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Evaluación del espectro de absorbancia y cuantificación de clorofilas en Silybum marianum
Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia, Escuela de Biología
Fisiología vegetal
Moreno Laura, Ballesteros Jose, Cotrino Esteban
INTRODUCCIÓN
El uso del clorofilómetro permite, de una manera sencilla y rápida, el diagnóstico de deficiencias de N
en el ciclo de las plantas (Martinez et al, 2015),(Castillo & Ligarreto, 2010). Esto gracias a que el
clorofilómetro mide el índice de verdor, el cual se relaciona directamente con la clorofila de la planta.
El clorofilómetro nos permite medir de forma indirecta y no destructiva el contenido de clorofilas en
la hoja mediante luz transmitida a través de la hoja en 650 nm y 940 nm (Castillo & Ligarreto, 2010).
El nitrógeno es fundamental en la síntesis de clorofilas y como parte de esta molécula está
involucrado en la fotosíntesis (Martinez et al, 2016). Las cantidades de clorofila en las hojas están
relacionadas con la concentración de nitrógeno, por lo que permite saber cual es el estado nutricional
de este nutriente. Hojas con pigmentación verde oscura nos indican una alta concentración de
clorofila, lo cual le permite a la planta la realización de la fotosíntesis (Castillo & Ligarreto, 2010).
La absorbancia de una planta se relaciona con la humedad, pigmentos fotosintéticos, estructura interna
de la hoja, composición de la cutícula y los daños por estrés (Peña et al, 2019). Gracias a esto,
mediante un análisis de las propiedades ópticas de la hoja y la interpretación de estos resultados, se
puede conocer el estado fisiológico de la planta (Peña et al, 2019). La clorofila es un pigmento de
color verde brillante que se encuentra en los cloroplastos mayormente. Predominan en las plantas
como clorofila a y clorofila b en una relación 3:1, siendo la primera la que se degrada más fácilmente
y suelen ser usadas como aditivos alimenticios (Cárdenas et al, 2017). Su cuantificación permite
determinar en qué estado se encuentra la planta (Peña et al, 2019).
Durante la fotosíntesis en plantas acuáticas, como Elodea sp., se crea una envoltura de pH elevado,
concentraciones de O2 y de CO2 disuelto (James et al, 1999). Los niveles significativos de
fotosíntesis de esta planta indican una baja fotorrespiración y una alta eficiencia fotosintética (Hough,
1979).
Conocer la morfología de las plantas, en este caso de las hojas, nos permite identificar el tipo de
metabolismo fotosintético que presentan (Olmedilla et al, 2010). Se han identificado distintas
variantes al mecanismo molecular de fijación y asimilación del CO2. Estos varían en relación al
ambiente al que tiene que adaptarse la planta. Estas variaciones se hacen presente en la morfología
foliar y se pueden evidenciar mediante un estudio estructural de las hojas. Dependiendo de estas
variaciones estas plantas se pueden catalogar como C3, C4, CAM y CAA (Olmedilla et al, 2010).
OBJETIVO GENERAL
- Evidenciar las características fotosintéticas del cardo mariano Silybum marianum.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Evaluar el espectro de absorbancia y cuantificar las clorofilas presentes en el cardo mariano.
- Evaluar la producción de oxígeno en Elodea.
- Analizar la morfología de plantas CAM y C4.
METODOLOGÍA
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
USO DEL CLOROFILÓMETRO
En la Tabla 1. Se puede observar una gran diferencia en los datos tomados para cada una de las
plantas analizadas. Cabe resaltar que el cardo no estuvo dentro de estas mediciones ya que no contaba
con el área necesaria para dicho experimento. Las diferencias observadas se deben a la alta
variabilidad en los contenidos de clorofila que se presentan en relación a las hojas y su filotaxia
(Castañeda et al, 2018). Además se realizó un promedio de las tres medidas tomadas para estimar el
contenido de clorofila más cercano al presente en la planta en general. De acuerdo a esto, la planta de
orégano mostró niveles de clorofila más altos por unidad de área foliar, por lo cual se espera que
tenga una mayor capacidad de realizar fotosíntesis. Es importante resaltar que las medidas tomadas en
las plantas se deben realizar en distintas partes de la planta ya que las mayores concentraciones de
clorofilas se encuentran en el tercio medio de las plantas (Castañeda et al, 2018).
Tabla 1. Contenido de clorofilas en dos especies de plantas obtenidos en el clorofilómetro.
PLANTA Pescadito (Nematanthus
gregarius)
Orégano (Lippia graveolens)
ÍNDICE DE CONTENIDO
DE CLOROFILA
(CCI)
25,6 3,3
5,5 41,9
1,1 6,3
PROMEDIO 10,73 17.17
ESPECTRO DE ABSORBANCIA CON ESPECTROFOTÓMETRO
Teniendo en cuenta los valores de absorbancia obtenidos a partir del análisis del cardo mariano Tabla
2 se realizó una gráfica Figura 1 en la cual se pueden analizar de una mejor manera los datos,
observando que los valores más altos se encuentran en las longitudes de onda 400-460 y 663,
resaltando el punto más alto en 430 nm. Lo anterior puede deberse a la presencia de carotenoides
(xantofilas y carotenos) que absorben luz en la región del azul 400-500 nm y 663 que puede atribuirse
a pigmentos fotosintéticos en la región del rojo (Peña et al, 2019). Es importante relacionar estos datos
obtenidos con los evidenciados en la germinación y el crecimiento del cardo mariano, el cual mostró
un mayor rendimiento en las dos variables cuando se expusieron espectros de luz oscuros como azul y
rojo lejano. Coincidiendo con la absorbancia, lo cual permite inferir que el cardo mariano es una
planta en la que estos espectros de luz favorecen la fotosíntesis y de la misma manera el crecimiento y
la germinación.
Tabla 2. Espectro de absorbancia y lecturas obtenidas cada 30 nm con el espectrofotómetro para
Silybum marianum desde 400 hasta 700 nm.
ESPECTRO DE ABSORBANCIA
Lecturas (Nm) Control o blanco (acetona pura)
(UA)
Cardo (Silybum marianum)
(UA)
400 0 0,903
430 0 1,678
460 0 0,959
490 0 0,330
520 0 0,072
550 0 0,076
580 0 0,134
610 0 0,188
640 0 0,257
645 0 0,351
652 0 0,503
663 0 0,878
670 0 0,635
700 0 0,006
Figura 1. Curva de absorbancia de Silybum marianum en contraste con la curva obtenida para la
acetona (control).
CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILAS CON ESPECTROFOTÓMETRO
En la Tabla 3 se encuentran los valores de unidad de absorbancia obtenidos en el espectrofotómetro
en 3 lecturas de 645, 652 y 663 nm respectivamente. Como podemos observar la mayor absorbancia
se presentó a los 663 nm con un valor de 0,878 UA. Es bien sabido que la clorofila A se encarga de
absorber la luz durante la fotosíntesis; por otro lado la B se encuentra presente en los cloroplastos y se
encarga de absorber la luz de otra longitud y transferirla la energía a la clorofila A (Ruiz, Velázquez,
Becerra, Jiménez & Villarreal, 2019). Teniendo lo anterior en cuenta cabe recalcar que a pesar de que
los valores obtenidos de clorofila fueron bajos puesto que las plántulas tenían poco tiempo de iniciar
su proceso de fotosíntesis ya que estaban adaptadas a condiciones de oscuridad, es decir etioladas;
esto es importante ya que explica porque el valor de clorofila A es mayor al valor de clorofila B
puesto que al estar etioladas la luz no había sido enviada a los cloroplastos, sino que aún se
encontraba siendo absorbida por la clorofila A, es decir la planta se encuentra en la fase fotoquímica
pero aún no ha entrado a la fase bioquímica como tal por lo cual debido al tratamiento de estrés
provocado por la privación de la luz a la planta; esta puede estar haciendo fotorespiración. Los valores
obtenidos de clorofila a y clorofila b fueron multiplicados por 1,5 debido a una corrección de
volumen.
volumen final = 6,5 ml mf = 0,18 gr
v= volumen final mf= biomasa foliar
Chla = [(12,7*D663) - (2,69*D645)] * v/(1000*mf) = x 1.5 =
Chla = [(12,7*0,878) - (2,69*0,351)] * 6,5ml/(1000*0,18 gr) = 0,3685*1,5 = 0,5528
Chlb = [(22,8*D645) - (4,48*D663)] * v/(1000*mf) = x 1,5
Chlb = [(22,8*0,351) - (4,48*0,878)] * 6,5ml/(1000*0,18 gr) = 0,1469 *1,5 = 0,2204
Chla total = Chla + Chlb
Chla total = 0,5528 + 0,2204 = 0,7732
Tabla 3. Cuantificaciónde clorofilas en espectrofotómetro en 3 lecturas de 645, 652 y 663 nm.
CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILAS
Nm Control o blanco (acetona pura) (UA) Silybum marianum (UA)
645 0 0,351
652 0 0,503
663 0 0,878
Teniendo en cuenta el análisis mediante el clorofilómetro y el espectrofotómetro se puede analizar
que el clorofilómetro muestra un dato aproximado al real, sirviendo como método comparativo de
cual planta contiene más clorofila, siendo un método no destructivo y el espectrofotómetro muestra
una mayor precisión ,permitiendo hasta la cuantificación de pigmentos, clorofilas y demás sustancias
que influyen directamente en los procesos de fotosíntesis. Lo anterior evidencia el posible uso del
clorofilómetro en campo, ya que permite identificar qué planta contiene mayor cantidad de clorofila,
pero cuando se desea conocer y cuantificar el indicado es el espectrofotómetro. Los dos análisis se
pueden usar de manera complementaria, aumentando la calidad de los datos.
MEDICIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE 02 EN ELODEA EN 65 MINUTOS
En la Tabla 4 se puede observar la producción de oxígeno por la elodea. teniendo en cuenta las
variables se obtuvo que en presencia de la luz la planta genera más oxígeno y de la misma manera en
presencia de bicarbonato de sodio (NaHCO3), la planta tiene una fuente constante de dióxido de
carbono, por lo cual muestra una mayor fotosíntesis viéndose reflejada en el aumento del volumen de
02 en la bureta (A.2022). La luz solar y el dióxido de carbono presente en el bicarbonato, favorecen el
proceso de la fotosíntesis, lo anterior se evidencia ya que en la prueba con agua, la producción de O2
no aumenta significativamente.
Tabla 4. medición de la producción de oxígeno en una planta de elodea en solución de bicarbonato de
sodio (NaHCO3) y en solución de agua en tratamientos de luz y oscuridad por 65, 100 y 145 minutos.
Solución Tratamiento Producción de O2
(ml) (65 min)
Producción de O2
(ml) (100 min)
Producción de O2
(ml) (145 min)
Bicarbonato de
sodio (NaHCO3)
Luz 1,5 1,8 2
Oscuridad 1 1,1 1,3
Agua (H2O) Luz 0,5 0,5 0,5
Oscuridad 0,2 0,2 0,2
ANATOMÍA FOLIAR
Es posible notar de acuerdo a la Tabla 5 la diferenciación celular en cada una de las plantas de
acuerdo al tipo de estrategia de fijación de carbono que presenta la planta, puesto que como podemos
ver en las plantas clasificadas como C4 tales como el cardo mariano y el pasto, podemos visualizar en
las imágenes un claro aumento en la venación y una reducción en el mesófilo, es decir reducción en el
número de células de la vaina del haz; esto debido a que las plantas C4 usan una segunda enzima
carboxilante llamada PPC, la cual es a fin al CO2 por completo por lo cual lo fija directamente,
ayudando así a que la planta no entre en fotorrespiración debido a la afinidad de la enzima Rubisco
por al 02 y al CO2 (Mosquera, Riaño, Arcila & Ponce, 1999). En el caso de la suculenta, esta fue
identificada como una planta CAM debido a que, como se observa en la imagen su conformación es
mucho menos diferenciada visualmente en comparación con las plantas C4 debido a que estas son
plantas de lento crecimiento por lo cual realizan fotorespiración.
Tabla 5. Anatomía foliar y clasificación por estrategias de fijación de carbono de 3 especies de
plantas tales como cardo mariano, pasto y suculenta observadas en aumento 40X.
Imagen Clasificación
Aumento: 40X
Planta: Cardo Mariano (Sylibum marianum)
Tipo: C4
Aumento: 40X
Planta: Pasto
Tipo: C4
célula de la vaina del haz
Aumento: 40X
Planta: Suculenta
Tipo: CAM
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