador
fosfatos.
- Amortiguador fosfatos (HPO4/H3PO4
pH 7.4).
EQUIPOS.
Microscopio marca NIKON modelo
ECLIPSE E200.
Balanza analítica.
Pinza hemostática
Procesador de alimentos
Centrífuga.
PROCEDIMIENTO.
1.Se lavó gentilmente con agua corriente
250 gramos de corazón de pollo.
2. Con unas tijeras se cortó cada uno de los
tejidos en fragmentos pequeños y se
colocó en su respectiva caja de Petri.
3. Se colocaron 25 ml de amortiguador
fosfatos en el procesador de alimentos
junto con 15 fragmentos de corazón de
pollo.
4. Se aplicó un pulso por 3 min a
temperatura ambiente.
5. Se realizó un frotis y se observó en el
microscopio para verificar el rompimiento
celular.
6. Se filtró el lisado con una malla de tela
y con 6-8 gasas hasta obtener 10 ml del
lisado.
7. Se equilibró en balanza cada uno de los
tubos que contienen en lisado.
8. Se centrifugó a 1000 gravedades por 10
min a temperatura ambiente.
9. Se transfirió el sobrenadante que
contiene las mitocondrias a un nuevo tubo.
10. Se colocaron 3 ml en la parte superior
del gradiente de sacarosa 40, 20, 15 y 10
en una proporción 1:1:2:2.
11. Se centrifugó a 4000 g por 30 min.
12. Se equilibró y centrífugo la fracción
recuperada a 3500 g durante 10 min a
temperatura ambiente.
13. Se colocaron las mitocondrias a cuatro
tubos Eppendorf y se aforaròn con 900
microlitros de amortiguador fosfatos.
14. Se adicionaron 100 μl de los
colorantes Sudán III, Azul de Metileno y
Eosina y se mezclaron suavemente con
vortex por 30 segundos.
15. Se incubaron las mezclas por 5 min a
50 grados centígrados.
16. De cada tinción se realizó un frotis de
50 μl en el cubreobjetos y se fijó la
muestra por calor.
Se sumergieron los portaobjetos en un
vaso de precipitado con agua desionizada
para retirar el exceso de colorante y se
observaron las muestras en el
microscopio.
RESULTADOS.
● Observación de muestra de
corazon de pollo
Figura 1. (corazon de pollo macerado, observado con
objetivos de 10x)
Figura 2. (corazon de pollo macerado, observado con
objetivo de 40x)
Figura 3. (corazon de pollo en procesador, observado
con objetivo de 10x)
Figura 4.(corazon de pollo en procesador, observado con
objetivo de 40x)
● Observación de la muestra de
corazon de pollo sin fijar
Figura 5.(corazon de pollo con eosina, observada con
objetivo de 10x, muestra sin fijar)
Figura 6. (corazon de pollo con sudán 3, observada con
objetivo de 40x, muestra sin fijar)
Figura 7. (corazon de pollo con azul de metileno,
observada con objetivo de 40x, muestra sin fijar)
● Observación de muestra de
corazón de pollo fija con
colorante.
Figura 8. (corazon de pollo con sudán 3, observada con
objetivo de 40x, muestra fijada)
Figura 9. (corazon de pollo con azul de metileno,
observada con objetivo de 40x, muestra fija)
Figura 10.(corazon de pollo con eosina, observada con
objetivo de 40x, muestra fija)
ANÁLISIS
Para un funcionamiento normal, el corazón
depende estrechamente de la energía
oxidativa generada en las mitocondrias,
principalmente a partir de la oxidación
beta de los ácidos grasos, la cadena
respiratoria de electrones y la
fosforilación oxidativa.
● Observación de muestra de
corazon de pollo
Muestra de corazón de pollo 10x y 40x
macerado
En la visualización del tejido macerado, se
puede apreciar claramente el
desprendimiento celular a causa de un
buen macerado, las células se pueden
diferenciar por la presencia de su núcleo,
dando un paso exitoso para el aislamiento
de mitocondrias.
podemos observar también acumulación
de grasa.
Muestra de corazon de pollo en
procesador, observado con objetivo de
10x y 40x
En la visualización de esta muestra
procesada se puede ver una gran cantidad
de mitocondrias debido a un rompimiento
absoluto de la célula, para la extracción de
estos orgánulos. Aunque también cabe
resaltar que para obtener la muestra por
medio de este procedimiento se necesito
agregar más amortiguador fosfato, debido
a que al momento de triturarlo este quedó
algo espeso y sólido por lo que no permitía
la obtención o filtración del lisado.
● Observación de la muestra de
corazón de pollo con tinciones sin
fijar.
Tinción de eosina: Se utilizó en la
muestra con la finalidad de
determinar la presencia de lasproteínas en esta, dando un
resultado positivo, debido a la
estructuración de la eucariota, es
decir, proteínas transmembranales,
periféricas e integrales, que fueron
separadas tanto en la maceración
como procesamiento.
Tinción de azul de metileno: Su
utilidad en la muestra es determinar
la presencia de ADN de la
mitocondria, debido a que este
reaccionante brinda una coloración
más intensa específicamente en
esta organela. A la tinción con este
colorante corresponderá la tinción
del genoma, RNA mitocondrial y
proteínas.
Tinción de sudan lll: su proceso
fundamental de tinción en la
muestra fue reconocer los lípidos
presentes, los cuales se encuentran
dispersos, debido al rompimiento
de la membrana, dándoles una
coloración más intensa, facilitando
su distinción. observará la tinción
que corresponde a las grasas y
membranas de las mitocondrias
● Observación de la muestra de
corazón de pollo con tinciones
fijadas.
En la observación de los tres tipos
de muestras, haciendo uso de la
técnica de fijación por medio de
calentamiento, se aprecian de
manera más clara y concisa los
distintas tinciones, facilitando aún
más la determinación e
identificación por medio del azul
de metileno, eosina y sudán III,
aunque cabe resaltar que para
realizar este proceso de fijación fue
necesario hacerlo con mucho
cuidado, debido a que si las
mitocondrias al momento de
sumergir la muestra en agua
desionizada entraban en contacto
con esta podían romperse, ya que
se produce un choque osmótico lo
que permitirá esta reacción de las
mitocondrias con el agua
desionizada. Cabe resaltar que en
estas muestras se puede observar
mayor tinción de las células debido
a que los colorantes suelen penetrar
con mayor facilidad las células que
se encuentran muertas, tiñendo así
su interior, lo que es diferente a la
tinción de las células vivas ya que
estos por lo general suelen teñirse
alrededor o exterior pero no en el
interior.
CUESTIONARIO.
1.¿Para qué me sirve el saber la forma de
aislar mitocondrias en el laboratorio?
El saber aislar de forma correcta las
mitocondrias es de gran importancia
debido a que al realizar la práctica
referente a esta podemos conocer su
estructura, características y por medio de
coloración encontrar las biomoléculas que
la componen como lípidos y proteínas.
Aunque lo más importante de esta es la
identificación de su genoma debido a que
nos aporta gran información con respecto
al estado de la célula.
2.¿Qué utilidad tiene el tener mitocondrias
aisladas?
Al momento de aislar las mitocondrias
podemos hacer varios estudios y análisis
con respecto a el estado de la célula ya que
si observamos su composición y en
especial su ADN podríamos tener la
información necesaria para determinar si
quizás está presente alguna mutación o
algún tipo de problema celular.
3.¿Existen otros métodos para aislar
mitocondrias además de la centrifugación?
Se podría decir que por lo general los
métodos más comunes para el aislamiento
de las mitocondrias es la centrifugación, ya
sea centrifugación diferencial o
centrifugación en gradiente de Ficoll, ya
que estos nos permiten la separación
adecuada de los orgánulos y en especial el
aislamiento de estas, quedando estas en el
sobrenadante.
4.¿Puedo usar el conocimiento de
mitocondrias en biotecnología u otras
áreas?
Realmente las mitocondrias por su
magnífica función pueden generar grandes
aportes en la biotecnología o en otras áreas
relacionadas con esta, ya sea la medicina u
otras. Como bien sabemos la biotecnología
trata siempre de contribuir de forma
tecnológica aspectos biológicos para
mejorar ya sea su funcionamiento u otros
rasgos. Por medio de las mitocondrias y su
ADN se puede hacer un estudio con
relación a mutaciones que ocurren en la
célula o las enfermedades que pueda tener
un individuo ya sean por fallos genéticos u
otras causas.
5.¿Cuál es la utilidad del conocimiento de
las mitocondrias en la biología?
El conocimiento y la utilidad del
aislamiento de las mitocondrias es muy
importante en biología debido a que el
buen manejo de esta y la utilización de los
elementos necesarios para aislarlos nos
permiten realizar estudios o
investigaciones ya sean de tipo
bioquímico, poblacional o histológico.
CONCLUSIÓN.
Para concluir el estudio y aislamiento de
las mitocondrias es de suma importancia,
ya que estos orgánulos tienen como
función principal generar energía para que
las células puedan realizar o llevar a cabo
sus funciones de forma adecuada y en
especial permiten que se de la respiración
celular en los seres vivos.
BIBLIOGRAFÍA.
Citologia.-_Karp_G_-_Biologia_celular_y.
pdf
Mitocondria (genome.gov)
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Mitocondria