5-MICOSIS OPORTUNISTAS POR HONGOS LEVADURIFORMES PII

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 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LEVADURAS 
 Muestra: elección y toma de muestra 
 Transporte, conservación y procesamiento 
 Examen directo y cultivo 
 Identificación 
 Interpretación de resultados 
 
MUESTRA 
A-SÍNDROME PULMONAR 
a) Sangre para estudio serológico 
b) Esputo inducido, aspirado transtraqueal, lavados bronquiales, lavados broquioalveolares, tejidos tomados 
por biopsias y líquido pleural. 
B-SÍNDROME MUCOCUTÁNEO 
a) Raspado de la lesión, exudado o pus aspirado, biopsia de tejidos. 
b) Sangre para estudios serológicos. 
C-SÍNDROME MENINGO-ENCEFÁLICO 
a) Líquido cefalorraquídeoo biopsia de tejidos, según el cuadro clínico. 
b) Sangre para estudios serológicos. 
D-SÍNDROME SÉPTICO 
a) Hemocultivo seriado (3 muestras como mínimo). 
b) Retrocultivos, punta de catéteres, prótesis. 
c) Sangre para estudios serólogicos. 
 
 
TRANSPORTE, CONSERVACIÓN Y PROCESAMIENTO 
 
 Antes de las 2 hs., 4°C hasta 24 hs 
 Cuando la muestra es muy escasa, se siembra directamente en el medio de cultivo adecuado 
 Muestras de biopsia pequeñas, agregar SF estéril 
 Tejido troceado cuando la biopsia es muy grande para tener mejor contacto con el cultivo y al realizar 
coloraciones, los colorantes puedan penetrar mejor el tejido. Fluidificarse cuando se trata de muestras 
viscosas. Y, si hay mucha cantidad como por ejemplo en los lavados bronquiales hay concentrar 
(centrifugación). 
 
 
EXAMEN DIRECTO Y CULTIVO 
 
Fresco: líquidos aclarantes (KOH), tinta china, gueguén, blanco de calcoflúor, azul de metileno, azul de 
lactofenol. 
Coloraciones: frotis, improntas: Gram, Giemsa, PAS, Ziehl-Neelsen. También tinciones histológicas con 
hematoxilina-eosina, PAS, o plata metenamina de Grocott-Gomori, mucicarmin de mayer. 
Cultivo: 4 tubos (Medio sin ATB, Medio enriquecido, 2 Medio con ATB) 
Medios: 
 ASG sin antibióticos, con cloranfenicol (inhibición de bacterias) o con cicloheximida (inhibe hongos 
ambientales contaminantes). Incubar: 25-28 °C hasta 40 días. 
 BHI-S enriquecido. Incubar: 35-37 °C hasta 40 días. 
 
IDENTIFICACIÓN 
 Criterios morfológicos Macroscópicos: aspecto de la colonia, película en caldo 
 Microscópicos: TG, hifas, pseudohifas, clamidoconidos, artroconidios 
 Criterios bioquímicos Enzimáticos: ureasa, feniloxidasa, nitroreductasa, medios cromogénicos 
 Asimilación: auxonograma, ID32C, API20 
 Fermentación: zimograma 
 
 Criterios inmunológicos 
 Criterios genéticos 
 
 
Especies de Candida 
 
CRITERIOS INMUNOLÓGICOS-CRITERIOS GENÉTICOS 
Pruebas complementarias: 
 Ag 
 Ac 
 Metabolitos fúngicos 
 ADN 
 
 Detección de Anticuerpos: 
 Los antígenos utilizados son Ag de manana, enolasa, citoplasmáticos, fase micelial. Posee una 
sensibilidad del 84,4 % y una especificidad del 94,7 %. 
 Técnicas utilizadas: ID, CIEF, ELISA 
 Limitaciones: Detección de títulos altos en pacientes colonizados 
 Respuesta reducida o inexistente en pacientes inmunocomprometidos 
 Falsos positivos: reacción cruzada con hongos ambientales 
 Detección de Antígenos: 
 Antígenos detectados: Ag manana, Ag enolasa 
 Técnicas utilizadas: APL (aglutinación en partículas de látex), ELISA, Inmunoblotin 
 Limitaciones: Falsos negativos: Antigenemia transitoria (muestras seriadas) 
 Formación de inmunocomplejos (eliminación previa por calentamiento) 
 Baja sensibilidad (combinar con otras pruebas) 
 
 Detección de metabolitos fúngicos: 
 D-arabinitol 
Pruebas complementarias 
(Rápidas e importantes cuando por ejemplo hay un paciente en 
estado crítico) 
 (1,3) B-D-glucanos: marcador panfúngico. S>78% y una E<8705% en el diagnóstico de la CI 
 
 
 Detección de ADN: 
 Identificar el agente patógeno desde muestras clínicas 
 Determinar el origen de una(s) infección(es) 
 Establecer la ruta de infección 
 Rastrear la transmisión de cepas involucradas en infecciones intrahospitalarias 
 Reconocer cepas resistentes a drogas antifúngicas 
 Las secuencias target más utilizadas son: genes ribosomales 18S Y 28S son conservadas (panfúngicos) y 
sus espaciadores internos ITS que son variables (especie) 
 
 
 
 
 
 Limitaciones: Falta de estandarización en métodos de extracción y detección del ADN 
 No diferencia entre colonización e infección 
 Falsos negativos y positivos 
 
 Combinación de pruebas: todas las pruebas complementarias por si solas no son indicativas de una 
infección, por lo tanto hay que realizar distintas combinaciones si se quiere aumentar la especificidad y la 
sensibilidad. Las distintas combinaciones son: 
 Antígenos y Anticuerpos (Manano y Ac anti-manano) 
 Antígenos y componentes no antigénicos (manano y (1,3)-β-D-glucano; enolasa y (1,3)-β-D-glucano 
 Anticuerpos y componentes no antigénicos (Ac antimicelio y (1,3)-β-D-glucano) 
 Antígenos, anticuerpos y componentes no antigénicos (Manano, Ac anti-manano y D-arabitinol) 
 2 Antígenos diferentes (H-manano y I-manano) 
 Antígeno (Manano) y PCR 
 
 
Especies de Cryptococcus 
 
 Análisis macro y microscópico de LCR 
 
 Normal LCR en meningitis micótica 
Examen físico Incoloro 
Límpido, cristal de roca 
Coágulo no presenta 
Incoloro 
Aspecto ligeramente turbio 
Coágulo no presenta 
Examen químico Glucosa:0.5-0.8 g/l 
Proteínas:0.15-0.35 g/l 
PANDY*:5/1/- 
Glucosa: disminuida 
Proteínas: aumentadas 
PANDY: + 
Examen citológico Rto celular: 3-5/ UL adulto 
Menor de 20/UL 
recién nacidos 
Diferencial: 95-100% MN 
0-5% PMN 
Ex. Citológica** 
Pleocitosis marcada 
Predominio de MN 
Tinta china: 
+ para criptococosis *** 
*PANDY: es una relación de las inmunoglobulinas, es albúmina/globulina. La relación es 5 a 1 y el negativo 
significa que se conserva. En el caso del Cryptococcus es positiva, esto significa que hay una alteración en la 
relación, y eso está indicando que hay un proceso infeccioso-inflamatorio. 
** Examen citológico: se realiza recuento celular. Y se observara, en el caso del Cryptococcus, la pleocitosis (un 
aumento celular marcado) y con predominio de monocitos. 
*** Se observan levaduras con cápsula en la tinta china y es indicativo de Cryptococcus 
 
EXAMEN DIRECTO Y CULTIVO 
 
 Directo con tinta china: es un coloide que tiene hidratos de carbono de un tamaño considerable, por lo 
que no pueden atravesar la cápsula, y de esta manera se observa un halo más claro alrededor de la levadura. 
 Tinciones histopatológicas para poner en evidencia la cápsula. Mucicarmin de mayer que colorea la 
cápsula (levadura + borde rojo), PAS, Grocotti-Gomori, Giemsa produce un halo alrededor de la levadura. 
 Cultivo: Sedimento LCR, ASG durante 48-72 hs sin cicloheximida. 
 Macroscópicamente son colonias mucoides color crema. 
 Microscópicamente se observan levaduras de 5-10 µm más cápsula 20 µm. 
 Pruebas de identificación: 
 Ureasa + 
 Feniloxidasa + 
 Nitroreductasa + 
 Asimilación (Inositol) 
 Sensible a cicloheximida 
 Crece a 37 °C 
 CHROM Agar Candida crece rosado 
 Prueba de canavanina-glicina-azul de bromotilol que permite diferenciar variedad: C. neoformans var 
gattii es + y C. neoformans var neoformans que es - 
 
CRITERIOS INMUNOLÓGICOS 
 
 Detección de Antígeno Capsular (látex) LCR, orina, suero. Posee una sensibilidad del 93-100 % y una 
especificidad del 93-98 %. 
 Cualitativa: 
- Nuevos casos de criptococosis 
- Confirmar reinfección (SIDA) 
 Cuantitativa: 
- Seguimiento de la evolución del paciente 
- Conocer la eficacia del tratamiento antifúngico 
 
Especies de Malassezia 
 
El diagnóstico de Malassezia se realiza para estudios epidemiológicos ya que llegar a especie de Malasezia 
carece de significado ya que el tratamiento es igual en todo el género. Pero se utilizan distintas pruebas 
bioquímicas para arribar a la identificación de cada especie en cuestión. Una de las pruebas es, en un medio de 
cultivo se realiza un orificio endonde se coloca los Tweens que son lípidos que poseen cadenas de tamaños 
diferentes (20-40-60-80) y luego se siembra la Malassezia. Donde crece, se simboliza con un + y significa que 
necesita de ese lípido para poder desarrollar. 
 
 
INTERPRETACIÓN E INFORME DE LOS RESULLTADOS 
 
Levaduras ¿contaminante, colonizante, causante de infección? 
Siempre: depende de la muestra que llega y va acompañada del cuadro clínico del paciente 
 
C. neoformans: no es flora normal aislamiento siempre es significativo 
 
Si la muestra es esputo no es una muestra muy representativa de las vías respiratorias porque está bastante 
contaminada entonces: 
 Si se aísla Candida albicans rara vez es patógeno 
 Si se sospecha candidiasis pulmonar  la única muestra que va a ser representativa es una biopsia pulmonar 
 Inmunodeprimido, aislamientos múltiples focos candidiasis diseminada 
 
BAL: 
 Menor contaminación orofaríngea no es una muestra totalmente estéril 
 Recuentos > 105 UFC/ml candidiasis pulmonar 
 
Hemocultivos: 
 +  candidemia transitoria benigna (por catéter) o candidiasis invasiva 
 -  NO descarta enfermedad activa 
 
Levaduras  ¿agente causal o saprófita o comensal? 
 
Catéter: 
 Métodos cuantitativos (Brum-Buisson) > 103 UFC/ml 
 Métodos semicuantitativos (Maki) > 15 UFC/ml 
 
Orina: 
 Punción suprapúbica  IU 
 Cateterización o chorro medio: 10000-40000 UFC/ml IU