Reporte práctica 4 inmuno

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Escuela de Ciencias de la Salud
Práctica No. 4: Separación de células mononucleares.
Becerril García Diana María, Contreras Reynoso Maricielo, Juárez Espinosa
Fernanda Elizabeth, López Vilchis Ximena, Polo Contreras Sabrina, Ramírez
Romero Karime.
Asignatura: Técnicas de inmunología.
Licenciatura: Químico Farmacéutico Biotecnólogo.
Periodo: 2021-01
Fecha de entrega: 29 de marzo de 2021
Docente: M en C. Araceli Álvarez Cruz.
RESUMEN
Se visualizó un video relacionado con la separación de las células mononucleares;
además, se investigó sobre los tipos, la importancia y las características de dichas
células; donde se encontró una técnica para la separación de las células
mononucleares, la cual consiste en la mezcla de ficoll-diatrizoato y la utilización de
la centrifugadora; lo que provoca dicha separación debido a las diferencias de
densidad. Finalmente, se comparó el conteo de leucocitos de 96 pacientes, donde
se obtuvo que en la muestra de sólo 2 de ellos no pudo realizar el conteo de
leucocitos requeridos ya que pueden llegar a movilizarse de manera insuficiente. De
acuerdo con Chemistbit (2016), los leucocitos manejan valores de 6,000-10,000 por
mm3/sangre, en valores anormales.
Palabras clave: Células mononucleares, centrifugadora, ficoll-diatrizoato,
separación, densidad.
INTRODUCCIÓN
Las células mononucleares de la
sangre periférica (también abreviadas
como PBMCs), son todas las células
en sangre periférica que contienen un
núcleo único y redondeado.
(Surat, s.f)
Los linfocitos y los monocitos son
células mononucleares que forman
parte del sistema inmunológico, las
cuales se pueden encontrar en la
sangre y en la linfa.
(AmBientech, s.f)
Características
- Linfocitos: El núcleo de un
linfocito se tiñe de oscuro y es
redondo o levemente identado.
El citoplasma se tiñe de azul
cielo y forma un anillo alrededor
del núcleo. Mientras más
grande sea la célula, más
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visible será el citoplasma.
Dependiendo del diámetro de
sus células se pueden clasificar
como linfocitos grandes (10-14
μm) o linfocitos pequeños (6-9
μm); a pesar de que el
significado funcional de la
diferencia de tamaño entre los
linfocitos no es claro, la
distinción es clínicamente útil
porque un incremento en la
cantidad de linfocitos grandes
tiene significado diagnóstico en
las infecciones virales agudas y
en algunas enfermedades
inmunodeficientes.
(Tortora, 2018)
Así mismo, dentro de los
linfocitos podemos encontrar
los linfocitos T y los linfocitos B.
- Linfocitos T: Son el
componente clave de las
respuestas inmunitarias
celulares del sistema
inmunológico adaptativo.
Estos maduran en el
timo, circulan por la
sangre, pueblas los
tejidos linfáticos
secundarios y se
reclutan en las zonas
periféricas de exposición
al antígeno. Así mismo,
expresan receptores
para el antígeno, que
reconocen fragmentos
peptídicos de proteínas
extrañas unidos a
moléculas propias del
MHC. Dentro de los
linfocitos T podemos
encontrar los subgrupos
funcionales, los cuales
son los Linfocitos T
helpers o cooperadores
(CD4+) y los Linfocitos T
citotóxicos (CD8+).
(Abbas., et. al; 2020).
- Linfocitos B: Son células
especializadas del
sistema inmune que
juegan un papel
importante en la
respuesta humoral,
siendo el principal
mecanismo de defensa
contra patógenos
extracelulares. Su
principal función es el
reconocimiento de
moléculas extrañas al
organismo, es decir, el
reconocimiento de
antígenos y así producen
anticuerpos específicos
para neutralizarlos.
(Labo’Life, 2014)
Figura 1. Linfocito observado al
microscopio (Tortora, 2018).
- Monocitos: El núcleo de un
monocito usualmente tiene
forma de herradura y el
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citoplasma es gris azulado y
tiene apariencia espumosa. La
sangre es un conducto para los
monocitos que migran desde
esta hacia los tejidos, donde se
agrandan y se transforman en
macrófagos. Algunos se
vuelven macrófagos fijos
(tisulares), esto quiere decir que
se encuentran en tejidos
particulares, un ejemplo son los
macrófagos alveolares o los del
bazo. Por otro lado, también se
pueden convertir en
macrófagos circulantes, que
rondan los tejidos y se juntan
cuando se encuentra un
problema como una infección o
una inflamación.
(Tórtora, 2018)
Figura 2. Monocito observado al
microscopio. (Tortora, 2018).
Por otro lado, para muchas pruebas
inmunológicas in vitro se requieren
preparaciones purificadas o
enriquecidas de linfocitos de la sangre
periférica. En los inicios, las primeras
técnicas utilizadas para aislar los
linfocitos consisten en mezclar la
muestra con un agente aglutinante de
eritrocitos, con el fin de que se
separaran debido a la sedimentación
de los grumos; sin embargo, estas
técnicas eran lentas y se obtenían
resultados con bajo rendimiento y
pureza. De esta forma, en 1958,
Boyum ideó un método basado en la
centrifugación de la muestra sobre un
gradiente de densidad discontinuo,
cuyo medio original consistía en una
mezcla de ficoll y metrizoato de sodio.
Este método es rápido y simple, por lo
que se utiliza comúnmente para
obtener preparaciones enriquecidas
de linfocitos sanguíneos; a pesar de
que esta técnica resulta en la
separación de los leucocitos
mononucleares, los linfocitos son más
abundantes que los monocitos cuando
se trabaja con muestras de sangre
periférica.
El medio de separación para purificar
linfocitos consiste en una mezcla de
dos componentes. El ficoll 400 es un
polímero sintético de sacarosa y
epiclorhidrina, soluble en agua. Por
otro lado, el diatrizoato de sodio, es un
compuesto que al ser mezclado con el
ficoll, forma soluciones de baja
viscosidad y alta densidad. La función
del diatrizoato es proveer la densidad
óptima para la separación y a la vez la
osmolaridad adecuada para mantener
la viabilidad de las células; mientras
que el ficoll, causa la aglutinación de
los eritrocitos, lo que facilita más la
sedimentación de los mismos. La
mezcla de ficoll-diatrizoato se debe
mantener protegida de la luz, debido a
la fotosensibilidad del diatrizoato;
además, se puede encontrar
disponible comercialmente, estéril y
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lista para su uso como Ficoll-Paque®,
Lymphoprep®, etc.
De esta forma, al estratificar una
muestra de sangre sobre el
ficoll-diatrizoato y centrifugar, las
células mononucleares se separan de
las demás debido a diferencias de
densidad, entonces:
- Los eritrocitos son aglutinados
por el ficoll, pasando a través
del medio y sedimentando al
fondo.
- Los granulocitos también
sedimentan por su tamaño y
densidad, y por su tendencia a
formar agregados.
- Las células mononucleares, por
su menor densidad se quedan
en la interfase, entre el plasma
y el medio (con una
contaminación relativamente
baja de plaquetas y otros tipos
celulares).
Figura 3. Distribución de los componentes
sanguíneos de acuerdo a su gradiente de
densidad.
(Lomonte, 2009)
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Se llevará a cabo una investigación
que abordará las características, tipos,
importancia, y; además, el fundamento
y la metodología para llevar a cabo la
separación de las células
mononucleares; y así,comprender la
importancia de las mismas.
JUSTIFICACIÓN
Conocer las características y los
métodos de separación de células
mononucleares es de gran importancia
para poder llevar a cabo una correcta
interpretación de análisis de
laboratorio.
OBJETIVOS
General
Comprender el fundamento para la
separación de células mononucleares.
Específicos
● Conocer las características y
tipos de células mononucleares.
● Conocer las funciones de los
reactivos utilizados en la
separación de células
mononucleares.
● Comprender la importancia de
las técnicas de separación de
células mononucleares.
HIPÓTESIS
En el proceso de separación de
células, éstas se separarán en fases
según su densidad.
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METODOLOGÍA
La primer parte consistió en preparar
las soluciones amortiguadoras PBS,
para lo cual, se preparó el material
para pesar en la báscula analítica las
sustancias por separado, luego se
añadieron pocoa poco 400 mL de
agua destilada en el vaso con las
sales, se introdujo el agitador
magnético y se colocó el vaso sobre la
plancha de agitación (solo utilizando la
agitación) hasta diluir las sales.
Posteriormente, se ajustó el pH a 7.4
con HCl o NaOH y se aforó la
solución a 500 mL en el matraz. Ya
que se tuvieron los 500 mL de la
solución de fosfatos, se pesó la
cantidad de NaCl a utilizar y se
repitieron los pasos del 3 al 6
(aforando a 250 mL). Luego se rotuló
la solución con el nombre de la
solución, fecha de preparación, grupo
y profesor responsable. Finalmente se
decidió conservar la solución a
temperatura ambiente (esterilizándola
previamente), para usarla
posteriormente en la práctica de
fraccionamiento celular.
En la segunda parte de la práctica se
realizó la separación de células
mononucleares, para ello; primero se
realizó una toma de muestra de
sangre suficiente en tubos de tapón
lila y se realizó una dilución 2:1 con
PBS. Posteriormente, con el propósito
de darle tratamiento a la muestra; se
centrifugaron 10 mL de la muestra de
sangre-PBS con 3 mL de Lymphoprep
a 400 g por 30 minutos a temperatura
ambiente en tubos cónicos de 15 mL,
luego se recolectó el anillo de células
mononucleares de la interfase y se
transfirió a otro tubo cónico, donde se
ajustó a 13 mL con PBS, acto seguido
se centrifugó nuevamente por 10 min
a 577 g, se descartó el sobrenadante y
se repitieron los pasos 7, 8 y 9,
después se agregó 1 mL de PBS y se
reconstituyó. Luego en un tubo
Eppendorf, se tomaron 10 μL de la
mezcla con 990 μL de PBS y se
reconstituyeron nuevamente.
Finalmente se colocó una gota en la
cámara de Neubauer y se observó al
microscopio para realizar el recuento
de células mononucleares.
● Nota: El radio de rotor de la
centrífuga utilizada fue de 159
mm.
RESULTADOS
Tabla 1. Características de los
concentrados celulares
Parámetro Media Mediana Rango
Volumen
(mL)
106 100 40-170
Cont. Total
de
leucocitos
(x109/L)
18.3 16.8 4.7-49.5
Células
mononuclea
res (CMN)
(%)
29 27 6-70
Cont. total
de CMN
x109 /L
5.35 4.2 0.66-21
ANÁLISIS DE RESULTADOS
En la tabla 1, el conteo se realizó en
96 pacientes, así mismo este conteo
de leucocitos fue superior a 20 x 109,
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El volumen promedio de los
concentrados de células
mononucleares (CMN) obtenidos fue
de 106 mL con un contenido medio de
leucocitos de 20.3x109. El contenido
promedio de CMN del concentrado fue
de 5.35x109. Y solo a 43 pacientes
estudiados se le pudo determinar el
número de células CD34+ en el
concentrado celular. (Cortina R, 2008).
Se apreció que en los 96 pacientes
evaluados, se obtuvo un incremento
del conteo de leucocitos superiores al
mínimo requerido, es decir en el caso
de conteo de leucocitos fue superior a
20x109. Así mismo en lo que es el
contenido de las CMN y de las células
CD34+ estuvo dentro de los
parámetros establecidos.
Para entrar un poco más en contexto,
de acuerdo con Chemistbit (2016), los
valores normales de las células
mononucleares son los siguientes: en
glóbulos rojos son de 4.5 millones a 5
millones/mL. Los leucocitos manejan
valores de 6,000-10,000 por
mm3/sangre, en valores anormales o
superiores a este rango se puede
presentar leucocitosis. Los neutrófilos
presentan valores de entre 3,500 a
7000 mm3, lo cual a porcentaje
equivale al 60-70% mientras que los
monocitos están en rangos de entre
150 y 800 mm3, en porcentaje
representa de 3 a 8%. Los linfocitos
tienen valores de 1,500 a 4,000 mm3,
lo cual representa el 30- 40%. Los
eosinófilos están entre 0 y 500 mm, lo
cual es el 1-5%, por lo que los
basófilos tienen un valor de 0-100
mm3, lo cual equivale al 0-1%.
Haciendo una comparación dentro del
mismo artículo mencionado
anteriormente, se pudo encontrar que
en dos pacientes no se pudo realizar
el conteo de leucocitos requeridos ya
que pueden llegar a movilizarse de
manera insuficiente, por lo tanto
necesitaron de una estimulación
adicional, lo que quiere decir que
presentaron valores anormales, se
puede considerar que el resultado es
poco fidedigno dado que se está
empleando un estímulo externo para
poder cumplir con el recuento
requerido. Sin embargo, según Lázaro
Cortina (2008), los parámetros del
hemograma de los demás pacientes
estuvieron dentro de las cifras
aceptadas para la autodonación.
Es de suma importancia para los
Q.F.B.T conocer sobre el conteo de
células mononucleares ya que brinda
un panorama sobre el estado general
que puede llegar a tener el paciente
debido a la patología. Así mismo es
posible llevar un control sobre los
parámetros normales que manejan
cada células.
CONCLUSIONES
Se comprendió la importancia y
características de las diferentes
células mononucleares; así como
también se conocieron las diferentes
técnicas y se comprendieron sus
fundamentos para la separación de
estas células.
REFERENCIAS
Abbas, A., et. al. (2020). Inmunología
Básica: Funciones y Trastornos del
6
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Cubana de Hematología, Inmunología
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