AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS

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PRÁCTICA Nº 4
AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS.
Natalia Montes, Elisa Cárdenas, Pedro Bertel.
UNIVERSIDAD DE SUCRE
Facultad de Educación y Ciencia
Biología II Semestre
RESUMEN.
Los cloroplastos son uno de los orgánulos más estudiados, debido a que cuentan con ciertas
características que los hacen especiales e importantes en las células vegetales, ya que le
generan grandes aportes a estas y en especial es donde ocurre la fotosíntesis. En esta práctica
de laboratorio se realizó el aislamiento de estos con el fin de observar aquellas características
y composición que los hacen tan importante para la célula. Realmente no fue fácil pero se
logró obtener buenos resultados, esto gracias a el método de centrifugación diferencial y los
diferentes métodos de tinción.
Palabras claves: cloroplastos, orgánulos, células vegetales, fotosíntesis, centrifugación
diferencial, tinción.
ABSTRACT.
Chloroplasts are one of the most studied organelles, because they have certain characteristics
that make them special and important in plant cells, since they generate great contributions to
these and especially it is where photosynthesis occurs. In this laboratory practice, the
isolation of these was carried out in order to observe those characteristics and composition
that make them so important for the cell. It was not really easy, but good results were
obtained, thanks to the differential centrifugation method and the different staining methods.
Keywords: chloroplasts, organelles, plant cells, photosynthesis, differential centrifugation,
staining.
INTRODUCCIÓN.
En las células vegetales, hay una estructura
que permite la captación de energía solar,
con la finalidad de procesarla para generar
ATP en beneficio del organismo portador,
este mecanismo tan avanzado le permite a
la célula realizar todos sus procesos
biológicos en el interior, y por ende
permite el buen funcionamiento y
supervivencia de los organismos
fotoautótrofos, a todo este proceso se le
denomina fotosíntesis. Se lleva a cabo en
los cloroplastos, ubicados en la parte
externa de las hojas, específicamente en el
tejido mesófilo,esto posibilita una mayor
exposición al sol, sin embargo este
mecanismo de producción de energía
necesita la presencia continua de dióxido
de carbono y agua como requisito
fundamental.
Por lo general los cloroplastos tienen la
función de convertir la energía lumínica
en energía química, dando como resultado
la liberación de oxígeno y la producción de
glucosa u otros compuestos orgánicos a
partir del agua y el C . Para que se lleve𝑂
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todo este proceso a cabo se realizan dos
fases. La fase luminosa que ocurre en la
membrana tilacoidal, en donde se absorbe
la energía o luz del solar, y se descompone
el agua para producir ATP y NADPH,
necesarios para la fase oscura. y por otra
parte tenemos la fase oscura la cual ocurre
en los estromas, esta utiliza la energía
química liberada en la fase luminosa y
absorbe CO2 para producir glucosa u otros
compuestos orgánicos.
Estos orgánulos son de gran importancia
para la célula debido a que le aportan
ciertas características y beneficios para
poder subsistir.
OBJETIVOS.
- Determinar la importancia de la
centrifugación diferencial como técnica
para el aislamiento de cloroplastos.
- Comprende los pasos necesarios para
desarrollar una centrifugación.
- Determina las diferencias morfológicas
de cloroplastos entre especies por medio
de tinción.
MATERIALES.
- Hojas de espinaca.
- Microscopio marca NIKON modelo
ECLIPSE E200.
- Cajas de Petri.
- Probeta de 50 ml.
- Filtro de malla de tela
- Gasas
- Embudo.
- Gradilla.
- Mortero.
- Tubos de fondo cónico, en polipropileno
transparente de 15 ml.
- Tubos Eppendorf de 1.5 ml
- Vaso de precipitado.
- Rotor con cabezal oscilante.
- Adaptador para rotor de cabezal oscilante
para tubos de 15 ml.
- Propipeta automática.
- Pipetas de 5 y 10 ml.
- Micropipeta de 1000 l.
- Micropipeta de 20-200 l.
- Pipetas Pasteur.
- Láminas porta y cubreobjetos
- Lámpara de alcohol.
REACTIVOS.
- Amortiguador fosfatos (HPO4/H3PO4
pH 7.4).
- Gradiente discontinuo sea bien de
sacarosa: Sacarosa 60%, 40%, 20%, 15%,
y 10%, disueltas en amortiguador fosfatos
(peso/volumen), en una proporción
1:1:1:2:2.
- Sudán IV al 2%, Azul de Metileno al 2%
y Eosina al 2%, disueltos en amortiguador
fosfatos.
- Agua desionizada.
EQUIPOS.
- Balanza analítica.
- Centrífuga.
- Procesador de alimentos
PROCEDIMIENTO.
1. Se cortó en fragmentos pequeños las
hojas de espinaca.
2. se colocó en un mortero y se
adicionaron 50 ml de amortiguador
fosfatos.
3. cuidadosamente se realizó la lisis del
tejido para no fragmentar los cloroplastos.
4. Por medio de una gasa se filtró el lisado
hasta recuperar 10 ml.
5. se procedió a centrifugar a 1000 g por 5
min.
6. El sobrenadante se retiró y se mantuvo
la pastilla que contiene los cloroplastos y
los núcleos.
7. Luego nuevamente se procedió a
centrifugar a 200 g por 5 min.
8. Se retiró el sobrenadante que contenía
los cloroplastos.
9. Se colocaron 3 ml en la parte superior
del gradiente de sacarosa 60%: 40%: 20%:
15%: 10%.
10. nuevamente se centrifugó a 500 g por
15 min.
11. Luego por medio de una pipeta se
procedió a retirar cuidadosamente cada
una de las bandas que se formaron en el
gradiente de sacarosa 60%: 40% :20%
:15% :10% y se colocaron en un tubo
Eppendorf de 1.5 ml.
12. se adiciono 1 ml de amortiguador
fosfato a las partes obtenidas y se mezcló
gentilmente.
13. por cinco min se centrifugó a 3200
gravedades.
14. Se retiró el sobrenadante y se procedió
a repetir nuevamente una vez más los
pasos 12 y 13.
15. se resuspendió la pastilla en 1000 l deµ
amortiguador fosfato.
16. se colocó en tubos Eppendorf 200 lµ 
de: 2% Azul de Metileno, 2% Eosina y 2%
Sudán IV. Todos ellos disueltos en
amortiguadores fosfatos.
17. se adiciono a cada colorante 200 l deµ
las fracciones resuspendidas y se mezcló
gentilmente por 30 segundos.
18. Se incubaron las mezclas por 5 min a
40 grados centígrados.
19. De cada tinción se realizó un frotis de
30 l en el cubreobjetos y se fijó laµ
muestra por calor.
20. Se sumergieron los portaobjetos en un
vaso de precipitado con agua desionizada
para retirar el exceso de colorante y se
procedió a observar las muestras en el
microscopio.
RESULTADOS.
● extracción de la lisis
Figura 1 . (vaso de precipitado 1: hoja de espinaca
macerada con etanol, vaso 2: hoja de espinaca macerada
con amortiguador fosfato, vaso 3: hoja de espinaca
triturada con procesador + amortiguador fosfato )
● Fluorescencia de la clorofila
Figura 2.(coloración de la clorofila al
exponerse a la luz
● Obtención del botón o pastilla
Figura 3 (Pastillas o núcleos que contienen cloroplastos,
con sobrenadante.)
● Observación de cloroplastos.
Figura 4. (hoja de espinaca triturada con procesador +
amortiguador fosfato observada en objetivo de 40x )
Figura 5. (hoja de espinaca macerada con amortiguador
fosfato observada en el microscopio con objetivo de 40x)
Figura 6. (hoja de espinaca macerada con etanol
observada en el microscopio con objetivos de 40x)
● Observación de cloroplasto con
los diferentes metodos de tincion
Figura 7 y 8.Cloroplastos con tinción de Eosina
(Identificación de proteínas). Observado a 40X
Figura 9. Cloroplastos con sudan III, observado a 40 X (
identificacion de lipidos )
Figura 10. Cloroplastos con Azul de Metileno.
Observado a 40 X ( identificación del genoma, ADN y
proteínas)
ANÁLISIS
Se realizaron los procesos de la mejor
manera posible y se detalla en cada uno de
los resultados los siguientes análisis:
● Lisis celular
Se realizaron tres procesos distintos con el
mismo resultados de lisis, sin embargo hay
diferencias entre cada uno de estos, son los
siguientes:el primero es el instrumento
con el que se procede; la efectividad o la
presencia de un una mayor cantidad de
cloroplastos es dada por el uso de un
aparato eléctrico que facilita una mayor
trituración de la espinaca, lo segundo es la
agregación de una etanol que posibilita
una extracción más líquida de la
maceración,y por último la maceración
clásica, que desprende cloroplastos en
menor medida por la aparición de
sustancia viscosa que imposibilita toda la
extracción de lisis. El diferenciamiento de
cada proceso es dado por la coloración de
cada proceso, es decir, entre más
coloración haya, más presencia de
cloroplastos habrá.
● Fluorescencia de la clorofila
Se debe saber que las plantas realizan el
proceso de fotosíntesis, gracias al factor de
radiación solar presente día a día, toda esta
energía es absorbida por los pigmentos
fotosintéticos como la clorofila a, b y
carotenoides. Toda esa energía recibida
produce un ambiente de excitación
químico, que se expresa en esa
luminosidad, en el caso de las lisis
realizadas anteriormente, al aplicarle luz
por medio de los celulares, se generó una
excitación en las electrones presentes en la
clorofila, por tal motivo se pudo apreciar
de manera efectiva este estupendo
fenómeno natural, sin embargo al quitar la
energía lumínica de la lisis, la
visualización de fluorescencia se pierde,
dado que los electrones de la sustancia
vuelven a su nivel de energía normal.
● Obtención del botón o pastilla
Al proceder con la separación de
organelas, se utilizó sacarosa con
diferentes concentraciones para romper la
membrana celular y homogeneizar los
contenidos de la célula, y proceder a la
centrifugación. Esta última trabaja según
el peso o densidad que contenga cada
estructura o moléculas presentes. Se
aplicaron varias centrifugaciones con la
finalidad de separar oportunamente los
sobrenadantes que no se necesitaban, hasta
aislar los cloroplastos. Cabe resaltar que
este procedimiento requirió de destrezas
para realizar de la mejor manera este
proceso, para no afectar los resultados al
momento de visualizar las distintas
muestras.
● Observación de muestras
Muestra de cloroplastos - procesador
de alimentos, en objetivo de 40x:
Se pudo observar, la presencia notoria de
gran cantidad de cloroplastos, indicando la
realización de un buen proceso de
centrifugación. Esto fue posible por el
instrumento (procesador de alimentos)
utilizado para extraer gran cantidad de
material clorofílico.
los cloroplastos se representan en la
muestra como aquellos circulos amarillos
o verdosos que se logran observar.
Muestra de cloroplastos - mortero:
Se observa la presencia de cloroplasto, sin
embargo tienen una cantidad escasa,
producto de varias sustancias viscosas que
imposibilitaron una buena aplicación
clásica de extracción de cloroplastos
mediante lisis. También cabe resaltar que
al utilizar un mortero no se puede efectuar
un buen rompimiento de la célula para la
extracción de estos, a diferencia de la
extracción por medio del procesador de
alimentos.
Muestra de cloroplastos - etanol:
Nula o poca presencia de cloroplastos en
la muestra, no se pudieron observar,
debido a que al momento de realizar el
proceso de extracción se utilizó un
mortero, el cual según en el resultado
anterior podemos identificar que no realiza
un buen rompimiento de la célula y al
agregar el etanol, éste deshidrata la célula
generando una permeabilidad en la célula,
especialmente en los cloroplastos
permitiendo que salga de estos la clorofila
de este, y en gran manera pierda su color
verde, por tal razón se puede observar que
estos cloroplastos son incoloros o
simplemente no se pueden observar.
● Observación de tinciones
Previo a este proceso, la pared celular de
los cloroplastos se destruyó, dejando sus
restos en el medio presente.
Tinción con azúl de metileno:
El azul de metileno es un colorante
orgánico que se utiliza en este caso para
teñir el material genético de los
cloroplastos. La muestra posee gran
contenido de material genético, ya sea
ADN o genoma. Este ADN se tiñó debido
a que posee un grupo fosfato el cual
permite que presente una coloración en sus
fibras Azul o morada al momento de entrar
en contacto con el azul de metileno.
Tinción con eosina:
Se pudo observar la tinción de los
cloroplastos debido a las proteínas que se
encuentran presentes en la membrana.
También se pudieron observar otras
partículas diferentes a los cloroplastos
teñidas, se podría decir que estas partículas
son restos de cutícula que no pudieron ser
degradados al momento de realizar este
procedimiento, pero fueron teñidas hasta el
interior por la Eosina debido a que son
células muertas y por lo general al estar en
este estado permiten la absorción de este
colorante. Por lo general la Eosina tiende a
teñir las proteínas y este solo tiñe la parte
externa de la célula cuando esta vivía, o en
ocasiones en el interior solo cuando la
célula es permeable a ella o está muerta.
Tinción con Sudan III:
El sudán III es utilizado para identificar la
presencia de lípidos en las células, en este
caso en los cloroplastos. Está por lo
general las detecta debido a que posee
características similares a estos, como la
insolubilidad en agua. la visualización en
la muestra brinda una coloración café
oscura intensa o rojo anaranjado,
indicando la gran cantidad de lípidos
presentes, determinando los restos de las
capas celulares destruidas con
anterioridad.
CUESTIONARIO.
1. ¿Por qué es importante conocer la forma
de aislar cloroplastos?
Es importante conocer la forma de aislar
los cloroplastos, por una sencilla razón,
tener buenos resultados, si no se ejecutan
con efectividad las muestras tendrán restos
de sobrenadantes como vesículas,
mitocondrias, afectando de manera
drástica el proceso de tinción, ya que no
solo teñirán estructuras del cloroplasto, si
también de todas sus organelas, dando un
resultado totalmente negativo.
2.¿Qué utilidad tiene el tener cloroplastos
aislados en proyectos de calentamiento
global?
Los cloroplastos tienen una gran utilidad
en proyectos de calentamiento global
debido a que como bien se sabe este es un
organulo fundamental en las plantas que le
permite llevar ciertos procesos a cabo en el
cual uno de esos es la absorción de la luz
solar para convertirlo en energía química.
Generalmente cuando existe un alto nivel
de calentamiento en la atmósfera los
cloroplastos absorber la luz del sol y por
ciertos motivos el agua de la superficie de
la hoja se evapora, emitiendo una
liberación de oxígeno y permite un
equilibrio en la temperatura.
3. ¿En qué utilizare cloroplastos aislados?
Los cloroplastos aislados son muy
importantes para realizar el estudio de
factores ambientales con respecto al
desarrollo de las plantas y en general a las
afectaciones que pueda traer el cambio
climático a estas.
4. ¿Sirven los cloroplastos aislados para la
biotecnología u otras áreas?
Los cloroplastos cumplen un proceso
fundamental en la fotosíntesis, sin
embargo han surgido grandes
investigaciones sobre la composición de su
ADN para poder determinar y estimar con
más veracidad todo su proceso evolutivo y
originario, estos procesos nos ayudarían a
entender de manera mucho más completa
factores como el crecimiento y
adaptabilidad.
5. ¿Puedo utilizar cloroplastos aislados
para comprender la biodiversidad o en la
producción de alimentos?
Sí, se puede utilizar los cloroplastos
aislados en la biodiversidad o producción
de alimentos, debido a que cada planta
posee un ADN codificado,pasado de
generación en generación, combinandose y
adaptándose a distintos factores, lo cual
explica esa gran biodiversidad. Todo este
mecanismo se puede realizar mediante un
proceso de aislamiento, donde será
sometido a gran variedad de análisis que
brindarán ese resultado deseado.
CONCLUSIÓN.
Para finalizar esta práctica es muy
significativa, ya que nos permite aumentar
nuestro nivel de conocimiento,
entendiendo con muchos más detalles el
proceso de creación de energía a partir de
la luz solar, convirtiéndose en uno de los
procesos más importantes de la evolución
y cadena de los seres vivos. La fotosíntesis
contribuye al buen funcionamiento de
todas las actividades celulares , como
también al sostenimiento de los
organismos heterótrofos incapaces de
sintetizar su propia energía por cuenta
propia.
BIBLIOGRAFÍA.
● https://www.redalyc.org/pdf/490/49011464003.pdf
● https://es.m.wikipedia.org/wiki/S
ud%C3%A1n_III
https://www.redalyc.org/pdf/490/49011464003.pdf
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