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WORLD HEALTH ORGANIZATION 
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE 
 
WELTGESUNDHEITSORGANISATION 
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA 
 
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE 
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE 
 
ゑでぎぜごづぞんé だづゎんぞごげんぴごé げがづんゑだだびづんぞぎぞごé 
ぎゑづだぢぎざでとだぎ づぎゎごだぞんずЬぞだぎ ゐùづだ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Análisis de la Presencia de Organismos 
Genéticamente Modificados en Muestras de 
Alimentos 
 
 
 
 
 
Sesión nº 6 
 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
 
 
 
M. Somma, M. Querci 
 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
 
Índice 
 
Sesión nº 6 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
 
 
 
Introducción 3 
 
Componentes, estructura y replicación del ADN 3 
Principios de la PCR 9 
Instrumentación y componentes para la PCR 12 
Diseño de cebadores para la PCR 18 
PCR especializada 22 
La PCR en la práctica 24 
 
Bibliografía 32 
 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 3 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
Introducción 
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus 
colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología molecular y la medicina 
molecular (Saiki et al., 1985). La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica 
in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN 
situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes 
solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un 
único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de 
ejemplares en tan solo unas pocas horas. 
Las técnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos 
comunes, como la clonación de fragmentos específicos de ADN, la detección e 
identificación de genes para diagnóstico y medicina legal, y en la investigación de 
modelos de expresión de los genes. Más recientemente, la PCR ha permitido la 
investigación de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos, 
la presencia de ADN modificado genéticamente y la contaminación microbiológica. 
Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en 
primer lugar a la naturaleza de la molécula del ADN, por lo que en la sección 
siguiente se describen la estructura y la replicación del ADN. 
 
Componentes, estructura y replicación del ADN 
Componentes. Una molécula de ADN consta de dos cadenas en hélice, 
complementarias y antiparalelas, formadas por unidades alternantes de ácido 
fosfórico y desoxirribosa, con uniones transversales de bases púricas y pirimidínicas, 
lo que constituye una estructura helicoidal dextrógira, y lleva la información genética 
codificada en la secuencia de las bases. En las células eucarióticas, la mayor parte 
del ADN se encuentra en el núcleo y se conoce como ADN cromosómico. Está 
separado del resto de la célula (citoplasma) por una membrana de dos capas 
(membrana nuclear). Por otra parte, puede haber ADN extracromosómico en las 
mitocondrias y cloroplastos. 
Los elementos estructurales del ADN, llamados nucleótidos, son los siguientes: 
• dATP, desoxiadenosina-trifosfato; 
• dGTP, desoxiguanosina-trifosfato; 
• dTTP, desoxitimidina-trifosfato; 
• dCTP, desoxicitidina-trifosfato. 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 4 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
Para mayor facilidad, estos cuatro nucleótidos se denominan dNTP (por las siglas en 
inglés de desoxinucleósido-trifosfato). Un nucleótido está formado por tres grandes 
partes: una base púrica (adenina, A, o guanina, G), o una base pirimidínica (citosina, 
C, o timina, T), un azúcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo trifosfato. Como se 
muestra en la figura 1, una base púrica o pirimidínica está unida a un anillo de 
pentosa por un enlace N-glucosídico, y un grupo fosfato está unido al átomo de 
carbono 5' del azúcar por un enlace diéster. En el ácido ribonucleico, ARN, la timina 
está sustituida por el uracilo (U) y la molécula de desoxirribosa por la ribosa. 
 
 
Figura 1. Componentes de los nucleótidos (imagen: Andy Vierstraete, 1999). 
 
 
Estructura. La figura 2 indica cómo forman los nucleótidos una cadena de ADN. El 
ADN se forma uniendo los nucleótidos entre el grupo fosfato de un nucleótido (que 
se sitúa en el átomo de C nº 5 de la molécula de azúcar) y el hidroxilo del átomo de 
C nº 3 de la molécula de azúcar del nucleótido anterior. Para efectuar este enlace, 
se separa un grupo difosfato, con liberación de energía. Los nuevos nucleótidos se 
añaden siempre en el extremo 3’ de la cadena. Como se indica en la figura 3, el 
ADN es bicatenario (excepto en algunos virus) y las dos cadenas o hebras se 
aparean entre sí de forma muy precisa. Cada base de una cadena se aparea con un 
solo tipo de base de la cadena contraria, formando un par de bases (pb): A siempre 
Nucleótido azúcar + fosfato
Desoxiadenosina - 
trifosfato = dATP 
Desoxiguanosina - 
trifosfato = dGTP 
Desoxicitidina - 
trifosfato : dCTP 
Desoxitimidina - 
trifosfato = dTTP 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 5 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
se une con T mediante dos puentes de hidrógeno, y C siempre se une con G 
mediante tres puentes de hidrógeno. De esta manera, las dos cadenas son 
mutuamente complementarias y una de las cadenas puede servir de ADN molde 
para formar la otra. 
 
 
 
Figura 2. Formación de una cadena de ADN a partir de los distintos nucleótidos 
(imagen: Andy Vierstraete, 1999). 
 
Las bases forman un núcleo hidrófobo dentro de la doble hélice. Los azúcares y los 
grupos fosfato (en su forma aniónica) constituyen la capa hidrófila exterior de la 
molécula. En condiciones fisiológicas, la hélice de ADN bicatenario es más estable 
que una hélice de ADN monocatenario. 
 
 
E
x
trem
o
 5
’ 
E
x
trem
o
 3
’ 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 6 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
 
 
 
Figura 3. Estructura del ADN de una célula (imagen: Andy Vierstraete, 1999). 
 
Genoma= total de todos los cromosomas 
Fragmento de cromosoma 
Gen 
Pares de bases de los 
nucleótidos 
Cromosoma 
 Esqueleto de azúcar y fosfato 
 
Puente de hidrógeno 
 
 Base 
 Mitocondria 
Membrana plasmática 
 Retículo endoplásmico 
 Aparato de Golgi 
Citoesqueleto filamentoso 
 Núcleo 
 Lisosoma 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 7 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
 
Replicación. El ADN contiene toda la información genética que define la estructura 
y la función de un organismo. Hay tres procesos diferentes encargados de la 
transmisión de la información genética: 
• replicación; 
• transcripción; 
• traducción. 
Durante la replicación, un ácido nucleico bicatenario se duplica para formar copias 
idénticas. Con este proceso se perpetúa la información genética. Durante la 
transcripción, un segmento de ADN que constituye un gen se lee y se transcribe en 
una secuencia monocatenaria de ARN. El ARN pasa del núcleo al citoplasma. 
Finalmente, durante la traducción, la secuencia de ARN se traduce a una secuencia 
de aminoácidos que forman una proteína (Alberts et al., 1983). 
 
La replicación del ADN es el proceso en que se basa la amplificación por PCR, y se 
va a describir en detalle. 
Durante la replicación, la molécula de ADN se desenrolla y cada cadena se convierte 
en un ADN molde para la síntesis de una cadena complementaria nueva. Cada 
molécula hija, consistente en una cadena nueva y una vieja de ADN, es una copiaexacta de la molécula madre. 
 
 
 
 
Figura 4. La horquilla de replicación. 
 
 
 
Hebra original 
Hebra nueva 
Cebador de ARN 
Hebra adelantada 
Las flechas indican la dirección de 
la replicación del ADN 
Fragmento de Okazaki 
Hebra 
retrasada 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 8 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
Para desenrollar la doble hélice y sintetizar una nueva hebra de ADN hacen falta 
varias enzimas. La topoisomerasa y la helicasa se encargan de desenrollar el ADN 
rompiendo la estructura superenrollada y cortando una sola hebra de ADN. A 
continuación, una primasa (parte de un agregado de proteínas denominado 
primosoma) une un pequeño cebador de ARN al ADN monocatenario, para actuar 
como extremo 3'OH a partir del cual la ADN polimerasa inicia la síntesis. Este 
cebador de ARN es eliminado finalmente por la ribonucleasa H y el hueco se rellena 
mediante la ADN polimerasa I. En esta fase, la ADN polimerasa avanza a lo largo de 
una molécula monocatenaria de ADN (una hebra sencilla), recogiendo dNTP libres 
para unirlos mediante puentes de hidrógeno a los dNTP complementarios situados 
en dicha hebra sencilla de ADN (A con T y G con C), y mediante un enlace 
fosfodiéster covalente al nucleótido anterior de la propia hebra nueva. La energía 
conservada en el trifosfato se utiliza para unir covalentemente cada nuevo nucleótido 
a la segunda hebra en crecimiento. Hay diferentes formas de ADN polimerasa, pero 
es la ADN polimerasa III la que se encarga de la síntesis progresiva de nuevas 
hebras de ADN. La ADN polimerasa actúa solo desde el extremo 5’ hacia el 3’. 
Como una de las hebras de la doble hélice tiene el sentido 5’-3’ y la otra el 3’-5’, la 
ADN polimerasa sintetiza una segunda copia de la hebra 5’-3’ (hebra retrasada) a 
tramos (fragmentos de Okazaki) (Ogawa y Okazaki, 1980). La síntesis de las nuevas 
copias de la hebra 5’-3’ se muestra en la figura 4. La otra hebra, la hebra 
adelantada, puede avanzar directamente con la síntesis, desde el extremo 5' al 3', 
según se va desenrollando la hélice. La ADN polimerasa no puede empezar la 
síntesis ex novo a partir de una hebra sencilla desnuda, sino que necesita la 
presencia de un cebador con un grupo 3’OH libre al que pueda unir un dNTP. 
Una ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo 3’OH y 
un 5’fosfato, libres y adyacentes. Así puede rellenarse el hueco que queda cuando 
se elimina el cebador de ARN. Ha de señalarse la importancia de la presencia de 
proteínas de unión a ADN monocatenario para mantener la estabilidad de la 
horquilla de replicación. El ADN monocatenario es muy lábil, o inestable, y estas 
proteínas se unen a él mientras es monocatenario, protegiéndolo así de la 
degradación. 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 9 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
Principios de la PCR 
La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN 
bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a 
enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de: 
• desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el 
ADN bicatenario en ADN monocatenario; 
• unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN 
diana; 
• extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los 
cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones 
Mg2+. 
 
Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, 
que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que 
flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de 
desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador 
constituyen un «ciclo» del método de amplificación por PCR. La figura 5 ilustra las 
tres fases principales del proceso de amplificación por PCR. 
 
 
Figura 5. Fases de la amplificación por PCR (imagen: Andy Vierstraete, 1999). 
 
30-40 ciclos de 3 fases 
 
 Fase 1: desnaturalización
 
 Fase 2: unión 
Cebadores directos 
e inversos 
 
 Fase 3: extensión 
Sólo dNTPs
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 10 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
 
Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde 
para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta 
reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen 
definidos por los extremos 5’ de los oligonucleótidos cebadores y cuya longitud viene 
dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de 
amplificación efectiva son moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas 
longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unión de los dos 
cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de ADN de 
longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de 
amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción. Así, la 
amplificación, que es el número final de ejemplares de la secuencia diana, se 
expresa con la siguiente ecuación: 
 (2n-2n)x (1) 
donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto 
obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo 
ciclo con longitud indefinida, x es el número de ejemplares del ADN molde original. 
Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220 veces, 
suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una 
PCR varía de un ADN molde a otra y depende del grado de optimización que se 
haya conseguido. 
En los párrafos siguientes se encuentra una descripción pormenorizada de las tres 
fases de la amplificación por PCR (desnaturalización del ADN molde, anillamiento 
del cebador y extensión) (Sambrook et al., 1989). 
 
 
gen deseado 
ADN plantilla 
1er ciclo 
2° ciclo 
3er ciclo 
4° ciclo
35° ciclo
68000 millones de 
ejemplares 4 8 16 32 
ejemplares ejemplares ejemplares ejemplares 
 
Figura 6. La amplificación exponencial del ADN mediante PCR. 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 11 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
Desnaturalización del ADN molde 
 
Durante la desnaturalización, la hebra doble se funde, abriéndose para dar ADN 
monocatenario, y se detienen todas las reacciones enzimáticas (es decir, la 
extensión de un ciclo anterior). Las dos cadenas complementarias se separan por el 
aumento de la temperatura, lo que se denomina desnaturalización. Para obtener la 
desnaturalización del ADN, la temperatura suele aumentarse hasta unos 93 - 96°C. 
De esta manera se rompen los fuertes puentes de H y aumenta el número de bases 
desapareadas. La reacción se completa cuando todo el ADN bicatenario se 
convierte en monocatenario. La temperatura a la que la mitad del ADN bicatenario 
ha pasado a monocatenario se denomina temperatura de fusión, Tf. El proceso de 
desnaturalización depende del tipo de disolvente, de la concentración salina y del pH 
utilizado; por ejemplo, la temperatura de fusión desciende al bajar la concentración 
salina, al subir el pH y en presencia de disolventes orgánicos como el formaldehído. 
El valor de la Tf también se puede ver afectado por la concentración de G/C y T/A. 
La Tf de una estructura de ADN que contiene una elevada proporción de G/C es más 
alta que la de un ADN más rico en T/A. Por ejemplo, Serratia marcescens tiene 
aproximadamente un 60 % de G/C y una Tf de unos 94 °C, mientras que 
Pneumococcus tiene aproximadamente un 40 % deG/C y una Tf de unos 85 °C. 
Anillamiento del cebador 
La unión o rehibridación de las hebras de ADN se efectúa a una temperatura inferior 
(generalmente, entre 55 y 65 ºC). Una vez se ha reducido la temperatura, las dos 
hebras complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una 
molécula de ADN bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven libremente y 
es continua la formación y la ruptura de puentes de hidrógeno entre el cebador 
monocatenario y el ADN molde también monocatenaria. Los enlaces más estables 
duran un poco más (los cebadores que se corresponden exactamente con el ADN 
molde) y es en ese pequeño fragmento de ADN bicatenario (ADN molde con 
cebador) donde puede fijarse la polimerasa y empezar a copiar el ADN molde. 
Cuando se han introducido unas cuantas bases, el enlace iónico entre el ADN molde 
y el cebador es tan fuerte que ya no se rompe. 
Extensión del cebador 
En esta fase, los cebadores se extienden a lo largo de la secuencia diana utilizando 
una ADN polimerasa termoestable (frecuentemente se trata de la ADN Taq 
polimerasa) en presencia de dNTP, lo que produce la duplicación del material diana 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 12 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
inicial. La temperatura de trabajo ideal para la ADN polimerasa Taq es de 72 ºC. 
Cuando los cebadores se han extendido unas cuantas bases, ejercen una atracción 
iónica más fuerte sobre el ADN molde, lo que reduce la probabilidad de que se 
invierta el proceso. Los cebadores que no se corresponden exactamente se vuelven 
a soltar (debido a la temperatura elevada) y no dan lugar a la extensión del 
fragmento. Las bases (complementarias del ADN molde) se unen al cebador en el 
extremo 3’ (la polimerasa añade dNTP desde 5’ hacia 3’, leyendo el ADN molde 
desde 3’ hacia 5’). La duración del tiempo necesario para las fases de extensión del 
cebador puede aumentar si es larga la región de ADN que se va a amplificar; sin 
embargo, en la mayoría de experimentos de PCR es suficiente un tiempo de 1 min 
para conseguir una extensión completa. 
Instrumentación y componentes para la PCR 
Instrumentos 
 
El proceso de la PCR ha podido automatizarse gracias a dos importantes avances: 
a) el uso de ADN polimerasas termoestables, que resisten a la inactivación a 
temperaturas elevadas; así pues, es posible que una alícuota inicial de 
polimerasa se mantenga a lo largo de muchos ciclos del protocolo; 
b) el desarrollo de baños termostatizados que pueden subir y bajar rápidamente su 
temperatura de forma automatizada y programada; se denominan 
termocicladores o máquinas de PCR. 
Se utilizan diversos diseños de termocicladores como, por ejemplo, calentamiento y 
refrigeración por fluidos, calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por 
fluidos, y calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por semiconductores. 
En la figura 7 se muestra un perfil típico de los ciclos de temperatura de un protocolo 
de tres fases. 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 13 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
 
Figura 7. Perfil de ciclos de temperatura de la PCR. 
 
Para que la PCR tenga éxito son fundamentales los parámetros ya mencionados de 
los ciclos térmicos, en sus fases de desnaturalización, anillamiento del cebador y 
extensión del cebador, así como los componentes utilizados y el número de ciclos 
descritos en los párrafos siguientes. 
 
ADN diana 
 
En principio puede efectuarse la amplificación por PCR si está presente al menos un 
ejemplar intacto del gen diana. Si el número de ejemplares del gen diana es mayor, 
también lo será la probabilidad de que tenga éxito la amplificación del ADN. 
Cualquier alteración, como una muesca en el ADN diana, puede bloquear la 
amplificación por PCR. El tamaño de la secuencia diana puede variar entre < 0,1 y 
unas cuantas kilobases. La cantidad total de ADN utilizada normalmente para la 
PCR está entre 0,05 y 1,0 µg, lo que permite la detección de ejemplares solos de la 
secuencia diana. Aunque las muestras no tienen que estar muy purificadas, sí es 
necesario eliminar algunos contaminantes, como la heparina, el formol, los agentes 
quelantes de Mg2+ o los detergentes, para evitar que inhiban el proceso de 
amplificación. 
 
Cebadores 
 
Generalmente se utilizan cebadores de 16 a 30 nucleótidos de longitud, lo que 
permite que la temperatura de anillamiento sea razonablemente elevada. Los 
cebadores no deben tener tramos de secuencias con una polibase (p. ej., poli-dG) ni 
Fase 1 : 
Desnaturalización de la ADN
Un « ciclo » 
Minutos 
 
 
 
 T
em
p
er
at
u
ra
 (
°C
) 
Fase 3 : 
Extensión 
del cebador 
Fase 2 : 
Hibridación del 
cebador 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 14 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
motivos repetidos, ya que podrían hibridarse de forma inadecuada con el ADN 
molde. Deben evitarse las secuencias repetidas invertidas, a fin de prevenir la 
formación de estructuras secundarias del cebador, que impedirían su hibridación con 
el ADN molde. También deben evitarse las secuencias complementarias de otros 
cebadores utilizados en la PCR, para prevenir la hibridación entre cebadores o la 
formación de dímeros de cebadores (esto es especialmente importante en relación 
con el extremo 3’ del cebador). Siempre que sea posible, conviene que el extremo 3’ 
del cebador tenga gran proporción de bases G y C para aumentar la hibridación del 
extremo que se quiere extender. La distancia entre cebadores debe ser inferior a 10 
kb en longitud. Normalmente se observa una importante reducción del rendimiento 
cuando los cebadores se encuentran a más de unos 3 kb de distancia entre sí. La 
concentración usual de oligonucleótidos para la PCR es de 1 µM. Esto resulta 
suficiente para al menos 30 ciclos de amplificación. La presencia de oligonucleótidos 
a una concentración superior puede provocar la amplificación no deseada de 
secuencias distintas de la diana. Por el contrario, la PCR no es eficaz si la 
concentración del cebador es limitante. 
 
ADN polimerasa 
 
El método original de PCR utilizaba el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de 
E. coli (Saiki et al., 1985). Sin embargo, esta enzima se desnaturaliza a 
temperaturas inferiores a las necesarias para desnaturalizar la mayoría de ADN 
molde bicatenario. Así pues, en los primeros experimentos era necesario añadir más 
enzima a la reacción tras cada ciclo. Por otra parte, había que trasladar las muestras 
desde un baño a una temperatura hasta otro a otra temperatura para permitir el 
desarrollo de las distintas fases de desnaturalización, anillamiento y polimerización. 
Evidentemente, el uso de una ADN polimerasa termorresistente ha facilitado el 
proceso porque ha dejado de ser necesario añadir enzimas tras cada fase de 
desnaturalización. En principio, las ADN polimerasas solo pueden incorporar 
nucleótidos al extremo 3’ de un polinucleótido. La primera ADN polimerasa 
termoestable utilizada fue la ADN polimerasa Taq, aislada de la bacteria Thermus 
aquaticus (Saiki et al., 1988). Aunque esta enzima es probablemente la más utilizada 
a efectos de la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN 
polimerasas. En el cuadro 1 se recogen las propiedades de algunas ADN 
polimerasas termoestables que se utilizan actualmente para la PCR (Newton y 
Graham, 1994). 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 15 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
 
Cuadro 1. Características de algunas ADN polimerasas utilizadas para la PCR. 
 
 
Taq/ 
AmpliTaq 
Vent 
Deep- 
Vent 
Pfu Tth UITma 
Fuente 
Thermus 
aquaticus 
Thermo-
coccus 
litoralis 
PyrococcusGB-D 
Pyrococcus 
furiosus 
Thermus 
thermophilus 
Thermotoga 
maritima 
 
Aplicación 
Taq: natural 
AmpliTaq: 
para 
ingeniería 
genética 
Para 
ingeniería 
genética 
Para 
ingeniería 
genética 
Natural 
Para 
ingeniería 
genética 
Para 
ingeniería 
genética 
T½ de actividad 
a 95 ºC (min) 
40 1380 400 >120 20 > 50
a 
Actividad 
exonucleásica 
de 5’ a 3’ 
 
Sí 
 
No 
 
No 
 
No 
 
Sí 
 
No 
Actividad 
exonucleásica 
de 3’ a 5’ 
 
No 
 
Sí 
 
Sí 
 
Sí 
 
No 
 
Sí 
Procesividad 50-60 ? 7 ? 30-40 ? 
Velocidad de 
extensión 
(nt/s) 
75 ? >80 60 >33 ? 
Extremos de 
ADN 
resultantes 
3’A 
> 95 % 
romos 
> 95 % 
romos 
? 3’A Romos 
PM en kDa 94 ? ? 92 94 70 
 
ADN polimerasa Taq/AmpliTaq. Como ya se ha indicado, esta enzima se aisló de 
la bacteria Thermus aquaticus que vive en una fuente caliente del parque nacional 
de Yellowstone, de EE.UU., a temperaturas próximas a los 85 ºC. La temperatura 
óptima de funcionamiento de esta enzima es de 70 a 80 ºC, a la que la bacteria 
sintetiza ADN a la velocidad de 35 – 100 nucleótidos/segundo. Se conoce como 
procesividad el número medio de nucleótidos que incorpora una enzima al ADN 
antes de separarse del ADN molde. La ADN polimerasa AmpliTaq es un enzima 
modificada genéticamente expresada por E. coli. Como AmpliTaq es recombinante, 
su pureza y reproducibilidad son superiores a las del tipo silvestre. Sin embargo, es 
posible que durante la amplificación del ADN se produzca contaminación con 
algunas secuencias homólogas de E. coli. En tal caso, se recomienda el uso de una 
ADN polimerasa que no se haya expresado con E. coli como organismo hospedador. 
Tanto la ADN polimerasa Taq como la AmpliTaq poseen actividad exonucleásica de 
5’ a 3’, con lo que eliminan nucleótidos por delante de la cadena en crecimiento. 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 16 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma. Estas enzimas tienen actividad 
exonucleásica de 3’ a 5’, que les permite eliminar los residuos mal apareados hasta 
que se forme un extremo con bases correctamente unidas. Sin embargo, la actividad 
exonucleásica de 3’ a 5’ puede provocar la degradación de los cebadores. Por tanto, 
la enzima solo debería añadirse una vez iniciada la reacción, o bien habría que 
utilizar cebadores modificados químicamente. 
 
ADN polimerasa AmpliTaqGold. Esta enzima consiste en una ADN polimerasa 
AmpliTaq, inactiva a temperatura ambiente, y que solo puede activarse durante un 
periodo de incubación a 94 ºC. En este caso, el programa del termociclador debe 
incluir un tiempo de pre-incubación a la temperatura de 92 – 95 ºC. En caso de PCR 
con liberación gradual es posible suprimir el tiempo de pre-incubación, pero deben 
efectuarse al menos 10 ciclos más que con la PCR clásica. 
 
Tampones de reacción y MgCl2 en las PCR 
 
Además de los reactivos que participan directamente en la reacción, la PCR necesita 
un tampón adecuado, cuya composición depende del tipo y de las características de 
la enzima utilizada. La mayoría de los proveedores proporcionan normalmente un 
tampón 10x para utilizarlo con la enzima respectiva. El tampón de reacción más 
común utilizado con la ADN polimerasa Taq/AmpliTaq contiene: 
• Tris 10 mM, pH 8,3 
• KCl 50 mM 
• MgCl2 1,5-2,5 mM. 
 
En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes. La concentración de 
MgCl2 en la mezcla final de reacción suele estar entre 0,5 y 5,0 mM, y la 
concentración óptima se determina empíricamente (Innis y Gelfand, 1990). 
Los iones Mg2+: 
• forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la 
incorporación de estos; 
• estimulan la actividad polimerásica; 
• aumentan la Tf de la interacción cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la 
interacción entre las dos cadenas). 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 17 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
Generalmente, una concentración baja de Mg2+ provoca un rendimiento bajo (o 
incluso nulo), mientras que una concentración elevada de Mg2+ hace que se 
acumulen productos inespecíficos (errores de cebado). Es importante evitar que en 
la solución de ADN molde haya una concentración elevada de agentes quelantes, 
como el EDTA, o de grupos iónicos con carga negativa, como el fosfato. En la 
bibliografía actual se encuentran discusiones sobre diversos tampones y 
suplementos de la PCR, como el DMSO, el PEG 6000, la formamida, el glicerol, la 
espermidina y los detergentes no iónicos, utilizados para aumentar la especificidad o 
el rendimiento de la reacción (Roux, 1995). Efectivamente, algunas ADN 
polimerasas alcanzan su nivel óptimo de actividad solo en presencia de tales 
suplementos (Rolfs et al., 1992). 
 
Desoxirribonucleósido-trifosfatos 
 
Para la síntesis de ADN hacen falta desoxirribonucleósido-trifosfatos libres (dNTP). 
La concentración de cada uno de los dNTP para la PCR debe estar entre 20 y 
200 µM, y los cuatro dNTP deben utilizarse a concentraciones equivalentes para 
minimizar los errores de incorporación (Innis et al., 1988). Hay varios fabricantes que 
suministran dNTP de elevada pureza, bien como soluciones madre de cada uno de 
los dNTP o bien como mezcla de los cuatro dNTP. Las soluciones madre de dNTP 
(generalmente 100 mM) se deben ajustar a un pH de 7,0-7,5 con Na OH 1 M para 
garantizar que el pH de la reacción final no baja de 7,1 (Sambrook et al., 1989); sin 
embargo, ahora se suministran muchas soluciones madre de dNTP con el pH ya 
ajustado. 
 
Número de ciclos y efecto de meseta 
 
El número de ciclos de amplificación necesarios para producir una banda visible en 
un gel depende mucho de la concentración inicial del ADN diana. A fin de amplificar 
50 moléculas diana se recomienda hacer entre 40 y 45 ciclos, mientras que para 
amplificar 3x105 moléculas hasta la misma concentración es suficiente con entre 20 y 
30 ciclos (Innis y Gelfand, 1990). Esta falta de proporcionalidad se debe al efecto 
denominado de meseta, que es la atenuación de la velocidad exponencial de 
acumulación del producto en las últimas etapas de una PCR, cuando el producto 
alcanza la concentración de 0,3-1,0 nM. Puede deberse a una degradación de los 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 18 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
reactivos (dNTP, enzima), agotamiento de los reactivos (cebadores o dNTP: lo 
primero con productos cortos y lo segundo con productos largos), inhibición por el 
producto final (formación de pirofosfato), competencia por los reactivos por parte de 
productos inespecíficos, competencia por la unión con el cebador mediante nueva 
hibridación del producto concentrado (10 nM) (Innis y Gelfand, 1990). Si no se 
obtiene el producto deseado tras 30 ciclos, debe tomarse una pequeña muestra (1 
µl) del producto amplificado, la cual se mezclará y volverá a amplificar durante 20 o 
30 ciclos en una nueva mezcla de reacción, en lugar de prolongar la tanda haciendo 
más ciclos. En algunos casos en que es limitante la concentración del ADN molde, 
esta nueva amplificación puede proporcionar un buen producto, mientras que la 
extensión de los ciclos a más de 40 no lo hace. 
 
 
Diseño de cebadores para la PCR 
Es posible que el parámetro más crítico para tener éxito con la PCR sea el diseño de 
los cebadores. A igualdad de todos los demás factores, un cebador mal diseñado 
puede hacer que fracase una PCR. La secuencia del cebador determina varios 
aspectos, como la posición y la longitud del producto, su temperatura de fusión y 
finalmente el rendimiento (Innis y Gelfand, 1994). Un cebador mal diseñado puede 
hacer que se consiga poco producto o incluso ninguno, debido a una amplificación 
inespecífica o a la formación de dímeros decebador, lo que puede llegar a competir 
con la formación de producto hasta suprimirla. El objetivo de la presente nota de 
aplicación es dar normas que deben seguirse en el diseño de cebadores para la 
PCR. En otras publicaciones puede encontrarse un tratamiento más completo de 
este tema (Dieffenbach et al., 1995). 
 
Selección del cebador 
 
Al diseñar cebadores para PCR hay que tener en cuenta diversas variables. Entre 
ellas cabe destacar: 
• la longitud del cebador; 
• la temperatura de fusión (Tf); 
• la especificidad; 
• las secuencias complementarias del cebador; 
• el contenido de G/C y los tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G); 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 19 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
• la secuencia del extremo 3’. 
En las secciones siguientes se habla de cada uno de estos elementos críticos. 
 
Longitud del cebador 
 
Dado que la especificidad, la temperatura y el tiempo de hibridación dependen en 
parte de la longitud del cebador, este parámetro es crítico para que tenga éxito la 
PCR. En general, los oligonucleótidos que tienen entre 18 y 24 bases presentan una 
especificidad extrema de secuencia, siempre que la temperatura de hibridación sea 
óptima. La longitud del cebador también influye en la eficacia de la hibridación. En 
general, cuanto más largo sea el cebador, menos eficaz será la hibridación. Al 
cebarse menos ADNs moldes en cada fase, esto puede hacer que disminuya de 
forma significativa la cantidad de producto amplificado. No obstante, los cebadores 
tampoco deben ser demasiado cortos, salvo que la aplicación lo exija 
específicamente. Como se comenta más abajo, el objetivo debe ser diseñar un 
cebador con una temperatura de anillamiento de al menos 50 ºC. 
La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es una de las 
«cajas negras» de la PCR. Una regla empírica general es utilizar una temperatura de 
hibridación inferior en 5 ºC a la temperatura de fusión. Con frecuencia es posible que 
la temperatura de hibridación determinada de esta forma no sea óptima y haya que 
efectuar experimentos de tanteo para determinar la verdadera temperatura óptima. 
La manera más fácil de hacerlo es con un termociclador de gradiente. 
 
Temperatura de fusión (Tf) 
 
Es importante no olvidar que son dos los cebadores que se añaden a una PCR en 
relación con un sitio o diana. Los dos cebadores oligonucleotídicos deben diseñarse 
de forma que tengan temperaturas de fusión similares. Si los cebadores no se 
ajustan bien en cuanto a su Tf, la amplificación será menos eficaz o incluso podrá no 
darse en absoluto, ya que el cebador con la Tf más elevada funcionará mal a 
temperaturas más bajas y es posible que el cebador con la Tf más baja no trabaje a 
temperaturas más elevadas. La forma más precisa de calcular las temperaturas de 
fusión de los oligonucleótidos es utilizar cálculos termodinámicos del vecino más 
próximo con la fórmula: 
 
Tf
cebador = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] -273,15°C + 16,6 log 10 [K+] (2) 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 20 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
 
donde H es la entalpía y S es la entropía de la formación de la hélice, R es la 
constante molar de los gases y c es la concentración de los cebadores. 
La forma más fácil de hacerlo es con paquetes de programas informáticos de 
diseños de cebadores que existen en el mercado (Sharrocks, 1994). 
Afortunadamente, con la fórmula siguiente puede calcularse una buena 
aproximación de trabajo de este valor (válido generalmente para oligonucleótidos de 
entre 18 y 24 bases): 
 
Tf = 2(A+T) + 4(G+C) (3) 
 
donde A, T, G y C son las bases púricas y pirimidínicas. 
El cuadro 2 muestra los valores correspondientes a cebadores de diversas 
longitudes que se han calculado mediante esta ecuación (denominada fórmula de 
Wallace) y suponiendo un contenido de GC del 50 % (Suggs et al., 1981). 
 
Cuadro 2. Cálculo de la longitud de los cebadores con la ecuación de Wallace. 
 
 
Longitud del 
cebador 
 
Tf = 2(A+T) + 4(G+C) 
 
 
Longitud del 
cebador 
 
Tf = 2(A+T) + 4(G+C) 
4 12°C 22 66°C 
6 18°C 24 72°C 
8 24°C 26 78°C 
10 30°C 28 84°C 
12 36°C 30 90°C 
14 42°C 32 96°C 
16 48°C 34 102°C 
18 54°C 36 108°C 
20 66°C 38 114°C 
 
Las temperaturas calculadas según la fórmula de Wallace son imprecisas en los 
extremos de este cuadro. Al calcular las temperaturas de fusión de los cebadores, 
ha de velarse por que la temperatura de fusión del producto sea suficientemente 
baja como para obtener el 100 % de fusión a 92 ºC. Este parámetro ayuda a 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 21 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
conseguir una PCR más eficaz, aunque no siempre es necesario para que la PCR 
tenga éxito. En general, los productos que tienen entre 100 y 600 pares de bases se 
amplifican de forma eficaz en muchas PCR. En caso de duda, la Tf del producto 
puede calcularse con la fórmula siguiente: 
 
Tf =81,5 + 16,6 (log10 [K+] + 0,41 (% G+C)-675/longitud (4) 
 
Especificidad 
 
Como ya se ha indicado, la especificidad del cebador depende al menos 
parcialmente de su longitud. Es evidente que hay muchos más oligonucleótidos 
distintos con 24 bases que con 15. Dicho esto, los cebadores han de elegirse de 
forma que tengan una secuencia única dentro del ADN molde que debe amplificarse. 
Un cebador diseñado con una secuencia muy repetitiva dará como resultado un 
borrón al amplificar ADN genómico. Sin embargo, el mismo cebador puede dar una 
sola banda si se amplifica un solo clon de una genoteca. Como la ADN polimerasa 
Taq es activa en una amplia banda de temperaturas, la extensión del cebador se 
producirá a las temperaturas inferiores de hibridación. Si la temperatura es 
demasiado baja, podrá darse un cebado inespecífico, que podrá ser extendido por la 
polimerasa si hay una corta homología en el extremo 3’. En general, los mejores 
resultados se obtienen con una temperatura de fusión de 55 a 72 ºC (lo que 
corresponde a una longitud del cebador de entre 18 y 24 bases, según la regla de 
Wallace). 
 
Secuencias complementarias del cebador 
 
Es absolutamente necesario que el diseño de los cebadores no incluya ninguna 
homología interna del cebador de más de 3 pares de bases. Si un cebador tiene 
alguna de estas zonas de auto-homología, pueden formarse estructuras con 
cambios bruscos u horquillas, parcialmente bicatenarias, capaces de interferir con la 
hibridación al ADN molde. Otro peligro relacionado es la homología entre cebadores. 
Una homología parcial en las regiones centrales de dos cebadores puede interferir 
con la hibridación. Si la homología se produce en el extremo 3’ de cualquiera de los 
cebadores, pueden formarse dímeros de cebadores, que en general impiden la 
formación del producto deseado por un mecanismo de competencia. 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 22 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
 
Contenido de G/C y tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G) 
 
La composición de bases de los cebadores debe ser de entre un 45 y un 55 % de 
GC. La secuencia del cebador debe elegirse de forma que no haya tramos de poli-G 
ni poli-C que puedan favorecer la hibridación inespecífica. También deben evitarse 
los tramos de poli-A y poli-T, ya que pueden «respirar» y abrir tramos del complejo 
cebador-ADN molde, lo que puede reducir la eficacia de la amplificación. También 
deben evitarse los tramos de polipirimidina (T, C) y polipurina (A, G). Lo ideal es que 
el cebador tenga una mezcla casi aleatoria de nucleótidos, un contenido de GC del 
50 % y una longitud aproximada de 20 bases. De esta manera, la Tf estaráen la 
banda de 56 – 62 ºC (Dieffenbach et al., 1995). 
 
Secuencia del extremo 3’ 
 
Se ha visto claramente que la posición terminal 3' de los cebadores de la PCR es 
fundamental para evitar errores de cebado. Ya se ha explorado el problema de las 
homologías de cebadores en estas regiones. Otra variable importante es la inclusión 
de un residuo de G o C en el extremo 3’ de los cebadores. Este «cepo de GC» 
contribuye a que sea correcta la unión en el extremo 3’, debido a la mayor fortaleza 
del puente de hidrógeno de los residuos de G/C. Esto también ayuda a mejorar la 
eficacia de la reacción por minimizar las eventuales aberturas que pudiera haber. 
 
PCR especializada 
Además de la amplificación de una secuencia diana de ADN por los procedimientos 
normales de PCR que se han descrito, se han desarrollado varios tipos 
especializados de PCR para aplicaciones específicas. 
 
PCR anidada 
 
Pueden utilizarse conjuntos anidados de cebadores para mejorar el rendimiento de 
la PCR de la secuencia diana de ADN (Newton y Graham, 1994). La PCR con 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 23 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
cebadores anidados se efectúa haciendo entre 15 y 30 ciclos con un primer conjunto 
de cebadores y después otros 15 a 30 ciclos con un segundo conjunto de cebadores 
respecto a una región interna del producto de ADN amplificado en primer lugar. Así 
pues, el fragmento más largo producido en la primera ronda de PCR se utiliza como 
ADN molde para la segunda PCR. El método de PCR anidada puede aumentar 
espectacularmente la sensibilidad y la especificidad de la amplificación del ADN. 
Mejora particularmente la especificidad porque esta técnica elimina casi siempre los 
eventuales productos de amplificación inespecíficos que perturban el proceso. Esto 
se debe a que tras la primera ronda de PCR es poco probable que los eventuales 
productos inespecíficos sean suficientemente complementarios de los cebadores 
anidados y puedan servir de ADN molde para la amplificación posterior, y así lo que 
se amplifica preferentemente es la secuencia diana. No obstante, un inconveniente 
de esta extrema sensibilidad es el mayor riesgo de contaminación, y deben 
extremarse las precauciones cuando se realiza esta PCR, sobre todo en un 
laboratorio de diagnóstico. 
 
PCR Múltiplex 
 
Mientras que la PCR normal utiliza en general un solo par de cebadores para 
amplificar una secuencia específica, la PCR Múltiplex utiliza múltiples pares de 
cebadores para amplificar muchas secuencias simultáneamente. La presencia de 
muchos cebadores de PCR en un solo tubo puede causar muchos problemas, como 
el aumento de la formación de productos de PCR con errores de cebado, dímeros de 
cebadores y la discriminación de la amplificación de fragmentos más largos de ADN 
(Atlas y Bey, 1994). 
Para este tipo de amplificación por PCR, se eligen cebadores con temperaturas de 
hibridación similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser 
similares; si hay grandes diferencias entre las longitudes de los ADN diana se 
favorece la amplificación de la diana más corta respecto a la más larga, lo que 
implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. Por otra parte, 
los tampones de PCR Múltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que 
reduce la competencia entre amplicones y la discriminación de fragmentos más 
largos de ADN durante la PCR Múltiplex. 
Los productos de la PCR Múltiplex pueden seguir hibridándose con una sonda 
específica del gen con fines de verificación. 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 24 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
La PCR en la práctica 
Como ya se ha visto en secciones anteriores, la utilización de la PCR está muy 
difundida porque se trata de una técnica potente de análisis y preparación. No 
obstante, dada la naturaleza de este procedimiento, es posible que cantidades traza 
de ADN contaminante sirvan de ADN molde, lo que provocaría la amplificación de un 
ácido nucleico distinto del diana (falsos positivos). Así pues, resulta fundamental 
realizar la amplificación por PCR en un entorno libre de ADN. El riesgo de 
contaminación se reduce si se dispone de zonas de trabajo físicamente separadas y 
dotadas de su propio material. El requisito previo más importante para reducir al 
mínimo la tasa de falsos resultados positivos es el cumplimiento estricto de las 
normas de descontaminación (descontaminación de ácidos nucleicos, prevención de 
la formación de aerosoles, etc.). La contaminación de la PCR puede deberse a 
fuentes diversas, como las siguientes: 
• mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con 
preparados anteriores de ADN, o con fragmentos de restricción purificados; 
• contaminación cruzada entre muestras; 
• productos de amplificaciones anteriores por PCR. 
Esta sección recoge algunas recomendaciones, con el fin de definir los requisitos 
normales para el establecimiento y mantenimiento de un entorno limpio para 
cualquier sistema de ensayo con PCR, independientemente del número de muestras 
tratadas (Roth et al., 1997). 
 
Métodos físicos de prevención 
 
Instalaciones de los laboratorios. Para evitar la contaminación, debe disponerse 
de zonas de trabajo separadas físicamente de la forma siguiente: 
1. Zona de preparación de muestras 
Esta sala consiste de una zona en que se efectúan todas las fases previas a la 
amplificación del ADN molde (p. ej., aislamiento y purificación del ADN). 
2. Sala de disposición de la PCR 
Esta sala «limpia» se dedica a los procesos de preparación de la PCR en sí (p. 
ej., mezcla maestra, diluciones de cebadores, etc.). 
3. Zona post-PCR 
Esta zona se reserva a la amplificación de la secuencia del ADN diana, y a la 
detección y análisis de los productos de la PCR. 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 25 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
Por otra parte, han de seguirse las normas generales siguientes: 
• Todas las salas deben contener su propio material (batas, guantes, reactivos y 
suministros). 
• Los reactivos y demás material deben etiquetarse con el nombre del contenido y 
la fecha de preparación. 
• Ha de utilizarse un sistema de flujo unidireccional, es decir, nunca se han de 
trasladar materiales, muestras ni equipos de las zonas post-PCR a lugares pre-
PCR. 
• Deben utilizarse tubos de reacción para PCR desechables, libres de 
desoxirribonucleasa y de ribonucleasa. 
• Han de utilizarse puntas de pipeta especiales, que impidan la formación de 
aerosoles, y los juegos de pipetas serán exclusivos (se utilizarán solo para la 
PCR) y, de preferencia, del tipo de desplazamiento positivo. 
• Siempre que sea posible, prepárese la PCR en una campana extractora dotada 
de luz UV. En la campana extractora hay de poner una microcentrifuga y guantes 
desechables que se utilizarán exclusivamente para la PCR. 
• Las mesas y estantes se lavarán periódicamente con lejía al 10 %, seguida de 
etanol al 70 %. 
 
Manipulación de las muestras 
 
• Utilícense técnicas estériles y llévense puestos guantes recientes siempre que se 
trabaje en las zonas antes descritas. Hay que cambiarse de guantes con 
frecuencia, sobre todo si se sospecha que se han contaminado con soluciones 
que contengan ADN molde. 
• Para preparar los reactivos de la PCR y el ADN molde han de utilizarse siempre 
materiales de vidrio, de plástico y pipetas nuevos o esterilizados. 
• Pasar por autoclave todos los reactivos y soluciones que puedan sufrir este 
tratamiento sin que se vean afectadas sus propiedades. Por supuesto, no deben 
pasar por autoclave los cebadores, los dNTP ni la ADN Taq polimerasa. 
• Debe disponerse de un conjunto propio de reactivos y soluciones de PCRque 
solo se utilizarán con este fin, y dichos reactivos se almacenarán en pequeñas 
cantidades. 
• Cuando se pipetea el ADN, ha de evitarse la formación de aerosoles que puedan 
transportar contaminantes. 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 26 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
• Siempre han de efectuarse reacciones de control, como por ejemplo un control 
negativo («sin ADN»), que contenga todos los componentes de la reacción 
excepto el ADN molde, y un control positivo que se haya utilizado con éxito en 
PCR anteriores. 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 27 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
Métodos bioquímicos de prevención 
 
Uracil-ADN glucosilasa. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede 
amplificar una sola molécula más de mil millones de veces. Así, es posible amplificar 
una cantidad incluso minúscula de un contaminante, lo que daría lugar a un falso 
positivo. Tales contaminantes suelen ser productos de anteriores amplificaciones por 
PCR (contaminación por arrastre). Por tanto, se han elaborado métodos para evitar 
esta contaminación. 
Una estrategia frecuente es sustituir el dTTP por dUTP durante la amplificación por 
la PCR, para formar ADN que contenga uracilo (U-ADN) (Longo et al., 1990). El U-
ADN contaminante de la muestra se eliminará tratando las mezclas de PCR 
posteriores con uracil-ADN glucosilasa (UNG) antes de la amplificación por PCR y 
descomponiendo después los polinucleótidos pirimidínicos a temperatura elevada 
(95 ºC) en condiciones alcalinas (durante la fase de desnaturalización inicial) (véase 
la figura 8). 
 
 
 
 
 
Figura 8. Reacción de la uracil-ADN glucosilasa. 
 
Por supuesto, este método exige que todas las PCR del laboratorio se realicen con 
dUTP en lugar de con dTTP. 
Ha de tenerse en cuenta lo siguiente cuando se utilicen productos de PCR que 
contengan dU en aplicaciones posteriores: 
A=Adenina 
U=Uracilo 
G=Guanina 
Calor 
─► 
pH alcalino 
 
Uracil-
ADN 
─► 
Glucosilasa 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 28 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
• los productos de PCR que contienen dU funcionan tan bien como los que 
contienen dT cuando se utilizan como dianas de hibridación o como ADN moldes 
para la técnica del didesoxi; 
• los productos de PCR que contienen dU pueden clonarse directamente si se 
transforman en hospedadores bacterianos UNG-; 
• un sustrato que contenga dU es digerido fácilmente por ciertas enzimas de 
restricción comunes (p. ej., EcoR I y BamH I), mientras que otras (p. ej., Hpa I, 
Hind II, Hind III) presentan una actividad reducida sobre estos sustratos; 
• no se recomienda utilizar ADN con dU en estudios sobre la unión a proteínas ni 
sobre la interacción del ADN con proteínas. 
 
Desoxirribonucleasa I, exonucleasa III. Otros métodos bioquímicos se basan en el 
tratamiento del ADN contaminado con desoxirribonucleasa I, exonucleasa III o con 
una enzima de restricción que contenga una secuencia de reconocimiento dentro del 
ADN diana. Sin embargo, dadas las condiciones desfavorables en que debe 
efectuarse la reacción, estas enzimas presentan el inconveniente de reducir la 
eficacia de la amplificación por PCR. 
 
Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra) 
 
Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampón de reacción, una 
ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos 
(dNTP) y ADN molde (diana), así como iones de magnesio (Mg2+). En general, todos 
los reactivos (excepto el ADN molde) se mezclan en un solo tubo, con un volumen 
suficiente según el número de reacciones que se vaya a realizar (mezcla maestra). 
La mezcla maestra se reparte a continuación en alícuotas en varios tubos y se 
añade el ADN molde. El uso de una solución maestra reduce el riesgo de 
contaminación y mejora el rendimiento de la PCR por los motivos siguientes: 
• se garantiza una calidad uniforme de la solución respecto a todos los reactivos 
para una serie de análisis; 
• disminuye el riesgo de contaminación de la solución original y de las resultantes; 
• pueden pipetearse volúmenes mayores; 
• hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo. 
El éxito en la amplificación de la región de interés depende de la cantidad y de la 
calidad del ADN molde. La cantidad de ADN molde necesaria es función de la 
complejidad de la muestra de ADN. Teniendo en cuenta que el tamaño del genoma 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 29 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
nuclear varía según los organismos, la concentración de ADN debe mantenerse 
constante (generalmente 10 ng/µl). El cuadro 3 muestra una comparación del 
tamaño del genoma de varias especies vegetales utilizadas con frecuencia en la 
transformación vegetal, así como el número correspondiente de ejemplares de 
genoma en una cantidad definida de ADN. 
 
Cuadro 3. Comparación del tamaño del genoma de varias especies vegetales y 
número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de 
ADN. 
 
Muestra Tamaño del 
genoma 
Ejemplares de genoma en 
1 µg ADN 
Ejemplares de genoma 
en 
1 ng ADN 
Maíz 5 x 109 pb 1,85 x 105 185 
Soja 1,55 x 109 pb 5,98 x 105 598 
Tabaco 3,8 x 109 pb 2,43 x 105 245 
Arroz 4 x 108 pb 2,31 x 106 2310 
 
Por ejemplo, en un plásmido de 4 kb con un inserto de 1 kb, la diana de interés es el 
25 % del ADN aportado. A la inversa, un gen de 1 kb en el genoma del maíz (5 x 109 
pb) representa alrededor del 0,00002 % del ADN aportado. Hace falta 
aproximadamente un millón de veces más ADN del genoma del maíz para mantener 
el mismo número de ejemplares de la diana por reacción. Para optimizar los 
resultados, deben utilizarse > 104 ejemplares de la secuencia diana como ADN 
molde inicial para obtener una señal al cabo de 25 o 30 ciclos. Aunque en la práctica 
es posible amplificar menos de 10 ejemplares de una secuencia diana, en este caso 
podría ser necesario un número mayor de ciclos de PCR para detectar una señal por 
electroforesis en gel. Los protocolos generales aplicados habitualmente consideran 
un número de ciclos entre 30 y 40. Debe vigilarse un aumento del número de ciclos, 
ya que entonces podría incrementarse la amplificación inespecífica. 
 
Controles 
 
Como se señalaba en la sección anterior, se encuentran fuentes posibles de 
contaminación por todo el laboratorio. Tanto las muestras como el personal de 
laboratorio, el sistema de aire acondicionado, el equipo y los reactivos pueden ser 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 30 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
fuente de contaminación. Entre los agentes contaminantes pueden citarse los 
siguientes: 
1. contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores; 
2. contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de ADN 
diana de una muestra a otra; 
3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores; 
4. degradación de productos por reacciones de descontaminación. 
Mientras que las tres primeras formas de contaminación producen falsos positivos, el 
último tipo produce falsos negativos. Esta forma de contaminación, observada en 
primer lugar por Niederhauser y colaboradores en 1994, provoca la inhibición de las 
PCR (Niederhauser et al., 1994). De hecho, la descontaminación con el método 
UNG favorece la formación de complejos con los cebadores. 
Para obtener resultados fiables, con las PCR siempre hay que utilizar controles tanto 
positivos como negativos. El cuadro 4 indica algunos de los controles más utilizados 
para garantizar el resultado de los procedimientos de amplificaciónde ácido 
nucleico. 
 
Cuadro 4. Controles que deben introducirse en los ensayos con PCR. 
 
Control Método 
Contaminación de los reactivos con 
el ADN diana 
Control negativo de la PCR sin ADN molde 
(solo mezcla maestra) 
Especificidad de la reacción Controles para detectar productos 
secundarios e inespecíficos 
Desarrollo y sensibilidad de la 
reacción 
Controles positivos y negativos para verificar 
que se cumplen las condiciones y 
rendimientos buscados 
Integridad de la mezcla de PCR PCR con control positivo de ADN 
 
Controles positivos 
 
Hay que comprobar mediante controles positivos la eficacia de la extracción y 
amplificación del ADN. Lo ideal es dar límites de detección en equivalentes 
genómicos, lo que permitiría la producción de controles de sensibilidad definidos, 
con pequeños números de ejemplares. Como norma, debe disponerse de un 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 31 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
preparado de referencia que contenga una concentración conocida del ADN diana 
estudiado. 
 
 
Controles negativos 
 
Puede darse contaminación (arrastre de productos amplificados o ácidos nucleicos) 
durante el aislamiento y la purificación del ADN diana, así como durante la 
preparación de la mezcla de reacción para la amplificación. Por tanto, es necesario 
introducir un control negativo con la mezcla de reacción para la amplificación. 
 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 32 
 
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 6 
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