BGMB_U2_EA_JESSICA_MENDOZA_PRADO

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Universidad Abierta y a Distancia 
de México 
División de Ciencias de la Salud, 
Biológicas y Ambientales 
Ingeniería en Biotecnología 
 
 
Genética Molecular Bacteriana 
 
 
Unidad 2 
Evidencia de aprendizaje 
Megaprimer 
 
Jessica Verónica Mendoza Prado 
ES202104539 
 Grupo BI-BGMB-2301-B2-002 
 
2 de junio de 2023 
 
Función del primer mutagénico 
Es el encargado de codificar alguna mutación o combinación de mutaciones, incluyendo 
deleciones e inserciones. Se usa desde la primera ronda de PCR. En su diseño debe 
considerarse que las mutaciones no deben ocurrir muy cerca del primer del extremo 3´que 
dificultaría la acción de la Taq pol, y su diseño debe resolver cualquier problema de adición de 
bases adicionales como A por la Taq pol en el extremo 3´. 
Función de primers flanqueadores 
Los primer flanqueadores, denominados A y B dentro del gráfico, son primers específicos de la 
secuencia que usualmente se diseñan para contener sitios de restricción que permiten que el 
producto final de la PCR pueda ser restringido y ligado a un mismo vector, conteniendo la 
secuencia final los mismos primers flanqueadores del comienzo. 
Megaprimer 
Un mega primer es un método que permite la mutagénesis basada en la PCR. Usa tres primers 
y dos rondas de PCR basándose en una hebra de ADN base que contiene el gen a ser mutado. 
Tiene la propiedad de que en la segunda ronda no es 
necesaria la separación de la doble hebra. 
1. En la primera ronda de PCR se realiza utilizando el 
primer mutagénico, y uno de los primer 
flanqueadores. 
2. El producto de doble hebra se purifica y se usa como 
primer en la segunda ronda de PCR junto con el 
segundo primer flanqueador. Debe considerarse que 
se usa la forma silvestre del gen clonado como base 
en ambas reacciones de PCR. 
3. El producto de la segunda ronda de PCR que 
contiene la mutación puede ser ahora utilizado, por 
ejemplo, en vectores de expresión. 
PCR necesarias para realizar la mutación solicitada 
Son necesarias dos rondas de PCR, en la primera se introduce el primer flanqueador y el primer 
mutagénico en sentido contrario, en la segunda ronda se introduce el segundo primer 
flanqueador quedando integrado el megaprimer. Posteriormente puede ser utilizado el producto 
en el propósito deseado. 
Secuencia de PDGF-A 
atgactttccacagcccccgtcgtgggaacttagtgcttcaggctccccagcgacccccgactctccttaaaaatcggggaggggagtgggggcggcca
gaggaagccgagatcccccgcgaggtgatcgagcggctggcccgcagtcagatccacagcatccgggacctccagcgactcctggagatagactccgt
agggagtgaggattctttggacaccagcctgcgagctcacggggtccatgccactaagcatgtgcccgagaagcggcccctgcccattcggaggaaga
gaagcatcgaggaagctgtccccgctgtctgcaagacccggacggtcatttacgagattcctcggagtcaggtcgaccccacgtccgccaacttcctgat
ctggcccccgtgcgtggaggtgaaacgctgcaccggctgctgcaacacgagcagtgtcaagtgccagccctcccgcgtccaccaccgcagcgtcaagg
tggccaaggtggaatacgtccggaagaagccaaaattaaaagaagtccaggtgcggttagaggagcatttggagtgcgcctgcgcgaccacaagcct
gaatccggattatcgggaagaggacacggatgtgcggtga 
 
Secuencia del primer mutagénico 
Secuencia para AGG 
3´CTCGATGCTTCTCTGCTTCCGAATGGGCAGGGGCCGC 5´ Primer reverse 
La parte señalada en amarillo es la sustitución del codón de arginina. 
Secuencia de los primer flanqueadores para el gen PDGF-A 
Los primer flanqueadores propuestos son los siguientes: 
5’ G GAGCTCACGGGGTCCATGCCAC 3´ Primer forward 
3´ GTTGGCGGACGTGGGGTCGAC 5´ Primer reverse 
Las especificaciones de los primer son las siguientes: 
 Primer 5´→ 3´ Primer 3´→ 5´ 
Peso molecular 6721 con 22 pb 6559 con 21 pb 
Tm °C 76.1°C 76.9°C 
Relación GC% 468.2 71.4 
Estructura secundaria Ninguna Débil 
Dimeros de primer No No 
 
Tamaño de los amplicones generados en cada ciclo de PCR 
Primer ciclo de PCR 
En la primera ronda tendrá un tamaño de 77 pb 
 
 
Segundo Ciclo de PCR 
En el segundo ciclo tendrá un tamaño de 158 pb 
 
Descripción de protocolo 
1. Uso del primer flanqueador forward (1) y el Primer mutagénico en la primera ronda de 
PCR. 
2. Se purifica el producto de esta ronda de PCR y se usa como primer en la segunda ronda 
3. En la segunda ronda se usa el primer flanqueador reverse (2) y el megaprimer obtenido 
en la ronda anterior 
4. Se purifica el producto y este contiene ahora la mutación 
 
 
 
Referencias 
Aula virtual de biología molecular (2021) Diseño de primers para la clonacino. YouTube. 
Recuperado de (99) DISEÑO DE PRIMER´S PARA LA CLONACIÓN - YouTube 
Trower, M. (1996) Chapter 18. In Vitro mutageneiss protocol. 
https://www.youtube.com/watch?v=gBcaV5vb0Cs