Biología molecular de las célula I Informe de laboratorio

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Biología Molecular de la Célula I
REPORTE DE PRÁCTICA: EL ESTUDIO DE LAS
PROTEÍNAS.
(unión de las prácticas: Precipitación isoeléctrica de la caseína de la leche,
cuantificación de proteínas y electroforesis de proteínas.
I. RESUMEN: En la práctica tres se realizó la obtención de caseína por medio de la
precipitación isoeléctrica de una disolución de leche en polvo, en dónde se manipuló
su pH para que la mezcla precipitara, el proceso continúo al centrifugar y lavar dicho
precipitado para finalmente obtener las pastillas de la proteína en cuestión. En la
práctica cuatro se cuantificó la proteína en diferentes muestras problema (pastillas de
la caseína obtenidas, sobrenadante y disolución de la leche en polvo), para ello se
trazó una gráfica con los datos de absorbancia obtenidos a direrentes concentraciones
de BSA (Albúmina sérica bovina) misma que sirvo para elaborar una curva patrón
con la cuál conocer la consentracion de las muestras problema. Finalmente, en la
práctica cinco se realizó la electroforesis con la cuál se pudo obtener el peso
molecular de los resultados de los geles, y su distancia recorrida por el frente.
Palabras clave: Proteínas, caseína, precipitación isoeléctrica, electroforesis.
II. INTRODUCCIÓN:
Proteínas: Pertenecen al grupo de las macromoléculas, son vitales para la mayoría de los
trabajos que se realizan en las células, una de ellas es dar soporte a la estructura, regulación
de los tejidos, etc. Estas están formadas por una o más cadenas largas, su unidad mínima son
los aminoácidos (cada cadena recibe el nombre de polipéptido) y las sus secuencias son
resultado de la traducción en la célula, realizada por los ribosomas.
1
imagen 1.1, recuperada de: National Human Genome Research Institute.
Las proteínas componen en gran parte a las células, se encuentran en compartimentos
celulares y cumplen con distintas funciones biológicas. Con el objetivo de estudiar cada una,
se requiere que se encuentren en un estado puro y en gran cantidad, por ello, después de que
se ha seleccionado una proteína se debe de liberar sin ocasionar daño en su actividad
biológica, así que al realizar su manipulación se debe de hacer en condiciones de pH
reguladas, así como de temperatura, grado de oxidación y fuerza iónica. Un método reciente
para producir una proteína específicamente ha sido la clonación molecular.
El método de la precipitación de proteínas, realizado con la adición de sales inorgánicas, es
una de los procedimientos para la purificación de proteínas que se basa únicamente en las
características fisicoquímicas. Otras técnicas que pueden alterar la solubilidad de las
proteínas son el cambio de temperatura o pH y la adición de solventes orgánicos, y para
separarlas se utiliza la ultracentrifugación fundamentada en la diferencia de densidades,
utilizada mayormente para realizar un análisis de la pureza de una muestra de una
macromolécula o para la determinación de su peso molecular.
Para obtener una buena separación de proteínas muchas veces se utilizan las combinaciones
de métodos, como lo son la cromatografía de filtración en gel, la cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de interacciones hidrófobas, etc
Finalmente, se debe mencionar que los procedimientos para realizar la purificación de
proteínas deben de poder subdividir la mezcla original en varias fracciones que contienen la
proteína de interés, eso se logra, además con un monitoreo para saber qué fracciones
contienen mayor parte de esa proteína y tenga un mejor grado de pureza.1
La purificación de proteínas hace posible el estudio detallado de las proteínas al aislarlas de
una mezcla compleja mediante una serie de procesos en donde se debe mantener a la proteína
de interés en condiciones óptimas preservando su función y estructura. El primer paso para
obtener un extracto proteico es la selección de la muestra biológica de partida (Ramirez,
2021)
En la leche bovina se encuentran aproximadamente 33 g/L de proteína de la cual cerca
del 80% se encuentra como micelas de caseína. La caseína es un agregado de
1 Facultad de Ciencias. (2013). MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA
I. Colegio de Profesores Departamento de Biología Celular.
macromoléculas de proteínas y minerales que conforman la fracción proteica de los sólidos
de la leche en la mayoría de los mamíferos, razón por la resulta accesible como fuente
proteica (Guevara, 2014).
Precipitación isoeléctrica
Técnica basada en la disminución de la solubilidad por punto isoeléctrico.
Con una naturaleza anfotérica (presentan una carga negativa con pH altos y una carga
positiva a pH bajos), las proteínas pueden tener un pH isoeléctrico, donde la su carga neta es
0, y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico.
El conocer la cantidad de proteínas total en una muestra es vital para evaluar la efectividad
del protocolo de purificación, pues ello permitirá realizar un estudio de proteínas fiable para
una gran multitud de temas de investigación. Para ello se
emplean diferentes métodos de cuantificación entre los cuales se encuentran los
colorimétricos y no colorimétricos, ambos métodos están basados en la ley de Beer y
Lambert que comprenden la transmitancia y absorbancia de la incidencia de un haz de luz a
través de la muestra. Los métodos colorimétricos más comunes son los ensayos de Bradford,
Lowry y ácido bicinconínico donde se mide la intensidad de color mediante la absorbancia de
luz visible a una longitud de onda determinada mediante el uso de un espectrofotometro. Para
esta experimentación, después del paso anterior se construye una “Curva patrón” donde se
grafican concentraciones determinadas de albúmina sérica de bovino (BSA) y la lectura de su
respectiva absorbancia. A partir de un volumen definido de la muestra problema se
extrapolan sus valores de absorbancia para determinar su concentración de proteína, esto
ocurre pasando un haz de luz y, por medio de los componentes de la muestra, y sus diferentes
tipos de absorbancia es que se pueden brindar los valores que pueden determinar de qué
molécula se está observando. Otra alternativa es mediante la ecuación de la gráfica (recta).
Los métodos colorimétricos se ensayan con un volumen determinado de la muestra, de tal
manera que no se expone el extracto al colorante.
Finalmente, la electroforesis es una técnica que ayuda al estudio del movimiento de las
biomoléculas con una carga neta a través de un campo eléctrico. Su migración depende de la
forma, tamaño, carga y composición química y como consecuencia es posible determinar el
tamaño de las moléculas de una muestra. La electroforesis en gel de poliacrilamida es una
técnica de separación ampliamente empleada debido a que es fácil de realizar, es sencilla, con
alto poder de resolución, y bajo costo.
Esta técnica se realiza en un gel de poliacrilamida, que tiene como objetivo separar las
moléculas de DNA, ARN o proteínas dependiendo de su tamaño y su carga eléctrica, esto con
ayuda de la corriente eléctrica, que con un gel o matriz hace que se muevan rápido las
moléculas pequeñas, y para comparar los tamaños se usan unos que se conozcan como
control. (NIH). Este forma una serie de redes de diferentes tamaños, los cuales van a frenar
las diferentes moléculas a lo largo del gel, formando una matriz sólida porosa.
II. Objetivos
● Obtener la caseína de la leche, utilizando el método de precipitación por punto
isoeléctrico.
● Analizar el principio químico y eléctrico del procedimiento.
● Conocer la técnica de Bradford para la determinación de la cantidad de proteína en
una muestra biológica.
● Elaborar una curva patrón para calcular la cantidad de proteína de una muestra de
concentración desconocida, usando una solución estándar de albúmina por medio del
ensayo de Bradford.
● Calcular (por interpolación) la cantidad de proteína contenida en una muestra.
● Determinar el rendimiento y la pureza de una proteína purificada: la caseína.
● Apreciar el uso de las técnicas espectrofotométricas para cuantificar productos
biológicos.
●Obtener una muestra de la proteína deseada por medio de la precipitación isoeléctrica
con el mayor grado de pureza.
● Reconocer el proceso de electroforesis como un método de estudio de tamaño y
conformación de macromoléculas.
● Obtener el conocimiento del método de electroforesis como aislante de la caseína de
la leche.
● Comprender el proceso de migración de las partículas son respecto a un campo
eléctrico.
● Recabar el peso molecular aproximado de la caseína aislada.
III. Hipótesis
Si se realiza el procedimiento de precipitación isoeléctrica, y el método de la
ultracentrifugación de manera adecuada, entonces se obtendrán las muestras fraccionadas,
donde, finalmente quedarán resultantes las pastillas de la caseína.
Para la práctica siguiente, si se realiza el proceso de dilución de nuestras pastillas de caseína
correctamente se reparten en diferentes concentraciones, entonces obtendremos una curva
patrón en base a los datos obtenidos con el espectrofotómetro con variaciones dentro del
límite establecido.
Finalmente, para la práctica número cinco, si se prepara de manera correcta el gel y el
ensamblaje para realizarlo, entonces se podrán obtener los resultados en donde se pueda
observar los componentes finales.
IV. Material y Métodos
Precipitación isoeléctrica de la casina de la caseína de la leche
Se preparó una disolución de 200 mL de leche en polvo, con una concentración de 65
g/L de la cual se le asignó 50 mL a cada equipo, de esta mezcla se realizó una dilución 1:4
con ayuda de una probeta de 200 mL resultando así una disolución nueva de 50 mL de leche
y 150 mL de agua desionizada, se se tomó una muestra de 5 mL para almacenar a 4°C, los
195 mL de disolución de leche restantes fueron vertidos en un vaso de precipitados de 250
mL. Para iniciar el proceso precipitación de la caseína se utilizó un potenciómetro y una
parrilla de agitación para realizar una titulación con HCl al 2% hasta alcanzar el pH
isoeléctrico de 4.8, la lectura del pH fue revisada constantemente. Con pH ajustado, la
disolución de leche reposó a temperatura ambiente hasta la formación de un precipitado
blanco, se descarta el sobrenadante no sin antes tomar 5 mL y almacenar a 4 °C.
Imagen 2. Caseína en proceso de
precipitación.
Una vez obtenido el
precipitado, éste se repartió en
pares de tubos de centrífuga
para posteriormente ser
pesados en una balanza
granataria donde se añadió
precipitado al tubo más ligero
con pipeta Pasteur obteniendo
un equilibrio entre pesos y así
asegurar el funcionamiento
correcto de la centrífuga y
evitar
accidentes.Posteriormente se
colocaron los tubos etiquetados
con las muestras equilibradas
dentro de la centrífuga
asegurando la carga simétrica,
tapa cerrada y los ajustes
pertinentes (3,000 rpm durante
5 min). De esta primera carga
se obtiene un nuevo
precipitado y sobrenadante, se
descarta este último mientras que el primero se lava con agua destilada. El proceso de
equilibrio de pesos, centrífuga, desecho del sobrenadante se repite nuevamente exceptuando
el lavado del precipitado que se efectúa con etanol al 75%. Para obtener las pastillas finales
se repite el procedimiento desde el equilibrio de peso hasta el lavado del precipitado,
posterior a ello se tomaron las pastillas resultantes y se fueron agitadas en un vaso de
precipitado agregando 20 mL de éter etílico en la campana de extracción. Completados los
pasos anteriores las pastillas se ponen sobre el papel filtro previamente cortado y ajustado al
embudo Büchner tratando de pulverizarlas con ayuda de un agitador. Finalmente el secado y
almacenamiento se realizó a temperatura ambiente en frascos de vidrio pequeños
debidamente etiquetados.
Cuantificación de proteínas
El procedimiento dio iniciocuando se pesó 200 mg de caseina (obtenidas de la
practica anterior) en la balanza analitica, posteriormente se depositó y agregó 30 mL de
solución de NaCl al 1% en un vaso de precipitados de 100 mL que fue agitado con ayuda de
la parrilla de agitación mientras que se agregaba gota a gota la disolución de NaOH 1N hasta
conseguir que la caseína se disolviera en su totalidad. Una vez disuelta la caseína se aforó la
disolución a 50 mL con la misma disolución anterior de NaCl al 1% se usó un matraz
volumétrico, paralelamente se etiquetó del uno al diez cada unos de los tubos de ensayo
previamente lavados con agua destilada y alcohol. Se proporcionó una disolución estándar de
BSA a 200 µg/mL, la disolución de NaCl y el reactivo de Bradford que se repartieron en
distinta proporción en los tubos de ensayo 1 a 5 conforme la tabla 1 mientras que en los tubos
restantes (6-8) se sustituyó la disolución de BSA con leche, caseína y sobrenadante para cada
uno, el procedimiento se llevó a cabo con micropipetas de diferentes volúmenes.
.
Tabla 1. Asignación de volúmenes de distintos reactivos para los diferentes tubos de ensayo
donde los tubos 1-5 pertenece la curva patrón y los tubos 6-8 las muestras problema.
Una vez completado el procedimiento anterior se incubaron los tubos cinco minutos
para iniciar con la lectura de absorbancia a 595 nm en espectrofotómetro para observar su
absorbancia.
Por otra parte en Electroforesis la realización se dividió en varias etapas, siendo la primera el
ensamblaje de la cámara de electroforesis y el armado de geles. Como primer paso, se realizó
el gel entre dos placas de vidrio, que se lavaron y se enjuagaron con agua desionizada y
alcohol, se colocaron los separadores de los cuales dependería su grosor del grosor del gel,
dichos espaciadores fueron puestos en las placas de vidrio, cuando se encontraban alineador y
ensamblados se colocaron dentro del porta geles, para después verificar que el sistema no
tuviera fugas. Después se vació la mezcla del gel, observando que estuviera 2.5 cm antes de
llegar al borde, se dejó polimerizar por 30 minutos, y pasando ese tiempo, se eliminó con
agua y se lavó la superficie con agua destilada.
(Para este punto, se agregó primero el gel concentrador hasta la marca, y en dicho proceso se
evitaron las burbujas, para que después se colocara el peine en una esquina y posteriormente
fue insertado poco a poco un diente a la vez y se dejó polimerizar por al menos una hora,
finalmente se colocó el sistema dentro de la cámara de electroforesis vertical, se retiró el
peine y se enjuagó con agua desionizada, para agregar el amortiguador de corrida para que así
los geles quedaran listos para aplicar muestras).
Como paso dos, se realizó la preparación del gel separador al 10% 20 ML,donde inicialmente
se agregó la mezcla de acrilamida bis al 30%, para después agregar el separador 4x (Tris 1.5
M pH 8.8, SDC 0.4%), luego agua desionizada, y al final el persulfato de amonio 10% y por
último TEMED. Se agregó la mezcla sin formar burbujas para que estas no pasen oxígeno y
así no se inhiba la reacción, se ajustó la solución entre las dos placas de vidrio hasta una
altura de aproximadamente 4.5 cm, para finalmente, agregar un litro de agua desionizada
encima del gel para dejar ocurra la polimerización al rededor de 30 minutos, después de ello,
se lavó la superficie del gel con agua desionizada antes de poner el gel concentrador.
Para la preparación del gel concentrador al 4%, se agregaron las siguientes soluciones en el
siguiente orden:
Soluciones Volúmenes para dos minigeles
1. Mezcla a de acrilamida-bis al 30% .65 ml
2. Amortiguador concentrador 4x ( Tris
0.5 m PH 6.8, SDS 0.4%)
1.25 ml
3. Agua desionizada 3.1 ml
4. Perisulfato de amonio 10% 0.075 ml
5. TEMED 7.5 por 10 a la menos tres ml
Se agitó sin formar burbujas, para después aplicar el espacio restante de las placas de vidrio y
se insertó de nuevo el peine, como último paso se dejó polimerizar por 30 minutos.
Preparación del amortiguador de corrida TGS 1x, se calcularon los mililitros necesarios para
realizar un litro de TGC 1x, se puso el TGS 10x necesario en el una probeta de 1,000 mL y se
aforó a 1,000 mL con agua destilada.
Preparación de las muestras, se descongeló el amortiguador de muestra 4x y se verificó que
no se hubieraprecipitado, se prepararon las muestras en microtubos con los estándares.
1. Cuando los geles se terminaron de correr se descartó el amortiguador de la cámara
superior y se liberó el portaplacas
2. Se retiraron con mucho cuidado los separadores de las placas para liberar el gel y con
uno de los separadores se hizo un corte pequeño en el extremo superior izquierdo
donde se colocó la primera muestra para identificar la orientación del gel.
3. Con mucho cuidado se transfirieron los geles con ayuda de una espátula a una charola
que contuvo la solución fijadora, luego de eso se sobrepuso la tapa y no se selló
herméticamente.
4. Se calentó en el horno de microondas durante un minuto y se eliminó el líquido.
5. Se cubrió el gel con solución para teñir y agregamos un mililitro de la disolución de
azul Coomassie en etanol. Se agitó suavemente y se sobrepuso la tapa
6. Se calentó durante un minuto en horno de microondas y se eliminó el líquido en un
frasco para ese desecho.
7. Se cubrió el gel con solución para teñir y agitamos suavemente por 3 minutos
8. Se cambió la disolución para teñir conforme fue necesario hasta que se obtuvo un
buen contraste
III. Resultados
Precipitación isoeléctrica de la casina de la caseína de la leche
Cuantificación de proteínas
La lectura de la absorbancia a 595 nm se muestra en la siguiente tabla
# Tubo µL de BSA mg de BSA Abs
1 250 250 0.380
2 200 20 0.621
3 150 15 0.8095
4 100 10 0.689
5 50 5 0.742
6 - - 0.614
7 - - 0.014
8 - - 0.494
Tabla x. Resultados de lectura de absorbancia en espectrofotómetro.
La siguiente gráfica muestra la curva patrón obtenida en base a los datos de los tubos dos a
cuatro de la Tabla x
Tabla x. Curva patrón de absorbancia en función de la concentración de mg de BSA
Una vez obtenida la curva patrón se utiliza la ecuación de la recta para predecir la
concentración de proteína en las muestras problema:
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏
Siendo “y” la absorbancia, “m” la pendiente (-0.0079), “x” la incógnita y “b” el valor de
0.776 de modo que del despeje de x surge la siguiente ecuación:
𝑥= 𝑦−𝑏𝑚
Al sustituir los y para los distintos valores de absorbancia se obtiene la siguiente tabla
Muestra Absorbancia Concentración final (mg/L)
Caseína 0.014 95.43
Sobrenadante 0.494 35.42
Leche 0.614 20.41
Electroforesis
Cálculo del PM
Para realizar el cálculo del PM, en primer
instancia tomamos como referencia una tabla
en la cual podíamos encontrar el kDa de
algunas proteínas con un PM conocido, a las
cuales nombramos dentro de nuestra tabla de
valores como PM relativo, una vez teniendo
este factor, procedimos a obtener el RF,
mediante la ayuda de un software
especializado para análisis de geles llamado GelAnalyzer, utilizamos dicho programa con la
finalidad de obtener valores precios y ausentes de algún error estadístico que pudiese afectar
nuestros cálculos a futuro.
Una vez obtenido el RF con la ayuda del software especializado, procedimos a comparar cada
una de nuestras bandas obtenidas en el corrimiento con las bandas de la tabla de PM relativo,
para así poder asignarles un PM relativo a nuestras bandaas, para posteriormente calcular el
logaritmo del PM y finalmente obtener la gráfica estándar de la electroforesis.
Una vez teniendo todos los valores de nuestra primera tabla de datos, insertamos dichos datos
en el programa Excel, ya que con ayuda de su opción para realizar gráficos, realizáramos el
gráfico de la gráfica estándar de electroforesis, una vez obtuvimos el gráfico con ayuda de las
opciones que nos brinda Excel agregamos una línea de tendencia para el gráfico obtenido
para finalmente obtener la ecuación de la recta y el valor de .𝑅2
Bandas PM (relativos) Log PM RF
1 200 2.30103 0.099
2 150 2.17609126 0.169
3 100 2 0.319
4 85 1.92941893 0.393
5 60 1.77815125 0.482
6 50 1.69897 0.585
7 40 1.60205999 0.732
8 30 1.47712125 0.789
Una vez obtenidos los
valores de RF, y la
ecuación de la recta,
procedimos a realizar
una segunda tabla de
datos para obtener el
PM de las bandas de la
segunda calle, para ello
obtuvimos el logaritmo
del PM en esta caso ya no
un PM relativo como en la
tabla anterior, sino que
esta vez el logaritmo
del PM sería para calcular el peso “real” de cada una de las proteínas expresadas en bandas
durante el corrimiento de la segunda calle, para ello precisamos la ecuación de la recta la cual
obtuvimos anteriormente; en la cual despejamos “x” quedando de la siguiente forma
, en la cual sustituimos cada𝑥 = 𝑅𝐹−2.0799−0,8736
uno de los valores de RF obtenidos de cada
una de las ocho bandas, una vez realizadas
todas las sustituciones y cálculos
pertinentes, obtuvimos el valor del LOG PM
de cada banda .
Obtenidos los LOG PM de cada banda,
calculamos en antilogaritmo de cada uno
para finalmente obtener el PM de cada
proteína expresada en bandas durante el
corrimiento, para ello precisamos la ayuda
del programa Excel usando la función
=POTENCIA(10,LOG PM), así finalmente obteniendo el PM y realizando la curva patrón.
Bandas RF LOG PM PM
1 0.099 2.26751374
185.1457
45
2 0.169 2.18738553
153.9520
69
3 0.319 2.01568223
103.6769
55
4 0.393 1.93097527
85.30515
47
5 0.482 1.82909799
67.46802
32
6 0.585 1.71119505
51.42745
76
7 0.732 1.54292582
34.90806
89
8 0.789 1.47767857
30.03852
28
IV. Análisis de resultados/ Discusión
Precipitación isoeléctrica de la casina de la caseína de la leche
Al momento de realizar las últimas centrifugaciones, por falta de tiempo, se tuvieron que
desechar 130 mL de la muestra, ya que estos no pasaron por el proceso de precipitación, lo
que nos deja como resultado un poco menos de cantidad que se tenía prevista para las
pastillas de caseína.
Cuantificación de proteínas
Como se aprecia en la tabla x algunos de las lecturas de absorbancia están fuera de la
curva patrón, específicamente para el caso de los tubos uno y tres , si bien se emplean
métodos estadísticos para eliminar datos de esta naturaleza, para efecto de esta práctica solo
se consultó con el docente.
Electroforesis
separación de las moléculas que se suspenden en el gel bajo la fuerza de un campo eléctrico
permitió que la migración de las cargas positivas de las moléculas fueran hacia el ánodo y la
migración de cargas negativas hacia el cátodo
Los factores que pudieron haber afectado el resultado de nuestras prácticas fueron la fuerza
del campo eléctrico, la carga de la muestra que usamos y el tamaño, la forma, la
hidrofobicidad de sus biomoléculas o la concentración del gel
En este método, se utilizó un medio de soporte polimérico inerte entre los electrodos para
separar y analizar la muestra, y en la que notamos que la principal ventaja de la presencia de
“medios de apoyo” es que minimizó la mezcla de nuestras muestras y permitió la
inmovilización de moléculas después de la electroforesis. En esta práctica utilizamos el tipo
de electroforesis en gel vertical (SDS-PAGE)
Después de la migración, aparecieron bandas en la matriz de gel en diversos grados.
V. Conclusiones
Es importante como biólogos el poder saber como extraer, analizar y cuantificar las proteínas
para poder estudiar los diferentes procesos bioquímicos de los seres vivos.
El saber este tipo de procesos nos abre las puertas al estudio bioquímico de una infinidad de
proteínas, tanto animales, vegetales, de bacterias, hongos , etc, permitiéndonos poder
comprender de mejor manera nuestro entorno.
Muchas muestras biológicas complejas se pueden separar usando varios métodos de
electroforesis
Con ayuda de material extra, las clases teóricas y deducción llegamos a la conclusión de que
este método es uno de los mejores para la identificación y separación de biomoléculas, sin
embargo debe de realizarse con mucho cuidado, ya que hay muchos factores que pueden
alterar el resultado de este tipo de estudios, además de que debe de ser analizado con mucho
cuidado para no malinterpretar los datos.
Además este método depende de las prácticas anteriores para aislar la proteína que va a
estudiarse, o los datos de absorbancia para interpretarlo.VII. Referencias
● Guevara G. et al.,(2014). Kappa caseína de la leche: aspectos bioquímicos,
moleculares, productivos y nutricionales. Revista Médica de Risaralda, 20(1), pp
29-33.
● Romero J et al., (2019). Proteínas en Alimentos ¿Buenas y Malas? Revista frontera
biotecnológica. Volumen no. 14 pp 9-13.(Romero, 2019)
● Ramírez C. et al.,(2021). Purificación de proteínas en linea:
http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.
pdf
● -Facultad de Ciencias. (2013). MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR DE LA CÉLULA I. Colegio de Profesores Departamento de Biología
Celular.
● -Proteína. (s. f.-c). Genome.gov.
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Proteina
● Bandow J, Baker JD, Berth M, Painter C, et al.: Improved image analysis workflow
for 2-D gels enables large-scale 2-D gel-based proteomics studies - COPD biomarker
discovery study. Proteomics 2008
http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.pdf
http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.pdf
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Proteina
● Berth M, Moser FM, Kolbe M, et al: The state of the art in the analysis of
two-dimensional gel eletcrophoresis images. Appl Microbiol Biotechnol.
2007;76(6):1223–43.
● Torres G. et al., (2007). Las proteínas en la nutrición. Revista salud pública y
nutrición, 8(2), 1-7.
Práctica 3. Precipitación isoeléctrica de la caseína de la leche
Estructura tridimensional de la caseína (extraída de
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/proteins/auxproteina/caseinabeta.jpg)
Introducción
Las proteínas son moléculas grandes y complejas que cumplen muchas funciones importantes
en el cuerpo. Son vitales para la mayoría de los trabajos que realizan las células y son
necesarias para mantener la estructura, función y regulación de los tejidos y órganos del
cuerpo. Una proteína está formada por una o más cadenas largas, plegadas de aminoácidos
(cada una llamada polipéptido), cuyas secuencias están determinadas por la secuencia de
ADN del gen que codifica la proteína. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Proteina
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Proteina
Las células contienen una amplia variedad de proteínas que se localizan en distintos
compartimentos celulares y tienen diferentes funciones biológicas y. Para estudiar a las
proteínas de manera individual, es necesario obtenerlas puras y grandes.
El desarrollo e innovación de técnicas que permitan un estudio cada vez más detallado de las
proteínas, diverge en dos direcciones, hacia el conocimiento básico para conocer su papel en
diferentes procesos celulares, y en otro sentido sus aplicaciones en las áreas de la
biomedicina, biotecnología y nanotecnología. Las técnicas de purificación de proteínas
juegan un papel fundamental en estas investigaciones, tomando como base el conocimiento
de las propiedades de estas biomoléculas para determinar el protocolo de purificación.
http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.pdf
Los diferentes procedimientos para la purificación de las proteínas están basados casi
exclusivamente en las características físico-químicas de cada una de ellas. El método más
ampliamente utilizado en la precipitación de proteínas es la adición de sales inorgánicas,
como el sulfato de amonio o el fosfato de potasio.
El estudio de una proteína se basa en la investigación exhaustiva de las propiedades
bioquímica y físico- químicas, secuencia de aminoácidos, carga, peso molecular,
hidrofobicidad, función, incluso qué moléculas y parámetros físicoquímicos pueden
modificar estas propiedades y el mecanismo por el cual llevan a cabo esta alteración de la
molécula.
La función de la proteína de interés es determinante durante el proceso de purificación.
Considerando que la muestra se dividirá en fracciones a lo largo de todo el proceso de
purificación, la identificación de la proteína de interés será mediante su función, o alguna
característica que se pueda monitorear de manera sencilla, rápida, reproducible y económica.
El ensayo que se determine para llevar a cabo esto, deberá estandarizarse antes de iniciar con
la obtención del extracto. Partiendo de esta información se inicia con el planteamiento de las
técnicas para purificar a la proteína, e incluso determinar las condiciones en que se trabajará
cada técnica. Sin duda, esta información es fundamental como primer paso en la purificación
de proteínas, una decisión errónea por la falta de información de la proteína de interés puede
ser fatídico, debido a la posibilidad de perder la muestra biológica, tiempo y recursos
materiales.
Existen otras técnicas que alteran la solubilidad de las proteínas como el cambio de
temperatura o pH y la incorporación de solventes orgánicos. Para la separación de proteínas
también se utiliza la ultracentrifugación que se fundamenta en la diferencia de densidad entre
los componentes de un sistema celular y la proteína de interés.
En las siguientes tres prácticas veremos los métodos de aislamiento y purificación de
proteínas: Aislamiento por precipitación isoeléctrica de la caseína de la leche,
Cuantificación de la caseína de la leche, Electroforesis de caseína de la leche
Objetivos.
● Aislar la caseína de la leche por el método precipitación por punto isoeléctrico.
● El alumno entenderá el principio químico eléctrico del procedimiento.
http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.pdf
Resultados
Análisis de resultados.
Práctica 4. Cuantificación de proteínas.
Introducción
La cuantificación precisa de proteínas es esencial para los estudios de proteínas en una
multitud de temas de investigación. Se ha desarrollado una amplia gama de métodos
diferentes para cuantificar tanto mezclas complejas de proteínas como un solo tipo de
proteína. Los métodos de cuantificación de proteínas totales comprenden métodos
tradicionales como la medición de la absorbancia UV a 280 nm, el ácido bicinconínico
(BCA) y los ensayos de Bradford, así como métodos alternativos como Lowry o ensayos
novedosos desarrollados por proveedores comerciales, que a menudo proporcionan un kit
conveniente para cada tipo de ensayo.
https://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html
Una manera de evaluar el protocolo de purificación es conociendo la cantidad de proteína
total de la muestra, desde que se clarifica el extracto hasta que se obtiene pura (rendimiento
expresado en porcentaje). Los métodos para cuantificar a la proteína se clasifican en
colorimétricos y no colorimétricos. Ambos métodos se fundamentan en la ley de Beer y
Lambert, la cual se basa en la transmitancia y absorbancia de la incidencia de un haz de luz a
través de una muestra [9]. Los métodos no colorimétricos se basan en la detección de la
proteína al incidir un haz de luz ultravioleta con una longitud de onda de 210 o 280 nm. Esto
se consigue mediante un equipo que se llama espectrofotómetro, observamos la detección
mediante una gráfica (espectro). Con la longitud de onda de 210 nm se detecta el enlace
peptídico, mientras que a una longitud de onda de 280 nm se detecta el aminoácido triptófano
presente en la mayor parte de las proteínas descritas hasta ahora. Este método se recomienda
para proteínas puras, ya que se considera el coeficiente de extinción molar (es un parámetro
específico para cada proteína) para obtener la cantidad de proteína
Los métodos colorimétricos se basan en el uso de un colorante, el cual interacciona
químicamente y de manera específica e irreversible con algunos aminoácidos presentes en las
proteínas. La intensidad del color determina la cantidad de proteína, es decir, si la mezcla de
la muestra tiene un color claro denota una cantidad pequeña de proteínas, mientras que un
color intenso refiere la presencia de una alta concentración de proteína en la muestra. Los
métodos colorimétricos más comunes son los ensayos de Bradford, Lowry y ácido
bicinconínico (BCA) [10–12]. Cada método se convierteen un análisis cuantitativo al medir
la intensidad de color mediante la absorbancia de luz visible a una longitud de onda
determinada. Siempre en este tipo de técnicas se debe construir una gráfica conocida como
“Curva de calibración”, en la que se grafican concentraciones determinadas de albúmina
sérica de bovino (BSA) y su respectiva absorbancia. A partir de un volumen definido de la
muestra problema se extrapolarán sus valores de absorbancia para determinar su
concentración de proteína, otra alternativa es mediante la ecuación de la gráfica (recta). Los
métodos colorimétricos se ensayan con un volumen determinado de la muestra, de tal manera
que no se expone el extracto al colorante. Los métodos colorimétricos se recomiendan para
muestras con una proteína pura y con muestras de varias proteínas.
Al elegir el método para cuantificar la cantidad de proteína, se debe considerar la
sensibilidad, reproducibilidad y costo del método. La compatibilidad de cada método con la
muestra depende de las condiciones (amortiguador, pH y pureza) en las que se encuentra la
proteína de interés, composición de aminoácidos y otros componentes de la muestra que
puedan interferir con cada método.
http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.pdf
Objetivos
• Conocer la técnica de Bradford para la determinación de la cantidad de proteína en una
muestra biológica.
• Elaborar una curva patrón para calcular la cantidad de proteína de una muestra de
concentración desconocida, usando una solución estándar de albúmina por medio del ensayo
de Bradford.
• Calcular (por interpolación) la cantidad de proteína contenida en una muestra.
• Determinar el rendimiento y la pureza de una proteína purificada: la caseína.
• Apreciar el uso de las técnicas espectrofotométricas para cuantificar productos biológicos.
Hipótesis
En esta práctica utilizaremos el colorante azul brillante de Coomassie donde al unirse a los
grupos amino de las proteínas se va a obtener un color azul.
El método Bradford consiste en mezclar Coomassie Brilliant Blue con las proteínas, y esta
unión hará que el máximo cambie de 465 a 595 nm. Esta unión es independiente de la
composición de aminoácidos de las proteínas.
Metodología
Podemos dividir el procedimiento de esta práctica en etapas: Preparación de las muestras, la
preparación de la curva estándar, y la cuantificación del contenido de proteínas.
1. Primero, con ayuda de un vidrio de reloj, una espátula y la caseína, se pesó 200mg
de caseína con la ayuda de la balanza analítica.
2. Posteriormente, se colocó en un vaso de precipitados de 100ml, se añadieron 30ml de
la disolución de NaCl al 1% hasta que se disolvió toda la caseína, y se agitó con ayuda
de la parrilla de agitación
3. Se transfereriría la disolución anterior a un matraz volumétrico y se aforó a 50ml.
4. Se diluypo el sobrenadante 1:100
5. Se puso 20 µL en un microtubo con ayuda de una micropipeta de 100, y se encendió
el espectrofotómetro
Solución madre y preparación de la curva estándar.
6. Después, con ayuda de la micropipeta agregar 250 microlitros de sénica bovina a los 8
tubos.
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http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.pdf
7. Se etiquetaron los tubos de ensayo del 1-8 y se almacenaron en la gradilla para tener
soporte.
8. Se añadió a cada tubo 20 µL de cada una de las distintas concentraciones de BSA
(Albúmina de suero bovino) y se completó a 1600 µL con agua destilada (de acuerdo
con una tabla que fue extraída del Manual de Laboratorio de Biología Molecular l), y
luego se mezcló.
9. Se añadió 400 µL de reactivo de Bradford a cada tubo, y luego se llevó a agitar bien
en el vórtex. Se dejó a temperatura ambiente al menos 10 minutos
10. Se leyó la absorbancia a 595 nm utilizando el tubo 1 como blanco
11. Estas muestras se guardaron a 4 ºC y fueron utilizadas posteriormente en la práctica
de electroforesis.
Resultados
No. de tubo Ml. DE BSA Mg. de BSA Ab 595nn
1 250 25 .350
2 200 20 .629
3 150 15 .805
4 100 10 .689
5 50 5 .742
6 .614
7 .014
8 .494
AÑADIR GRAFICA CURVA ESTANDAR
Proteína
mg/mL
Factor de
disolució
n 1:4
(mg)
Proteína
de
volumen
inicial en
la leche
(mg)
Proteína
total de
materia
seca
aislada
(mg)
Proteína
restante en
el sobre
nadante
(mg)
Porcenta
je de
caseína
en la
materia
seca
Rendimient
o de
extracción
de la
caseína
Muestra Absorbancia
Caseína 0.014
SN 0.494
Leche 0.614
Discusión
La concentración de proteínas en la muestra es directamente proporcional a la absorbancia de
estas en el espectrofotómetro, siendo que mientras mayor es la cantidad de luz absorbida
mayor es la cantidad de proteínas que estas poseen, y mientras menor es, menos proteínas
tienen.
Conclusión
Existen varios métodos para cuantificar proteínas. un gran número de estos métodos se basan
en la propiedad intrínseca de las proteínas a absorber luz en los UV, para la formación de
derivados químicos, o la capacidad de las proteínas para unirse a ciertos colorantes.
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20METODOS%2
0PARA%20LA%20CUANTIFICACION%20DE%20PROTEINAS.pdf
Hay muchos procedimientos para cuantificar el contenido de proteína de un extracto. Una
sola solución de proteína probablemente daría resultados diferentes cuando se mide con
diferentes métodos, ya que se basan en principios diferentes. La elección de un método
apropiado dependerá de la naturaleza de las proteínas presentes en la muestra, la pureza de
los extractos, la sensibilidad y precisión requeridas y la velocidad con la queremos tener el
resultado.
Bibliografía
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20METODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACION%20DE%20PROTEINAS.pdf
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20METODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACION%20DE%20PROTEINAS.pdf
● Colaboradores de Wikipedia. (2019, 6 septiembre). Azul de Coomassie. Wikipedia, la
enciclopedia libre. https://es.wikipedia.org/wiki/Azul_de_Coomassie
Práctica 5. Electroforesis
Introducción
La electroforesis es una técnica de laboratorio que se usa para separar moléculas de ADN,
ARN o proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se usa una corriente eléctrica
para mover las moléculas a través de un gel o de otra matriz. Los poros del gel o la matriz
actúan como un tamiz, lo cual permite que las moléculas más pequeñas se muevan más
rápido que las moléculas más grandes. Para determinar el tamaño de las moléculas de una
muestra, se usan estándares de tamaños conocidos que se separan en el mismo gel y luego se
comparan con la muestra. (Electroforesis, s. f.)
La electroforesis es una técnica que ayuda al estudio del movimiento de las biomoléculas con
una carga neta a través de un campo eléctrico. Su migración depende de la forma, tamaño,
carga y composición química; por ejemplo, si se tiene una mezcla, cada molécula presentará
una carga y tamaño único, por lo tanto la movilidad y velocidad de migración en el campo
eléctrico para cada molécula es única y se separan en bandas.
Para tener una idea de la complejidad del extracto, es decir, conocer aproximadamente la
cantidad de proteínas que están presentes en la muestra, así como el tipo de proteínas con
base en su peso molecular y carga, las proteínas que conforman el extracto se pueden analizar
mediante la técnica de electroforesis en gel. Esta técnica se basa en el movimiento de las
proteínas en respuesta a un campo eléctrico a través de una matriz porosa (tamiz) o gel de
poliacrilamida, dando como resultado la separación de las proteínas [14, 15]. La
electroforesis en gel de poliacrilamida es una técnica de separación ampliamente empleada
debido a que es fácil de realizar, es sencilla, con alto poder de resolución, y bajo costo.
Existen variantes de esta técnica, elegir una de ellas dependerá de la característica bioquímica
de la proteína con la que se basará su análisis. Esto es, si se analiza la muestra por el peso
molecular de las proteínas o por carga,o ambas. El análisis de las proteínas con base en su
peso molecular se realiza mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes.
En la electroforesis en condiciones desnaturalizantes, las proteínas se ponen en contacto con
un detergente catiónico que despliega estas cadenas y les confiere carga negativa a todas las
proteínas de la muestra, por lo que las proteínas migrarán hacia la misma dirección, hacia el
polo positivo. El gel funciona como un tamiz, con poros microscópicos de tamaño definido, a
través de los cuales las proteínas de mayor tamaño permanecerán en la parte superior del gel,
mientras que las de menor tamaño migrarán en la parte inferior de la matriz, y las de tamaño
intermedio se distribuirán en la mayor parte del gel. De esta manera, la separación de las
proteínas dependerá de su tamaño. En el caso de la electroforesis en condiciones nativas, es
decir, en ausencia de agentes químicos que alteren la función y plegamiento de la proteína, se
mantendrá su conformación y función. La migración de las moléculas a través de la matriz se
rige por la carga natural de la proteína. (Almazán Rodríguez, C., Miranda-Zaragoza, B., &
Ramírez-Carreto, S. (2021).)
Existen geles en una dimensión y en dos dimensiones, isoelectroenfoque para determinar el
punto isoeléctrico, geles para secuenciación de ácidos nucleicos, geles de agarosa,
inmunoelectroforesis, etc. Se pueden realizar dos tipos de geles. Los primeros son, en
condiciones nativas son aquellos en los que las proteínas mantienen su conformación y
estructura tridimensional; los segundos son los geles desnaturalizantes, en los que se agrega
un detergente el dodecil sulfato de sodio (SDS) que confiere una carga negativa y un agente
reductor, el 2-mercaptoetanol que rompe enlaces disulfuro, que provoca que las proteínas
pierdan la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria produciendo un polipéptido de cadena
lineal. (Manual)
Objetivos
● Apreciar a la electroforesis como un método para el estudio del tamaño y de la
conformación de macromoléculas.
● Analizar las muestras del aislamiento de caseína mediante el método de
electroforesis.
● Aprender acerca de la migración de una partícula sobre un campo eléctrico.
● Obtener el peso molecular aproximado de la caseína aislada de la leche.
Hipótesis
● La electroforesis va a ser una técnica que va a consistir en aplicar una carga a través
del gel para estudiar el comportamiento de la caseína y que con base en su tamaño y
su carga se va a desplazar hacia diferentes direcciones.
● Determinaremos el punto isoeléctrico de la caseína después de su extracción química
de la leche entera líquida
Metodología
Se puede dividir el procedimiento en ciertas etapas: El ensamblaje de la cámara de
electroforesis, preparación del gel separador al 10% a 20 mL, preparación del gel
concentrador al 4%, preparación del amortiguador de corrida TGS 1x, preparación de las
muestras, y la Tinción del gel.
Lo primero que se debió hacer fue hacer el ensamblaje de las cámaras y posteriormente el
armado de los geles, en este punto se tuvo que tener en cuenta una serie de cosas.
a) El gel se realizó entre dos placas de vidrio, que fueron necesariamente lavadas y
enjuagadas con agua desionizada y alcohol, asegurándose de que no tengan restos de
ninguna otra sustancia,
b) Se colocaron los separadores de los cuales su grosor va a depender del grosor del gel,
su posición estuvo entre las dos placas de vidrio
c) Los espaciadores fueron colocados en las placas de vidrio, una vez que estuvieron
alineados y ensamblados se colocaron dentro del porta geles . Luego de esto,
verificamos que el sistema no tuviera fugas.
d) Al momento de que se vertió la mezcla del gel, tuvimos en cuenta que estuviera 2.5
cm antes de llegar al borde.
e) Dejamos polimerizar al menos 30 minutos.
f) Una vez que estuvo polimerizado, eliminamos con agua y se lavó la superficie con
agua destilada
En este punto, se agregó primero el gel concentrador hasta la marca y en el proceso se
evitaron las burbujas, luego se colocó el peine en una esquina y fue insertado poco a poco un
diente a la vez y se dejó polimerizar al menos una hora. Posteriormente colocamos el
sistema dentro de la cámara de electroforesis vertical, se retiró el peine y enjuagaríamos con
agua desionizada, posteriormente se agregó el amortiguador de corrida para que así los geles
quederan listos para aplicar las muestras.
Etapa de la preparación del gel separador al 10% 20 ML .
Se agregó primero la mezcla a de acrilamida bis al 30%, de manera posterior el
amortiguador separador 4x (Tris 1.5 m pH 8.8, SDC 0.4 %), luego agua desionizada,
después persulfato de amonio 10%, y por último TEMED.
Se agregaría la mezcla sin formar burbujas ya que la entrada de oxígeno puede inhibir la
reacción.
Se ajustó la solución entre las dos placas de vidrio hasta una altura aproximada de 4.5 cm
Se agregó aproximadamente un litro de agua desionizada encima del gel y se dejó polimerizar
alrededor de 30 minutos. Una vez transcurrido el tiempo se lavó la superficie del gel con agua
desionizada antes de poner el gel concentrador.
Preparación del gel concentrador al 4%.
Se agregó cada una de las soluciones mostrado en el siguiente orden
Soluciones Volúmenes para dos minigeles
6. Mezcla a de acrilamida-bis al 30% .65 ml
7. Amortiguador concentrador 4x ( Tris
0.5 m PH 6.8, SDS 0.4%)
1.25 ml
8. Agua desionizada 3.1 ml
9. Perisulfato de amonio 10% 0.075 ml
10. TEMED 7.5 por 10 a la menos tres ml
1. Se agitó la disolución teniendo cuidado de que no se formaron burbujas
2. Se aplicó el espacio restante de las placas de vidrio e insertamos de nuevo el peine
3. Se dejó polimerizar por 30 minutos
Preparación del amortiguador de corrida TGS 1x
Se calcularon los mililitros necesarios de TGS 10x para preparar un litro de TGS 1x
Se puso el tgs 10x necesario en una probeta de 1000 ML y se aforo a 1000 ML con agua
destilada
Preparación de las muestras
Descongelamos el amortiguador de muestra 4x y se verificó que no se hubiera precipitado
antes de agregarlo a las muestras
Se prepararon las muestras en micro tubos con los siguientes estándares.
Tinción del gel
9. Cuando los geles se terminaron de correr se descartó el amortiguador de la cámara
superior y se liberó el portaplacas
10. Se retiraron con mucho cuidado los separadores de las placas para liberar el gel y con
uno de los separadores se hizo un corte pequeño en el extremo superior izquierdo
donde se colocó la primera muestra para identificar la orientación del gel.
11. Con mucho cuidado se transfirieron los geles con ayuda de una espátula a una charola
que contuvo la solución fijadora, luego de eso se sobrepuso la tapa y no se selló
herméticamente.
12. Se calentó en el horno de microondas durante un minuto y se eliminó el líquido.
13. Se cubrió el gel con solución para teñir y agregamos un mililitro de la disolución de
azul Coomassie en etanol. Se agitó suavemente y se sobrepuso la tapa
14. Se calentó durante un minuto en horno de microondas y se eliminó el líquido en un
frasco para ese desecho.
15. Se cubrió el gel con solución para teñir y agitamos suavemente por 3 minutos
16. Se cambió la disolución para teñir conforme fue necesario hasta que se obtuvo un
buen contraste
Resultados
Regresión lineal → Despeje (con los datos de la regresión lineal de la cuantificación de
proteínas)
caseína= (SN)x + leche
x= = = -1.214574899 𝑐𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 − 𝑙𝑒𝑐ℎ𝑒𝑆𝑁
 0.014 − 0.614
0.494
muestra = bx + a
= x𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝑎𝑏
leche → = 31.2580.614 − 0.3640.008
caseína → = 43.750.014 − 0.3640.008
Sn → = 16.250.494 − 0.3640.008
Cálculo del PM
Para realizar el cálculo del PM, en primer instancia tomamos como referencia una tabla en
la cual podíamos encontrar el kDa de algunas proteínas con un PM conocido, a las cuales
nombramos dentro de nuestra tabla de valores como PM relativo, una vez teniendo este
factor, procedimos a obtener el RF, mediante la ayuda de un software especializado para
análisis de geles llamado GelAnalyzer, utilizamosdicho programa con la finalidad de obtener
los valores precios y ausentes de algún error de estadístico que pudiese afectar nuestros
cálculos a futuro.
Una vez obtenido el RF con la ayuda del software especializado, procedimos a comparar
cada una de nuestras bandas obtenidas en el corrimiento con las bandas de la tabla de PM
relativa, para así asignarles un PM relativo a nuestras bandas. con el objetivo de
posteriormente calcular el logaritmo del PM y finalmente obtener la gráfica estándar de la
electroforesis.
Una vez teniendo todos los valores de nuestra primera tabla de datos, insertamos dichos
datos en el programa Excel, para con ayuda de su opción para realizar gráficos realizar el
gráfico de la gráfica estándar de electroforesis, una vez obtuvimos el gráfico con ayuda de
las opciones que nos brinda Excel agregamos una línea de tendencia para el gráfico
obtenido para finalmente obtener la ecuación de la recta y el valor de .𝑅2
Bandas
PM
(relativos) Log PM RF
1 200 2.30103 0.099
2 150 2.17609126 0.169
3 100 2 0.319
4 85 1.92941893 0.393
5 60 1.77815125 0.482
6 50 1.69897 0.585
7 40 1.60205999 0.732
8 30 1.47712125 0.789
Una vez obtenidos los valores de RF, y la ecuación de la recta, procedimos a realizar una
segunda tabla de datos para obtener el PM de las bandas de la segunda calle, para ello
obtuvimos el logaritmo del PM en esta caso ya no un PM relativo como el la exterior tabla,
sino que esta vez el logaritmo del PM para calcular el peso “real” de cada una de las
proteínas expresadas en bandas durante el corrimiento de la segunda calle, para ello
precisamos la ecuación de la recta la cual obtuvimos anteriormente, en la cual despejamos
“x” quedando de la siguiente forma , en la cual sustituimos cada uno de los𝑥 = 𝑅𝐹−2.0799−0,8736
valores de RF obtenidos de cada una de las ocho bandas, una vez realizadas todas las
sustituciones y cálculos pertinentes, obtuvimos el valor del LOG PM de cada banda .
Una vez obtenidos los LOG PM de cada banda, calculamos en antilogaritmo de cada uno
para finalmente obtener el PM de cada proteína expresa en bandas durante el corrimiento,
para ello precisamos la ayuda del programa Excel usando la función =POTENCIA(10,LOG
PM), así finalmente obteniendo el PM y realizando la curva patrón.
Bandas RF LOG PM PM
1 0.099 2.26751374 185.145745
2 0.169 2.18738553 153.952069
3 0.319 2.01568223 103.676955
4 0.393 1.93097527 85.3051547
5 0.482 1.82909799 67.4680232
6 0.585 1.71119505 51.4274576
7 0.732 1.54292582 34.9080689
8 0.789 1.47767857 30.0385228
Discusión
El principal fundamento que suponemos de la electroforesis es que hace que lo que causa la
separación de las moléculas que se suspenden en el gel bajo la fuerza de un campo eléctrico
permitió que la migración de las cargas positivas de las moléculas fueran hacia el ánodo y la
migración de cargas negativas hacia el cátodo
Los factores que pudieron haber afectado el resultado de nuestras prácticas fueron la fuerza
del campo eléctrico, la carga de la muestra que usamos y el tamaño, la forma, la
hidrofobicidad de sus biomoléculas o la concentración del gel
En este método, se utilizó un medio de soporte polimérico inerte entre los electrodos para
separar y analizar la muestra, y en la que notamos que la principal ventaja de la presencia
de
“medios de apoyo” es que minimizó la mezcla de nuestras muestras y permitió la
inmovilización de moléculas después de la electroforesis. En esta práctica utilizamos el tipo
de electroforesis en gel vertical (SDS-PAGE)
Después de la migración, aparecieron bandas en la matriz de gel en diversos grados.
Conclusión
Muchas muestras biológicas complejas se pueden separar usando varios métodos de
electroforesis
Con ayuda de material extra, las clases teóricas y deducción llegamos a la conclusión de que
este método es uno de los mejores para la identificación y separación de biomoléculas, sin
embargo debe de realizarse con mucho cuidado, ya que hay muchos factores que pueden
alterar el resultado de este tipo de estudios, además de que debe de ser analizado con mucho
cuidado para no malinterpretar los datos.
Además este método depende de las prácticas anteriores para aislar la proteína que va a
estudiarse, o los datos de absorbancia para interpretarlo.
Bibliografía
- Facultad de Ciencias. (2013). MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA
CÉLULA I. Colegio de Profesores Departamento de Biología Celular.
-Proteína. (s. f.-c). Genome.gov. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Proteina
- Electroforesis.(s.f.).Genome.gov.https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Electroforesis
- Almazán Rodríguez, C., Miranda-Zaragoza, B., & Ramírez-Carreto, S. (2021). Purificación de
proteínas. Departamento de Bioquímica de La Facultad de Medicina; UNAM.
http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.pdf
★ El procedimiento se efectuó con los siguientes reactivos y materiales: Centrifuga
analitica, potenciómetro, balanza granataria y analitica, parrilla eléctrica con mosca,
un vaso de precipitado de 500, 250 y 100 mL, una probeta de 50,100 y 500 mL,
gradilla, papel filtro, embudo buchner, una piceta, tubos de centrífuga, pipeta Pasteur,
varilla de vidrio, etanol al 75%, HCl al 2%, éter etílico, frascos pequeños y leche en
polvo.
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Electroforesis