Practica de Lowry

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Instituto Politécnico Nacional
Escuela nacional de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Métodos de Análisis 
Determinación de proteínas por el método de Lowry
Profesor: Francisco Fernández López 
Alumna:
Felipe Ortega Reyes
Grupo: 4IM1	 Semestre: 20/2 Sección: 3
OBJETIVOS:
a) Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
b) Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.
c) Conocer el efecto de sustancias no proteicas, en el desarrollo de color.
d) Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas. 
FUNDAMENTO: 
El método de Lowry utiliza tres sistemas para producir coloración por la presencia de proteínas. En primer lugar, el Cu+, forma complejos de coordinación con dos enlaces peptidicos consecutivos de las proteínas, dando lugar a un compuesto coloreado azul. En segundo lugar, este compuesto es capaz de reducir el reactivo de Folin-Ciocalteu (ácido fosfotungstico y fosfomolibdico), dando un color mas azulado. Por último, el reactivo de Folin-Ciocalteu también reacciona con los restos tirosinil (residuos de tirosina) de la cadena polipeptidica, produciendo así mismo un color azul por la reducción de fosfomolibdato en medio básico. 
RESULTADOS:
Tabla 1. Curva de calibración de albúmina 
	Tubo
No.
	Cantidad de proteína
(μg)
	A595
	
	
	Serie a
	Serie b
	1
	25
	0.023
	0.029
	2
	50
	0.080
	0.043
	3
	75
	0.119
	0.110
	4
	100
	0.142
	0.130
	5
	125
	0.186
	0.188
Tabla 2. Resultados de la regresión lineal 
	Aplicando la regresión lineal a la curva graficada
	R
	0.9815
	A
	0.001586
	B
	-0.0139
 Grafica 1. Representación de la curva de calibración.
De la ecuación de la curva y=0.001586x - 0.0139 donde y es la absorbancia y x la concentración de proteína, despejando a x obtenemos; x= .
Tabla 3. Replicas para el análisis estadístico obtenidas con la ecuación de la curva.
	Tubo No.
	A595
	Cantidad de proteína
(x); (μg)
	1
	0.132
	92.0239
	2
	0.110
	78.1525
	3
	0.124
	86.9798
	4
	0.121
	85.0882
	5
	0.107
	76.2610
	6
	0.104
	74.3648
	7
	0.108
	76.8915
	8
	0.108
	76.8915
	9
	0.108
	76.8915
	10
	0.109
	77.5215
Tabla 4. Resultados del análisis estadístico realizado con las concentraciones obtenidas. 
	X͞
	S
	S2
	%C.V.
	μ
	80.1070
	5.8051
	33.6991
	7.2466
	75.95-84.25
 
 μ = X͞ ± t: “t” tablas (2.262)
 μ = 80.10 ± μ = 80.10 ± 4.12 
 %C.V. = x 100 %C.V. = x 100 = 7.24 %
Tabla 5. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el método de Bradford. 
	Tubo No.
	sustancia
	A595
	Cantidad de proteína
	Tipo de interferencia generada 
	1
	Tris 1M, pH 7.0
	0.156
	107.15
	Positiva
	2
	Glicerol al 1% (v/v)
	0.147
	101.48
	Positiva
	3
	Detergente comercial al 1%
	0.161
	110.30
	Positiva
	4
	Dodecil sulfato de sodio al 1%
	0.134
	93.28
	Positiva
	5
	Ácido tricloroacético al 5%
	0.129
	90.13
	Positiva
Tabla 6. Comparación del método de Lowry con otros métodos de determinación de proteína (ventajas y desventajas)
	Método de Biuret
	Método de Bradford
	Método de absorción en uv (280nm)
	ventajas
	desventajas
	ventajas
	desventajas
	ventajas
	desventajas
	En un método general
	Es menos sensible
	Es más rápido
La reacción se puede completar en 2 min. 
	Reacciona con los iones amonio
	Es rápido
	Los ácidos nucleicos también absorben a 280nm
	Su A máxima es a 540nm
	Tiene que ser en medio alcalino
	Es más sensible detecta 1μg/ml
	El color varia con diferentes tipos de proteína
	Es más sensible 
	La solución debe ser lo más clara posible
	Es más rápido
	Necesita más cantidad de muestra
	Reacciona con los 20 aminoácidos
	Los detergentes interfieren
	No existe interferencias con los Buffer
	Se requiere un sistema puro
	No detecta N2 de fuentes no proteicas
	Presenta opalescencia por presencia de carbohidratos 
	Su A máxima es a 595nm
	El color puede unirse a las celdas de cuarzo
	No destruye las proteínas
	Es solo para aminoácidos aromaticos
Preguntas:
a) ¿Cumple su curva la Ley de Bouguer y Beer?
R: Si 
b) ¿Entre qué límites de cantidad de proteína?
R: En las concentraciones más bajas y más altas de la proteína determinada (25-125μg).
DISCUSIÓN:
En la práctica me toco realizar la curva de calibración en la cual se obtuvo un coeficiente de correlación de .9815 el cual es aceptable, pero al visualizar la grafica se observan los puntos alejados de la linealidad y esto puede deberse a que el día de la realización de la practica me encontraba con gripa y esto genero un poco de distracción en mi manera de trabajar lo cual ocasiono que agregara algunas gotas de mas en los tubos.
Para el análisis estadístico le correspondió elaborar las repeticiones a mi compañero en las cuales obtuvo un %C.V. de 7.24 pero ya que la concentración obtenida para las concentraciones viene de el despeje de la ecuación de la curva y esta nos dio una ordenada al origen negativa la cual se esperaba positiva, dicho resultado también se debe a la forma de trabajar que tuve en el momento del desarrollo de la práctica, teniendo en cuenta no solo que tenia gripa sino que esta es la primer practica que realizo en un año tenía un poco olvidado el manejo de el material en el laboratorio. 
De la obtención de la ecuación de la curva es de donde provienen los resultados obtenidos en cuanto a las concentraciones de las interferencias y estas nos dieron como resultado para la práctica una interferencia positiva lo que quiere decir que entonces nuestras concentraciones en las repeticiones nos dieron elevadas por causa de dichas interferencias. Pero al tener en cuenta que él %C.V. es de 7.24 se tiene un poco en duda los resultados obtenidos de esta determinación.
CONCLUSIÓNES: 
· El método de Lowry cumple la ley de Bouguer y Beer y sirve para la cuantificación de proteínas 
· Es un método específico ya que identifica solo aminoácidos aromáticos.
· El método de Lowry es un método más utilizado en cuanto a los otros métodos y es más sensible que el método de Biuret.
· El método de Lowry con respecto a Bradford es menos sensible y más tardado con el mismo nivel de confiabilidad.
BIBLIOGRAFÍA:
· Voet, Donald. Fundamentos de bioquímica: la vida a nivel molecular. 2° edición. Editorial Panamericana, p.c. 99.
· Roca, Pilar. Bioquímica. Técnicas y métodos. Editorial Hélice, 2003, p.c. 155-158
· http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Proteinas.pdf
ANEXO
Pruebas para establecer diferencias en exactitud y precisión entre los métodos de Lowry y Bradford.
Prueba de la t
 tcalculada = D x 
	X͞1 prueba (Bradford)
	X͞2 estándar (Lowry)
	D
( X͞1- X͞2)
	79.9896
	92.0239
	-12.0343
	89.5006
	78.1525
	11.3481
	83.4298
	86.9798
	-3.55
	83.2274
	85.0882
	-1.8608
	 83.2274
	76.261
	6.9664
	90.1077
	74.3648
	15.7429
	88.0841
	76.8915
	11.1926
	86.8699
	76.8915
	9.9784
	80.799
	76.8915
	3.9075
	86.8689
	77.5215
	9.3473
	D͞
	SD
	tcalculada
	5.1038
	8.5181
	1.89
tcalculada = 5.1 x = 1.89
“t” tablas: 2.262 al 95% de confianza 
1.89 <2.262 por lo tanto no hay una diferencia significativa en la exactitud entre los métodos.
Prueba de la F
Fcalculada= 
	S2 Lowry
	S2 Bradford
	209.280
	248.769
“F” tablas: 4.03 al 95% de confianza
Fcalculada=
1.188<4.03 por lo tanto no existen diferencias significativas en la precisión de los dos métodos.
Curva de calibración (Lowry)
curva tipo	y = 0.001x - 0.014
25	50	75	100	125	25	50	75	100	125	2.3E-2	8.0000000000000099E-2	0.11899999999999999	0.14199999999999999	0.186	2.9000000000000001E-2	4.2999999999999997E-2	0.11	0.13	0.188	concentración (μg)
absorbancia