Reporte práctica 6 inmuno

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Escuela de Ciencias de la Salud
Práctica No. 6: Laboratorio virtual de identificación de bacterias por técnicas
inmunológicas.
Becerril García Diana María, Contreras Reynoso Maricielo, Juárez Espinosa
Fernanda Elizabeth, López Vilchis Ximena, Polo Contreras Sabrina, Ramírez
Romero Karime.
Asignatura: Técnicas de inmunología.
Licenciatura: Químico Farmacéutico Biotecnólogo.
Periodo: 2021-01
Fecha de entrega: 21 de mayo de 2021
Docente: M en C. Araceli Álvarez Cruz.
RESUMEN
Se realizó una investigación sobre las técnicas inmunológicas para detectar
microorganismos generales y las técnicas relacionadas a la detección de
Histoplasmosis capsulatum por medio de la recopilación de información científica.
Posteriormente se buscaron artículos y se realizó la comparación de las distintas
técnicas de detección e identificación de Histoplasma capsulatum en el laboratorio
donde se encontró que se realiza por métodos directos e indirectos. Por lo que de
acuerdo con Muñoz (2010) se puede decir que los valores de sensibilidad y
especificidad en ambos métodos (directos e indirectos) son variables, y los
resultados dependen, a su vez, de la forma clínica de la enfermedad que presente el
paciente y de su estado inmune.
Palabras clave: Histoplasmosis, detección, técnicas, inmunológica,
microorganismos.
INTRODUCCIÓN
Las técnicas inmunológicas son
técnicas de gran ayuda, ya que
permiten la detección para los
diagnósticos tempranos con mayor
certeza y también para el seguimiento
del curso de la enfermedad en función
de la variación de los anticuerpos
presentes en las muestras de los
pacientes; un ejemplo son los
autoanticuerpos simultáneamente
adquiridos a partir de volúmenes de
muestra pequeños.
(Hernández, 2010)
Las técnicas de inmunología más
comunes para identificar
microorganismos (MO´s) son las
siguientes:
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A. Aglutinación indirecta: Es más
rápida y menos sensible que la
técnica de ELISA; consiste en
que los anticuerpos se adhieren
a partículas grandes de látex
por la región Fc.
B. Inmunofluorescencia: Los
anticuerpos están marcados
con sustancias fluorescentes,
los cuales se unen a los MO´s y
son observados en el
microscopio de fluorescencia.
C. ELISA: Anticuerpos fijados en
base de pocillo de placa de
microtitulación o membrana de
nitrocelulosa (específicos del
antígeno buscado). Asimismo,
anticuerpos (generalmente
monoclonales) fijados en base
de pocillo de placa de
microtitulación o membrana de
nitrocelulosa (específicos del
antígeno buscado).
(Anónimo, 2012)
Por otro lado, las técnicas de
inmunología más importantes para
identificar Histoplasmosis capsulatum
son las siguientes:
A. Métodos microbiológicos o
directos
A.1. Exámenes en fresco y
coloraciones especiales: Coloraciones
especiales tales como Wright, Giemsa,
el ácido peryódico de Schiff (PAS) y la
plata metenamina o Grocott,
realizadas a partir de muestras
respiratorias biopsias de tejido,
raspados de lesiones en piel y
extendidos de médula ósea.
A.2. Cultivos para el aislamiento de H.
capsulatum: Agar de infusión de
cerebro y corazón (BHI) con una
fuente de sangre (generalmente de
carnero) más antibióticos y
ciclohexamida, y el Sabouraud
dextrosa agar más cicloheximida y
cloramfenicol (Mycosel, BBL).
A.3. Hemocultivo por lisis
centrifugación: La sangre extraída se
pone en contacto con sustancias
líticas, como la saponina, que
destruyen los eritrocitos y los
leucocitos y liberan en el medio las
levaduras intracelulares.
B. Métodos indirectos o
técnicas inmunológicas.
B.1. Fijación de complemento e
inmunodifusión (ID) en gel-agar: La
fijación de complemento es una
prueba inmunológica que busca
detectar y medir la presencia de Acs
fijadores de complemento específicos
contra el hongo, presentes en el suero
o en el líquido cefalorraquídeo de los
individuos infectados. Mientras que la
prueba ID en gel-agar permite
identificar dos bandas de precipitado,
denominadas H y M, que
corresponden al reconocimiento de
Acs específicos contra tales antígenos
presentes en el suero de pacientes
con histoplasmosis.
B.2. ELISA directa e indirecta para
detección de anticuerpos: Han sido
poco utilizados para la detección de
Acs contra H. capsulatum debido a la
dificultad para su estandarización y a
su difícil interpretación; y, presentan
alta reacción cruzada cuando se
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utilizan sueros de pacientes con otras
enfermedades micóticas.
B.3. Detección de antígenos: El uso de
las técnicas de radioinmunoensayo
(RIA) y ELISA, y el empleo de Acs
policlonales son herramientas
importante para el diagnóstico de la
histoplasmosis, el seguimiento de los
pacientes y la determinación de su
respuesta al tratamiento.
(Muñoz, 2010)
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Se conocerán las técnicas
inmunológicas para la identificación de
diferentes microorganismos.
JUSTIFICACIÓN
El conocimiento de las técnicas
inmunológicas para la identificación de
microorganismos es de suma
importancia para la detección de
alguno en particular.
OBJETIVOS
General
Simular técnicas inmunológicas
computacionales en la identificación
de bacterias.
Específicos
● Conocer las técnicas
inmunológicas para la
identificación de
microorganismos.
● Conocer las técnicas para la
identificación de Histoplasma
capsulatum.
● Comparar los resultados
obtenidos en la simulación con
los reportados en la literatura.
HIPÓTESIS
Si se lleva a cabo de forma correcta la
investigación teórica, entonces se
podrán comprender mejor las técnicas
inmunológicas para la detección de
microorganismos.
METODOLOGÍA
Se investigaron diversas técnicas
inmunológicas; tanto directas, como
indirectas para la identificación de
microorganismos en general.
Posteriormente, se buscaron
documentos científicos que contuviera
información sobre las pruebas de
laboratorio que se emplean para el
diagnóstico de la histoplasmosis (en la
forma clínica de la micosis). Por
último, se llevó a cabo la comparación
de la sensibilidad y especificidad de
las pruebas serológicas utilizadas para
el diagnóstico de histoplasmosis.
RESULTADOS
En el artículo “Detección e
identificación de Histoplasma
capsulatum por el laboratorio: de los
métodos convencionales a las pruebas
moleculares” de Muñoz, et al. (2010),
se evaluaron las diferentes pruebas de
identificación de H. capsulatum.
Métodos convencionales
a) Métodos directos o
microbiológicos.
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Tabla 1. Porcentajes de
sensibilidad de las pruebas de
laboratorio empleadas en el
diagnóstico convencional de la
histoplasmosis de acuerdo con la
forma clínica de la micosis.
NOTA: HPA: Histoplasmosis
pulmonar aguda.
HPC: Histoplasmosis pulmonar
crónica.
HPD: Histoplasmosis
progresiva diseminada.
Ag: Antígeno
* Wright, Giemsa, Plata
metenamina.
* *Inmunodifusión y fijación del
complemento.
Figura 1. Aspecto micro y
macroscópico de H.
capsulatum.
b) Métodos indirectos o
inmunológicos.
Tabla 2. Comparación de la
sensibilidad y especificidad de las
pruebas serológicas utilizadas
para el diagnóstico de la
histoplasmosis.
Tabla 3. Histoplasmosis progresiva
diseminada: porcentajes de
sensibilidad de las pruebas
serológicas y detección de
antígenos en muestras de
pacientes inmunocompetentes,
con el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida u otro
tipo de alteración inmunológica.
Pruebas moleculares
Se evaluaron dos pruebas de PCR
anidada para la detección de DNA de
H. capsulatum en muestras de tejido
humano utilizando un nuevo gen
blanco denominado Hc100 que
amplificaba una secuencia del gen que
codifica para una proteína de 100-kDa,
única y específica de H. capsulatum.
Este estudio demostró que ambas
pruebas de PCR anidada eran
capaces de detectar H. capsulatum en
muestras de tejido humano fijado y
embebido en parafina con límites de
detección similares; sin embargo, la
especificidad para la Hc100-PCR fue
del 100%, en contraste con la
presencia de falsos positivos
revelados por la PCR dirigida a
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amplificar la secuencia 18S del rRNA
(77%); además, la prueba de
Hc100-PCRfue útil para el diagnóstico
de histoplasmosis diseminada en un
paciente con SIDA.
La prueba molecular Hc100-PCR
presentó una sensibilidad del 100% y
una especificidad del 92.4% con
respecto a controles negativos y del
95.2% cuando se utilizaron muestras
positivas para otras micosis. (Muñoz,
2010)
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Tradicionalmente, el diagnóstico de
Histoplasmosis se realiza por métodos
microbiológicos directos y biopsias
que emplean una variedad de
coloraciones especiales tales como
Wright, Giemsa y plata metenamina,
entre otras, así como por cultivo tal y
como se muestra en la Figura 1
donde; el inciso A) corresponde a
Blastoconidias intracelulares
compatibles con H. capsulatum en una
muestra clínica de un lavado
broncoalveolar coloreada con la
tinción de Wright (1000x); B) son
Blastoconidias compatibles con H.
capsulatum en una biopsia de piel
coloreada con la tinción de Grocott
(400x); C) es el aspecto macroscópico
de colonias de H. capsulatum en
cultivo a temperatura ambiente de
una muestra clínica respiratoria
(correspondiente a un cultivo incubado
por seis semanas) y el inciso D)
corresponde a Macroconidias
tuberculadas características de H.
capsulatum obtenidas de un cultivo a
temperatura ambiente (18-24°C),
tratadas con azul de lactofenol (400x).
No obstante estos métodos basados
en tinciones presentan una
sensibilidad inferior al 50% y una
amplia variabilidad que depende de la
forma clínica de la micosis y de la
experiencia del observador.
Adicionalmente, las levaduras de H.
capsulatum son potencialmente
confundidas y erróneamente
identificadas con otros
microorganismos. Además la
sensibilidad de estas pruebas es más
baja en pacientes con formas agudas
y leves de la micosis, aunado a que el
microorganismo es de crecimiento
lento, pues requiere entre tres y seis
semanas para su aislamiento en los
medios de cultivo.
De acuerdo a la Tabla 1, la serología
fue la prueba convencional de
laboratorio que presentó los
porcentajes más altos de sensibilidad
en el diagnóstico convencional de la
histoplasmosis de acuerdo con la
forma clínica de la micosis, con un
95% de de sensibilidad para
Histoplasmosis pulmonar aguda,
90%-100% para Histoplasmosis
pulmonar crónica y un 70%-80% de
sensibilidad para la Histoplasmosis
progresiva diseminada.
Se emplean igualmente métodos
tradicionales indirectos que incluyen la
detección de anticuerpos y antígenos
como se aprecia en la Tabla 2, donde
se observa que aunque la prueba de
FC presenta una sensibilidad más alta
en comparación con la ID, esta última
es mucho más específica
independientemente de la forma
clínica de la histoplasmosis.
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Según Muñoz (2010); los valores de
sensibilidad y especificidad en ambos
métodos (directos e indirectos) son
variables, y los resultados dependen,
a su vez, de la forma clínica de la
enfermedad que presente el paciente
y de su estado inmune.
Por otra parte, al realizar el
diagnóstico de Histoplasmosis
progresiva diseminada en pacientes
inmunocomprometidos, se requiere
evaluar los porcentajes de sensibilidad
de las pruebas serológicas y detección
de antígenos como se muestra en la
Tabla 3, donde los porcentajes de
sensibilidad de las pruebas
serológicas fueron más elevados para
detectar Histoplasmosis en pacientes
inmunocomprometidos.
Sin embargo recientemente, la
biología molecular ha permitido
introducir nuevas herramientas que
han sido utilizadas para la detección e
identificación de H.capsulatum, una de
ellas es la PCR anidada, que se
caracteriza por sus altos niveles de
sensibilidad y especificidad, además
de que estas técnicas moleculares han
facilitado realizar múltiples estudios de
epidemiología molecular que han
permitido recopilar información valiosa
sobre la variabilidad genética de H.
capsulatum. Por lo que la PCR
anidada Hc100 es una herramienta de
diagnóstico prometedora que se
puede implementar para detectar el
ADN de H. capsulatum en una gran
variedad de muestras clínicas.
Como QFBT´s, es muy importante
mantenerse actualizados en cuanto a
las nuevas técnicas de diagnóstico y
estar bien capacitados para realizar
las pruebas convencionales en caso
de no tener acceso a las nuevas
técnicas, con el propósito de brindar
un diagnóstico más certero y con altas
probabilidades de recibir el tratamiento
adecuado y específico.
CONCLUSIONES
Se logró conocer las técnicas
inmunológicas para la determinación
de microorganismos, asimismo
mediante estas, se pudo encontrar las
diferentes técnicas para identificar al
microorganismo H. capsulatum las
cuales son por métodos indirectos o
pruebas moleculares.
REFERENCIAS
Anónimo. (2012). Métodos
inmunológicos para la identificación
microbiana. Consultado el 14 de mayo
de 2021. Recuperado de
http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/r
ecursos/12/tema-14.pdf.
Hernández, D., et al. (2010). Técnicas
inmunológicas que apoyan el
diagnóstico de las enfermedades
autoinmunes. Reumatología Clínica, 6
(3); pp. 173-177. Consultado el 14 de
mayo de 2021. Recuperado de
https://www.sciencedirect.com/science
/article/pii/S1699258X09002411.
Muñoz, C., et al. (2010). Detección e
identificación de Histoplasma
capsulatum por el laboratorio: de los
métodos convencionales a las pruebas
moleculares. Revista Infectio, 14 (2);
pp. 145-158. Consultado el 14 de
mayo de 2021. Recuperado de
http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v14s2/v
14s2a07.pdf.
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http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/tema-14.pdf
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