Identificación Bacteriana I

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 
Facultad de Medicina 
Departamento de Microbiología 
 
PRÁCTICAS DE LABORATORIO 
 
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA I 
 
 
 
Maye Bernal Rivera 
Profesora Asociada 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
MEDIOS DE CULTIVO 
 
Definición: 
 
Medio de Cultivo es el conjunto de nutrientes y sustratos que permiten el crecimiento, 
la multiplicación y el aislamiento de las diferentes especies bacterianas para llegar a su 
identificación, además de otros estudios complementarios como lo es su 
comportamiento frente a los antimicrobianos. Un medio de cultivo mínimo debe tener: 
agua, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una sal para mantener estable 
la concentración de iones. 
 
Clasificación 
 
Los medios de cultivo se clasifican de acuerdo con: 
 
 
 
Para establecer el diagnóstico etiológico de la enfermedad infecciosa, se debe partir 
de una muestra clínica procedente del paciente en estudio, para ser procesada en el 
laboratorio clínico. Dependiendo del diagnóstico clínico presuntivo, consignado en la 
orden de solicitud expedida por el médico tratante, se determina el procedimiento a 
seguir. Así, la muestra biológica se siembra en diferentes medios de cultivo, en 
condiciones ambientales específicas, de acuerdo con el microorganismo que se 
pretenda aislar. 
 
Esta primera parte del módulo de Bacteriología corresponde a la identificación del 
microorganismo (género y especie) la cual conlleva a establecer el diagnóstico 
etiológico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MEDIOS DE TRANSPORTE 
 
Son aquellos que aseguran la viabilidad de la bacteria desde el momento de la toma de 
la muestra, hasta su llegada y procesamiento en el Laboratorio. Carecen de un 
nutriente mínimo indispensable, evitando así el crecimiento de las bacterias. Como 
ejemplo tenemos el medio de Stuart, Ames, Sílica gel, Cary Blair, entre otros. 
 
 
MEDIOS DE CONSERVACIÓN 
 
Son medios que permiten mantener la viabilidad de las bacterias, conservando sus 
características fisiológicas, morfológicas, tintoriales, etc. Los hay para tiempos cortos y 
tiempos más prolongados, aunque para mantener y garantizar todas las características 
bacterianas se deben conservar liofilizadas o congeladas a -70ºC o en nitrógeno a -
120ºC. Ejemplos de este tipo de medios son: medio de Dorset, medio de leche 
descremada triptona glucosa glicerol (LDTGG), solución de Greaves, etc. 
 
 
CONDICIONES AMBIENTALES 
 
Para el cultivo de bacterias, además de suministrarles sus requerimientos nutricionales 
(medios de cultivo óptimos), se les debe proporcionar las condiciones ambientales 
necesarias para permitirles su crecimiento y multiplicación. 
 
 
- Temperatura y porcentaje de humedad 
- Concentración atmosférica 
- Presencia de O2 (Aerobiosis) 
- Disminución de O2 (Microaerofilia) 
- Presencia de CO2 (Capnofilia) 
- Atmósfera de Nitrógeno y ausencia de O2. (Anaerobiosis) 
 
 
SELECCIÓN DE MEDIOS 
 
Para la recuperación de los microorganismos a partir de las muestras clínicas, es 
indispensable hacer la selección adecuada de los medios primarios de cultivo para 
obtener resultados óptimos y confiables. Es importante para el médico, conocer los 
 
ORIGEN 
 
Naturales 
Sintéticos 
 
 
CONSISTENCIA 
 
Líquidos 
Sólidos 
Semi-sólidos 
 
 
COMPOSICIÓN 
 
Nutritivos 
Enriquecidos 
Selectivos 
Diferenciales 
 
diferentes medios utilizados en el Laboratorio Clínico para, en un momento dado, poder 
interpretar adecuadamente los resultados y detectar posibles falsos negativos. El 
siguiente cuadro muestra algunos ejemplos de cómo, dependiendo del agente 
etiológico en determinada entidad, se selecciona el medio de cultivo a utilizar: 
 
 
SELECCION DE MEDIOS DE CULTIVO 
Entidad Agente Etiológico Medio de Cultivo 
Faringitis estreptocócica Streptococcus pyogenes Agar Sangre 
Uretritis gonocócica Neisseria gonorrhoeae Thayer Martin * 
Tuberculosis pulmonar Mycobacterium tuberculosis Ogawa Kudoh 
Tos ferina Bordetella pertussis Bordet Gengou 
 * modificado 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TÉCNICA DE INOCULACIÓN 
 
Las técnicas para inocular las muestras en los diferentes medios de cultivo varían de 
acuerdo con el objetivo. 
 
 
Esterilización del Asa Bacteriológica 
 
Las asas bacteriológicas básicamente son alambres unidos a un 
mango que permite manipularlas. El alambre puede ser de diferente 
material (ferro níquel, nicromo, platino, etc.) y la forma (recta, curva, 
etc.,) según la necesidad. 
 
 
 
Mábery 
Para su esterilización se tomar el asa bacteriológica por el mango y 
se coloca en posición vertical sobre la llama del mechero, hasta que 
el alambre quede al rojo vivo. Posteriormente se deja enfriar o se 
enfría dentro del medio de cultivo, antes de tomar las colonias. 
 
 
Inoculación en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Medios en caja de Petri 
 
Siembra por agotamiento: el objetivo de esta técnica es diluir la muestra de tal manera 
que al final se obtengan colonias separadas y así, poder iniciar el estudio de 
identificación y sensibilidad a los antimicrobianos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C. Siembra en Agar 
semisólido (taco) 
 
1. Obtener la muestra con 
asa recta 
 
2. Hacer una picadura por 
el centro hasta la mitad del 
medio. 
 
B. Siembra en Agar 
Inclinado (pico de flauta) 
 
1. Obtener la muestra con 
asa 
 
2. Hacer estrías en la 
superficie del medio 
 
A. Siembra en Medio 
Líquido (Caldo) 
 
1. Obtener la muestra con 
asa bacteriológica o 
escobillón 
 
2. Introducir en el caldo de 
cultivo, haciendo 
movimientos de rotación. 
 
1. Obtener la muestra con escobillón o asa y suspenderla en un extremo de la placa 
de agar, haciendo estrías (líneas) de un extremo a otro (primer cuadrante). 
 
2. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante primero y 
extenderlas hasta el cuadrante dos. 
 
3. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante dos y 
extenderlas hasta el cuadrante tres. 
 
4. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante tres y 
extenderlas hasta el cuadrante cuatro. 
 
Mábery 
Mábery 
Mábery Mábery Mábery 
Mábery 
 
 
 
 
 
Siembra en cuadrícula: El objetivo de esta técnica, es hacer recuento de unidades 
formadoras de colonias (UFC). 
 
 
 
 
 
 
 
1. Obtener la muestra con asa calibrada o pipeta automática que dispense una 
cantidad exacta y distribuirla con el asa en línea recta por todo el centro. 
 
2. Hacer estrías de extremo a extremo en sentido contrario a la línea de inóculo 
 
3. Girar la placa y hacer estrías de extremo a extremo, en sentido contrario a las 
anteriores 
 
1 2 3 
3 2 4 1 
PARTE I. SIEMBRA 
 
Objetivos específicos 
 
• Conocer diferentes medios de cultivo utilizados en el laboratorio de 
Microbiología médica y sus técnicas de siembra. 
 
• Aprender el procedimiento para tomar una muestra faríngea, su siembra en Agar 
Sangre y su aplicabilidad para el diagnóstico de amigdalitis y faringitis. 
 
 
Al final de esta práctica, el estudiante debe estar en capacidad de: 
 
- Conocer e identificar adecuadamente los medios de cultivo utilizados de rutina en el 
laboratorio de Microbiología para el cultivo de patógenos comunes: agar sangre, agar chocolate 
y agar Mac Conkey. 
- Conocer cómo se hace la identificación del agente etiológico, partiendo del cultivo. 
- Diferenciar un cultivo puro de uno mixto. 
- Observar cómo puede crecer la microbiota bacteriana normal en orofaringe y cómo se 
detecta portadores sanos de Streptococcus pyogenes. 
- Tener conocimiento de la utilidad médica del faringocultivo 
- Aprender a solicitar un cultivo faríngeo. 
- Informar adecuadamente el resultado del faringocultivo, para una correcta interpretación de 
reportes recibidos posteriormente. 
 
Materiales 
 
 
 
OBJETIVO 
 
Proporcionar al estudiante el conocimiento científico y las habilidades prácticas 
de losmétodos y técnicas utilizados en Microbiología Médica para el 
aislamiento e identificación de algunos agentes patógenos para el hombre, a 
partir de muestras clínicas, lo que le permitirá desempeñarse con idoneidad, en 
su práctica médica, en el campo de las enfermedades infecciosas. 
 
- Asa curva y asa recta 
- Mechero de alcohol 
- Cepas bacterianas puras 
 
Tubos: 
- Caldo Nutritivo 
- Agar Nutritivo (inclinado) 
- Agar semisólido (taco) 
 
 
Cajas de Petri: 
- Agar nutritivo 
- Agar Sangre (2 cajas) 
- Agar Chocolate 
- Agar Mc Conkey 
 
- Escobillones y bajalenguas 
estériles 
Procedimiento 
 
Con el objeto de tener una visión general de la identificación del agente etiológico a 
partir del cultivo, describimos el procedimiento simple que se sigue, para aislar el 
microorganismo. 
 
1. El medio de cultivo debe marcarse en la base, nunca en la tapa: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Siembra en caldo de cultivo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Siembra en Agar Inclinado: Seguir los mismos pasos (a a j) pero al sembrar, hacer estrías sobre la 
superficie del agar. 
 
Siembra en Agar semisólido: Seguir los mismos pasos (a a j) pero al sembrar, utilizar el asa recta e 
inocular en línea recta por el centro y hasta la mitad del agar. 
 
Siembra en Agar - Cajas de Petri: Siembra por agotamiento: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
a. Tomar con la mano izquierda el tubo que contiene la bacteria. 
b. Con la mano derecha, manejar el asa y esterilizarla. 
c. Retirar la tapa del tubo con el dedo meñique de la mano derecha y mantenerla ahí (no colocar 
sobre el mesón, para evitar contaminación). 
d. Flamear la boca del tubo. 
e. Introducir el asa estéril y tomar una “asada”. 
f. Flamear nuevamente la boca del tubo y colocar la tapa . 
g. Coger el tubo que contiene el caldo con la mano izquierda, y con el meñique de la derecha retirar 
la tapa, flamear la boca del tubo. 
h. Introducir el asa en el caldo y dar movimientos de rotación. 
i. Retirar el asa, flamear y tapar el tubo. 
j. Esterilizar el asa. 
 
a. Seguir los pasos a a g. 
b. Tomar la base de la caja por los bordes, con el índice y pulgar de la mano izquierda y voltear la 
mano para que la superficie del agar quede hacia arriba. 
c. Descargar el inóculo en el primer cuadrante haciendo estrías de lado a lado, como lo indica la 
figura (ver arriba, siembra por agotamiento); flamear el asa y enfriarla en un extremo del agar, 
introduciendo el asa (picando). 
d. Girar la caja e iniciar las estrías partiendo del primer cuadrante, flamear el asa, y enfriarla en el 
extremo del agar. 
e. Girar nuevamente la caja y repetir una vez más el mismo procedimiento. 
La etiqueta debe contener: 
 
1. Nombre del paciente 
 
2. Registro de laboratorio 
(con fecha y consecutivo del Laboratorio) 
 
3. Tipo de muestra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ver: 
https://drive.google.com/drive/folders/1QQfmzWiy2foswrMaGt1RPItTqJKoUz_d?usp=sh
aring 
 
FARINGOCULTIVO 
 
Siembra a partir de muestra faríngea 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ACTIVIDAD 
 
1. Enumere las diferentes técnicas de siembra en medios de cultivo y especifique, su 
utilidad. 
 
2. ¿Cuál es la importancia de seleccionar correctamente, los medios de cultivo 
adecuados, para la identificación del agente etiológico en la práctica clínica? 
 
3. Escriba las diferentes condiciones atmosféricas y de temperatura en las que debe 
cultivarse las bacterias. 
 
 
 
1. Identificar correctamente los medios (agar sangre 
y agar chocolate) y etiquetar según los parámetros 
de la institución. 
2. Sentar al “paciente” cómodo. 
3. Alistar el escobillón (pretratado) y bajalenguas 
estériles. 
4. Usar guantes y tapabocas. 
5. Indicar al paciente que abra la boca, colocar el 
bajalenguas y con el escobillón frotar las amígdalas. 
6. Hacer la siembra por agotamiento en agar sangre 
y agar chocolate. En agar sangre picar el medio unas 
4 veces, con el fin de aumentar la producción de 
hemolisina beta sensible al oxígeno. 
7. Incubar en CO2 (frasco con vela), 24 horas a 37ºC. 
 
 
1. Colocar las cajas de Agar Sangre con la tapa hacia 
abajo, dentro de la jarra con vela (CO2 al 5%) y algodón 
mojado en agua estéril (ambiente de humedad). 
 
2. Colocar los otros medios (cajas con la tapa hacia 
abajo y tubos en los vasos) en la canasta destinada para 
ello. 
 
3. Incubar a 37ºC por 24 horas en aerobiosis. 
 
 
4. Una vez obtenido el crecimiento bacteriano, ¿qué pasos se debe seguir para la 
identificación del microorganismo en estudio? 
 
5. ¿Cuál es la utilidad de la siembra de secreción faríngea en agar sangre y en agar 
chocolate? 
 
6. ¿Cuál agente etiológico se persigue estudiar de rutina en el faringocultivo? ¿Y qué otros 
agentes etiológicos diferentes a los de rutina, pueden crecer en el cultivo faríngeo? 
 
7. ¿Qué utilidad médica tiene un faringocultivo?