Practica Metodos Quimicos de Analisis -Electroforesis

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SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Camacho Galán Araceli. 4IM1. Sección 2. 04/May/2016 
Profe. Hernández Derramadero Fernando
INTRODUCCIÓN
La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas
partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinación de su
carga, peso molecular y estructura tridimensional.
El movimiento de las moléculas está gobernado por dos fuerzas adicionales; la fricción con el solvente,
que dificulta el movimiento, lo que genera una fuerza que se opone al movimiento; por otro lado las
moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energía
cinética propia. Esto se denomina difusión y sigue la ley de Fick. La energía cinética de las moléculas
aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La velocidad de migración de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva y
el gradiente de potencial eléctrico e inversamente proporcional al coeficiente de fricción relativo a la talla
y forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
Los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como 
método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde 
aportan un potente criterio de pureza. Es útil además para determinar otros parámetros como peso 
molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas.
La poliacrilamida es un gel resultante de la polimerización química de acrilamida y bisacrilamida.
Regulando la concentración de ambas se consiguen distintas porosidades.
OBJETIVOS
 Efectuar la separación de proteínas de varias muestras mediante la técnica en electroforesis en
gel de poliacrilamida.
 Determinar el tamaño del poro “óptimo” de poro del gel, para la mejor separación de cada una de
las muestras. 
 RESULTADOS
Tabla 1. Características de los electroferogramas a diferentes %T
5.5 7.5 10.0 12.5
Longitud del gel antes de teñir ,
cm. (l)
7.5 6.3 6.2 8
Longitud del gel después de
teñir, cm. (l¨)
8.2 7.2 6.8 8.2
Distancia recorrida por el
colorante, cm. (f)
6.3 5.4 4.5 6.3
No. De
bandas en:
Suero 3 8 4 3
Yogurt 1 2 6 2
Clara 4 8 8 8
%T
Característica
Tabla 2. Movilidad electroforética relativa promedio de cada muestra a diferentes %t
%T
Muestra Valores de m de
la proteína
seleccionada
(cm)
Valor
promedio
de m (cm)
Movilidad
electroforética
M
Log (M X 100)
 Suero 6.2 6.3 6.5 6.33 0.9184 1.9630
5.5 Clara 6.2 6.7 6.5 6.47 0.9378 1.9721
 Yogurt 6 6.7 6.5 6.40 0.9291 1.9681
 Suero 5.3 5.3 5.3 5.30 0.8588 1.9339
7.5 Clara 5.5 5.6 5.6 5.57 0.9000 1.9542
 Yogurt 5.3 5.7 X 5.50 0.8912 1.9500
 Suero 4.5 4.5 4.5 4.50 0.9117 1.9599
10 Clara 5.4 5.4 5.5 5.43 1.1001 2.0414
 Yogurt 5.5 5.3 5.1 5.30 1.0738 2.0309
 Suero 4 4.1 3.9 4.00 0.6194 1.7920
12.5 Clara 4.6 4.7 4.6 4.63 0.7170 1.8555
 Yogurt 4.5 4.5 4.4 4.47 0.6909 1.8394
Ejemplo de cálculo de la Movilidad electroforética.
Se emplean la formula siguiente:
M= ( ll ' )(
m
f )
Donde
l: longitud en cm del electroferograma antes de teñir
l’: longitud en cm del electroferograma después de teñir
m: distancia recorrida en cm, por la proteína elegida en cada muestra, desde la parte inferior del pozo
hasta el recorrido máximo de cada banda
f: distancia recorrida por el colorante
Entonces, para la concentración de 5.5 %T de poliacrilamida y con la muestra de suero:
M= ( 7.58.2 )(
6.33
6.30 )=¿ 0.9184
El cálculo anterior se realizo para cada %T de poliacrilamida y con las distintas muestras de proteína.
Posteriormente los resultados obtenidos se multiplicaron por cien y se obtuvo su logaritmo. 
Después con los valores de la tabla, se construyó la gráfica de Ferguson.
5 6 7 8 9 10 11 12 13
1.7
1.75
1.8
1.85
1.9
1.95
2
f(x) = - 0.02x + 2.08
R² = 0.98
f(x) = - 0.02x + 2.07
R² = 0.98
f(x) = - 0.03x + 2.11
R² = 0.99
Gráfica de Ferguson
Suero Linear (Suero) Clara Linear (Clara) Yogurt Linear (Yogurt)
%T
Log (Movilidad * 100)
Gráfica 1. Gráfica de Ferguson para determinar carga y peso molecular relativo de las muestras de clara, yogurt y suero.
Se obtuvo la ecuación de la recta para las diferentes muestras, ya que la ordenada al origen proporciona
la carga neta de la proteína que se separo, mientras que la pendiente aporta el valor del peso molecular
relativo, resultando lo siguiente:
Clara Peso molecular relativo= 0.0173 Carga= 2.0739
Yogurt Peso molecular relativo= 0.0191 Carga= 2.0815
Suero Peso molecular relativo= 0.0252 Carga= 2.1104
NOTA: Los resultados de 10 de %T no se utilizaron para elaborar la gráfica de Ferguson, debido a que 
presentaban valores demasiado altos que salían de la tendencia general. 
PREGUNTAS EXTRA.
1. Diga ¿cuál %T recomienda para la separación de las proteínas de cada muestra?, ¿Por qué?
Es recomendable 7.5 de %T, ya que a ese tamaño de poro las proteínas de las muestras
empleadas tuvieron una mejor separación, lo que se observa reflejado en el número de bandas en
el gel. A dicho %T se logra una mejor separación y resolución. 
2. Escriba la reacción completa para la copolimerización de la acrilamida y la bis-acrilamida por
radicales libres, ¿Qué función tiene el TEMED y el persulfato de amonio?
La reacción de copolimerización de la acrilamida y la bis-acrilamida (N, N’-metilen-bis-acrilamida),
es iniciada por el TEMED (tetrametiletiléndiamina) y el persulfato de amonio. El radical persulfato
activa el TEMED, que a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. 
Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan de forma azarosa por la bisacrilamida, formándose
una red de porosidad uniforme, la cual puede ser regulada variando las condiciones de la
reacción y las concentraciones de los monómeros.
La polimerización se detiene cuando desaparecen los radicales libres del medio; entre los
agentes que producen su desaparición con mayor eficacia se encuentra el oxígeno molecular.
Imagen 1. Reacción de copolimerización de la acrilamida y la bis - acrilamida
3. Mencione una aplicación de la electroforesis preparativa y una de la electroforesis analítica.
Electroforesis preparativa. Purificar moléculas y fragmentos de DNA y RNA, y aplicar una
preparación a las muestras a analizar.
 Electroforesis analítica: determinar la composición, peso molecular y carga de una proteína.
4. Defina velocidad de migración y movilidad electroforética. Explique la diferencia.
Velocidad de Migración: movimiento de una molécula, determinada velocidad, la cual es específica
para cada molécula y campo eléctrico. Sus unidades son cm/s. Además es inversamente
proporcional a la viscosidad del medio y proporcional a la carga neta de la molécula.
Movilidad Electroforética: parámetro que determina el comportamiento de una molécula bajo la
acción de un campo eléctrico, velocidad de migración por unidad de campo eléctrico.
La diferencia es que, la velocidad de migración hace referencia al movimiento y carga neta de las
moléculas de la muestra y a las características del medio como la viscosidad, mientras que la
movilidad electroforética tiene relación con la aplicación de un campo eléctrico al gel donde se esté
llevando la separación y a la migración de las moléculas de la muestra por cada unidad de campo
eléctrico.
5. Defina el término Electroferograma
Gráfico construido a partir de los resultados de una electroforesis, representa las bandas
distribuidas en el gel de poliacrilamida, permite diferenciarlas y analizarlas con más detalle.
Relaciona la respuesta de separación en función del tiempo en el que se desarrolla la
electroforesis.