Teoría 1 2 Diagnóstico biológico de hemopatías

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DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO DE HEMOPATÍAS
Citoquímica
Estudia la composición química de la célula y permite conocer la localización topográfica de diversas sustancias, quimícamente activas (es posible hacerlas reaccionar con otros compuestos). Requiere de una adecuada selección en funcion del conocimiento clínico y citomorfológico previo.
Inmunocitología
Se utiliza para detectar componentes celulares mediante anticuerpos específicos. La union antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) puede revelarse empleando diferentes métodos:
· Fluorocromos (FIT, Auramina, Rodamina, Naranja de Acridina, Texas Red, etc.).
· Reacciones enzimáticas (peroxidasas, fosfatasa alcalina, glucosaoxidasa, galactosidasa, etc.).
· Metales electrodensos (ferritina, oro coloidal).
· Sustancias radiactivas, que ya son cada vez menos usadas.
Las moléculas en estudio pueden identificarse en frotis celulares o cortes histológicos. Las técnicas sobre suspenciones celulares utilizan en general la citometría de flujo. Es rápido, objetivo, cuantitativo y pueden analizarse hasta cuatro marcadores simultáneamente.
Inmunofenotipo
Es la identificación y cuantificación de distintas poblaciones celulares en base a la expresión diferencial de marcadores de membrana. Se realiza empleando anticuerpos monoclonales antígeno-específicos marcados con fluorocromos. Se utiliza para identificar poblaciones celulares desconocidas así como para cuantificar posibles alteraciones en poblaciones celulares conocidas.
Aplicaciones de la citometría de flujo al diagnóstico hematológico
· Inmunofenotipo de las leucemias agudas.
· Inmunofenotipo de los sindromes linfoproliferativos crónicos.
· Otros: Evaluación de la inmunidad celular, transplante y movilización de células hematopoyéticas.
Inmunocitoquímica
Utilidad:
· Escasa muestra, tejidos con poca representación de la celularidad neoplásica o cuando interesa valorar la morfología de la célula patológica.
· Detección de proteínas producto de genes de fusión.
· Evidenciar micrometástasis, diferenciación entre leucemias y linfomas de otros tumores, etc.
Cultivos celulares in vitro
En leucemias agudas:
· Diferenciar leucemias linfoblásticas de no linfoblásticas.
· Pronóstico de leucemias agudas no linfoblásticas (LANL).
En síndromes mielodisplásicos:
· El crecimiento normal se asocia a una escasa probabilidad de de desarrollar leucemia aguda y a un curso clínico estable.
En sindromes mieloproliferativos crónicos:
· Diferenciación de trombocitemia esencial de trombosis reactiva.
· Diferenciacion de policitemia vera de poliglobulias secundarias.
Aplasia medular y otras citopenias:
· Permite identificar pacientes con procesos inmunológicos que suprimen la funcion hematopoyética y pueden beneficiarse con tratamiento inmunosupresor.
· Control de viabilidad de progenitores hematopoyéticos para transplante.
Ultra estructura. Indicaciones en patología hematológica
Fundamentales
· LA sin marcadores de diferenciación (precursores eritroblásticos, mieloblásticos y megacarioblásticos muy inmaduros o precursores basófilos).
· Complemento con histoquímica ultraeestructural.
· Anemias diseritropoyéticas congénitas.
· Confirmación de diseritropoyesis autoinmune (sinartesis eritroblástica).
· Confirmación de histiocitosis X.
CITOGENÉTICA CONVENCIONAL
Importancia en el estudio de las neoplasias hematológicas.
Theodor Boveri en 1914 propuso la teoría de la mutación somática, y el origen clonal de las neoplasias. Según dicha teoría, el cáncer se desarrolla a partir de una célula individual que presenta cambios genéticos, en especial un desequilibrio en la dotación cromosómica.
Estructura del cromosoma metafasico
El cromosoma metafásico es el que está más condensado y se distingue mejor. Se diferencian las siguientes partes:
· Cromátidas: Son cada una de las partes simétricas y genéticamente idénticas del cromosoma, ya que son el resultado de la duplicación del ADN que se realiza antes de comenzar la división celular.
· Centrómero o constricción primaria: Es una zona delgada que une entre sí las cromátidas y divide al cromosoma en dos brazos que según la posición del centrómero nos dará determinadas longitudes de los brazos que nos permite clasificar los cromosomas en 4 tipos (metacéntrico, submetacéntrico, acrocéntrico y telocéntrico).
· Constricciones secundarias: Son estrechamientos distintos al centrómero. Son zonas asociadas a los nucleolos (formarán los nucleolos cuando termine la división celular y vuelva a aparecer el núcleo). Se conocen como regiones de organización nuclear.
· Telómeros: Son los extremos finales del cromosoma. Protegen al cromosoma al evitar que se pierda información en cada ciclo de replicación, ya que cada vez que se duplica el ADN, se pierde un fragmento de telómero. El ADN que forma los telómeros no codifica información para fabricar nada y contiene una secuencia de ADN que se repite muchas veces (en el caso de los vertebrados la secuencia es TTAGGG). La misión de los telómeros no es transportar información genética sino estabilizar la estructura de los cromosomas. Tras muchas divisiones, la pérdida total del telómero produciría la muerte celular al perderse otros fragmentos de ADN más importantes, por lo que el telómero limita el número de veces que se puede dividir una célula. Los telómeros están relacionados con el envejecimiento celular y las células cancerosas se dividen un número ilimitado de veces porque tienen telomerasas, enzimas que evitan la pérdida de fragmentos de telómero en cada replicación.
· Cinetocoros: A cada lado del centrómero hay una serie de proteínas que forman el cinetocoro que es donde se insertan los microtúbulos del huso acromático que son los responsables de la separación controlada de las cromátidas de cada cromosoma durante la división celular.
· Bandas: Utilizando diversas técnicas de tinción aparecen las bandas que son segmentos que se colorean con diferente intensidad y sirven para distinguir los cromosomas homólogos entre otros cromosomas de similar forma y tamaño.
· Satélites: Cuando una constricción secundaria se sitúa cerca de los telómeros dejando una zona corta más o menos redondeada se llama satélite.
Cariograma
Se conoce como mapa citogenético o cariograma a la representación ordenada de los cromosomas de un individuo en función de su número, forma y tamaño cuando se tiñe y se examina bajo un microscopio. Dependiendo de la tinción empleada, se obtendrá un patrón de bandas claras y oscuras diferente y específico para cada par cromosómico. Esta característica permite estudiar los cromosomas de una persona en busca de alteraciones cromosómicas.
Los bandeos más comúnmente utilizados son:
· Bandeo Q: Se obtienen bandas fluorescentes brillantes al teñir con quinacrina.
· Bandeo G: Las bandas obtenidas son las contrarias al bandeo Q, es decir, donde en el Q había una banda oscura, en eL G es brillante. Se obtiene al tratar el cromosoma con tripsina y teñir posteriormente con giemsa.
· Otras: Bandeo R (definir los extremos de los cromosomas), bandeo C (resalta las regiones centroméricas), bandeo T (tinción de los telómeros).
Nomenclatura citogenética básica para hemopatías
1. Indicar los cromosomas implicados en alteraciones en orden ascendente.
2. Si está implicado un cromosoma sexual consignarlo primero.
3. Si un mismo cromosoma está afectado de alteraciones numéricas y estructurales, colocar primero las numéricas.
4. Si un mismo cromosoma tiene varias alteraciones estructurales colocarlas en orden alfabético ascendente.
5. Colocar entre corchetes el número de metafases estudiadas. Ejemplo: 46,XX [20].
6. Si existen dos o más clones separar con una barra. Ejemplo: 47,XX,+12 [18] / 46,XX [6].
7. A las ateraciones constitucionales marcarlas con la letra “c”. Ejemplo: 48,XX,+8,+21c, es decir, cariotipo de un paciente masculino con síndrome de Down y una ganancia clonal de cromosoma 8.
Otro ejemplo: 47,XX,+21
· 47: Es el número total de cromosomas (46 es lo normal).
· XX: Son los cromosomas sexuales (femeninos).
· +21: Indica que hay un cromosoma 21 extra (síndrome de Down).
Algunosejemplos con cariotipos en neoplasias y su interpretación
Utilidad de los estudios citogenéticos en hemopatía
	BIOQUÍMICA CLÍNICA Y CUANTITATIVA I
	2018
· 
8
· Diagnóstico.
· Clasificación.
· Pronóstico.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU
Se utiliza para la localización y la detección de secuencias de ADN y de ARN específicas en las células, cromosomas o tejidos preservados, mediante la formación de una molécula híbrida entre una molécula endógena de ARN o ADN de la célula y una sonda complementaria de ARN o de ADN monocatenario. La técnica se basa en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia.
Hibridación in situ convencional
· Sondas centroméricas que varían de un cromosoma a otro. Permiten identificar alteraciones de tipo numérico.
· Sondas que hibridan simultáneamente con múltiples secuencias del cromosoma y se denominan sondas de pintado cromosómico. Sólo pueden utilizarse en metafases y sirven para detectar alteraciones estructurales (traslocaciones, cromosomas marcadores, derivativos, etc.) difíciles de identificar con la citogenética convencional.
· Sondas que hibridan con una única secuencia de ADN. Detección de reordenamientos estructurales de genes o regiones cromosómicas concretas. Es necesario conocer a priori la región candidata a estudiar en cada patología.
Aplicaciones: a) La detección de traslocaciones cromosómicas. b) El estudio de pérdidas de genes concretos. c) El estudio de genes que se amplifican.
Hibridación in situ con fluorescencia (FISH)
Detecta secuencias de ácidos nucleicos en células o tejidos preservados mediante el empleo de una sonda marcada con un fluorocromo, la cual va dirigida hacia un lugar específico del cromosoma y que emite fluorescencia que puede ser observada por medio de un microscopio.12 Se caracteriza por permitir la visualización directa de las alteraciones genéticas en la célula.
Ejemplo:
Pintado cromosómico
 (
Spectral
 
karyotyping
 of 
human
 
chromosomes
. 
The
 
image
 shows a normal 
metaphase
 
plate
 
after
 
the
 
simultaneous
 
hybridization
 of 24 
differentially
 
labeled
 
chromosome
 
painting
 
probes
. 
The
 
image
 
was
 
acquired
 
using
 
spectral
 
imaging
 (a 
combination
 of Fourier 
spectroscopy
 and 
CCD-imaging
) 
through
 a 
custom-designed
 
filter
 cube 
from
 
Chroma
 
Technology
 
Corp
, A 
classfication
 
algorithm
 
then
 
allows
 
the
 
assignment
 
fo
 
spectra-spe
cific
 color 
to
 
all
 
chromosomes
.
)
Hibridación genómica comparada
Se basa en la hibridación competitiva de dos ADNs, (tumoral y control normal) marcados con distintos fluorocromos, sobre cromosomas normales.
Cariotipo multicolor
FICTION (fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasms)
Características de las técnicas de citogenética convencional y molecular
	
	Cariotipo
	FISH en interfase
	CGH
	SKY-FISH M-FISH
	FICTION
	Necesidad de cultivo
	+
	-
	-
	+
	-
	Método de screening
	+
	-
	+
	+
	-
	Analiza todo el genoma
	+++
	-
	+
	++
	-
	Material archivado
	-
	+
	+
	-
	+
	Detecta diferentes subclones
	+
	-/+
	-
	+
	-/+
	Detecta alteraciones desequilibradas
	+
	+
	+
	-/+
	+
	Detecta alteraciones equilibradas
	++
	+
	-
	+
	+
	Selecciona poblaciones celulares
	-
	-
	-
	-
	+
	Permite cuantificar
	+
	++
	-/+
	+
	+++
	Sensibilidad
	+
	++
	-/+
	-/+
	+++
	Precisión
	-/+
	++
	-/+
	+
	++
	Personal especializado
	++
	+
	++
	++
	+
	Tiempo de realización
	++
	-/+
	+
	++
	+
	Coste económico
	-
	+
	++
	+++
	+
Técnicas de biología molecular
Se realizan teniendo en cuenta las observaciones del estudio morfológico. Prácticas habituales en el diagnóstico:
· PCR: Diagnóstico y/o monitorización de pacientes con neoplasias.
· Southern Blot o FISH convencional: Genes de gran tamaño con puntos de rotura variables o en aquellos casos de genes muy promiscuos.
Estudios de clonalidad
Procesos linfoproliferativos: Las técnicas de genética molecular se utilizan cada vez con mayor frecuencia para el diagnóstico de enfermedades linfoproliferativas de línea B o T, a través de los estudios de reordenamiento de los genes de las cadenas de inmunoglobulinas y de los receptores de células T (TCR).
Amplificación de DNA genómico mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e identificación del reordenamiento por electroforesis en gel de acrilamida (PAGE). Ejemplo de aplicación es en el análisis mutacional de los genes IgVH.?
Permite diferenciar un proceso linfoproliferativo reactivo de uno clonal. Analizar afectación de órganos en los cuales no se detectan linfocitos en situaciones fisiológicas. La clonalidad no implica necesariamente malignidad. Los reordenamientos de Igs y TCR no son necesariamente marcadores de línea B y T respectivamente.
Procesos mieloproliferativos: Se basan en el análisis del patrón de inactivación del cromosoma X (metilación). Se puede utilizar sólo en mujeres heterocigotas. 
Estudios de traslocaciones
· Traslocaciones resultantes en genes híbridos o de fusión: Se utiliza el ARN trascripto del gen quimérico y la técnica de RT-PCR.
· Traslocaciones que provocan alteraciones en la expresión génica/disregulación génica: Suelen implicar los promotores del gen de las IgH o del TCR delta y producen una expresión aumentada del gen bajo su control. Se utiliza PCR a partir de ADN (o FISH).
Detección de enfermedad residual minima – ERM
Se utiliza PCR y técnicas de inmunofenotipificación. La PCR cuantitativa en tiempo real permite la cuantificación del número de copias del gen presentes en la muestra analizada.
PCR cuantitativa en tiempo real
Existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de un fragmento de ADN complementario a una parte intermedia del ADN a amplificar.
Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del "quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser.
La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En general para que sea válida esta técnica requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando.
Microarrays
Las micromatrices o microarreglos permiten el depósito de miles de puntos conteniendo genes o parte de genes sobre un portaobjetos para su estudio en paralelo. De esta manera es posible tener una visión instantánea de actividad de genomas completos o de un grupo selecto de genes.
En los estudios de microarrays se combinan las técnicas de hibridización de ácidos nucleicos y detección por fluorescencia. De esta manera, sólo en los puntos del portaobjeto donde haya ocurrido hibridización habrá fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia detectada será proporcional al nivel de expresión del gen en estudio.