BFDE_U3_EA_JEMP

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Universidad Abierta y a Distancia 
de México 
División de Ciencias de la Salud, 
Biológicas y Ambientales 
Ingeniería en Biotecnología 
 
Fenómenos de transporte 
 
 
Unidad 3 
Evidencia de aprendizaje 
Cromatografía liquida de alto rendimiento 
 
 
Jessica Verónica Mendoza Prado 
ES202104539 
 Grupo BI-BBFDE-2301-B2-002 
 
7 de junio de 2023 
Resumen 
El presente trabajo pretende dar evidencia de las actividades desarrolladas durante la realización 
de la evidencia de aprendizaje, donde se trabajo con el software propuesto sobre cromatografía 
desarrollado por la Universidad de Geneva, abordando específicamente la cromatografía liquida 
de alta eficiencia. Se brinda un panorama general al lector sobre esta técnica y se realiza la 
practica sobre vitaminas liposolubles utilizando el solvente acetonitrilo a concentraciones 
variables y se explora la temperatura más adecuada para el desarrollo del experimento. 
Finalmente, se realiza un análisis de los resultados. 
Objetivos de la practica 
1. Describir la cromatografía de alta eficiencia 
2. Describir los componentes involucrados en la cromatografía de alta eficiencia. 
a. Describir los componentes fijos como detector UV, columna de horno, inyector y 
bomba. 
b. Describir los componentes variables como solvente, solución a analizar y 
temperatura. 
3. Describir el efecto del cambio de los valores de las variables en el resultado 
cromatográfico. 
Marco teórico 
La cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC dadas las siglas en inglés) es la técnica analítica 
que determina los componentes de un producto compuesto por sustancias diversas, 
separándolas y permitiendo su posterior purificación. Se compone de una fase móvil que contiene 
las sustancias a analizar y la columna cromatográfica interacciona con la móvil que es bombeada 
a través de la columna y constituye la fase estacionaria. El tiempo de retención de la fase móvil 
en la estacionaria dependerá de los componentes y de sus características y los componentes 
son separados por un proceso de migración diferencia. 
Fase estacionaria 
Puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico, siendo matrices solidas que contienen 
sitios activos con carga electrostática positiva o negativa. Al circular la muestra a través de la 
matriz, queda retenida sorbe el soporte solido por afinidad electrostática. 
Fase móvil 
Se emplea un disolvente que migra hacia abajo gravitatoriamente, impulsado muchas veces por 
la presión de una bomba o mediante succión vacío, separando los componentes de la mezcla 
que ingresan por la parte superior. 
Principios 
a) Dependiendo de la relación carga tamaño, serán los productos detenidos con mayor 
fuerza sobre el soporte sólido, separándose del resto. 
b) Las sustancias que permanecen más tiempo libre en la fase móvil avanzan más rápido 
sobre la misma. 
c) Las sustancias que quedan más tiempo unidas a la fase estacionaria avanzan menos y 
tardan más en circular. 
 
Procedimiento experimental 
 
Análisis de resultados 
Módulos más usuales en HPLC 
Detector UV 
Detecta los analitos separados que salen de la columna y produce una señal para el software de 
análisis. Durante el análisis, la muestra pasa a través de una celda incolora de cristal en la que 
se irradia luz UV, siendo una parte absorbida por la muestra y el resto detectada. La medida de 
ancho de onda va de 195 a 370 nm y debe estipularse en primer lugar la intensidad de la fase 
móvil sin la muestra. 
Columna empaquetada 
Las columnas generalmente están hechas de acero inoxidable o similares como vidrio grueso, 
polímeros o una combinación de estos. Van de los 3 a 25 cm de longitud y tienen un diámetro de 
1 a 5 mm. El material de empaquetamiento suele ser pelicular o poroso. El primero se compone 
de partículas de algún polímero o perlas de cristal, que son rodeadas por una capa delgada y 
uniforme de silica, resina sintética, alúmina o alguna otra resina que permita el intercambio iónico. 
El grosor de la película es de 30 a 40 um. Las partículas porosas, por otro lado, tienen un diámetro 
de 3 a 10 um, pueden estar hechas de silica, resina sintética, alúmina u otros, siendo silica la 
mas común. 
Inyector 
Se encarga de inyectar la muestra sin perturbar el flujo y presión del sistema. Permite que los 
resultados sean reproducibles y son configurables en cuanto a volumen. Los requerimientos para 
un inyector de calidad son: 
1. Introducir la muestra con presión constante y con flujo de acuerdo con el sistema 
2. Introducir la muestra sin burbujas de aire 
3. El volumen debe ser en microlitros y constante 
4. Debe estar libre de cualquier partícula contaminante 
El más común es el inyector de Reodine, que tiene dos posiciones, cargar e inyectar. 
Bomba 
Se encarga del bombeo de la muestra a través de la columna de cromatografía. Es necesaria 
una bomba precisa y fiable para obtener resultados reproducibles. 
Comportamiento del cromatograma al modificar T 
 
Ilustración 1 Temperatura fijada en 20°C 
 
Ilustración 2Temperatura fijada en 30°C 
 
Ilustración 3 Temperatura en 40°C 
Comportamiento del cromatograma al modificar la concentración de solvente de la fase móvil 
 
Ilustración 4 Concentración a 10° 
 
Ilustración 5 Concentración a 50% 
 
Ilustración 6 Concentración a 90% 
 
Ilustración 7Concentración a 100% 
Identificación de cada pico del cromatograma con el componente separado 
El mix de vitaminas liposolubles contiene 4 vitaminas: acetato de retinol, colecalciferol, alfa 
tocoferol y vitamina K1. El pico de cada columna, expresado en unidades de absorbancia de UV, 
nos ayuda a determinar el componente que estamos analizando. Se determino que el acetato de 
retinol tuvo una altura de 121 que corresponde al primer pico, el colecalciferol de 111 que 
corresponde al segundo pico, el alfa tocoferol de 67 y la vitamina k1 de 61 correspondiendo al 
ultimo pico. 
 
Ilustración 8Cromatograma final a 40°C y una concentración de 100% 
Tabla 1 Resultados de la cromatografia con las especificaciones previas 
 
Discusión del tiempo de retención y el valor de k y su interpretación 
Conclusiones 
La cromatografía liquida de alta eficiencia es una técnica cualitativa que nos permite determinar 
las sustancias que componen cierta mezcla de forma sencilla en ejecución y con alta 
confiabilidad. Se compone de una fase móvil liquida donde se encuentran los solutos y una fase 
estacionaria que forma uniones químicas con los componentes, así como de un lector de UV que 
envía datos para su análisis. En este trabajo, tuve oportunidad de manipular los distintos valores 
de la cromatografía para observar su efecto sobre el resultado, siendo a mi parecer el de mayor 
significancia la concentración del solvente. 
Referencias 
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basics/index.html#:~:text=High%20Performance%20Liquid%20Chromatography%20(HPLC)%2
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Aplicada. Recuperado de 
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