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Bases biológicas de los sistemas agropecuarios Biología celular Licenciatura en economía y administración agrarias - 2022- Facultad de Agronomía - Universidad de Buenos Aires Av. San Martín 4453 - C1417DSE - Argentina – Tel. +541145258000 - www.agro.uba.ar http://www.agro.uba.ar/ 2 CONTENIDOS DE BIOLOGÍA CELULAR SECCIÓN 1: Introducción y Niveles de Organización. ● Biomoléculas ● Niveles de organización biológica SECCIÓN 2: Estructura y regulación de la expresión genética ● Estructura molecular del gen ● Transcripción y traducción del material genético en eucariotas 3 SECCION 1: INTRODUCCIÓN Y NIVELES DE ORGANIZACION Introducción En líneas generales podemos decir que la Biología es el estudio de los Seres Vivos, siendo un poco más específicos podemos mencionar distintas ramas dentro de la biología que tendrán distintos objetos de estudio, como ser la Zoología que estudia los animales, la Botánica los vegetales, la Ecología que estudia las interacciones entre los seres vivos y entre estos y su ambiente, la Biología Evolutiva que estudia como surgieron y fueron cambiando los organismos a través del tiempo, y otras más. En la biología constantemente aparecen nuevas explicaciones, se descubren nuevas especies, otras lamentablemente se extinguen y aparecen nuevas relaciones entre especies, a medida que la tecnología avanza también se van definiendo nuevas ramas de la biología como ser la Biología Molecular que comenzó a desarrollarse en los últimos 70 años, la Biotecnología y últimamente la Biología Sintética. El Universo tiene aproximadamente 13700 millones de años, se ha originado por una Gran explosión (Big Bang) después de la cual el universo comenzó a expandirse y todavía en nuestros días esta expansión continua. Al principio la temperatura era muy elevada, cerca de los 100 mil millones de grados centígrados, lo que impedía que los Átomos (mínima porción de materia) existieran, a media que el universo se expandía también se enfriaba, esto permitió que las partículas subatómicas (Protones y Neutrones) se combinaran formando los Núcleos de los futuros átomos, los cuales para estabilizar sus cargas se asociaron a otras pequeñas partículas subatómicas llamadas Electrones. De estos átomos se formaron las estrellas y los planetas. Hace aproximadamente 5000 millones de años atrás se originó nuestro Sol a partir de polvo estelar y gases de Hidrogeno y de Helio. Muy poco después, hace 4600 millones de años se formaron los planetas y en la Tierra, la Vida apareció hace 3500 millones de años atrás. Según la teoría más aceptada, la de la Síntesis Química, todo comenzó mediante un proceso espontaneo de autoensamblaje de átomos o moléculas simples, cuyo aumento de complejidad dio origen a sistemas polimoleculares (biomoléculas o moléculas orgánicas), estos a las células primitivas o protocelulas, también llamados coacervados. Estas estructuras ya presentaban las siguientes características: • Presentaban una membrana que separaba la célula del ambiente circundante y les permitía mantener una identidad bioquímica. • Presentaban proteínas complejas esenciales para las reacciones químicas de las que depende la vida (enzimas). • Presentaban la capacidad para replicarse generación tras generación. • Presentaban la posibilidad de evolucionar, a partir de la producción de descendencia con variación. Para lograr mantener estas dos últimas características, era necesario presentar algún tipo de manual de instrucciones que se pudiera transmitir, el cual estaría formado por una molécula capaz de acumular información (Información Genética), esta información es la responsable de todas las características de la célula y de las reacciones químicas que se producirán en su interior (Metabolismo). Como veremos más adelante estas moléculas pertenecen al grupo de los Ácidos Nucleicos. Durante las clases iremos viendo que las distintas formas de vida comparten las mismas Características Básicas y el mismo mecanismo de transmisión genética basado en ADN y ARN (Ácido DesoxirriboNucleico y Ácido RiboNucleico respectivamente), por lo cual podemos hablar de un Antecesor o Ancestro Común, del cual y por evolución descienden todos los seres vivos Cuando aparecieron las primeras células requirieron de un aporte continuo de materia y energía para crecer mantenerse y reproducirse. Los organismos modernos y las células que los componen 4 satisfacen sus requerimientos energéticos en una de dos formas. Algunos incorporan moléculas orgánicas del ambiente exterior, las que degradan para obtener energía y componentes para su estructura, estos organismos que incluyen a todos los animales, los hongos y a muchos unicelulares, se denominan Heterótrofos (del griego hetero “otro” y trophos “el que se alimenta”) y tienen un Metabolismo Heterótrofo. otros organismos son capaces de sintetizar moléculas orgánicas ricas en energía a partir de sustancias inorgánicas simples y, por lo tanto, no requieren moléculas orgánicas del exterior. Esta categoría recibe el nombre de Autótrofos (del griego auto “propio”), y poseen un Metabolismo Autótrofo. Podemos mencionar los Fotótrofos quienes utilizan la luz (Fotosíntesis) y los Quimioautotrofos, que utilizan distintos compuestos químicos inorgánicos, en ambos casos, como fuente de energía para poder sintetizar sus propias moléculas orgánicas. Todavía no está claro sí en la evolución, surgieron primero los autótrofos o los heterótrofos, pero sí, está claro que, sin los autótrofos, la evolución de la vida en la tierra pronto habría llegado a un callejón sin salida, ya que por medio de la fotosíntesis la energía capturada de fuentes como el sol, gracias a los autótrofos fotosintéticos, alcanza y sustenta a todas las otras formas de vida. Dos tipos de células: procariontes y eucariontes. La Teoría Celular, uno de los fundamentos de la biología moderna, afirma que todos los organismos vivos están compuestos por una o más células, también que las reacciones químicas de un organismo vivo, incluidas reacciones que liberan energía y reacciones bio sintéticas, ocurren dentro de las células, lo que definimos como metabolismo. La teoría también nos dice que toda célula proviene de otra célula preexistente, y que las células contienen información hereditaria de los organismos de los cuáles son parte, pasando esta, de las células progenitoras a las células hijas. Toda la evidencia disponible indica que hay una continuidad ininterrumpida entre las primeras células primitivas que poblaron la tierra y las células y organismos actuales. En base a los estudios bioquímicos hoy podemos reconocer tres grandes grupos llamados dominios de la vida dónde están incluidos todos los seres vivos, los dominios Bacteria, Arquea y Eucaria. Básicamente existen dos tipos fundamentales de células; las Procariotas y las Eucariotas. Entre los procariontes encontramos dos grupos con características bioquímicas ligeramente distintas, los cuales se pueden agrupar en los dominios Bacteria y Arquea siendo formas de vida unicelulares o coloniales. Mientras que el dominio Eucaria se caracteriza por contener seres vivos con células eucariotas tanto unicelulares como pluricelulares. Independientemente de cuál sea el dominio al que pertenece una célula, todas están formadas por cuatro tipos de moléculas orgánicas o biomoléculas con ligeras diferencias. Todos los seres vivos están constituidos por los mismos componentes químicos y físicos que encontramos en la naturaleza en las cosas no vivas, obedeciendo las mismas leyes físicas y químicas. Después de analizar la composición de un organismo podemos ver que seis elementos (C, H, N, O, P y S) constituyen el 99%de toda la materia viva y también es posible encontrar otros elementos en menores cantidades (Fe, Mg, Zn y otros). Los átomos de estos elementos constituyen enlaces covalentes estables y fuertes entre ellos formando moléculas complejas que caracterizan a los sistemas vivos. Como vimos en los organismos podemos encontrar cuatro tipos diferentes de moléculas orgánicas (Biomoléculas) y en gran cantidad: carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Todas estas moléculas contienen carbono, hidrógeno y oxígeno. Además, las proteínas contienen nitrógeno, pudiendo contener azufre, magnesio, hierro, mientras que los ácidos nucleicos, así como algunos lípidos, contienen nitrógeno y fósforo. En esencia, la química de los organismos vivos es la química de los compuestos que contienen carbono, o sea, los compuestos orgánicos. El carbono es singularmente adecuado para este papel central, por el hecho de que es el átomo más liviano capaz de formar múltiples enlaces covalentes. A raíz de esta capacidad, el carbono puede combinarse con otros átomos de carbono y con átomos distintos para formar una gran variedad de cadenas fuertes y estables y de compuestos con forma de anillo. Las moléculas orgánicas derivan sus configuraciones tridimensionales primordialmente de sus esqueletos de carbono. Sin embargo, muchas de sus propiedades específicas dependen de 5 grupos funcionales. Una característica general de todos los compuestos orgánicos es que liberan energía cuando se oxidan. Los carbohidratos son la fuente primaria de energía química para los sistemas vivos. Los más simples son los monosacáridos ("azúcares simples"). Los monosacáridos pueden combinarse para formar disacáridos ("dos azúcares") y polisacáridos (cadenas de muchos monosacáridos). Los lípidos son moléculas hidrofóbicas que, como los carbohidratos, almacenan energía y son importantes componentes estructurales. Incluyen las grasas y los aceites, los fosfolípidos, los glucolípidos, las ceras, y el colesterol y otros esteroides. Las proteínas son moléculas muy grandes compuestas de cadenas largas de aminoácidos, conocidas como cadenas polipeptídicas. A partir de sólo veinte aminoácidos diferentes usados para hacer proteínas se puede sintetizar una inmensa variedad de diferentes tipos de moléculas proteínicas, cada una de las cuales cumple una función altamente específica en los sistemas vivos. Los nucleótidos son moléculas complejas formadas por un grupo fosfato, un azúcar de cinco carbonos y una base nitrogenada. Son los bloques estructurales de los ácidos desoxirribonucleico (DNA) y ribonucleico (RNA), que transmiten y traducen la información genética. Los nucleótidos también desempeñan papeles centrales en los intercambios de energía que acompañan a las reacciones químicas dentro de los sistemas vivos. El principal portador de energía en la mayoría de las reacciones químicas que ocurren dentro de las células es un nucleótido que lleva tres fosfatos, el ATP. Durante las clases se verán ejemplos de los cuatro grupos de biomoléculas, sus funciones y características. Niveles de organización biológica (adaptado de Biología de Curtis et al. 2000) Uno de los principios fundamentales de la biología es que los seres vivos obedecen a las leyes de la física y la química. A pesar de que como vimos todos los organismos, están constituidos por los mismos componentes químicos -átomos y moléculas- que las cosas inanimadas. Esto no significa, que los organismos sean "solamente" los átomos y moléculas de los cuales están compuestos; hay diferencias reconocibles entre los sistemas vivos y los no vivos. En cualquier organismo, como la bacteria Escherichia coli, los átomos constituyentes se combinan entre sí de forma muy específica. Gran parte del hidrógeno y del oxígeno de la tierra, está presente formando la molécula de agua, pero además de agua cada bacteria contiene aproximadamente 5.000 tipos de macromoléculas diferentes. Algunas de ellas desempeñan funciones estructurales, otras regulan la función celular y casi 1.000 están relacionadas con la información genética. Algunas de las macromoléculas actúan recíprocamente con el agua para formar una película delicada y flexible, una membrana, que encierra a todos los otros átomos y moléculas en un compartimiento tridimensional cerrado. Así encerrados constituyen notablemente una célula, una entidad viva. Al igual que otros organismos vivos, puede transformar la energía tomando moléculas del medio y utilizarlas para sus procesos de crecimiento y reproducción. Puede intercambiar información genética con otras células de E. coli. Puede moverse impulsándose con la rotación de fibras delgadas y flexibles unidas a una estructura que se asemeja a la caja de cambios de un automóvil, pero es mucho más antigua. La dirección del movimiento no es al azar; la E. coli, pequeña como es, tiene un número de distintos sensores que la capacitan para detectar y moverse hacia los alimentos y alejarse de las sustancias nocivas. La E. coli es uno de los organismos microscópicos más conocidos. Su residencia preferida es el tracto intestinal del ser humano, donde vive en íntima asociación con las células que forman el tapiz de ese tracto. Estas células humanas se asemejan a la E. coli en muchos aspectos importantes: contienen aproximadamente la misma proporción de las mismas seis clases de átomos 6 y, como en la E. coli, estos átomos están organizados en macromoléculas. Sin embargo, las células humanas también son muy distintas de la E. coli. Por un lado, son de tamaño mucho mayor; por otro, mucho más complejas. Lo más importante es que no son entidades independientes como las células de E. coli, pues cada una forma parte de un organismo pluricelular. En éstos, las células individuales están especializadas en cumplir funciones particulares, que ayudan a la función del organismo en conjunto. Cada célula del tapiz intestinal vive durante unos pocos días; el organismo, con suerte, vivirá varias décadas. La E. coli, las células de su huésped humano y otros microorganismos que viven en el tracto intestinal interactúan unos con otros. Habitualmente esto ocurre sin consecuencias, de modo que no nos damos cuenta de estas interacciones, pero ocasionalmente tomamos conciencia del delicado equilibrio que existe. Por ejemplo, muchos de nosotros hemos tenido la experiencia de tomar un antibiótico para curar un tipo de infección para finalmente adquirir otro tipo de infección, causado en general por un tipo de levadura. Lo que ocurre es que el antibiótico mata no sólo a las bacterias que causan la infección inicial, sino también a las E. coli y a los otros habitantes normales de nuestro tracto intestinal. Las células de levadura no son susceptibles al antibiótico y, por lo tanto, se apoderan del territorio, del mismo modo que ciertas especies de plantas se apoderarán rápidamente de cualquier pedazo de terreno del que se elimine la vegetación original. 7 Figura 1.1: Niveles de organización biológica Para el estudio de los seres vivos, la biología ordena en jerarquías o niveles de organización, que van desde los átomos a los ecosistemas (Fig. 1.1). Por lo tanto, es posible estudiar biología a muchos niveles, desde un conjunto de organismos (comunidades) hasta la manera en que funciona una célula o la función de las moléculas de esta. Cada nivel en la jerarquía representa un incremento en la complejidad de organización, estando cada nivel compuesto por unidades básicas del nivel anterior. El principio básico subyacente para cada nivel es el concepto de propiedades “emergentes”. Este concepto se refiere a las propiedades y funciones encontradas en un determinado nivel jerárquico que son propias del nivel y por lo tanto no se hallan en los niveles inferiores. Los seres vivos están formados por materia. La materia estáformada por elementos (92 elementos naturales, como el Cloro, por ejemplo) y se caracterizan por poseer determinadas propiedades intensivas, tales como el punto de fusión, punto de ebullición, conductividad eléctrica, etc. Los elementos están formados por átomos. Un átomo es la porción más pequeña de un elemento que conserva sus propiedades químicas. Las investigaciones de los físicos han descubierto un variado número de partículas subatómicas (Nivel Subatómico), para nuestros fines mencionaremos sólo tres: protones, neutrones y electrones. Si combinamos un protón y un electrón se forma un átomo de Hidrógeno (Nivel Atómico), entidad con propiedades diferentes a las de un protón y un electrón por separado (propiedades emergentes). Si combinamos átomos de Hidrógeno entre sí obtenemos Hidrógeno molecular (H2) (Nivel Molecular), que es un gas; si, en cambio, combinamos dos átomos de hidrógeno con uno de Oxígeno, obtenemos agua, otra molécula, cuyas propiedades todos conocemos y que no son las mismas que las del H2 y el O2 y que también difieren de las propiedades de las partículas subatómicas y de los átomos que éstas forman. La vida surgió a partir de átomos y moléculas. Si combinamos moléculas entre sí, formamos grandes y complejas moléculas: las macromoléculas, como las proteínas y los ácidos nucleicos (Nivel Macromolecular o biomolecular). Estas macromoléculas constituyen la materia prima que forman las organelas celulares (Nivel Subcelular) y células (Nivel Celular). En el Nivel Subcelular múltiples moléculas se ensamblan y dan lugar a estructuras especializadas como las organelas (mitocondrias, cloroplastos, etc.). Podemos decir que la vida aparece como propiedad definitoria en el Nivel Celular, o de otro modo, la célula es la unidad de la materia viva que es capaz de realizar todas las funciones imprescindibles para la vida. En la mayor parte de los individuos pluricelulares, las 8 células se organizan de acuerdo con sus características y funciones conformando tejidos como el conectivo, muscular, epitelial, nervioso (Nivel Tisular). Los tejidos están ordenados en estructuras funcionales, denominadas órganos como el corazón y los pulmones en los animales, o las hojas y las raíces en las plantas (Nivel de Órgano). Las funciones biológicas básicas se llevan a cabo por sistemas de órganos (sistema circulatorio, digestivo, reproductor, etc.), que es una asociación coordinada de tejidos y órganos (Nivel de Sistema). Los organismos o individuos pluricelulares están formados por los distintos sistemas que actúan en forma coordinada (Nivel Individual). Existen otros niveles de organización biológica, además de los nombrados anteriormente, donde las propiedades provienen de la relación entre los organismos. Por ejemplo, el Nivel Poblacional reúne a todos los individuos de una misma especie que viven en un mismo lugar, en el mismo tiempo, y que comparten el mismo hábitat (población). Estas poblaciones interactúan de distinta manera con otras poblaciones del lugar constituyendo una comunidad (Nivel Comunitario), por ejemplo, la población de seres humanos de la ciudad de Buenos Aires y el conurbano, aprovecha para alimentarse a las distintas poblaciones de animales y plantas de la zona y se halla parasitada por las mismas poblaciones de parásitos intestinales. Esta comunidad comparte el mismo lugar físico que presenta características particulares. La unión de estos factores físicos con los factores biológicos constituye los ecosistemas (Nivel de Ecosistema). Todos los ecosistemas de la Tierra están relacionados, directa o indirectamente. Es por ello, que un cambio drástico o continuo de alguno de ellos indefectiblemente acarreará cambios en los restantes. Del mantenimiento de un equilibrio entre los distintos ecosistemas, depende la vida en el planeta. Bibliografía recomendada Curtis, H, Barnes, NS, Schnek, A, y Massarini, A. 2008. Biología 7ª edición en español. Editorial: Médica Panamericana. Curtis, H, Barnes, NS, Schnek, A, y Flores, G. 2000. Biología 6ª edición en español. Editorial: Médica Panamericana. Molecular Biology of the Cell. Alberts et al. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/?depth=2 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/?depth=2 SECCIÓN 2. ESTRUCTURA Y REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA Si observamos a los seres vivos, nos encontramos con dos aspectos aparentemente contradictorios, por un lado, la variabilidad entre especies y dentro de una especie, y por otro, la constancia de los caracteres que definen las especies, familias o grupos. Esta paradoja se explica por la presencia, en cada uno de los seres vivos de un material genético que contiene la información necesaria para construir un nuevo individuo. Históricamente, la extraordinaria diversidad de los seres vivos fue un obstáculo para el descubrimiento de principios unificadores de la Biología en general y de la herencia en particular. La investigación en genética formal comenzó en el siglo XIX. Se estudió la herencia de los caracteres variables y surgió el concepto abstracto de gen indivisible como la unidad fundamental de la herencia. En 1920, Hans Winkler, profesor de Botánica en la Universidad de Hamburgo, Alemania, utilizó la palabra genoma (como un acrónimo de las palabras gene y chromosoma) para indicar la suma de genes de un organismo; sin embargo, fue preciso llegar hasta la mitad del siglo XX para comenzar a explorar la identidad química de los genes comenzando el desarrollo de la nueva genética molecular. En esta sección se propone analizar cómo está contenida la información en el ADN y como dicha información es procesada y decodificada desde el lenguaje de los nucleotidos al de las proteínas. Este proceso denominado expresión del material genético se encuentra regulado por diversos factores incluyendo proteínas; son estas últimas de un interés particular ya que directa o indirectamente determinan las caracteristicas de la celula y del individuo completo. Estructura molecular del gen El genoma de los organismos eucariotas se organiza en estructuras llamadas cromosomas, cada cromosoma está compuesto por una sola molécula de ADN de doble hebra. Es importante recordar que químicamente el ADN es un ácido nucleico que consiste en un polímero lineal (no ramificado) de unidades conocidas como nucleótidos (monómero). En todos los organismos celulares (incluso en algunos virus) el polímero forma una estructura de doble hebra o hélice. Cada cadena tiene una polaridad definida (Figura 4.1); por convención las secuencias de ADN (simple hebra) se escriben siempre en sentido 5´→3´. Esto significa que una hebra simple de ADN comienza con un nucleótido en el que el grupo fosfato del C 5´ de la unidad de ribosa se encuentra libre. Figura 4.1. La forma en que los nucleótidos se alínean confiere al ADN una polaridad química. Puede pensarse como un bloque con un extremo que tiene una llave (el fosfato 5´) y el otro extremo con una cerradura (el hidroxilo 3´) Así cada cadena completa tendrá todas sus subunidades alíneadas en la misma orientación. Además, los dos extremos de la cadena serán fácilmente distinguibles, uno tendrá una llave (5´) y el otro una cerradura (3´). Esta polaridad en el ADN se indica refiriéndose a un 10 La doble hebra de ADN que compone un cromosoma tiene una gran longitud que puede expresarse en número de nucleótidos. Por ejemplo, el tamaño del cromosoma 22 del humano medido en número de nucleótidos es de 48 x 106 (48 millones). Si consideramos el largo total del genoma humano, es decir el largo de sus 23 cromosomas, el número de nucleótidos asciende a 3,2 x 109. Arabidopsis thaliana una especie vegetal modelo de estudio, posee un genoma de aproximadamente 1,35 x 108 nucleótidos, valor obtenido sumando el largo de sus 5 cromosomas. El cromosoma 1 de esta especie, elcual es el más largo de todos, posee aproximadamente 3,4 x 107 nucleótidos. Estas largas secuencias de nucleótidos contienen la información hereditaria completa para el organismo que la porta (genoma). Las secuencias que componen el genoma contienen unidades funcionales denominadas genes (Figura 4.2). Siguiendo con los ejemplos anteriores, el tamaño promedio de un gen de A. thaliana es de 2 x 103 nucleótidos y en humanos es de 1x104 - 1,5x104 nucleótidos. Por lo tanto, se desprende fácilmente que cada molécula discreta de ADN (cromosoma) podrá contener una gran cantidad de genes. Los genomas completos de diferentes organismos pueden tener tan pocos como < 500 genes (algunas bacterias), hasta tantos como > 25.000 como el humano. Si bien las secuencias de ADN que conforman el genoma de un individuo contienen genes, existe una porción importante de ADN compuesta por secuencias no codificantes (que no codifican para ningún ARN). Figura 4.2. Detalle de una porción de ADN del genoma que constituye un gen. En la mayoría de los casos un gen constituye una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína, así el producto final de la expresión de los genes son polipéptidos que se sintetizan a partir de moléculas de ARN (ácido ribonucleico). El proceso comienza con la denominada transcripción que tiene lugar en el núcleo en la cual se sintetiza ARN a partir de ADN. Luego en el citoplasma ocurre la traducción mediante la cual se produce un polipéptido a partir de ARN mensajero, ARNm (Figura 4.3). Considerando su función, podemos entonces definir al gen, a escala molecular, como un fragmento de ADN que codifica para un polipéptido. Si bien la mayoría de los genes corresponden a esta definición, debe considerarse que hay otros tipos de genes cuyos productos finales son ARNs que forman parte de la maquinaria de síntesis proteica de la célula. Un caso común es de los genes que codifican para ARNs ribosomales (ARNr) y ARNs de transferencia (ARNt). Todos los genes se localizan en una ubicación particular del cromosoma (singular: locus; plural: loci). Los genes pueden verse modificados en su secuencia nucleotídica sólo cuando ocurren mutaciones. 11 Figura 4.3. Representación de una célula eucariota donde se observan los distintos ARNs y sus funciones. Imagen adaptada de: National Human Genome Research Institute. Podemos entonces definir al gen desde distintos puntos de vista: Definición funcional de gen: Unidades hereditarias que se transmiten de una generación a otra en forma uniforme y predecible, y que contienen información decodificable sobre estructuras y funciones del organismo. Definición molecular de gen (combinación de estructura y función): Unidad de información físicamente constituida por ADN que puede estar interrumpido por secuencias no codificantes denominadas intrones (ver más adelante) y que codifica una “unidad” de función (polipéptido, ARN ribosomal o ARN de transferencia). Estructura del gen eucariota Los genes poseen dos regiones distinguibles, una región estructural y regiones regulatorias (Figura 4.4 y 4.5). Figura 4.4. Esquema de un gen eucariota Región estructural Esta constituida por una secuencia de nucleótidos que se traduce en la secuencia de aminoácidos de una proteína (región codificante). En el extremo 5´ se encuentra una zona 12 denominada 5´ UTR (5´ untraslated región: 5´ no traducible). El extremo 5´ será el sitio de unión del CAP (7-metilguanosina) o caperuza protectora del ARNm. Si bien esta secuencia es parte de la región estructural, no está incluida en la región codificante ya que no será parte de la proteína. Sin embargo, esta secuencia es importante porque será parte del transcripto maduro y la región de reconocimiento para la unión de los ribosomas durante la traducción. En el extremo 3´ se encuentra el 3´ UTR (3´ untranslated región: región 3´ no traducida). Al igual que el 5’ UTR, esta secuencia no codifica para aminoácidos, pero contiene zonas de relevancia como lo es la señal de corte y poliadenilación. Esto significa que esta secuencia será la que define la terminación de la transcripción y determinará el sitio donde se adicionará en el extremo 3’ del transcripto la cola de poli-A. Figura 4.5 Ubicación de zonas génicas a partir del sitio de inicio de la transcripción (Nucleotido +1) En mamíferos la señal de poliadenilación es una secuencia conocida: AATAAA, encontrándose entre 10 y 30 bases corriente arriba del sitio de poliadenilación. Sin embargo, en vegetales superiores no existe un consenso acerca de esta secuencia y se han propuesto diferentes posibilidades (AATAAA, CAYTG, YGTGTTYY y YAYTG; entendiendo Y= C o T). Esto indica que aun siendo el procesamiento del extremo 3’ del mensajero una característica eucariótica universal, no opera de la misma manera en diferentes eucariotas. El ARN mensajero recién transcripto (inmaduro) incluye regiones codificantes que se corresponden exactamente con la proteína de acuerdo con el código genético (Fig. 4.6); la misma se encuentra interrumpida por otras secuencias adicionales que serán removidas durante la maduración del mensajero. A las primeras se las denomina exones y están representadas en el ARN maduro y que codifican para los aminoácidos que conforman la proteína. Por definición un gen empieza con un exón que contiene la secuencia ATG (codón de iniciación de la traducción que codifica para el aminoácido metionina). También por definición, la región codificante de un gen termina con un exón. El último triplete del último exón puede ser uno de los tres siguientes: TGA, TAA o TAG, a los cuales se los denomina codón STOP o codón de finalización (determina el fin de la traducción y no se traduce a aminoácido). Como se mencionó anteriormente existen secuencias no codificantes que serán removidas del ARN inmaduro, estas secuencias se las denomina intrones. Estos se alternan con los exones y los separan entre sí. Los intrones son removidos cuando el transcripto primario o inmaduro (que ya posee CAP y cola de poli A) es procesado para generar el ARN maduro (a través del proceso de corte y empalme o splicing). Figura 4.6: Código genético 13 Regiones regulatorias Estas secuencias son sumamente importantes ya que controlan cuándo, en que células y que nivel de proteína será producida. Existen distintas secuencias regulatorias dependiendo de cada gen. Entre ellas la región regulatoria más importante es el PROMOTOR del gen, el cual posee secuencias que son consideradas como “sitios de unión al ADN”, es decir, secuencias que permiten que las proteínas que actúan en la transcripción (factores de transcripción), interaccionen con el ADN. En los eucariotas muchos de los promotores conocidos, aunque no todos, poseen una secuencia llamada TATA box (caja TATA). Esta secuencia del promotor constituye el sitio donde se unen los factores de transcripción junto con la enzima ARN polimerasa II (ARN pol II) determinando el lugar de inicio de la transcripción. Esta zona, como su nombre lo indica, posee la secuencia consenso 5’- TATAAA-3’ y está ubicada alrededor de 25 pb corriente arriba (-25) del punto de iniciación de transcripción (+1). La TATA box no es la única secuencia que señaliza el inicio de la transcripción en la mayoría de los promotores, pero si la más importante. Corriente arriba de la TATA box, exiten otras secuencias que también afectan la expresión génica: CAAT box y GC box (denominadas secuencias proximales del promotor). La caja CAAT recibe ese nombre por su secuencia de consenso (GGCCAATCT) y está localizada a unas 80 pb corriente arriba del punto de iniciación de la transcripción. Como ocurre con la TATA box, los cambios mutacionales en la CAAT box afectanla actividad génica corriente abajo o la transcripción del ARN. La GC box posee la secuencia de consenso GGGCGG y, con frecuencia, está repetida. Estas cajas presentes en la región promotora constituyen los elementos estructurales de regulación que actúan en CIS, esto es, todas las secuencias presentes en la molécula de ADN misma, que serán reconocidas por la maquinaria transcripcional para la expresión de un gen dado. Sin embargo, la expresión de un gen no solamente depende de estos factores en CIS, sino también de la participación de un grupo de proteínas conocidas como factores de transcripción. Estos factores proteicos de transcripción (químicamente son proteínas, codificadas a su vez por otro gen del genoma del mismo organismo) asisten a la enzima ARN polimerasa a posicionarse en el promotor, a abrir la doble hebra de ADN ayudando a que la transcripción se inicie, y finalmente colaboran en la liberación de la enzima una vez que la transcripción ha finalizado. Una vez que la ARN polimerasa comienza a elongar la cadena de ARN, los factores de transcripción se liberan del ADN y se vuelven disponibles para iniciar otra ronda de transcripción. De estos factores que trabajan sobre la cadena de ADN pero no pertenecen a ella se dice que actúan en TRANS. Debe considerarse, sin embargo, que existen muchas variaciones a este esquema general en diferentes genes; por ejemplo, algunos promotores no tienen TATA box (llamados por ellos TATA-less) también algunos carecen de las CAAT o GC boxes mientras que otras tienen múltiples copias de ellas. Otras regiones regulatorias pueden modificar la expresión de un gen aun estando situadas muy lejos (en número de nucleótidos) de la secuencia de este. Éstas son los enhancers (aumentadores) y los silencers (silenciadores) las cuales son también parte del ADN del mismo individuo (en la Fig. 4.4 estarían como ejemplo posicionalmente representadas por “Otra secuencia regulatoria fuera de la secuencia de gen”). Como su nombre lo indica, los primeros aumentan el nivel de transcripción del gen mientras que los segundos lo disminuyen hasta incluso lograr silenciarlo por completo. En la sección de regulación podrá observarse la disposición espacial que toma el ADN durante la transcripción, mostrando como interactúan a través de intermediarios, la secuencia del gen que se está transcribiendo con las secuencias de silencers y de enhancers. 14 Transcripción y traducción del material genético en eucariotas En un gran número de procesos regulatorios, el producto final de la acción de los genes son polipéptidos los cuales se sintetizan usando ARN como molécula intermediaria. Como se dijo antes, el proceso a través del cual se produce ARN a partir de ADN se denomina transcripción. Existen diversos tipos de ARN que participan en la síntesis de proteínas: ARNm contiene la información del orden de los aminoácidos que forman el polipéptido; el ARNr forma parte de los ribosomas y es en donde se ensamblan los aminoácidos durante la síntesis proteica. El ARNt lleva los aminoácidos para ensamblar de acuerdo con el orden de los nucleótidos en el ARNm. La transcripción es una reacción en la que una enzima llamada ARN polimerasa (ARNpol) une ribonucleótidos de acuerdo con la información del ADN, dando como resultado la síntesis de una cadena de ARN. Dicha reacción es dependiente de la acción de la ARNpol y de otras prOteínas (factOres de transcripción) que requieren de una de las hebras del ADN cOmO mOlde y de lOs 4 ribOnucleótidOs trifOsfatO (ATP, GTP, CTP y UTP) (Figura 4.7). Figura 4.7: Esquema del proceso de transcripción del ADN mediada por la ARN polimerasa y factores de transcripción asociados. La finalización del ARN es mediada por una señal de terminación. Fuente: St. Olaf College. Es impOrtante destacar que el prOcesO de transcripción se realiza siempre en sentidO 5’→ 3’, estO cOnvierte a la hebra de ADN 3’→ 5’ en la hebra mOlde para el ARN. La ARN pOlimerasa se une al ADN en el promotor (Figura 4.8). Al primer ARN sintetizado se los denomina transcripto primario (ARN inmaduro). Luego de la incorporación de los primeros 30 ribonucleótidos al mensajero, en el extremo 5’ se produce el agregado de una estructura llamada caperuza (cap). El cap es un nucleótido guanina modificado (7- metilguanosina) cuya función es el reconocimiento del ARNm por parte del ribosoma y protección contra enzimas que degradan ARN. En el extremo 3’ del transcripto primario de la mayoría de los ARN mensajeros se encuentra una secuencia específica de bases denominada señal de poliadenilación. 15 Figura 4.8: Esquema del modelo de transcripción para genes eucariotas. El ensamblaje del complejo proteico de la ARN polimerasa II comienza con la unión del factor de transcripción IID (TFIID) a la TATA-box. El TFIID está compuesto por una subunidad proteica llamada TBP y otras 8 subunidades. Diferentes inhibidores pueden unirse al complejo TFIID-promotor, bloqueando la unión de otros factores de transcripción. Posteriormente, TFIIB se une al complejo TFIID-promotor y este complejo se une al complejo TFIIF-ARN polimerasa II. Finalmente, TFIIE, TFIIH y TFIIJ se deben agregar al complejo para que comience la transcripción. Fuente: Garland Publishing 1998. Esta secuencia demarca una zona de corte y de agregado de una cola de poli-adeninas (poli-A) por parte de la enzima Poli A polimerasa. Estas secuencias de entre 30 y 200 adeninas tienen la función de proteger al transcripto frente al ataque de ribonucleasas que se encuentran en el citoplasma. El ARN inmaduro (con cap y cola de poli- A) realiza su maduración mediante un proceso denominado splicing que implica la remoción de intrones y el empalme de exones. El ARNm ya maduro es reconocido por proteínas receptoras en el poro de la membrana nuclear y transportado activamente al citoplasma. Una vez allí comenzará el proceso de síntesis de proteínas o traducción. Para el inicio de la traducción, la subunidad menor del ribosoma reconocerá al mensajero por el CAP y el 5’ UTR para luego unirse al ARNm (Figura 4.9). La subunidad menor ya unida al mensajero se trasladará hasta el primer triplete con el que comienzan todas las proteínas y se denomina codón de iniciación, AUG (Figura 4.6). A partir del AUG el mensaje se lee por tripletes de bases (codones). El reconocimiento de cada uno de los codones que determinan a cada aminoácido es realizado por apareamiento complementario con el aminoacil-ARNt (codón- anticodón). Una vez ubicada la subunidad menor sobre el codon de iniciación se unirá el ARNt portador de metionina cuyo anticodón es complementario al codon AUG. Luego se completará el ribosoma con la unión de la subunidad mayor. El ribosoma posee dos cavidades denominadas sitio P (peptidil) y sitio A (aminoacil) cada una de las cuales puede ser ocupada por un sólo ARNt. Al comenzar la síntesis el sitio P es ocupado por el ARNt -metionina, luego según complementariedad ingresa un ARNt al sitio A. Con la unión peptídica entre la metionina y el aminoácido siguiente, se libera el ARNt que portaba a la metionina. El ribosoma se transloca hacia el siguiente triplete pasando el ARNt con los Inicio de la transcripción Comientzo de la transcripción 16 aminoácidos unidos al sitio P. De la misma manera irán ingresando al sitio A los distintos ARNt complementarios a cada codón mientras el polipétido suma aminóacidos. Cuando el sitio A se ubica sobre un codón de terminación (UGA, UAG o UAA), factores de liberación separan la proteína completa del ARNt y las subunidades del ribosoma se disocian. Figura 4.9: Esquema del proceso de traducción Niveles de regulación de la expresión génica eucariota El ADN de un organismo eucariota contiene un gran número de genes. Por ejemplo, hasta el día de hoy se han identificadocerca de 25.000 genes a partir de la secuenciación completa del genoma humano y unos 20.000 a partir de la secuenciación completa del genoma de la planta modelo Arabidopsis thaliana. Sin embargo, cuando se analiza la expresión génica en un determinaddo tipo celular, sólo una pequeña parte del genoma es expresada. Algunos genes se expresan en todos los tipos celulares como, por ejemplo, los genes que codifican para ARNr, ARNt y proteínas ribosomales se expresan en todas las células todo el tiempo. Este tipo de expresión se denomina constitutiva. La expresión diferencial de los genes en el espacio y en el tiempo permite explicar la diversidad de tipos celulares presentes en organismos complejos. Los mecanismos que determinan estos patrones de expresión se conocen colectivamente como regulación génica. Este proceso puede ocurrir en los siguientes niveles: a) transcripcional, b) post transcripcional, c) traduccional, d) post traduccional y e) a nivel del ADN (Figura 4.10). 17 Figura. 4.10: Representación esquemática de los diferentes posibles niveles de regulación de la expresión génica en eucariotas. Regulación transcripcional El nivel de regulación más estudiado es el transcripcional. Podemos separar a los mecanismos de regulación transcripcional en dos tipos: los que actúan en TRANS (conformados por proteínas que se unirán al ADN individual o en complejos junto a otras) y los que actúan en CIS (constituidos por regiones del mismo ADN). Entre los mecanismos en Trans se encuentran: 1) ARN polimerasas: Existen tres tipos de ARN pol que cuya participación en la transcripción depende del gen y por ende del ARN resultante (ARNm, ARNt, ARNr, etc). 2) Factores de transcripción: Los promotores eucariotas, a diferencia de los procariotas, no proveen suficientes señales de reconocimiento para que la ARN polimerasa inicie la transcripción. Los factores de transcripción son proteínas distintas a la ARNpol, que poseen regiones o dominios de unión a una secuencia de ADN presente en el promotor. Así, activan la transcripción mediante una interacción proteína-proteína uniéndose a la ARN polimerasa (Figura 4.8). 3) Proteínas activadoras y represoras: Se trata de otras proteínas que participan en la 1regulación. Se unen en regiones específicas del ADN las cuales pueden estar alejadas del gen a transcribir. Los activadores aumentan la tasa de transcripción a través de su interacción con otras proteínas (factores de transcripción y ARNpol). Los represores inhiben o disminuyen la transcripción de los genes que regulan. 18 Entre los mecanismos en Cis se encuentran: 1) Promotores: Se han podido aislar y caracterizar regiones de ADN con actividad de promotores. Existe alta diversidad de promotores cada uno de los cuales define un patrón distinto de expresión de los genes que controla. Por ejemplo, la actividad de los promotores es la que determina que una proteína este presente en un tipo celular y ausente en otro. 2) Enhancers o amplificaciores y silenciadores: Otro tipo de secuencia regulatoria identificada son los llamados enhancers o amplificadores. Se trata de secuencias capaces de inducir y amplificar el nivel de transcripción de genes. Sus propiedades más importantes son: (a) regular la expresión de genes situados a distancias de miles de nucleótidos y, (b) funcionamiento independiente de su orientación y de su posición, el enhancer puede estar localizado en la región 5’ o 3’ no transcripta o en un intrón (Figura 4.11). A estas secuencias se se unen los activadores antes mencionados. A través de estos activadores, muchas hormonas, intervienen en la regulación de la transcripción. Un ejemplo lo constituye la producción de proteína ovoalbúmina del huevo de la gallina que es específicamente sintetizada en respuesta a la presencia de estrógeno en los oviductos. La hormona es transportada desde el citoplasma al núcleo por una proteína que la reconoce (factor de transcripción) y que luego se une al ADN en una secuencia enhancer que regula a este gen, incrementando su nivel de expresión. Los silenciadores son secuencias capaces de disminuir o inhibir la transcripción. A estas secuencias se unen los represores ya mencionados. Figura 4.11: Esquema de la maquinaria molecular que controla la transcripción en células humanas. Los factores de basales descriptos en la figura 1 son esenciales para la transcripción pero por sí mismos no pueden incrementar o disminuir la tasa de transcripción de un determinado gen. Esta tarea es realizada por moléculas regulatorias conocidas como activadores o represores. Los activadores (y posiblemente los represores) se comunican con los factores basales a través de co- activadores. Estos últimos están asociados con la/s proteína/s de unión a la TATA-box del promotor, que es el primer factor de transcripción en unirse al mismo. Tomado de: Griffith et al. An Introduction to Genetic Analysis. 8th edición 19 Regulación post transcripcional Este nivel de regulación incluye modificaciones que suceden sobre transcripto generado. En primer lugar, como ya fue mencionado en las etapas de la transcripción, la adición de la caperuza 5’, la poliadenilación y la remoción de intrones (splicing) son procesos fundamentales, necesarios para mantener estable un transcripto (estabilidad o vida media de los ARNs mensajeros) y también para obtener un correcto funcionamiento durante el proceso de traducción. Caperuza 5’ (cap 5’): cuando el transcripto alcanzan una longitud de 25-30 nucleótidos, se añaden a sus extremos 5’ una 7-metilguanosina o caperuza. Poliadenilación 3’: La adición de poliadeninas en el extremo 3’ del transcripto es llevado a cabo por diversas proteínas. Mientras que una endonucleasa es la que detecta el sitio de poliadenilación (rico AU) y realiza un corte rio abajo, la poli-A polimerasa adiciona de 50 a 200 adeninas en el extremo libre. Splicing y splicing alternativo: Se trata de otra etapa clave en la regulación post transcripcional. El splicing es un proceso de romoción de intrones y empalme de exones en el que participan un complejo de nucleoproteínas (ARN y proteínas) denominado spliceosoma. Concluida esta etapa se considera que el ARNm ya está maduro. A partir de un mismo ARNm inmaduro, se pueden obtener diferentes ARNm maduros y como consecuencia diferentes formas de una proteína. A esta variante del proceso se la denomina splicing alternativo y ocurre en forma diferente en los distintos tejidos y estadíos del desarrollo. El splicing alternativo no solamente tiene el potencial de producir varias formas proteicas a partir de un solo gen, sino que puede afectar el resultado de un proceso de desarrollo. Un ejemplo es el que involucra la determinación sexual en Drosophila, donde el splicing que involucra un solo exón eventualmente determina si el embrión se desarrollará como macho o hembra. Existen distintos tipos de splicing alternativo (Figura 4.12). Ejemplos de esto son, la remoción de algunos exones junto con los intrones, y la retención de intrones en el mensajero maduro (retención de intrones). Cabe destacar que en los procesos de splicing el ensamblado siempre respeta el orden en el que se encuentran los exones en el ARN inmaduro. Figura 4.12: Tipos de splicing alternativo. Las barras corresponden a exones y las líneas intrones. A la izquierda, las flechas sobre los mensajeros inmaduros, indican el comienzo de la transcripción. A la derecha se observan los diferentes ARNm maduros resultantes. 20 ón traduccional ARN de interferencia: En 1998 los científicos Andrew Fire y Craig Mello descubrieron un mecanismo de regulación por el cual se degradan ciertos ARNm, que les valió el premio Nobel de Medicina. Este mecanismo conocido con el nombre de ARN interferencia(ARNi) se desencadena cuando se detectan moléculas de ARN de doble cadena (ARNds). Como resultado los ARNds son reconocidos por complejos proteicos (Dicer) y degradados. Los fragmentos pequeños de ARN producto de la degración quedan como simple cadena y se unen a proteínas formando un complejo denominado RISC. El complejo RISC permanece en el organismo y cuando aparece un ARNm con secuencias complementarias a las que él porta, lo reconoce y lo cliva. De este modo la proteína codificada no se sintetiza, lo que se denomina silenciamiento génico por ARNi (Figura 4.13). El mecanismo de ARNi se observó en plantas, animales y humanos, y constantemente se descubren procesos donde este mecanismo opera. Ejemplo de ello es el mecanismo por el cual las plantas pueden silenciar la síntesis de proteínas virales una vez que el virus que las ha infectado intenta replicarse en la célula vegetal. Figura 4.13: Mecanismo de acción de ARNi. Los ARNds interactúan específicamente con el complejo proteico DICER que los cliva en fragmentos de aprox. 21-23 nucleótidos. El complejo proteico RISC utiliza los fragmentos de ARNds para encontrar secuencias complementarias a las de estos últimos en ARNm de genes blanco que son posteriormente degradados y de esta manera el gen es silenciado. Regulación traduccional: El complejo proteico DICER degrada al ARNds en fragmentos de aprox 21-23 nucleotidos Los segmentos de ARNds se unen al complejo proteico RISC ARNm con secuencias complementarias a los ARNds se unen a RISC RISC-ARNds degradan a los ARNm blanco 2.3.c. Regulaci 21 Casi una tercera parte del ARNm citoplásmico no está unido a ribosomas, aun cuando más del 90% de los ribosomas se encuentre en actividad. La velocidad con que los mensajeros son traducidos y el número de veces que debe traducirse pueden ser regulados. Existe un control general, global o inespecífico de la traducción, ejercido sobre los factores del complejo de traducción, y además se conocen casos específicos de control particular de la traducción de ciertos ARNm. (a) Control general de la traducción: La caperuza de los ARNm es esencial para el reconocimiento de los factores de iniciación de la traducción y posterior pegado de la subunidad menor del ribosoma. Los factores de iniciación (IFe2B, IFe3, IFe4B e IFe4F) son controlados a través de la fosforilación y desfosforilación producidas por diversos estímulos (desnutrición severa, hiperosmolaridad, infección viral o shock térmico). El IFe2B parece ser el más importante de los puntos de control de la traducción. En el caso particular del IFe2B es la subunidad A la susceptible de ser fosforilada por una proteinquinasa independiente de AMPc que responde a señales de estrés y se inactiva evitando la formación del complejo 40S. (b) Control específico de la traducción: depende de sustancias reguladoras que modifican la configuración de un tramo de nucleótidos no traducibles localizados en el extremo 5’ entre la caperuza y el codón de iniciación. Un ejemplo de este tipo de regulación lo proporciona la traducción del mensajero de la Ferritina que se une al hierro para su depósito intracelular. Cuando las concentraciones citosólicas de hierro aumentan la síntesis de ferritina se produce a altas velocidades, el hierro se liga a la aconitasa o IRF. En cambio, cuando estas concentraciones disminuyen la IRF queda libre y se liga al ARNm de la ferritina formando un bucle en el extremo 5’ que impide el ligado de IFe4F y con ello el ensamblaje del aparato de traducción, bloqueando de esta manera la producción innecesaria de proteína. En los últimos años se han descubierto nuevos procesos en cuanto al control de la traducción que operan en algunas células en particular. A continuación, se mencionan algunos de ellos: • Cambio del marco de traducción: el ribosoma cambia la pauta de lectura en algún punto de su movimiento a lo largo del ARNm desplazándose un nucleótido hacia atrás o hacia adelante, pudiendo un mismo mensajero dar origen a dos proteínas. • Salto del codón de terminación: el ribosoma pasa por alto el codón de terminación y continúa leyendo la secuencia de nucleótidos. • Paso por alto de la traducción: el ribosoma “salta” una secuencia de nucleótidos en el mensajero de modo que queda una proteína más corta que la que el mensajero codifica. Nuevamente un mismo mensajero puede dar origen a dos proteínas. • Empalme de proteínas: de igual manera que ocurre el splicing en los mensajeros, se han encontrado casos en proteínas. Un segmento específico del polipéptido se secciona y los dos bordes se unen en forma covalente. 29 Regulación post traduccional Los péptidos que nacen del ribosoma pueden sufrir diversas modificaciones acorde con su función biológica posterior incluyendo, remoción del extremo amino terminal, agregado de secuencias que resultan señales para exportación, acilaciones, metilaciones, sulfataciones, glicosilaciones, adición de moléculas hidrofóbicas, modificaciones dependientes de vitamina C, carboxilaciones dependientes de vitamina K (como en el caso de los factores de coagulación) o bien clivajes post-traduccionales para tornarse activas (lo cual es un modo de controla su actividad como en el caso de algunas enzimas y hormonas peptídicas). Todas estas modificaciones pueden ser controladas por señales internas (pH intracelular, actividad de 22 chaperones moleculares) o externas (cascadas de quinasas que controlan fosforilaciones). Cualquier problema en estas modificaciones post-traduccionales puede desencadenar alteraciones en la fisiología de la célula. La actividad post-traduccional se controla a través de la regulación de la actividad de las enzimas intervinientes en los procesos citados. Cualquiera sea la estructura y función de la proteína es indispensable un correcto plegamiento post- traduccional de los péptidos ya que la formación de estructuras secundarias, suprasecundarias y terciarias, así como las oligomerizaciones serán las responsables de que la proteína sea funcional. Proteólisis limitada de poliproteínas: algunos mensajeros codifican para poliproteínas. Éstas son productos transitorios que se escinden en varias proteínas, cada una con estructura y función diferente. Un ejemplo de poliproteína es el producto del gen POMC (Propiomelanocortina) que puede escindirse en modo diferencial según sea que esté en las células adrenocorticotropas del lóbulo anterior de la hipófisis (generando ACTH y β lipotrofina) o en las células de la hipófisis media donde genera bendorfina, glipotrofina y hormona estimulante de melanocitos que les permite a los peces, anfibios y reptiles cambiar de color su piel con fines de termorregulación, camuflaje y exhibiciones conductuales. Control sobre la estabilidad de las proteínas: las células pueden controlar el tiempo de supervivencia de las proteínas una vez que han sido sintetizadas y modificadas posttraduccionalmente. Aunque no se trata directamente de la regulación de la expresión de genes, es una extensión del tema. Los mecanismos que controlan la estabilidad proteica no están bien comprendidos, aunque se sabe que en las proteínas que en el extremo amino terminal son ricos en metionina, serina, alanina, treonina, valina y glicina son estables por más de 20 horas en cambio los que son ricos en fenilalanina, ácido aspártico, lisina y arginina tienen una vida menor a 5 minutos. Esto se llama “Regla del Extremo N”. Las últimas secuencias mencionadas se llaman “Secuencias PEST” (por la nomenclatura internacional de aminoácidos) y son altamente sensibles al reconocimiento por ubiquitina y con ello, su degradación en el proteosoma. Regulación a nivel del ADN Dentro de los mecanismos de regulación a este nivel pueden incluirse aquellos relacionadosa las modificaciones epigenéticas, la inactivación al azar de un cromosoma X en hembras, los 30 rearreglos del ADN en linfocitos para la producción de anticuerpos y receptores, la amplificación génica, entre otros. Modificaciones epigenéticas: son aquellos cambios que sufre la cromatina sin afectar a la secuencia de nucleótidos (por eso no son modificaciones "genéticas", sino que están "por encima: epi"). Estos mecanismos epigenéticos juegan un papel fundamental en el correcto desarrollo y funcionamiento del organismo, como es el caso del desarrollo embrionario, el comportamiento o la diferenciación celular. En los últimos años se han encontrado un gran número de casos en el que ocurre este tipo regulación. Algunos ejemplos de modificaciones epigenéticas son: (a) Metilación del ADN: se ha descubierto que, en organismos superiores, a la base nitrogenada citosina se le añade un grupo metilo. Esta modificación sobre las citosinas de la región promotora impide el pegado de factores de transcripción y como resultado puede ocurrir un bloqueo en la transcripción del gen (silenciamiento de genes). Se sabe que el ambiente es uno de los factores que controla la metilación. En los mamíferos se ha visto que la metionina, la colina, el ácido fólico y las piridoxinas (que son sustancias provenientes de la dieta) tienen como función la adición de grupos metilos. Por lo general la metilación se da en mayor grado en citosinas de las islas CpG (regiones con alta concentración de citosina y guanina) las cuales forman parte de la región promotora de los genes. Para que la metilación ocurra de forma adecuada, necesita de la enzima ADN metiltransferasa, la cual se encarga de establecer y mantener los patrones de metilación, y también de las proteínas de unión metil-CpG, que están involucradas en dirigir las marcas de metilación. Un ejemplo conocido es la impronta de genes que hace referencia a la herencia de una copia metilada de un gen (puede ser tanto la copia materna o paterna). Dicha copia metilada se encuentra silenciada y por tanto la expresión es monoalélica. Por lo tanto, se observará un patrón de metilación correspondiente al sexo. Si existen 23 anomalías en el silenciamiento de ciertas copias se pueden dar cambios en el fenotipo que pueden ser resultado de enfermedades como el caso del síndrome de Beckwith Wiedemann. Este síndrome se produce cuando las dos copias del gen IGF2 están activas, es decir el proceso de impronta génica no ocurrió de forma adecuada al no silenciar la copia materna, y por lo tanto el individuo se caracteriza por la presencia de un alto número de tumores de gran tamaño. Se ha determinado que un alto índice de metilación de genes reguladores del ciclo celular y reparadores de ADN lleva una mayor frecuencia de la formación de tumores cancerígenos. De igual forma, si hay un bajo nivel de metilación (hipometilación) también se presentan enfermedades. Estudios recientes han demostrado que la metilación es un mecanismo de defensa contra virus y parásitos, para evitar que éstos logren dañar el ADN. (b) Modificación de histonas: la cromatina está conformada por ADN unido a proteínas como las histonas (H2A, H2B, H3 y H4) y a proteínas no histónicas. Las histonas sufren modificaciones por medio de procesos de acetilación, fosforilación, metilación, ubiquitinización entre otras. Combinaciones específicas en la modificación de las histonas determinan si el gen ha de ser silenciado o expresado. Estos mecanismos epigenéticos juegan un papel fundamental en el correcto desarrollo y funcionamiento del organismo, como es el caso del desarrollo embrionario, el comportamiento o la diferenciación celular. Inactivación del cromosoma X en hembras: Durante el desarrollo embrionario en las hembras se produce una inactivación al azar de uno de los cromosomas X del par homólogo. Se han observado altos niveles de metilación en el cromosoma X inactivo. Todas las células hijas procedentes de la célula en la que se ha producido la inactivación de uno de los cromosomas X, tendrán el mismo patrón de inactivación que la célula original. Esto explica la expresión de algunos rasgos ligados al cromosoma X, tales como el color del pelaje en los gatos. Las gatas conocidas como “gata mariposa o barcina”, muestran un pelaje con manchas de color negro, naranja y blanco de acuerdo con la información que posee el gen X activo en esa región del pelaje (Figura 6). Los gatos machos son color negro o naranja puesto que poseen un solo X que determina su coloración. FIG. 6 gata Barcina Es muy importante tener claro que la inactivación del cromosoma X no es completa, es decir, no afecta a todos los genes del cromosoma. De hecho, se estima que sólo un 65% de los genes presentes en el cromosoma X se inactivan; un 20% de los genes se inactivan sólo parcialmente (es decir, no están inactivados en todas las células) y un 15% escapan totalmente al proceso de inactivación. En este último caso, existen dos copias funcionales de cada gen en mujeres XX pero sólo existe una copia en varones XY. Para evitar las diferencias de dosis génica en estos casos, algunos de estos genes que escapan a la inactivación tienen un gen homólogo funcional en el cromosoma Y, lo que hace que ambos sexos tengan la misma dosis génica funcional. Se piensa que el fenotipo de mujeres X0 con Síndrome de Turner se debe precisamente a la disminución de dosis de todos o algunos de los genes 24 que escapan la inactivación, ya que estas pacientes sólo tienen una dosis funcional de estos genes (cuando deberían tener dos). Rearreglos del ADN en linfocitos: Uno de los fenómenos más interesantes y únicos de la regulación génica a nivel del ADN es la recombinación somática (conocida en inglés como DNA splicing), producida en la formación de las inmunoglobulinas y los receptores de linfocitos T (TCR) (Figura 7). Por mucho tiempo, el origen de la enorme diversidad que presentan los anticuerpos (con alrededor de 109 alternativas de especificidad) era imposible de explicar con el número de genes presente en el genoma de los mamíferos. Las inmunoglobulinas se presentan en familias multigénicas con secuencias codificantes que varían según el tipo de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas están formadas por dos cadenas livianas (L) y dos pesadas (H); a su vez, estas cadenas tienen porciones constantes (C), con poca variabilidad entre anticuerpos, y otras variables (V), que interviene en el reconocimiento del antígeno. En el caso de las cadenas L, hay cientos de genes que codifican para la zona variable (genes V) y unas decenas de genes para zonas de unión (genes J). Para las cadenas H, existen los mismos genes V y J pero además hay una decena de genes de diversidad (D) entre ellos. Las inmunoglobulinas funcionales se producen durante la maduración de los linfocitos B en un proceso en el que los segmentos V, D y J (en el caso de la cadena H) y V y J (en el caso de la cadena L) se reordenan al azar (por corte y empalme), con pérdida de ADN. Los reordenamientos de segmentos génicos correspondientes a las regiones variables se producen en la médula ósea: primero se organizan los genes de VH y luego los de VL. Además, durante esta recombinación, se producen pequeña inserciones y deleciones que aumentan las posibilidades de variabilidad en los anticuerpos. La asociación azarosa de una cadena H con otra L y la aparición de mutaciones somáticas en los genes mencionados aumentan aún más la diversidad en la especificidad de los anticuerpos. Finalmente, otro mecanismo particular de la expresión de los genes de inmunoglobulinas es la llamada exclusión alélica, donde sólo uno de los alelos del par homólogo se expresa, y no ambos como en la mayoría de los genes. La regulación en la dosis del producto de un gen es uno de los mecanismos queactúan a nivel del ADN. Un ejemplo de este tipo de regulación lo podemos observar en las histonas, donde una gran cantidad de genes (copias normales del complemento cromosómico) aseguran la gran producción de estas proteínas esenciales para la formación de la cromatina. En otros casos, la dosis génica puede verse afectada en forma temporaria, como respuesta a un estímulo dado, fenómeno conocido como amplificación génica. Un ejemplo de esto lo encontramos en el anfibio Xenopus laevis donde el número de genes de ARNr (necesarios para la producción de los ribosomas) aumenta hasta 4.000 veces específicamente durante el desarrollo del ovocito. Estado de condensación de la cromatina: heterocromatina y eucromatina. La organización de la 25 cromatina juega otro papel sumamente importante a nivel de la regulación, comenzando por el hecho que la fibra de 30 nm o solenoide no es continua, sino que poseen regiones libres de nucleosomas que se denomina elementos reguladores del locus y que dejan acceso a las proteínas reguladoras a las secuencias específicas para que puedan unirse y estimular la transcripción de un determinado gen en un determinado tejido. Estos patrones de la cromatina son propios de cada tejido dependiendo de que genes se encuentran activos. En el caso de eucromatina, las proteínas que regulan la expresión de los genes pueden tener acceso para unirse y estimular la transcripción de un determinado gen en un determinado tejido. Por otra parte, existen cambios de las histonas que favorecen o frenan la expresión facilitando su afinidad con el ADN o reduciéndola, y de esta manera favoreciendo la transcripción o limitándola. Por otra parte, para evitar que las regiones de ADN menos condensadas en las células (fibra de 30 nm) continúen empaquetándose y terminen convertidas en heterocromatina impidiendo la expresión de los genes, existen unos elementos denominados Delimitadores o Insulators que impedirán como si fueran paredes que avance la heterocromatinización hacia regiones que deben transcribirse. Bibliografía: Sitios web consultados para la preparación de este capítulo y recomendados: http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/faq/genenumber.shtml y lecturas recomendadas en el sitio. http://www.emunix.emich.edu/~rwinning/genetics/ http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/transcription.swf http://www.arabidopsis.org http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine Versiones resumidas de ediciones previas a las últimas pueden consultarse gratuitamente en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=books Ejercitación: cuestionario guía 1 ¿Dónde se localiza el ADN en una célula eucariota? ¿Y en una procariota? 2 ¿Es cierto que los elementos que regulan la expresión de un gen, desde el punto de vista químico, están constituidos exclusivamente por ADN? 3 De lo que se conoce como región estructural, ¿exactamente cuáles secuencias del ADN se traducen a proteína? 4 Además de polipéptidos, ¿existe otro tipo de molécula codificada por un gen? 5 ¿Por qué resulta necesaria la existencia de elementos regulatorios de la transcripción? 6 ¿Cuáles son las secuencias funcionales principales que definen la estructura de un gen eucariótico? 7 ¿Considera que TATA box es sinónimo de promotor? 8 ¿Puede un gen codificar para más de un polipéptido? Explique. 9 ¿Es suficiente que el ADN esté desplegado para que se inicie la transcripción de un gen? Explique. http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/faq/genenumber.shtml http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/transcription.swf http://www.arabidopsis.org/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=books 26 10 Los enhancers y promotores actúan como reguladores de la expresión génica. ¿En qué se diferencian estas dos clases de secuencias regulatorias? 11 En células de un organismo eucariota superior existe un número de genes mayor o igual a 25.000. En un instante dado, en la mayoría de las células, sólo 5.000 de ellos se están expresando. ¿Qué mecanismos permiten explicar eso? 12 Indique a qué niveles puede haber regulación de la expresión de un gen. Considere los niveles desde el ADN potencialmente activo hasta el producto final activo (proteína funcional). Bibliografía ● Curtis, H, Barnes, NS, Schnek, A, y Massarini, A. 2008. Biología 7ª edición en español. Editorial: Médica Panamericana. ● Curtis, H, Barnes, NS, Schnek, A, y Flores, G. 2000. Biología 6ª edición en español. Editorial: Médica Panamericana.