Proyecto 1

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UABC

Gladiz Berenisse Flores zapotl

31/5/2022

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Biología Molecular

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PROYECTO 1
FARMACOGENÉTICA DE LA ENZIMA
N-ACETILTRANSFERASA 2 (NAT2) HUMANA

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

INTEGRANTES
Catalán García Karla Angelica
Chavez Mex Bitia Eunice
Flores Zapotl Gladiz Berenisse

DOCENTE
Dra. Muñoz Muñoz Patricia Lilian Alejandra

OBSERVACIONES
- Para la preparación del gel de agarosa, en el manual indica que es al 2% pero
se preparó al 1% para el PCR.

- Para el análisis de RFLP de SNP C481T, el buffer que se utilizó en la mezcla de
reacción para SNP C481T, fue NBE1.

- Para el análisis de RFLP de SNP G857A, el buffer que se utilizó para la mezcla
de reacción para SNP G857A, fue NBE3.

- El tiempo que se dejó correr la electroforesis del PCR y RFLP fue de 25 minutos.

- La muestra que se utilizó para la electroforesis de la RFLP fue donada por el
equipo 3.

- La preparación del gel de agarosa para la electroforesis del RFLP fue de 1.5%.

- No deben centrifugar, ni aplicar vortex a las enzimas.

RESULTADOS

Electroforesis en Gel de agarosa de la PCR

El PCR proporcionada por la maestra emitieron los siguientes
resultados del análisis de 6 muestras de PCR del gen
codificante de NAT2 que se lee de izquierda a derecha, la
muestra 1 y 4 se observa en menor concentración. El marcador
de peso molecular nos permite saber entre qué talla se
encuentran nuestros fragmentos por lo tanto podemos deducir
que están entre un marcador de peso mayor a 500 pb y menor
600 pb; se considera un resultado positivo para 547 pb.

Electroforesis PCR 1
Los resultados obtenidos en la PCR experimental
(Laboratorio) emiten el análisis de 5 muestras del
gen codificante de NAT2 que se lee de izquierda a
derecha; en el primer carril se observa el marcado
de peso molecular 100 pb que nos permitirá conocer
la talla que se encuentran los fragmentos. El carril 2
y carril 7 no se observan esta razón puede ser a que
en la preparación del PCR hubo un error, carril 3 y
8 carril se observan con mayor concentración y el
carril 4 se observa con menor concentración. Los
fragmentos de los carriles 3, 4, y 8 codifican para el
peso molecular de 547 pb.

Electroforesis en Gel de agarosa de RFLP

La Electroforesis proporcionada por la maestra emite el análisis de
4 muestras de RFLP, el cual se consideran dos enzimas de
restricción: KpnI y BamHI. En el carril 1 y 4 pertenece a BamHI,
carril 2 y 3 KpnI y carril 5 está el marcador de Peso
Molecular(100pb). De acuerdo con el corte por la endonucleasa
BamHI en el carril 1 es un homocigoto silvestre, el carril 2 presenta
dos cortes en la endonucleasa KpnI es un heterocigoto, el carril 3
tienen un corte en endonucleasa KpnI es un homocigoto silvestre, y
carril 4 tienen un corte en endonucleasa BamHI es un homocigoto
silvestre.

Carril 1: Muestra problema_1_BamHI
Carril 2: Muestra problema_1_KpnI
Carril 3: Muestra problema_2_KpnI
Carril 4: Muestra Problema_2_BamHI
Carril 5: Marcador de Peso Molecular 100pb

Electroforesis PCR 2
Electroforesis RFLP 1

En la Electroforesis experimental (Laboratorio) se emitieron el análisis de 9
muestras de RFLP, el cual se consideran dos enzimas de restricción KpnI y BamHI.
Los carriles 2, 3,6,8 y 10 pertenecen a BamHI, carril 4, 7, 9 y 11 pertenecen a KpnI
y el carril 1 es el marcador de Peso Molecular de 100pb. De acuerdo con el corte
por la endonucleasa BamHI en los carriles 2,3,6, 8, y 10 presentan un alelo o
homocigoto silvestres. En los carriles 7 , 9 y 11 presentan un sitio de
reconocimientos para la endonucleasa KpnI presentando un alelo o homocigoto
silvestres; en el carril 4 presenta dos cortes en el sitio de reconocimiento para la
endonucleasa KpnI es un heterocigoto debido a que tienen dos genes uno mutante
y otro silvestre. Las muestras de los carriles 8 y 9 se encuentran en menor
concentración.

DISCUSIÓN
Para llevarse a cabo el análisis de los polimorfismos para la enzima de N-
Acetiltransferasa 2 (NAT2); se obtuvo que aislar y purificar el ADN genómico
(sangre periférica); para amplificar el ADN se realizó un PCR.
En la PCR se sometió a una Electroforesis que nos permitió conocer si las muestras
codificaban a 547 pb para NAT2 humano. La electroforesis proporcionada por la
maestra (Electroforesis PCR 1) emiten el resultado de 6 muestras que codifican
para a 547 pb para NAT2 humano, siendo las muestras de los carriles 2,3,5,6 se
encuentra con mayor concentración y los carriles 1 y 4 con menor concentración
Carril 1: Marcador de peso molecular 100pb
Carril 2: Muestra problema _C_ BamHI
Carril 3: Muestra problema _1_ BamHI
Carril 4: Muestra problema _1_ KpnI
Espacio carril 5
Carril 6: Muestra problema _2_ BamHI
Carril 7: Muestra problema _2_ KpnI
Carril 8: Muestra problema _3_ BamHI
Carril 9: Muestra problema _3_ KpnI
Carril 10: Muestra problema _4_ BamHI
Carril 11: Muestra problema _4_ KpnI

Electroforesis RFLP 2

en la muestra esto pudo ocurrir debido a que no se realizó la PCR correctamente
o que la muestra sufrió una contaminación.
La Electroforesis del PCR 2 realizada por nosotros emite el resultado de 5
muestras. Los carriles 2 y 7 no se aprecia el fragmento para la codificación de
NAT2, dado que en la preparación del PCR hubo un error o una contaminación en
la muestra; el carril 3, 4 y 8 si codifican 547 pb para NAT2 humano, siendo que el
carril 4 se observa con menor concentración. Las tallas de los fragmentos se
obtuvieron mediante la comparación del marcador de peso molecular.

La Electroforesis del RFLP 1 que fue proporcionada por la maestra se obtuvieron
4 resultados el cual se consideran dos enzimas de restricción: KpnI y BamHI. Los
carriles 1 y 4 pertenecen a BamHI, solo existe un corte por lo tanto presenta dos
fragmentos en 57 pb y 490 pb por lo tanto es un homocigoto silvestre tienen el
mismo alelo. El carril 2 perteneciente a Kpnl presenta dos cortes por lo tanto
presenta tres fragmentos en 114 pb, 433 pb y 547 pb, es un heterocigoto esto
quiere decir que presenta un alelo silvestre y un alelo mutante. Para el carril 3
tienen un corte por lo tanto presenta dos fragmentos en 114 pb y 433 pb es un
homocigoto silvestre.
La Electroforesis de RFLP 2 se obtuvieron 9 resultados se consideran dos
enzimas de restricción KpnI y BamHI. Se observa un solo corte que presenta dos
fragmentos en 57 pb y 490 pb para la endonucleasa BamHI en los carriles 2,3,6,
8, y 10 presentan un alelo o homocigoto silvestres. En los carriles 7 , 9 y 11
presentan un sitio de reconocimientos para la endonucleasa KpnI presentando un
alelo o homocigoto silvestres debido a que solo hay un corte presenta dos
fragmentos en 114 pb y 433 pb; en el carril 4 presenta dos cortes en el sitio de
reconocimiento para la endonucleasa KpnI es un heterocigoto debido a que tienen
dos genes uno mutante y otro silvestre, presentará tres fragmentos en 114 pb, 433
pb y 547 pb. Las muestras de los carriles 8 y 9 se encuentran en menor
concentración.

CONCLUSIÓN
La aplicación de diversas técnicas moleculares ha permitido aislar el gen
codificante NAT2. Mediante el PCR se replicó varias veces el ADN de interés, con
electroforesis de gel de agarosa se rectificó que el fragmento obtenido es 547 pb
en base a los de marcadores de peso moleculares; en RFLP mediante las enzimas
de restricción (endonucleasas) KpnI y BamHI se reconoció los alelos: homocigoto
silvestre (mismo alelo) y heterocigoto (alelo mutante y alelo silvestre).
De acuerdo con los resultados obtenidos podemos inferir que no existe acetilador
lento debido a que ninguna de las muestras presenta en KpnI y BamHI un
homocigoto mutante,por lo tanto, los los pacientes el cual se llevó a cabo el
análisis para la codificación para NAT2 humano podrían metabolizar los fármacos
para la Tuberculosis (TB). La ciencia molecular ha permitido realizar diagnósticos
oportunos de enfermedades, el análisis del metabolismo de fármacos para que
logre el objetivo el efecto terapéutico deseado.

CUESTIONARIO

1. ¿De cuáles tejidos podríamos realizar la extracción de ADN genómico?

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano; como sangre,
semen, piel, caspa, pelos con raíz, dientes, huesos, saliva, sudor, o heces.
[1]

2. Menciona y describe las metodologías utilizadas para la cuantificación de
ADN
Para la cuantificación del ADN, hay dos métodos indirectos que permiten
estimar la concentración del ADN en las muestras, por visualización y
mediante espectrofotómetro.
Visualización: Mediante el análisis de la muestra de PCR , se aplica
electroforesis de gel agarosas el cual se colocan muestras con
concentraciones conocidas.
Espectrofotómetro: Se determina la concentración y la pureza de una
muestra de ADN en la capacidad de la absorbancia de un compuesto
presente en una solución a una longitud de onda determinada. [2,3]

3. Mencione que ocurre en cada uno de los pasos/ciclos de una reacción de
PCR.

Desnaturalización: Es la primera etapa donde el ADN molde se
desnaturaliza completamente Aplicando una temperatura de 94 ºC durante
30 segundos a 1 minuto. Si el ADN tiene un alto contenido de guaninas y
citosinas, se recomienda aumentar el tiempo o la temperatura.

Hibridación: En la segunda etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del
templado previamente separado e hibridan con su secuencia
complementaria. Para formar complejo templado-primers, la temperatura
de hibridación o temperatura melting (Tm) debe disminuir entre 50-60 °C.
Elongación: La última etapa donde, la Taq polimerasa actúa sobre el
complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad
muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas
completas de ADN. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis
del ADN (5’ a 3’). La temperatura para la reacción debe ser de 72 °C,
debido a que la enzima es funcional a esa temperatura. [4,5]

4. ¿Qué propiedades fisicoquímicas posee la Taq ADN polimerasa?

La Taq DNA Polimerasa es una enzima termoestable de aproximadamente
94 kDa, aislada de la eubacteria Thermus aquaticus, cepa YT-1. Esta enzima
replica el DNA a 72 ° C. La enzima cataliza la polimerización de nucleótidos
en DNA de doble hebra en dirección 5' → 3', en presencia de iones de
magnesio, y muestra actividad exonucleasa 5' → 3'. La enzima está
altamente purificada y libre de exonucleasas endonucleasas o nucleasas
inespecíficas. La Taq DNA polimerasa deja extremos libres 3' dA en sus
productos de reacción.

5. Qué aplicaciones posee la técnica de PCR

La PCR es una técnica imprescindible en múltiples ámbitos, por ejemplo, en
investigación bioquímica y médica, para pruebas de paternidad y en análisis
forenses de la policía científica. [10]

6. Menciona que es un polimorfismo genético

Un polimorfismo implica una de dos o más variantes de una secuencia
particular de ADN, puede tener efecto o no. Se transmiten a la descendencia
y adquieren cierta frecuencia en la población tras múltiples generaciones.
[11]

7. Define: homocigoto, heterocigoto, alelo, endonucleasa, palindrome

Homocigoto: Se refiere a un individuo que tiene dos alelos idénticos en un
locus determinado, uno en cada cromosoma.[12]

Heterocigoto: Se refiere a un individuo que hereda dos formas diferentes
de un gen particular, una de cada progenitor.[13]

Alelo: Es una forma alternativa de que un gen ocupa un locus dado en un
cromosoma. [14]

Endonucleasa: Son enzimas que son capaces de cortar cadenas de ADN o
ARN en puntos intermedios de las mismas mediante la rotura del enlace
fosfodiéster.[15]

Palindrome: Es una secuencia de ADN que puede ser leída en la misma
dirección (de 5’ a 3’ o de 3´a 5´).[16]

8. Qué aplicaciones posee la técnica de RFLP
Se usa para diferenciar en las secuencias de ADN la presencia de
fragmentos de diferentes longitudes después de la digestión de las muestras
de ADN en cuestión con endonucleasas de restricción específicas. RFLP, es
marcador molecular, específico de una sola combinación de clon/enzima de
restricción.[17]

ANEXOS

ANEXO1: FUNDAMENTO Y COMPONENTES DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA, ASÍ COMO SUS APLICACIONES.
Fundamentos
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase
Chain Reaction) es una reacción enzimática in vitro que replica varias veces una
secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la
secuencia en blanco es copiada. [1,2]
La PCR surge cuando Gobind Khorana (1971) describe la técnica al explicar la
replicación de un fragmento de ADN usando dos iniciadores (Kleppe et al. 1971).
En 1983 cuando Kary Mullis y sus compañeros de la compañía californiana Cetus
Corporation la llevaron a cabo por primera vez mientras trabajaban en la
fabricación de oligonucleótidos y en el uso de iniciadores para la secuenciación de
ADN. Mullis y colaboradores usaron dos iniciadores que se alineaban con cada una
de las hebras del ADN, adicionaron ADN polimerasa I de Escherichia coli y
nucleótidos trifosfatados. Como resultado obtuvieron la replicación exponencial
del fragmento de ADN flanqueado por los iniciadores (Mullis y Faloona 1987). [1]
La reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la
capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. En la reacción, si
usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una
PCR.[1]
Componentes
El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza química ofrece ventajas
para su manipulación. molécula de ADN está formada por tres componentes: un
azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, timina,
guanina o citosina) que es complementaria con la base de otra cadena, de tal
forma, que el ADN se estructura en una doble hélice. n la PCR, el templado son las
cadenas de ADN que se separan y funcionan como molde para que la enzima
sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de interés. Por su
parte, la ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las
nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanca. [1]
Cómo funciona
Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas
a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la
secuencia del templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, será necesario más
tiempo para romper sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases está
formado por tres enlaces, uno más que las bases de A-T. Además, depende de la
velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto varía de
acuerdo con el modelo del equipo. Al final de esta etapa tendremos las cadenas
separadas que servirán como templado para el siguiente paso. [1]
Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado
previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se
forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de
hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila
entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el co rrecto y la temperatura es la
adecuada, la estabilidad y especifi cidad del complejo será eficiente. [1]
Elongación. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-
primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s
complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión delas
cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura
óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es
funcional. Al fi nal del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño
dictado por el número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el
investigador.[1]
Aplicaciones
La arqueología, la medicina forense, pruebas de paternidad, genética,
investigación biológica y el diagnóstico clínico.[3]
Mutaciones asociadas con enfermedades hereditarias, cánceres, diagnóstico de
enfermedades, infecciones provocadas por VIH, papilomarivus y bacteria
Mycobacterium tuberculosis [4]
En diagnóstico clínico, los científicos pueden tomar un espécimen de material
genético que pese una trillonésima de gramo, copiar la secuencia genética una y
otra vez, y generar una muestra suficiente para detectar la presencia o ausencia
de un virus o bacteria específicos, o de material genético mutado. Este proceso de
amplificación permite al laboratorista detectar la presencia y en algunos casos la
cantidad de un patógeno. Además, utilizando los analizadores de DNA se pueden
conocer las secuencias variables entre los distintos aislados de patógenos, lo que
en definitiva permite la identificación de distintas cepas de patógenos [3]

ANEXO2: EL PROTOCOLO (TRADUCIDO): "DNA PURIFICATION FROM BLOOD OR
BODY FLUIDS (SPIN PROTOCOL)"

Este protocolo es para la purificación del ADN total (genómico, mitocondrial y
viral) de sangre entera, plasma, suero, capa leucocitaria, linfocitos y fluidos
corporales usando un microcentrífuga
Puntos importantes antes de empezar
· Todos los pasos de centrifugado se llevan a cabo a temperatura ambiente (15–
25 °C).
· Utilice ADN portador si la muestra contiene <10.000 equivalentes de genoma
· 200 µl de sangre total producen de 3 a 12 µg de ADN. Preparación de la capa
leucocitaria se recomienda si se requiere un mayor rendimiento.

Cosas que hacer antes de empezar
· Equilibre las muestras a temperatura ambiente (15–25 °C).
· Caliente un baño de agua o un bloque calefactor a 56 °C para usarlo en el paso
4.
· Equilibre el tampón AE o el agua destilada a temperatura ambiente para la
elución en el paso 11.
· Asegúrese de que se hayan preparado el tampón AW1, el tampón AW2 y la
proteasa de QIAGEN. según las instrucciones de la página 16.
· Si se ha formado un precipitado en el tampón AL, disuélvalo incubando a 56°C.

FUNDAMENTO DEL PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADNG (QUÉ OCURRE EN
CADA PASO Y CUÁL ES LA FUNCIÓN DE CADA REACTIVO UTILIZADO).
Procedimiento
1. Pipetee 20 µl de proteasa QIAGEN (o proteinasa K) en el fondo de un recipiente
de 1,5 ml. tubo de microcentrífuga.
2. Agregue 200 µl de muestra al tubo de microcentrífuga. Utilice hasta 200 µl de
sangre entera, plasma, suero, capa leucocitaria o fluidos corporales, o hasta 5 x
106 linfocitos en 200 µl de PBS. Si el volumen de la muestra es inferior a 200 µl,
agregue el volumen adecuado de PBS. Las mini columnas de centrifugación QIAamp
copurifican el ARN y el ADN cuando ambos están presentes en la muestra. El ARN
puede inhibir algunas reacciones enzimáticas aguas abajo, pero no la PCR. Si se
requiere ADN genómico libre de ARN, 4 µl de una solución madre de ARNasa A (100
mg/ml) debe agregarse a la muestra antes de agregar el tampón AL.
Nota: Es posible agregar proteasa QIAGEN (o proteinasa K) a las muestras que
tienen ya se ha dispensado en tubos de microcentrífuga. En este caso, es
importante asegure una mezcla adecuada después de agregar la enzima.
3. Agregue 200 µl de tampón AL a la muestra. Mezclar por pulso-vórtex durante 15
s. Para asegurar una lisis eficiente, es esencial que la muestra y el tampón AL se
mezclen a fondo para obtener una solución homogénea. Si el volumen de la
muestra es superior a 200 µl, aumente la cantidad de QIAGEN Proteasa (o
proteinasa K) y Tampón AL proporcionalmente; por ejemplo, 400 µl la muestra
requerirá 40 µl de proteasa QIAGEN (o proteinasa K) y 400 µl de tampón ALABAMA.
Si se requieren volúmenes de muestra superiores a 400 µl, use QIAamp DNA sangre.
Se recomiendan Mini o Maxi Kits; estos pueden procesar hasta 2 ml o hasta 10 ml
de muestra, respectivamente.
Nota: No agregue QIAGEN Proteasa o proteinasa K directamente al tampón AL.
4. Incubar a 56°C durante 10 min. El rendimiento de ADN alcanza un máximo
después de la lisis durante 10 min a 56 °C. Incubación más larga los tiempos no
tienen efecto sobre el rendimiento o la calidad del ADN purificado.
5. Centrifugar brevemente el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para eliminar las
gotas del interior de la tapa
6. Añada 200 µl de etanol (96–100 %) a la muestra y mezcle de nuevo mediante
agitación vorticial pulsada, durante 15 s. Después de mezclar, centrifugar
brevemente el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para eliminar gotas desde el
interior de la tapa. Si el volumen de la muestra es superior a 200 µl, aumente la
cantidad de etanol proporcionalmente; por ejemplo, una muestra de 400 µl
requerirá 400 µl de etanol.
7. Aplique con cuidado la mezcla del paso 6 a la columna de centrifugación QIAamp
Mini (en un recipiente de 2 ml tubo colector) sin mojar el borde. Cerrar la tapa y
centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 min. Coloque la columna de
centrifugación QIAamp Mini en una colección limpia de 2 ml (incluido) y deseche
el tubo que contiene el filtrado. *
Cierre cada columna de centrifugado para evitar la formación de aerosoles durante
la centrifugación. La centrifugación se realiza a 6000 x g (8000 rpm) para reducir
el ruido. Centrifugación a toda velocidad no afectará el rendimiento o la pureza
del ADN. Si el lisado no tiene pasado completamente a través de la columna
después de la centrifugación, centrifugue nuevamente a velocidad más alta hasta
que la columna de centrifugación QIAamp Mini esté vacía.
Nota: Al preparar ADN a partir de una capa leucocitaria o de linfocitos, centrifugar
a máxima. Se recomienda velocidad para evitar atascos.
8. Abra con cuidado la columna de centrifugación QIAamp Mini y añada 500 µl de
tampón AW1 sin mojando el borde. Cierre la tapa y centrifugue a 6000 x g (8000
rpm) durante 1 min. Coloque la columna de centrifugación QIAamp Mini en un tubo
de recolección limpio de 2 ml (incluido) y deseche el tubo de recolección que
contiene el filtrado. *
No es necesario aumentar el volumen de Buffer AW1 si la muestra original el
volumen es superior a 200 µl.
9. Abra con cuidado la columna de centrifugación QIAamp Mini y añada 500 µl de
tampón AW2 sin mojar el borde. Cierra la tapa y centrifuga a máxima velocidad
(20.000 x g; 14.000 rpm) durante 3 min.
10. Recomendado: coloque la columna de centrifugación QIAamp Mini en un tubo
de recolección nuevo de 2 ml (no incluido) y deseche el tubo de recolección viejo
con el filtrado. Centrifugar a tope velocidad durante 1 min. Este paso ayuda a
eliminar la posibilidad de un posible remanente de Buffer AW2.
11. Coloque la columna de centrifugación QIAamp Mini en un tubo de
microcentrífuga limpio de 1,5 ml (no provisto) y deseche el tubo de recolección
que contiene el filtrado. abrir con cuidado la columna de centrifugación QIAamp
Mini y añada 200 µl de tampón AE o agua destilada. Incubar a temperatura
ambiente (15–25 °C) durante 1 min y luego centrifugar a 6000 x g (8000 rpm)
durante 1 min. Incubación de la columna de centrifugación QIAamp Mini cargada
con Buffer AE o agua durante 5 min a temperatura ambiente antes de la
centrifugación generalmente aumenta el rendimiento de ADN. Un segundo paso de
elución con 200 µl adicionales de tampón AE aumentará los rendimientos hasta al
15%.
No se deben eluir volúmenes de más de 200 µl en una microcentrífuga de 1,5 ml.
porque la columna de centrifugación entrará en contacto con el eluido, lo que
provocará posible formación de aerosoles durante la centrifugación.
La elución con volúmenes inferiores a 200 µlaumenta la concentración final de
ADN en el eluato significativamente, pero reduce ligeramente el rendimiento total
de ADN (ver Tabla 5, página 25). Para muestras que contengan menos de 1 µg de
ADN, elución en 50 µl de tampón Se recomienda AE o agua. Eluir con 2 x 100 µl en
lugar de 1 x 200 µl no aumenta la eficiencia de elución.
Para el almacenamiento a largo plazo de ADN, se recomienda eluir en Buffer AE y
almacenar a –20°C. recomendado, ya que el ADN almacenado en agua está sujeto
a hidrólisis ácida.
Una muestra de 200 µl de sangre humana entera (aproximadamente 5 x 106
leucocitos/ml) normalmente produce 6 µg de ADN en 200 µl de agua (30 ng/µl) con
una relación A260/A280 de1.7–1.9.

ANEXO 3: COMPONENTES Y FUNDAMENTO DE LA "REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA"
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polimerase chain reaction) se
considera una de las técnicas más sensibles y específicas de las pruebas
moleculares. En 1986, el doctor Kary Mullis desarrolló esta técnica en los
laboratorios de CETUR Corporation, en Estados Unidos, lo que le hizo valedor del
premio Nobel en 1993. La idea se fundamentó en la necesidad de obtener un gran
número de copias de fragmentos específicos de ácido desoxirribonucleico (DNA,
deoxyribonucleic acid) de manera rápida y económica, los cuales no podían
obtenerse por otros métodos hasta ese momento. Esta técnica se basa en una
replicación exponencial in vitro de una molécula de DNA genómico (gDNA) o DNA
complementario (cDNA), mediante ciclos repetidos, que constan de tres
temperaturas. En cada uno de los ciclos las moléculas se duplican hasta que los
reactivos se agotan.
La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, también
llamados primers u oligonucleótidos, de cuyo diseño adecuado depende el éxito de
la PCR. Los iniciadores deben ser específicos, no formar estructuras secundarias ni
hibridaciones inespecíficas entre ellos u otra parte de la cadena.
Componentes de la reacción de PCR.
Para que se lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa se requiere una
cadena de gDNA o cDNA que sirva de molde, una enzima DNA polimerasa, Mn+2 o
Mg+2 necesarios como cofactores para la enzima, dNTP o desoxinucleótidos y
oligonucleótidos para el inicio de la síntesis. Estos reactivos se mezclan y se
someten en el termociclador a los ciclos de amplificación.

Componentes de PCR

ANEXO 4: FUNDAMENTO DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías
más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos
nucleicos. Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN
en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta
forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una
estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del
gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en
diferentes aplicaciones. La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una
herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN
recombinante o ingeniería genética. La idea de utilizar la técnica de electroforesis
a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne,
un bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, quien a mediados de los años
60 del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las distintas formas de ADN
que se obtenían de partículas purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era
que una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el
desplazamiento y separación en función del tamaño o topología de diferentes
moléculas de ADN. Éste es exactamente el principio en que se basa la
electroforesis de ácidos nucleicos. Sometidos a un campo eléctrico, la carga neta
negativa del ADN y el ARN hará que estos se muevan en dirección al ánodo. Si se
fuerza a los ácidos nucleicos a moverse a través de un gel formado por una malla
tridimensional de un polímero como la agarosa, la fricción hará que las moléculas
de mayor tamaño migren con más lentitud, mientras las de menor tamaño avanzan
más en el gel, permitiendo que las diferentes moléculas se separen en función de
su tamaño. Del mismo modo, moléculas de ADN o ARN con topologías o estructuras
tridimensionales diferentes también se comportarán de forma diferente ante la
fricción con la malla del polímero, permitiendo su separación.
Mediante la electroforesis en gel de agarosa, Thorne logró separar y visualizar tres
formas topológicas diferentes del ADN del polyomavirus: superenrrollada, relajada
y lineal, tras haber marcado el ADN con [3H] timidina (Thorne 1966, 1967). El
trabajo de Thorne recibió poca atención hasta principios de los años 70, cuando el
empleo de enzimas de restricción permitió el análisis de moléculas de ADN mucho
más grandes que los genomas virales.
La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar y purificar
fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolución.

ANEXO 5: FUNCIONAMIENTO DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.

Una enzima de restricción es una enzima que corta ADN y que reconoce sitios
específicos en él. Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados en o
cerca de su sitio de reconocimiento y producen extremos sobresalientes de cadena
sencilla.
Las enzimas de restricción se encuentran en bacterias (y otros procariontes).
Reconocen secuencias específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y se unen
a ellas. Cada enzima de restricción reconoce solo uno o unos pocos sitios de
restricción. Cuando encuentra su secuencia blanca, la enzima de restricción corta
las dos cadenas de una molécula de ADN. Por lo general, el corte es en o cerca del
sitio de restricción y ocurre en un patrón ordenado y predecible.

ANEXO 6: ANÁLISIS DE PIPETEO
Cada una de los integrantes del equipo realizó pipeteo el cual de 200 y 1000 μl ,
se realizaron 10 ensayos de pipeteo cada uno fue pesado con una balanza analítica

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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