TP 1 - Hemograma y VSG

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BIOQUÍMICA CLÍNICA Y CUANTITATIVA I
	2018
HEMOGRAMA - ERITROSEDIMENTACIÓN
Introducción
El hemograma puede realizarse por técnicas manuales, semiautomatizadas y automatizadas. Para realizar el hemograma se recomienda que el paciente no realice actividad muscular intensa previa a la toma de muestra, y se encuentre en ayuno de 6-8 horas ya que la hiperlipemia genera variaciones en el dosaje de hemoglobina y de los parámetros relacionados con ella. La muestra (sangre anticoagulada con EDTA) debe procesarse antes de la 6 horas de realizada la extracción o hasta 24 horas si se la conserva a 4°C. En este último caso, antes de procesar hay que dejar que tome temperatura ambiente.
Los valores de referencia para cada determinación, se deben definir en cada laboratorio clínico teniendo en cuenta la población estudiada, condiciones de trabajo y metodología utilizada. Para cada determinación hematológica se expresarán sus valores de referencia según el sistema clásico y el sistema internacional (SI) (estandarización de métodos y unificación en la expresión de resultados). 
Anticoagulantes
· EDTA: Sódico o potásico. Efecto quelante sobre el calcio. Se recomienda el uso de las sales dipotásicas en concentración de 1.5-2.2 mg/mL de sangre. Un exceso de anticoagulante puede producir importantes modificaciones leucocitarias y un falso aumento de la CHCM. Por otro lado, un exceso de sangre conduce a una insuficiente anticoagulación sanguínea y a la formación de microcoágulos, que invalidan las determinaciones. De elección para hemograma. Ventajas:
· Respeta la morfología eritrocitaria y leucocitaria (especialmente la sal potásica).
· No permite la aglutinación plaquetaria, por lo que es el mejor anticoagulante para el recuento de plaquetas.
· Citrato trisódico: Forma un complejo soluble con el Ca2+, evitando la coagulación. El citrato trisódico dihidratado es el anticoagulante de elección para realizar pruebas de hemostasia (1 parte de citrato 3.2 g% y 9 partes de sangre) y determinación de la velocidad de sedimentación globular (VSG) o eritrosedimentación (1 parte citrato 3.8 g% y 4 partes de sangre).
· Heparina: Sales de litio o de sodio. Actúa formando un complejo con la antitrombina plasmática, que neutraliza la trombina (factor IIa) y otros factores de coagulación. Se lo utiliza en una proporción de 0.1-0.2 mg/mL sangre. No es adecuado para realizar recuentos sanguíneos porque puede inducir la formación de agregados de plaquetas y leucocitos. De elección para realizar determinaciones de química de la sangre y estudios citogenéticos. Ventajas:
· No altera el tamaño corpuscular ni el hematocrito.
· Mantiene la morfología leucocitaria.
· Mejor anticoagulante para prevenir hemólisis, se lo usa para pruebas de fragilidad osmótica.
Antes de cada determinación, se debe homogeneizar la sangre invirtiendo el tubo unas 8-10 veces.
Hemograma
· Hematocrito.
· Hemoglobina.
· Recuento eritrocitario.
· Índices hematimétricos (VCM, HCM, CHCM, ADE).
· Recuento leucocitario total.
· Recuento diferencial de leucocitos (absoluto o relativo).
· Morfología de elementos sanguíneos.
Hematocrito
El hematocrito (Hto) corresponde a la relación entre el volumen ocupado por los eritrocitos y el correspondiente a la sangre total. Puede determinarse mediante microcentrifugación manual o métodos automatizados.
Microcentrifugación
Se usan capilares de 75 mm de longitud y 1 mm de diámetro interior. Pueden adquirirse heparinizados (marca roja) o no heparinizados (marca azul). Los primeros se utilizan preferentemente para la obtención directa de sangre capilar. 
Técnica: 
1. Cargar sangre en el interior del tubo por capilaridad, llenar hasta un máximo de 3/4 partes de su capacidad. Limpiarlo bien por fuera. Cerrar el extremo seco del tubo a la llama o con plastilina.
2. Colocar el capilar en el surco radial de una microcentrífuga con el extremo cerrado dirigido hacia afuera. Centrifugar 4 minutos a 12000 r.p.m.
3. Medir la relación de la longitud de la columna de eritrocitos con respecto a toda la columna (plasma incluido) en un ábaco especial. La prueba debe leerse tan pronto como sea posible tras la centrifugación, porque la interfase se vuelve cada vez más indiferenciada al pasar el tiempo.
Por encima de los eritrocitos y no incluida en la lectura de la columna de los mismos, puede verse una capa gris rojiza de leucocitos y sobre ésta una fina capa cremosa de plaquetas. Ambas forman la denominada capa anteada.
El hematocrito puede variar según el volumen plasmático. Así, un descenso del volumen plasmático dará lugar a un aumento del hematocrito por hemoconcentración (en caso de deshidratación, por ejemplo), mientras que un aumento del volumen plasmático producirá una disminución del hematocrito por hemodilución, como podría ocurrir en el embarazo.
Concentración de hemoglobina
Esta determinación es el criterio fundamental para el diagnóstico de una anemia.
Método de la cianometahemoglobina
Se emplea una solución de ferrocianuro y cianuro potásico. El ferrocianuro convierte el hierro ferroso de la Hb en férrico para formar metahemoglobina, que se combina con el cianuro de potasio para formar cianometahemoglobina estable. La determinación se realiza comparando la densidad óptica (DO) de la muestra problema con la de un patrón utilizando para ello un colorímetro o espectrofotómetro. El reactivo que se utiliza, llamado reactivo de Drabkin, debe guardarse en botella marrón y desecharse si se enturbia.
Técnica: Añadir 20 μL de sangre a un tubo donde previamente se ha pipeteado 3 mL de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operación es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del tip antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas, mediante aspiraciones y expulsiones consecutivas de la mezcla dentro del tubo. Dejar en reposo 10 minutos para la formación de la cianometahemoglobina. Procesar un testigo. Leer la absorbancia de la solución a 540 nm. 
Como blanco se puede emplear agua destilada o la solución del reactivo de Drabkin.
Índices hematimétricos eritrocitarios
Son útiles para la caracterización morfológica de los hematíes y pueden calcularse a partir del recuento de glóbulos rojos (GR), de la concentración de Hb y del Hematocrito (Hto).
Volumen corpuscular medio (VCM)
Es el valor medio del volumen de una población de hematíes. Evalúa el tamaño de los hematíes. Se calcula a partir del Hto y del recuento de GR. [fL].
Hemoglobina corpuscular media (HCM)
Expresa el valor medio del contenido (peso interno) de hemoglobina de una población de hematíes. Se calcula a partir de la Hb y el recuento de GR. [picogramos = 10-12g].
Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM)
La CHCM corresponde al promedio de las concentraciones internas de hemoglobina en una población de hematíes. Evalúa el color de los hematíes. Se calcula a partir de la concentración de hemoglobina y el Hto. [g/dL].
En las anemias microcíticas hipocrómicas los índices disminuyen. En las anemias macrocíticas aumentan el VCM y la HCM, mientras que la CHCM da valores normales, ya que si bien el hematíe macrocito es más grande y contiene más hemoglobina que uno normal, la concentración interna de Hb es normal. La CHCM aumenta en muy pocas situaciones, por ejemplo en esferocitosis hereditaria. 
Los índices VCM y HCM no pueden ser determinados si no se cuenta con autoanalizadores hematológicos para la realización del recuento eritrocitario. En un laboratorio que no posee un autoanalizador hematológico, el único índice que se puede informar es la CHCM porque se calcula a partir de dos parámetros que se pueden realizar.
Recuentos globulares
El recuento globular es la determinación del número de hematíes y/o leucocitos por unidad de volumen sanguíneo. Incluye tres fases, primero una dilución de la sangre, luego toma de muestra de la suspensión diluida en un volumen determinado y, por último, recuento de los glóbulos en ese volumen. Antiguamente se realizaban ambos por métodos ópticosen cámara cuentaglóbulos y microscopio óptico. Hoy en día, sólo se acepta el recuento manual de leucocitos, no el de hematíes.
El error que se comete en el recuento de elementos mediante la cámara cuentaglóbulos es aproximadamente 20%, esto carece de importancia en el recuento de leucocitos, pero sí la tiene en el recuento de hematíes, por lo tanto no resulta fiable este método óptico para su determinación, y menos aún para obtener los índices eritrocitarios secundarios.
Recuento de leucocitos
Método óptico: El líquido de dilución debe lisar los eritrocitos. Dil. inicial 1/20 (20 μL de sangre y 380 μL de líquido). Se realiza el recuento en cámara de Neubauer, donde los 4 cuadrados de las esquinas W, se emplean para el recuento de leucocitos y se subdividen en 16 cuadrados terciarios.
Observación del extendido sanguíneo coloreado
La observación del extendido permite: 
· Integrar de forma global los datos del hemograma.
· Controlar si el recuento de leucocitos está correctamente realizado, si existe leucopenia o leucocitosis.
· Corroborar los datos aportados por los índices hematimétricos con la observación microscópica. 
· Realizar la fórmula leucocitaria o recuento diferencial de los leucocitos.
· Evaluar la morfología de los distintos elementos. 
· Evaluar el tamaño, distribución, número y agrupación plaquetaria. 
La fidelidad de la información obtenida depende de la calidad de las extensiones. Una buena extensión debe comprender una porción gruesa y una delgada con una transición gradual entre ambas, su aspecto liso, sin ondulaciones ni poros. El portaobjetos engrasado, la cantidad de sangre insuficiente o en exceso, entre otros factores, pueden ser causa de extendidos incorrectos. La coloración más ampliamente utilizada es la de May Grünwald-Giemsa.
Fórmula leucocitaria o recuento relativo de leucocitos
El diferente tamaño de los leucocitos hace que se distribuyan de manera irregular, los más pequeños (linfocitos) tienen tendencia a situarse hacia el centro y cabeza de la extensión y los de mayor tamaño (monocitos y neutrófilos) en las regiones más periféricas: bordes y cola del extendido.
Se deben observar 100 leucocitos, diferenciando neutrófilos encayados, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos de manera de hallar el porcentaje de cada uno y con el recuento total de leucocitos informar el valor absoluto (109/L) de cada uno.
En caso que se observen mieloblastos, linfoblastos, promielocitos, mielocitos, metamielocitos, se los debe incluir en el conteo diferencial dentro de los 100 leucocitos contados, hallar el porcentaje y recuento absoluto de cada uno. 
En caso de que se observen eritroblastos, éstos deben informarse aparte, como N° de eritroblastos cada 100 leucocitos. Si el número es mayor a cinco se debe efectuar una corrección en el recuento de leucocitos, calculándose la cifra de GB. Por ejemplo:
 
Variación fisiológica de los leucocitos
Durante las primeras 24 horas de vida, los neutrófilos son los leucocitos predominantes. Luego comienzan a disminuir de tal forma que a partir de la primera semana de vida son los linfocitos las células predominantes (fórmula invertida), permaneciendo así hasta los 5-6 años, época en que empieza un nuevo predominio de neutrófilos.
Morfología
Las extensiones sanguíneas deben estar bien hechas y bien coloreadas. Se debe informar dentro de las determinaciones del hemograma si la morfología de los hematíes, leucocitos y plaquetas es normal, en caso que se observen alteraciones, describirlas.
Las alteraciones más importantes que deben buscarse son las siguientes:
· Hematíes: Alteraciones en el tamaño (anisocitosis, microcitosis, macrocitosis) o en la forma (poiquilocitosis), menor tinción (hipocromía), tinción desigual (anisocromía), mayor tinción o tinción gris azulada (policromatofilia), presencia de esferocitos, leptocitos, dianocitos, esquizocitos, etc. Observación de inclusiones eritrocitarias como cuerpos de Howell-Jolly, anillos de Cabot, punteado basófilo.
· Leucocitos: Alteraciones nucleares y citoplasmáticas.
· Plaquetas: Alteraciones en el tamaño y agrupación. Normalmente deben hallarse agrupadas.
Velocidad de sedimentación globular
También conocida como eritrosedimentación, es una determinación que no está incluida dentro del hemograma, pero que suele ser solicitada junto con él. Equivale a la longitud del recorrido descendente de la columna de hematíes en un intervalo determinado de tiempo. 
Los eritrocitos de una muestra de sangre, colocados en un tubo vertical, tenderán a caer hacia el fondo observándose incremento de la sedimentación globular en ciertas alteraciones patológicas por efecto de factores plasmáticos y eritrocitarios. El incremento de los valores de las proteínas del plasma (principalmente fibrinógeno y gamma globulinas) resulta en una disminución del potencial zeta (carga negativa en la superficie de los eritrocitos que los mantiene separados). Con un potencial zeta menor, los eritrocitos pueden unirse en formación de pilas de monedas y asentarse en el plasma a una velocidad más rápida. 
De igual manera, el tamaño y las formas de los eritrocitos afectan la velocidad de la sedimentación. Los macrocitos se asientan más rápidamente que los eritrocitos normales y los microcitos de una manera más lenta. Debido a su forma irregular, los poiquilocitos no pueden formar pilas de monedas y se asientan a una velocidad más lenta.
Técnica: Extraer 2 mL de sangre venosa y depositarla en un tubo que contiene 0.5 mL de anticoagulante. Se utiliza como anticoagulante, citrato trisódico 3,8%. Homogeneizar la sangre mediante al menos 8 inversiones completas del tubo. También se puede utilizar sangre anticoagulada con EDTA, a la que se la debe diluir con citrato de sodio antes de la prueba (1 parte de citrato de sodio + 4 partes de sangre). La sangre citratada puede conservarse 2 horas a temperatura ambiente o 4 horas a 4°C hasta su procesamiento.
Transcurrida la hora, registrar en mm la longitud del plasma desplazado, lo cual constituye la distancia de descenso en la primera hora, y corresponde al valor de la VSG. Si la demarcación entre plasma-columna de hematíes resulta nebulosa, el nivel se fija en el punto de máxima densidad.
Causas de error
· Si se deja sangre en la pipeta durante más de 60 minutos, la VSG aumentará.
· Si se lee antes de los 60 minutos, la VSG dará resultados bajos.
· Un aumento o disminución muy marcado de la temperatura ambiente dará valores de VSG aumentados o disminuidos, respectivamente. 
· La vibración del tubo donde se halla la sangre, aumenta los valores de la VSG.
· La presencia de burbujas en la sangre dará resultados erróneos.
· La presencia de coágulos de fibrina en la sangre invalida los resultados de la prueba.
 Interpretación
Aunque es una determinación inespecífica, refleja cambios en el contenido en proteínas plasmáticas. Tiene utilidad clínica en ciertos trastornos crónicos como colagenopatías e infecciones, como índice del progreso de la enfermedad. También es útil como prueba de orientación en el examen habitual de pacientes. No se altera en enfermedades virales. 
La VSG se halla aumentada en: 
· Embarazo.
· Edad avanzada (> 60 años).
· Anemia severa (se altera la relación hematíes-plasma, aumenta la formación de rouleaux o eritrocitos en pila de monedas).
· Macrocitosis.
· Aumento del fibrinógeno (infecciones, inflamaciones, sepsis).
· Trastornos de proteínas monoclonales y policlonales.
· Neoplasias.
La VSG se halla disminuida en:
· Recién nacidos por poliglobulia fisiológica.
· Poliglobulia en adultos.
· Alteraciones de los hematíes: Esferocitosis, acantocitosis, microcitosis y anisocitosis.
· Leucocitosis extrema.
· Hipofibrinogenemia, hipogammaglobulinemia.
Como alternativa se dispone de pruebas de mayor sensibilidad y especificidad, como la proteína C reactiva (es una proteína que aparece en la sangre en las etapas agudas de distintos trastornos inflamatorios, virtualmente ausente en personas sanas).
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