Antimicrobianos

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 
Facultad de Medicina 
Departamento de Microbiología 
 
PRÁCTICA VIRTUAL DE LABORATORIO 
 
PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA 
 
 
Aura Lucía Leal 
Profesora Asociada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
Con el advenimiento de la quimioterapia y la antibioterapia, se creyó que el problema de la 
enfermedad infecciosa había sido superado. Bien pronto se llegó a la conclusión de que surgían 
nuevos problemas ya que con el uso de los quimio- antibióticos pueden seleccionarse mutantes 
resistentes a ellos y mutantes dependientes de ellos, de manera que en una infección en donde 
esos mutantes estén presentes proliferarán, manteniéndose la infección por gérmenes totalmente 
resistentes al antibiótico dado. Los antibióticos de amplio espectro presentaron el mismo 
fenómeno, de manera que fue necesario buscar técnicas de laboratorio para probar la sensibilidad 
de un germen ante un antibiótico determinado y de esta manera hacer una terapia más racional. 
 
OBJETIVO 
• Conocer los principales métodos disponibles en la actualidad a nivel clínico para 
evaluar la sensibilidad antimicrobiana teniendo 
• Conocer los parámetros de aceptación establecidos por el Comité Internacional 
de Estándares de Laboratorio (CSLI) y la expresión de resultados de las pruebas 
dentro de un reporte médico. 
 
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El criterio actual ante una infección consiste en aislar el agente causal y probar su sensibilidad 
frente a varios antibióticos con el fin de emplear posteriormente el más adecuado. Adicionalmente, 
debido a la emergencia de múltiples marcadores de resistencia, actualmente las pruebas de 
susceptibilidad antimicrobiana pueden ser de utilidad en la detección de mecanismos de 
resistencia como por ejemplo la expresión de enzimas que hidrolizan cierto grupo de 
antimicrobianos. 
 
 TÉCNICAS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA 
La actividad antimicrobiana de un antibiótico frente a un microorganismo específico puede 
ser determinada por distintos métodos ya sean cualitativos o cuantitativos. Las técnicas para 
la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana son Dilución y Difusión. 
 
1. TÉCNICA DE DILUCIÓN 
Está basada en la realización de una serie diluciones dobles del antibiótico frente una 
concentración determinada del microorganismo, teniendo como constante el volumen final de 
cada dilución (Figura 1). Esta técnica determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) que se 
define como la menor concentración del antimicrobiano que inhibe visiblemente el crecimiento 
microbiano y se expresa usualmente en microgramos por mililitro (µg/mL). Esta técnica puede 
realizarse en agar o en caldo (en tubo o en microplacas). Tiene como ventaja que es muy precisa 
y da una estimación cuantitativa que puede correlacionarse con parámetros de fármaco cinética 
y fármaco dinamia del antibiótico. Puede realizarse en tubo (macrodilución) o en microplacas 
(microdilución) (Figura 2). 
 
 
Figura1. Esquema de realización de diluciones en tubo seriadas para determinar la CIM 
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Figura 2. Técnica de microdilución en caldo. Prueba de sensibilidad de Streptococcus pneumoniae frente a la 
Penicilina. 
 
La técnica de dilución se considera el estándar de oro para la determinación de la sensibilidad 
antimicrobiana. Es el fundamento que se sigue en los métodos automatizados. 
 
 
2. TÉCNICA DE DIFUSIÓN (Método de Kirby Bauer) 
Utiliza discos impregnados con una concentración de antimicrobiano determinada, los cuales se 
colocan sobre una superficie de Agar a un volumen determinado y con una concentración 
bacteriana conocida. Esta se establece al realizar una suspensión de la bacteria y comparar contra 
un estándar de turbidez llamado escala de MacFarland. Si la suspensión bacteriana tiene la misma 
turbidez de 0.5 de la escala significa que la concentración de bacterias es de 1,5x108 UFC/ml. La 
figura 3 muestra todos los pasos a seguir para realizar la técnica de difusión y evaluar la 
sensibilidad antimicrobiana. La prueba se realiza generalmente en agar Mueller Hinton y 
ocasionalmente suplementado con sangre. En casos especiales como H. influenzae se utilizan 
medios especiales. 
 
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La preparación se incuba por un período determinado, durante el cual, el antibiótico difunde dentro 
del agar sobre el cual ha crecido el microorganismo. El punto en el cual el crecimiento microbiano 
es inhibido por la concentración del antimicrobiano determina la formación de un halo, cuyo 
diámetro es medido para interpretarlo de acuerdo con estándares internacionales. Aunque es una 
técnica muy rápida, económica y de muy fácil ejecución puesto que en una sola caja de Petri se 
pueden estudiar varios antibióticos simultáneamente, el dato generado es de carácter cualitativo 
y no se puede obtener la concentración del antibiótico a la cual es sensible el microorganismo. 
 
Aunque se puede aplicar a la mayoría de los microorganismos, existen casos en los cuales los 
resultados obtenidos por esta técnica no pueden ser equivalentes a los datos obtenidos por 
técnicas de dilución (por ejemplo, determinación de sensibilidad a cefalosporinas de tercera 
generación en Streptococcus pneumonie o sensibilidad a vancomicina en Staphylococcus 
aureus). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TÉCNICA DE DIFUSIÓN (Método de Kirby Bauer) 
 
 1. Selección de Colonias 2. Preparación del inóculo 3. Inoculación de la placa 
 
 
 4. Aplicación de los sensidiscos 5. Incubación 6. Lectura 
 
 
Figura 3. Procedimiento para realizar una prueba de difusión 
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PRUEBA EPSILON (E- test) 
En los últimos años se ha incrementado el uso de un nuevo método para determinar la actividad 
antimicrobiana denominado E-test (prueba Epsilon). El principio de este método es una expansión 
de la técnica de difusión en disco y consiste en colocar una tira de plástico no poroso de 6 cm de 
largo por 5 mm de ancho que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano. El protocolo 
para preparar el inóculo bacteriano es el mismo que para la difusión en disco (índice de difusión 
de MacFarland). 
Una vez colocada la tira sobre el agar, el antimicrobiano comienza a difundirse y produce 
resultados cuantitativos de la susceptibilidad del microorganismo frente al agente probado. Es 
decir, permite cuantificar la CIM que se lee en el punto en donde la elipse de crecimiento bacteriano 
intercepta la escala de la tira (figura 4). 
 
 
Figura 4. Determinación de la CIM mediante el uso de tiras de E-test. 
 
SISTEMAS AUTOMATIZADOS 
En los últimos años, las necesidades a nivel de laboratorios clínicos de manejar números 
importantes de muestras clínicas, así como de obtener resultados de manera rápida y sistemática, 
llevó a la introducción de sistemas automatizados para la identificación y la determinación de la 
susceptibilidad bacteriana. Existen diferentes sistemas en el mercado, pero en general todo utiliza 
el principio de la técnica de microdilución. Algunos son semiautomatizados (autoscan) o 
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automatizados (walkaway, vitek, Phoenix) ) que consiste en bandejas de microtitulación de 
plástico, de tamaño estándar, en las cuales hay sustratos para la identificación y susceptibilidad 
antimicrobiana para microorganismos Gram positivos, Gram negativos, levaduras, anaerobios y 
gérmenes de crecimiento difícil. (figura 5). 
 
Dichos paneles se encuentran deshidratados y se inoculan con un sistema de suspensión 
bacteriana estandarizado, el cual posteriormente se incuba a 35°C durante 15-18 horas. Las 
lecturas se realizan por métodos fotocolorimétricos. Son métodos muy confiables y con buena 
concordancia con la microdilución manual, dando datos en términos de concentración inhibitoria 
mínima. Tiene como desventaja que traen los antibióticos ya incluidos por locual los hace 
métodos poco flexibles si se requieren probar otros antimicrobianos. 
 
 
Figura 5. Sistemas automatizados 
 
 LECTURAS E INTERPRETACIÓN DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD 
Una vez realizadas las pruebas de sensibilidad mediante cualquiera de los métodos descritos, 
los datos obtenidos ya sea en términos de CIM o en halos de inhibición en mm, se deben 
interpretar mediante un sistema de puntos de corte establecidos internacionalmente para 
interpretar el resultado de tal manera que permitan determinar si el asilamiento es sensible, 
intermedio o resistente frente al antimicrobiano probado y de esta manera realizar el informe 
que va a orientar la terapia antimicrobiana en el paciente (figura 6). 
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Figura 6. Ejemplo de reporte que recibe el médico del perfil de sensibilidad de un microrganismo. 
 
Los puntos de corte son establecidos luego de realizar consensos a nivel internacional, que 
incluyen estudios de distribución poblacional microbiana, estudios de farmacocinética y fármaco 
dinamia (PK/PD) y estudios clínicos. Uno de los comités más reconocidos que determina los 
puntos de corte y su interpretación y que se utiliza en nuestro medio es el comité internacional de 
estándares de laboratorio clínico de los Estados Unidos (CSLI) que define las categorías de 
sensibilidad así: 
 
Sensible: Los aislamientos son inhibidos por las concentraciones que usualmente alcanza el 
agente cuando se utiliza la dosis recomendada para el sitio de infección” 
 
Intermedia: Los aislamientos con una CMI (o halo) para los cuales la respuesta clínica puede ser 
más baja que para aislamientos susceptibles”. Esto implicaría que la Infección podría responder 
en los sitios donde el antimicrobiano se concentra como, por ejemplo, betalactámicos en orina y 
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si es posible que se pueden utilizar dosis más altas que las usuales. 
 
Resistente: Los aislamientos NO son inhibidos por las concentraciones que usualmente alcanza 
el agente cuando se utiliza la dosis recomendada para el sitio de infección 
 
Sensible dosis dependiente 
No sensible 
 
 DETECCIÓN DE MECANISMOS DE RESISTENCIA 
En algunos casos las técnicas de detección de la sensibilidad antimicrobiana (específicamente 
la técnica de difusión es utilizada en los laboratorios clínicos de manera complementaria para 
poder confirmar un tipo específico de mecanismo de resistencia. En estos casos, se siguen los 
mismos principios descritos para las pruebas de difusión: preparación del inóculo, inoculación 
del agar Mueller Hinton, preparación de una concentración estándar del antibiótico en 
sensidiscos, postura de los sensidiscos en el agar, incubación y lectura. Sin embargo, los 
resultados obtenidos confirman los mecanismos de resistencia, por ejemplo, la presencia de 
una enzima, que se refleja mediante el aumento del halo de inhibición al adicionarle al disco que 
contiene el antibiótico un inhibidor de dicha enzima, el ejemplo más común es la confirmación 
de betalactamasas de espectro extendido en la identificación de enterobacterias (Figura 6). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Método de detección de Betalactamasas de espectro 
extendido (BLEE) utilizando los antibióticos: Cetofaxima (CTX), 
Ceftazidima (CAZ), Cetofaxima-Ácido clavulánico (CTX-CLA) y 
Ceftacidina- Ácido clavulánico (CAZ-CLA) 
 
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BIBLIOGRAFÍA 
• Microbiology Laboratory. George A. Wistreich. Prentice – Hall, Inc. 1997. USA. 
• Koneman E, Allen SD, Janda W. Et al: Introducction to Microbiology Part I: The role of 
the Microbiology Laboratory in the Diagnosis of the Infectious Diseases: Guidelines 
to practice and Management in Koneman E, Allen SD, Janda W, et al: Diagnostic 
Microbiology. 5thed, New York: Lippincott, 1997:69-120. 
• CLSI . Clinical Laboratory Standards Institute. Performans Standards for 
antimicrobial disk susceptibility test. 2012